DE69230318T3 - Reagenzzusammensetzungen für analytische testungen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bilden einer Vielzahl von Reagenzkugeln, die Reagenzien zum Analysieren einer biologischen Probe enthalten und in einer wäßrigen Lösung vollständig aufgelöst werden können, sowie auf Reagenzkugeln, die nach diesem Verfahren hergestellt sind, und ferner auf ein Verfahren zum optischen Analysieren eines biologischen Fluids unter Verwendung der Reagenzkugel.
  • Beim Vorbereiten von Reagenzien für das bequeme und effektive Prüfen klinischer biologischer Proben ist es oftmals wichtig, trockene chemische Mischungen in gleichmäßigen diskreten Mengen zu erhalten. Diese Reagenzien müssen effektiv und ökonomisch in kleinen präzise bemessenen Mengen hergestellt werden. Reagenzien, die organische Stoffe enthalten, streben jedoch danach, bei der Lagerung zu verderben oder sich zu verschlechtern, wodurch Qualitätssteuerungsprobleme hervorgerufen werden. Deswegen werden Reagenzien typischerweise in getrockneter Form bereitgestellt, um die Stabilität zu erhöhen. Die heutige Technologie zur Herstellung trockener chemischer Mischungen beinhaltet Prozeduren wie etwa Trockenmischen, Sprühtrocknen oder Wirbeltrocknen. Alle drei Prozeduren weisen jedoch Einschränkungen auf, wonach sie teuer, uneffektiv oder schwierig auszuführen sind.
  • Bei Trockenmischtechniken ist es schwierig, homogene Mischungen von Chemikalien, die unterschiedliche Dichten aufweisen, zu erhalten. Überdies ist eine Homogenität insbesondere dann schwer zu erreichen, wenn sehr kleine Mengen von Ingredenzien mit großen Mengen anderer Ingredenzien gemischt werden. Wenn Homogenität hergestellt wurde, ist es äußerst schwierig, reproduzierbar (innerhalb 1 Prozent) kleine Mengen (weniger als ungefähr 10 mg) der gemischten Chemikalien abzugeben.
  • Die Sprühtrockentechnologie schafft homogenere Mischungen von Chemikalien, denn die Reagenzien werden zunächst in einer Flüssigkeit gelöst. Unter Verwendung von Sprühtrocknen ist es jedoch schwierig und teuer, präzise dimensionierte Mengen der gemischten Chemikalien zu erhalten. Wie allgemein praktiziert erzielt dieser Vorgang Partikel mit Größenverteilungen, die Schwankungskoeffizienten aufweisen, die größer als 20 Prozent sind. Die resultierenden Partikel müssen weiterverarbeitet (gewöhnlich verdichtet) werden, um gleichmäßige Partikelgrößen zu erhalten. Nach der Verdichtung sind diese Partikel im allgemeinen weniger löslich als die ursprünglichen sprühgetrockneten Partikel. Überdies verwenden diese Prozeduren typischerweise Fluorkohlenstoff-Kryolösungen, die umweltgefährdend sind.
  • Die Wirbeltechnologie besteht aus dem Sprühen einer flüssigen Reagenzmischung auf ein Partikel und dem Trocknen der Flüssigkeit, um einen mit den gemischten Reagenzien beschichteten Partikel zu erhalten. Unter Verwendung dieser Prozedur ist es schwierig, gleichmäßig dimensionierte Partikel zu erhalten sowie eine gleichmäßige Beschichtung zu erzeugen.
  • Für Reagenzien, die beim Analysieren biologischer Proben verwendet werden, ist die vorliegende Erfindung besonders interessant, wie etwa für Blutplasma oder Serum in Zentrifugalanalysatoren. Die in derartigen Analysatoren verwendeten Rotoren messen das Volumen der zu prüfenden Proben, mischen die Probe mit einem Verdünner und trennen das Fluid von Zellenbestandteilen. Die Rotoren bieten außerdem eine Vielzahl getrennter, chemische Reagenzien enthaltende Testmulden, in denen einzelne Volumina optisch geprüft werden.
  • Die Analyse biologischer Proben in den Testmulden von Zentrifugalrotoren stellt eine Reihe von Anforderungen an die für die Analyse verwendeten Reagenzien. Insbesondere weil die Analyse typischerweise stark automatisiert ist, ist die Geschwindigkeit der Analyse besonders hoch. Außerdem erfordern viele klinische Diagnoseanalysen, daß die Messungen innerhalb kurzer Zeit, nachdem die Probe zum Reagenz gegeben wurde, erfolgen. Deswegen müssen sich die getrockneten Reagenzpräparate in der Probenlösung schnell auflösen. Außerdem kann die schnelle Rehydration der Reagenzien Blasenbildung verursachen, die die Ergebnisse durch Störungen bei der optischen Messung nachteilig beeinflussen.
  • In Zentrifugalanalysatoren wird die Probe typischerweise vor der Analyse mit einem Verdünner gemischt. Es ist nicht möglich, die Menge des hinzugefügten Verdünners direkt zu messen, während sich die verdünnte Probe im Rotor befindet. Es ist naheliegend, daß falsch verdünnte Proben fehlerhafte Ergebnisse liefern. Deswegen werden bequeme Verfahren zur Bestimmung des Verdünnungsgrads der Probe an Ort und Stelle benötigt. Wenn die zu verdünnende Probe außerdem Zellen enthält, muß die Verdünnung isotone Konzentrationen der Verbindungen enthalten, um einen osmotischen Schock der Zellen zu verhindern. Solche Verbindungen dürfen jedoch keine Analyse verbessern oder verhindern. Im Stand der Technik sind viele isotone Lösungen offenbart, einschließlich Salzlösungen, Glukoselösungen oder phosphatgepufferte Salzlösungen. Da sie die Ergebnisse beeinflussen können, ist keine dieser Lösungen geeignet, denn sie schaffen für die Lösung eine zusätzliche Pufferkapazität oder sie fügen Chemikalien hinzu, die den Analyten gleich sind, die von Interesse sind.
  • Im Stand der Technik fehlen somit Reagenzzusammensetzungen, die in Zentrifugalanalysatoren das obige Problem vermeiden. Insbesondere fehlen im Stand der Technik ökonomische und zuverlässige Reagenzpräparate, die sich schnell in Probenlösungen auflösen und Blasenbildung vermeiden. Überdies sind die gegenwärtig verfügbaren Verdünnungsmittel nicht geeignet, da die Verdünnung nicht einfach gemessen werden kann und sie die Ergebnisse der Analyse verändern können. Die vorliegende Anmeldung wendet sich an diese sowie an verwandte Probleme.
  • US-A-3.721.725 und US-A-3.932.943 beziehen sich auf Verfahren zur Herstellung lyophilisierter Reagenzien, die das Sprühen einer das Reagenz enthaltenden Lösung in ein bewegtes Bad von Fluorkohlenstoff-Kältemitteln und das Lyophilisieren der resultierenden Tröpfchen beinhalten. US A-4.848.094 offenbart Verfahren für die Erzeugung von im wesentlichen kugelförmigen gefrorenen Tröpfchen und verbesserte Verfahren zum Entfernen von gefrorenen Tröpfchen aus einer Kryoflüssigkeit. US-A-4.655.047 beschreibt Verfahren zum Gefrieren von Tropfen von relativ dicken Flüssigkeiten, indem sie aus geringer Höhe in einen Kryowerkstoff getropft werden. US A-3.819.488 schafft stabile lyophilisierte Diagnoseverbindungen für das Bestimmen der Aktivitäten von Glutamin-Oxal-Transaminase und Glutamin-Grenztrauben-Transaminase. US-A-4.588.696 bezieht sich auf die Herstellung von Tabletten, die beim Test nach Formaldehyd und/oder Glutaraldehyd verwendet werden. US-A-4.295.280 , 4.351.158 und 4.712.310 beziehen sich alle auf Verfahren für das Herstellen homogener Präparate, die unvereinbare Verbindungen enthalten. US-A-4.820.627 offenbart einen Wirbelschichtvorgang zum Herstellen von Partikeln, die zur Tablettenherstellung als Diagnosereagenzien geeignet sind. US-A-4.115.537 bezieht sich auf Diagnosetabletten, die Ionenaustauschharze enthalten. US-A-4.755.461 betrifft Blutplasmaverbindungen in Tablettenform. US-A-4.678.812 und 4.762.857 beziehen sich beide auf Diagnosetabletten, die Trehalose als Arzneistoffträger und Stabilisator enthalten. Die Verwendung von TRITON® X-100 ist ebenfalls offenbart. US-A-4.716.119 offenbart das Hinzufügen von Tetramethylammoniumacetat zu Blutserum. Die rumänische Patentanmeldung Nr. 85 155 bezieht sich auf enzymatische alkalische Phosphatase-Reagenztabletten, die n-Nitrophenylphosphat enthalten. Driscoll u. a., Clin. Chem., 29:1609-1615 (1983) offenbart ein Instrument/Reagenzsystem mit Reagenzien in Tablettenform für die Durchführung photometrischer Untersuchungen.
  • Die Erfindung betrifft das obenerwähnte Verfahren zum Bilden einer Vielzahl von Reagenzkugeln, das die folgenden Schritte enthält:
    Bilden einer wäßrigen, homogenen Lösung der Reagenzien;
    Abgeben einzelner, gleichmäßiger, präzise bemessener Tropfen der wäßrigen Lösung in eine Kryoflüssigkeit, die nicht umgerührt wird, wodurch die Tropfen gefrieren; und
    Lyophilisieren der gefrorenen Tropfen, wodurch Reagenzkugeln mit einem Gewichtsschwankungskoeffizienten von weniger als ungefähr 3 % gebildet werden.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Vielzahl von im wesentlichen gleichmäßigen, präzise bemessenen Kugeln gemäß den Ansprüchen 2-4, die nach Anspruch 1 hergestellt sind.
  • Außerdem betrifft die Erfindung das obenerwähnte Verfahren zum optischen Analysieren eines biologischen Fluids, umfassend:
    Zuführen eines vorgegebenen Volumens des biologischen Fluids in eine Testvertiefung, die eine der Vielzahl von Reagenzkugeln nach den Ansprüchen 2, 3 oder 4 enthält, wobei die Reagenzkugel die Reagenzien zur Analyse der Probe enthält und im Fluid vollständig aufgelöst wird;
    Senden eines Lichtstrahls durch das in der Testvertiefung befindliche Fluid; und
    Erfassen des Lichtstrahls, nachdem er durch das Fluid hindurchgegangen ist.
  • Die Reagenzkugeln haben einen Durchmesser zwischen ungefähr 1,7 mm und ungefähr 2,3 mm. Die Reagenzkugeln enthalten zusätzlich zu den Reagenzien, die für die Analyse der biologischen Probe notwendig sind, ein Tensid in einer Konzentration, die ausreicht, um Blasenbildung zu verhindern, wenn sich die Kugel auflöst, sowie einen Füllstoff in einer Konzentration, die ausreicht, um die Bildung eines chemischen Gitters zu erleichtern, das Wasser in die Reagenzkugel leiten kann.
  • Das Tensid ist typischerweise ein nicht ionisches Detergens, wie etwa Octoxynol 9 (TRITON® X-100) oder Polyoxyethylen 9 Laurylether. Die Konzentration des Tensids in der Reagenzkugel ist typischerweise so eingestellt, daß die Konzentration im wiederaufgelösten Reagenz zwischen ungefähr 0,08 g und ungefähr 3,1 g pro 100 ml liegt.
  • Geeignete Füllstoffe zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Polyethylenglycol, Myo-Inosit, Polyvinylpyrrolidon, Rinderserum Albumin, Dextran, Mannit, Natriumcholat oder eine Kombination hiervon. Die Füllstoffverbindungen sind typischerweise in einer Konzentration zwischen ungefähr 10 % und ungefähr 50 % des Trockengewichts vorhanden. Das durch die Füllstoffverbindungen gebildete chemische Gitter gestattet der Reagenzkugel, sich in einer Probenlösung oder in einem Verdünner schnell und vollständig aufzulösen.
  • Reagenzkugeln werden durch Herstellen einer wäßrigen Lösung des geeigneten Reagenz (der geeigneten Reagenzien), Abgeben gleichmäßiger, präzise bemessener Tropfen der wäßrigen Lösung in eine Kryoflüssigkeit und Lyophilisieren der gefrorenen Tropfen gebildet. Die Kryoflüssigkeit ist typischerweise flüssiger Stickstoff, der nicht umgerührt wird.
  • Es werden außerdem Verdünner geschaffen, die für das Mischen mit einer biologischen Probe vor dem optischen Analysieren der Probe geeignet sind. Verdünner der vorliegenden Erfindung umfassen eine isotone Konzentration einer Verbindung, die die Analyse der Probe nicht stört. Die bevorzugte Verbindung wird insbesondere im wesentlichen keine Pufferkapazität beim pH-Wert der speziellen Untersuchung besitzen. Typische Verbindungen für diese Verwendung enthalten Tetramethylammoniumacetat bei einer Konzentration zwischen ungefähr 120 mM und ungefähr 150 mM sowie Inosit zwischen ungefähr 20 und ungefähr 30 g/l. Der Verdünner kann außerdem zum Bestimmen der Verdünnung der biologischen Probe eine photometrisch erkennbare Markierungsverbindung enthalten. Typische Markierungsverbindung enthalten Farbstoffe wie etwa 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyaninjodid, 1,1'-Di(Sulfalkyl)-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyaninsalze, Enzymsubstrate (wie etwa Lactat und p-Nitrophenylphosphat) und Enzyme (wie etwa D-Lactat-Dehydrogenase und mikrobielle Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase).
  • Die vorliegende Erfindung schafft Verbindungen für das Analysieren von biologischen Proben beispielsweise in Zentrifugalrotoren und Analysatoren, die eine schnelle und ökonomische Analyse von Blutproben gestatten. Es werden lyophilisierte Reagenzkugeln geschaffen, die ein chemisches Gitter enthalten, um ein schnelles und vollständiges Auflösen der Kugeln in einer wäßrigen Lösung zu erleichtern. Sie enthalten außerdem ein Tensid in einer Konzentration, die ausreicht, um Blasenbildung zu verhindern, wenn sich die Reagenzkugeln auflösen. Die Reagenzkugeln können in Verbindung mit Verdünnungslösungen verwendet werden, die isotone Konzentrationen von Verbindungen enthalten, die im wesentlichen keinen Einfluß auf die Untersuchungen haben. Es werden außerdem Markierungsverbindungen verwendet, um schnell und einfach die Verdünnung der Probe an Ort und Stelle zu bestimmen.
  • Die Reagenzkugeln und Verdünner der vorliegenden Erfindung sind zur Verwendung in Zentrifugalanalysatoren für das optische Analysieren biologischer Proben, insbesondere Blutplasma oder Serum, geeignet. Zentrifugalrotoren, die in solchen Analysatoren verwendet werden, enthalten typischerweise eine Einrichtung zum Mischen des Bluts mit einem geeigneten Verdünner und zum Trennen des Plasmas vom Zellengewebe. Die Rotoren dienen außerdem zur Verteilung des verdünnten Plasmas in eine Vielzahl von Küvetten im Rotor, so daß verschiedene optische Analyseprozeduren durchgeführt werden können, ohne daß Fluidreste von der Apparatur übergeben werden müssen. Eine oder mehrere Reagenzkugeln, die die für eine gewünschte Untersuchung notwendigen Reagenzien enthalten, werden in jede Küvette gegeben.
  • Es werden vorzugsweise die in WO 91/18656 beschriebenen Rotoren und Verfahren verwendet.
  • Die obige Anwendung offenbart Zentrifugalrotore zum Separieren von Plasma aus Vollblut, die eine Vielzahl innerer Kammern und Durchlässe zum Kombinieren des Blutplasmas oder Serums mit einem oder mehreren Reagenzien und zum Verteilen des Blutplasmas oder Serums zu einer Vielzahl von einzelnen Testmulden. Die Kammern und Durchlässe, die für das Separieren des Vollbluts in Plasma benötigt werden, verlaufen von Meßkammern, die präzise bemessene Volumen von Blut und/oder Verdünner an eine Trennkammer abgeben, radial nach außen. Die Trennkammer enthält eine Zellenfalle, die radial außen liegt. Das Drehen des Rotors bewirkt, daß die Zellenkomponenten des Vollbluts in der Zellenfalle sequestriert werden. Das abgetrennte Plasma wird dann an eine Vielzahl von Testmulden oder Küvetten abgegeben. Die obige Trennung und die Aufteilungsschritte erfolgen typischerweise als Ergebnis der durch den drehenden Rotor erzeugten Zentrifugalkraft.
  • Der Aufbau der vorliegenden Erfindung in Kombination mit dem obenbe schriebenen Rotor sind insbesondere zum Analysieren von Blutplasma oder verdünntem Blutplasma geeignet. Sie sind außerdem bei einer breiten Vielzahl weiterer biologischer Fluids nützlich, wie etwa Urin, Sputum, Samen, Speichel, Augenlinsenfluid, Cerebralfluid, Magenfluid, amniotischem Fluid und Medien aus Gewebekulturen sowie Lebensmitteln und Industriechemikalien u.ä.
  • Der Aufbau der vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet zur Durchführung einer breiten Vielzahl von analytischen Prozeduren, die vorteilhafterweise oder notwendigerweise an Blutplasma oder verdünntem Plasma ausgeführt werden. Analytische Prozeduren erfordern im allgemeinen, daß das Blutplasma mit einem oder mehreren Reagenzien kombiniert wird, so daß im Plasma eine optisch erkennbare Veränderung eintritt, auf die sich die Messung einer bestimmten Komponente oder Charakteristik des Plasmas bezieht. Vorzugsweise wird das Plasma einer Reaktion oder einer anderen Veränderung unterworfen, die eine Veränderung der Farbe, Fluoreszenz, Lumineszenz o.ä. zur Folge hat, die durch herkömmliche Spektrophotometer, Fluorometer, Lichtdetektoren usw. gemessen werden kann. In einigen Fällen können Immununtersuchungen und weitere spezielle Verbindungsuntersuchungen in den Testmulden durchgeführt werden. Im allgemeinen müssen jedoch solche Untersuchungsprozeduren homogen sein und erfordern keinen Trennungsschritt. In anderen Fällen ist es möglich, heterogene Untersuchungssysteme anzupassen, indem eine Einrichtung vorgesehen wird, um Blutplasma von den Testmulden zu separieren, nachdem ein immunologischer Reaktionsschritt erfolgt ist.
  • Herkömmliche Blutuntersuchungen, die durchgeführt werden können, enthalten Glucose, Lactat-Dehydrogenase, Serum-Glutaminoxalacetat-Transaminase (SGOT), Serum-Glutaminbrenztrauben-Transaminase (SGPT), Blutures (Stickstoff) (BUN), Gesamtprotein, Alkalität, Alkaliphosphatase, C-reaktives Protein Bilirubin, Calcium, Chlorid, Natrium, Kalium, Magnesium u.ä. Diese Liste ist nicht erschöpfend und ist lediglich beispielhaft für Untersuchungen, die unter Verwendung der Vorrichtung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Diese Prüfungen erfordern gewöhnlich, daß das Blutplasma mit einem oder mehreren Reagenzien kombiniert wird, was eine visuell erkennbare, gewöhnlich photometrisch erkennbare Veränderung im Plasma zur Folge hat.
  • Deswegen sind die Reagenzkugeln der vorliegenden Erfindung aus Reagenzien hergestellt, die für eine der obigen analytischen Untersuchungen ge eignet sind. Es wird typischerweise eine wäßrige Lösung hergestellt, die die Reagenzien enthält. Um eine gleichmäßige Zusammensetzung der Reagenzkugeln zu gewährleisten, muß die Lösung homogen sein und alle Bestandteile müssen vollständig aufgelöst oder aufgeschwemmt sein. Es werden nachfolgend einzelne Tropfen der Lösung in eine Kryoflüssigkeit, vorzugsweise flüssiger Stickstoff, abgegeben. Eine Kryoflüssigkeit, wie sie hier verwendet wird, bezeichnet ein verflüssigtes Gas, das unter Normalbedingungen einen Siedepunkt unterhalb ungefähr –75 °C, vorzugsweise unterhalb ungefähr –150 °C besitzt.
  • Die gefrorenen Massen werden nachfolgend lyophilisiert, um die Reagenzkugeln zu erzeugen. Die Reagenzkugeln enthalten typischerweise weniger als 6 % Restfeuchtigkeit, vorzugsweise weniger als ungefähr 3 %. Die Lyophilisierung wird gemäß Standardprozeduren ausgeführt, die in der Technik bekannt sind. Die gefrorenen Tropfen werden typischerweise während einer Zeit von ungefähr 4 Stunden bis ungefähr 24 Stunden bei einem Druck von ungefähr 6,6 × 10-6 Pa bis etwa 5,9 × 10-5 Pa (50 bis etwa 450 m Torr) lyophilisiert, vorzugsweise während ungefähr 6 Stunden bei ungefähr 2,6 × 10-5 Pa (200 m Torr).
  • Die Tropfen sind gleichmäßig und präzise abgemessen, so daß die sich ergebenden getrockneten Reagenzkugeln eine gleichmäßige Masse besitzen. Wenn die Tropfen gleichmäßig und präzise abgemessen sind, ist die Massenungenauigkeit (der Gewichtsschwankungskoeffizient) der Reagenzkugeln, die aus den Tropfen hergestellt sind, kleiner als ungefähr 3 % und vorzugsweise zwischen ungefähr 0,3 % und ungefähr 2,5 %. Um den Gewichtsschwankungskoeffizienten weiter zu verringern, wird die wäßrige Lösung vorzugsweise unter Verwendung einer Unterdruckpumpe oder einer Unterdruckleitung entgast, bevor die Tropfen der Lösung abgegeben werden.
  • Um Werte für den Gewichtsschwankungskoeffizienten zu bekommen, werden bekannte Anzahlen der Reagenzkugeln gewogen. Der Schwankungskoeffizient (C.V.) wird dann folgendermaßen bestimmt: C.V. = J/x - × 100wobei
    Figure 00080001
    x = Gewicht einer Kugel
    x - = Mittelwert (für "n" Kugeln) = Σx/n
  • Die Gleichförmigkeit der durch dieses Verfahren hergestellten Reagenzkugeln eliminiert die Notwendigkeit eines zusätzlichen tablettenbildenen Schrittes, um eine gleichmäßige Größe zu erzielen. Die Tropfen können durch jede von einer Anzahl von Einrichtungen abgegeben werden, die die notwendige Genauigkeit gewährleisten. Typischerweise wird eine IVEK-Pumpe, Modell AAA (N. Springfield, VT) verwendet. Die Lösung wird in einzelnen Tropfen abgegeben, die ein Volumen zwischen ungefähr 2,5 μl und ungefähr 4,0 μl aufweisen. Das genaue Volumen der Tropfen hängt von der speziellen Anwendung ab. Beispielsweise werden bei der Herstellung von Reagenzkugeln für Gesamtproteinbestimmungen typischerweise Tropfen mit 2,96 μl verwendet, für C-reaktionsfähige Protein- und Alkali-Phosphatasebestimmungen werden 2,67 μl verwendet. Folgende Volumina sind für weitere Prüfungen geeignet: SGOT 4,0 μl; Kalium 4,0 μl; Kreatinin 4,0 μl; Bilirubin 2,667 μl; Amylase 2,667 μl; Cholesterol 2,667 μl; Harnsäure 3,478 μl und Glucose 2,065 μl.
  • Die Reagenzkugeln der vorliegenden Erfindung lösen sich in einer wäßrigen Probenlösung oder in einem Verdünner schnell auf. Eine Probenlösung der vorliegenden Erfindung kann eine verdünnte oder unverdünnte biologische Probe sein. Die Reagenzkugeln lösen sich typischerweise in weniger als ungefähr 30 Sekunden, vorzugsweise weniger als ungefähr 10 Sekunden, auf. Die Geschwindigkeit der Auflösung ergibt den Eindruck, daß die Reagenzkugel "explodiert" und die sich auflösenden Chemikalien im gesamten sich neu bildenden Volumen verteilt. Die schnelle Auslösung der Kugeln wird durch eine chemische Gitterstruktur erleichtert, die Wasser schnell in die Reagenzkugel leitet. Um das chemische Gitter zu bilden, sind in der wäßrigen Lösung, die zur Herstellung der Kugeln verwendet wird, Füllstoffe enthalten. Wenn die Reagenzkugeln lyophilisiert werden, erleichtern diese Moleküle in den Kugeln die Bildung eines Netzes offener Räume oder eines chemischen Gitters. Die Füllstoffkomponenten der Reagenzkugeln sind typischerweise Polymerverbindungen, wie etwa Rinderserum Albumin, Polyethylenglycol, Dextran, Ficoll® (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey) oder Polyvinylpyrrolidon. Außerdem sind Emulgatoren wie etwa Natriumcholat u. ä. als Füllstoffe nützlich. Außerdem können Monosaccharide und deren Derivate, wie etwa Mannitol oder der Polyalkohol Myo-Inositol, verwendet werden. In Abhängigkeit von der Untersuchung können die Füllstoffe einzeln oder in Verbindung mit einer oder mehreren der anderen Füllstoffkomponenten verwendet werden.
  • Die Reagenzkugeln der vorliegenden Erfindung enthalten zusätzlich zu Füllstoffen außerdem ein oder mehrere Tenside in Konzentrationen, die ausreichen, um Blasenbildung zu verhindern, wenn die Kugeln schnell rehydratisiert werden. Wie oben beschrieben ist, sind Blasen für die Untersuchungen nachteilig, da sie die optischen Messungen stören. Wenn die Reagenzkugeln jedoch Tenside in geeigneten Konzentrationen enthalten, werden solche Probleme vermieden. Geeignete Tenside enthalten nicht ionische Detergenzen wie etwa Polyoxyethylen-9-laurylether, Octoxynol-9, Synthrapol®, NP-90, Trycol® 5941, Trycol® 6735 u.ä. Außerdem sind ionische Detergenzen wie etwa Gafac® 560, Natriumdodecylsulfat u.ä. geeignet. Typischerweise sind die Tenside in den wieder aufgelösten Reagenzkugeln in einer Konzentration zwischen ungefähr 0,08 g und ungefähr 3,1 g pro 100 ml vorhanden. Die Tensidkonzentration hängt von den speziellen Reagenzien ab, die in der Untersuchung verwendet werden.
  • Die Füllstoffe und die Tenside, die bei der Herstellung einer speziellen Reagenzkugel verwendet werden, sind vorzugsweise so gewählt, daß sie eine Störung bei der Untersuchung minimieren. Die Optimierung dieser Komponenten wird durch Tabelle 1 erleichtert, die Informationen liefert, die die gewünschten Eigenschaften von Füllstoffen und Tensiden betreffen, die für die Verwendung bei Reagenzien geeignet sind, die in einer Vielzahl von Untersuchungen verwendet werden. Außerdem liefert der nachfolgende Beispielabschnitt die präzisen Konzentrationen der Füllstoff- und Tensidkomponenten, die sich bei den beispielhaft angeführten Untersuchungen als besonders nützlich erwiesen haben.
  • Um Reagenzkugeln mit der richtigen Größe in einer Testvertiefung bereitzustellen, werden die Komponenten typischerweise in der Reagenzkugel konzentriert. Bei der Rehydration mit einem vorgegebenen Volumen der Probe, sind die Reagenzien und die weiteren Komponenten in der richtigen Konzentration vorhanden. Zum Beispiel sind die Komponenten der Reagenzkugeln für alkalische Phosphatbestimmungen typischerweise in ungefähr 6-facher Konzentration und Gesamtprotein-Reagenzien sind in der ungefähr 2,7-fachen Konzentration. Die ideale Konzentration der Reagenzien für eine bestimmte Untersuchung kann in Abhängigkeit von der Größe der Testvertiefung, des Probenvolumens u. ä. einfach bestimmt werden.
  • Figure 00110001
  • Wie oben erläutert worden ist, werden Verdünnungen typischerweise bei Untersuchungen biologischer Proben verwendet. Verdünnungen zur Verwendung bei Proben, die intakte Zellen enthalten, wie etwa Vollblut, müssen isotone Konzentrationen von Verbindungen enthalten, die die Zellen gegen den osmotischen Schock schützen. Die Anwesenheit von isotonen Verbindungen in der Verdünnung darf jedoch im wesentlichen keinen Einfluß auf die Ergebnisse der Untersuchung haben. Eine isotone Verbindung hat im wesentlichen keinen Einfluß auf eine Untersuchung, wenn seine Anwesenheit zu einer Veränderung der Ergebnisse einer quantitativen Untersuchung von weniger als ungefähr 5 %, vorzugsweise weniger als ungefähr 2,5 %, und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 1 % führt. Insbesondere sollte eine zusätzliche Pufferkapazität, die durch die isotonen Verbindungen geschaffen wird, minimiert sein. Die vorliegende Erfindung schafft verbesserte Verdünnungen, die isotone Konzentrationen von Verbindungen enthalten, die die Untersuchungen nicht stören. Dies wird beispielsweise durch das Wählen von Salzen schwacher Säuren realisiert, die pKa-Werte außerdem des pH-Bereichs der jeweiligen Untersuchung haben. Ein bevorzugtes Salz einer schwachen Säure für diesen Zweck ist Tetramethylammoniumacetat bei einer Konzentration von ungefähr 120 bis ungefähr 150 mM. Weitere geeignete Verbindungen enthalten Myo-Inosit, ein Polyalkohol, der keine Pufferkapazität besitzt, bei Konzentrationen von ungefähr 2 % bis ungefähr 3 %.
  • Die Verdünnungen der vorliegenden Erfindung können außerdem Markierungsverbindungen enthalten, die es dem Benutzer ermöglichen, schnell und einfach die Verdünnung an Ort und Stelle zu bestimmen. Die Markierungsverbindungen der vorliegenden Erfindung sind typischerweise photometrisch erkennbare Verbindungen, die der Verdünnung in vorgegebenen oder meßbaren Mengen zugegeben werden. Nach dem Mischen der Verdünnung mit der Probe wird die Konzentration der Markierung photometrisch bestimmt. Dies kann beispielsweise durch Vergleichen der Absorbierung der verdünnten Probe bei einer geeigneten Wellenlänge mit Standardlösungen von bekannter Konzentration erfolgen. Das Verhältnis der Konzentrationen der Markierung vor und nach dem Mischen kann dann verwendet werden, um den Verdünnungsgrad der Probe zu bestimmen. Es können zahlreiche photometrisch erkennbare Markierungsverbindungen verwendet werden. Es können außerdem Verbindungen verwendet werden, die zu einer photometrisch erkennbaren Farbreaktion benutzt werden können. Idealerweise absorbieren die Markierungsverbindungen keine der Wellenlängen, die in irgend einer der Analysen verwendet werden oder verursachen keine Störung bei irgendeiner der nachfolgenden Untersuchungen, die an der Probe durchgeführt werden. Es werden typischerweise Farbstoffe wie etwa 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyaninjodid oder 1,1'-Di(Sulfoalkyl)-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyaninsalze verwendet. Geeignete Markierungsverbindungen, die in photometrisch erkennbare Verbindungen umgewandelt werden, enthalten normalerweise in der Probe nicht vorhandene Enzymsubstrate, wie etwa p-Nitrophenylphosphat oder D-Lactat. Die Verbindung p-Nitrophenylphosphat ist ein Substrat für alkalische Phosphate und erzielt ein farbiges p-Nitrophenol-Reaktionsprodukt. D-Lactat ist ein Substrat für D-Lactat-Dehydrogenase und erzeugt, wenn es mit NAD verwendet wird, das farbige NADH-Reaktionsprodukt. Weitere mögliche Markierungen, die für die Verwendung in der Verdünnung geeignet sind, enthalten selbst Enzyme, wenn sie mit eine Farbe erzeugenden Substraten verwendet werden, die entweder im Plasma oder in der Reaktionskammer vorhanden sind. Die Enzyme sollten normalerweise in der Probe nicht vorhanden sein. Bei Proben menschlichen Ursprungs enthalten die typischen Enzyme mikrobielle Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und D-Lactat-Dehydrogenase. Es ist klar, daß die Markierung vorzugsweise so gewählt wird, daß Störungen mit allen nachfolgend an der Probe durchgeführten Untersuchungen minimiert werden. In Fällen, wo die Markierungsverbindung instabil ist und eine langfristige Lagerung der Verdünnung nicht möglich ist, kann die Markierung oder ihr Zwischenstoff in trockenem Zustand aufbewahrt werden und kurz vor oder zum Zeitpunkt seiner Verwendung aufgelöst werden. Ein solches Beispiel ist 1,1'-Di(Sulfoalkyl)-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyaninsalz, das sich nach der Auflösung in wäßrigen Lösungen zusammenballt. Um diese Probleme zu vermeiden, werden die Indocyanin-Farben und weitere instabile Farben, die auf eine feste Oberfläche aufgebracht werden, typischerweise in trockener Form aufbewahrt. Die feste Oberfläche kann beispielsweise die Wand eines Durchlasses, eines Kapillargefäßes oder einer Kammer im analytischen Rotor oder eines inerten Trägers wie etwa einer Polystyrolkugel sein. Die Oberfläche, die die adsorbierte Farbe enthält, kann im analytischen Rotor in jedem Durchlaß oder jeder Kammer angeordnet sein, beispielsweise in einem Durchlaß zwischen der Verdünnungskammer und der Mischkammer oder in der Mischkammer. Eine geeignete isotone Verdünnungslösung löst nachfolgend die Farbe zum Zeitpunkt ihrer Verwendung aus der Oberfläche. Die wäßrige Verdünnung wird gemäß der speziell verwendeten Farbe gewählt. Für Indocyanin- Farben ist 2,5 % Myo-Inosit geeignet.
  • Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung von Reagenzkugeln für spezielle Untersuchungen. Diese Beispiele dienen der Erläuterung und nicht zur Einschränkung.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Reagenzkugeln für die Gesamtproteinbestimmung
  • Die nachfolgende Lösung wurde durch genaues Abwiegen und Auflösen folgender Chemikalien in einem Behälter mit ungefähr 800 ml deionisiertem und destilliertem Wasser hergestellt:
    Natriumkaliumtartrat 37,80 g
    Natriumhydroxidpellets 28,20 g
    Kupfer(II)sulfat 12,00 g
    Kaliumjodid 12,90 g
    Natriumcarbonat 3,85 g
    Natriumcholat 5,00 g
    Polyoxyethylen-9-laurylether 1,43 g
    Polyethylenglykol (FW 3400) 50,00 g
    Polyethylenglykol (FW 8000) 40,00 g
    Polyethylenglykol (FW 20.000) 5,00 g
  • Es ist am besten, jede Chemikalie vor dem Zufügen der nächsten Chemikalie vollständig aufzulösen. Nachdem die letzte Chemikalie aufgelöst wurde, wurde das Lösungsvolumen mit deionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1 Liter eingestellt. Die Lösung wurde durch einen Medienblock mit einer Endporosität von 0,45 μm gefiltert. Die Lösung wurde nachfolgend unter Verwendung einer Unterdruckpumpe entgast. Wenn 37 ml mit 63 ml Wasser verdünnt werden, wird die obige Lösung verwendet, um die Gesamtproteinkonzentration in verschiedenen klinischen Proben, wie etwa Serum oder Plasma, zu untersuchen. Das Natriumcarbonat wird als Stabilisator zugefügt und Polyoxyethylen-9-laurylether wird zur Steuerung der Blasen während der Auflösung zugefügt. Natriumcholat und verschiedene Polyethylenglykole werden als Füllstoffe zugefügt, um die Bildung eines chemischen Gitters während des nachfolgenden Gefriertrocknens zu erleichtern.
  • Die Lösung wurde durch eine IVEK Pumpe, Modell AAA in einzelnen Tropfen von 2,96 Mikrolitern bei einer Rate von 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde abgegeben. Die einzelnen Flüssigkeitsmengen tropfen durch die Luft, bilden Kugeln und landen auf der Oberfläche von flüssigem Stickstoff. Die Oberfläche des Stickstoffs muß nicht umgerührt werden. Nach dem Gefrieren wurden die Tropfen in einem Virtis-Gefriertrockner (Modell Nr. 12EL console) (Gardener, N.Y.) getrocknet, bis ihre Restfeuchtigkeit weniger als 11 % der verbleibenden Gesamtmasse betrug.
  • Eine gefriergetrocknete Reagenzkugel, die gemäß dem obenerwähnten Verfahren hergestellt ist, kann mit 8 Mikrolitern einer Mischung aus Wasser oder Verdünner (14 Teile) und menschlichem Serum (1 Teil) wieder aufgelöst werden. Die sich ergebende Veränderung der Absorption bei 550 nm minus die Absorption einer Reagenzkugel, die mit 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünnung wieder aufgelöst ist, und minus die Absorption der menschlichen Serumprobe, die im gleichen Verhältnis mit Wasser plus Polyethylen-9-laurylether und Natriumcholat verdünnt ist, ist zur Menge des Gesamtproteins in der Probe proportional.
  • Die Ungenauigkeit (Schwankungskoeffizient) zwischen den Kugeln mit 1,78 Millimetern Durchmesser beträgt:
    abgegebene gefrorene Kugeln 1,5 % bei 3,7 mg
    gefriergetrocknete Kugeln 2,5 % bei 0,6 mg
  • Jede Reagenzkugel löst sich in einem Zentrifugalanalysator in 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünner innerhalb von 5 Sekunden auf.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von Reagenzkugeln für die Bestimmung von C-reaktionsfähigem Protein
  • Die nachfolgende Lösung wurde durch genaues Messen, Abwiegen und Auflösen folgender Chemikalien in einem Behälter mit ungefähr 200 ml deionisiertem Wasser hergestellt:
    C-reaktionsfähige Protein-Antikörper 0,56 Liter
    Natriumchlorid 25,50 g
    HEPES 71,50 g
    TRITON® X-100 3,00 g
    Polyethylenglykol 84,00 g
  • Es ist am besten, jede Chemikalie vor dem Zufügen der nächsten Chemikalie vollständig aufzulösen. Nachdem die letzte Chemikalie aufgelöst wurde, wurde der pH-Wert mit verdünntem Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt und das Volumen wurde mit deionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1,0 Liter eingestellt. Die Lösung wurde durch einen Medienblock mit einer Endporosität von 0,2 μm gefiltert. Nachfolgend wurde die Lösung entgast.
  • Wenn 33 ml mit 67 ml Wasser oder Verdünnung verdünnt werden, wird die obige Lösung verwendet, um C-reaktionsfähiges Protein in verschiedenen klinischen Proben, wie etwa Serum oder Plasma, zu untersuchen. Das Natriumchlorid wird als Stabilisator zugefügt, und TRITON® X-100 wird zugefügt, um die Blasen während der Auflösung zu steuern. Polyethylenglykol wird zugefügt, um die Entwicklung der Trübung in der analytischen Reaktion zu erleichtern sowie als Füllstoff, um die Bildung eines chemischen Gitters während des nachfolgenden Gefriertrocknens zu erleichtern.
  • Die Lösung wurde durch eine IVEK Pumpe, Modell AAA in einzelnen Tropfen von 2,67 Mikrolitern bei einer Rate von 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde abgegeben. Die einzelnen Flüssigkeitsmengen tropfen durch die Luft, bilden Kugeln und landen auf der Oberfläche von flüssigem Stickstoff. Die Oberfläche des Stickstoffs muß nicht umgerührt werden. Nach dem Gefrieren wurden die Tropfen in einem Virtis-Gefriertrockner (Modell Nr. 12EL console) getrocknet, bis ihre Restfeuchtigkeit weniger als 6 % der verbleibenden Gesamtmasse betrug.
  • Eine gefriergetrocknete Reagenzkugel, die gemäß dem obenerwähnten Verfahren hergestellt ist, kann mit 8 Mikrolitern einer Mischung aus Wasser oder Verdünner (14 Teile) und menschlichem Serum (1 Teil) wieder aufgelöst werden. Die sich ergebende Veränderung der Absorption bei 340 nm minus die Absorption einer Reagenzkugel, die mit 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünnung wieder aufgelöst wurde, und minus die Absorption der menschlichen Serumprobe, die im gleichen Verhältnis mit Wasser plus TRITON® X-100 verdünnt wurde, ist zur Menge des C-reaktionsfähigen Proteins in der Probe proportional.
  • Die Ungenauigkeit (Schwankungskoeffizient) zwischen den Kugeln mit 1,72 Millimetern Durchmesser beträgt:
    abgegebene gefrorene Kugeln 1,5 % bei 3,7 mg
    gefriergetrocknete Kugeln 2,5 % bei 0,6 mg
  • Jede Reagenzkugel löst sich in einem Zentrifugalanalysator in 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünner innerhalb von 3 Sekunden auf.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Reagenzkugeln für die Bestimmung von alkalischer Phosphatase (ALP)
  • Die folgenden Lösungen wurden hergestellt. ALP Teil A:
    Die folgenden Chemikalien wurden genau gemessen, gewogen und in einem Behälter mit ungefähr 800 ml deionisiertem oder destilliertem Wasser aufgelöst:
    Tri(hydroxymethyl)aminomethan-HCl 10,2 g
    HEDTA 2,1 g
    Magnesiumchlorid-Hexahydrat 2,6 g
    Zinksulfat-Heptahydrat 1,7 g
    4-Nitrophenylphosphat 35,6 g
    Polyethylenglykol (FW 20.000) 54,0 g
    Myo-Inosit 10,0 g
    TRITON® X-100 0,8 g
    Glycerin 6,0 g
    Polyvinylpyrrolidon (FW 30.000) 1,0 g
  • Es ist am besten, jede Chemikalie vor dem Zufügen der nächsten Chemikalie vollständig aufzulösen. Nachdem die letzte Chemikalie aufgelöst wurde, wurde der pH-Wert mit verdünntem 2-Amino-2-methyl-1-propanol auf 6,8 eingestellt, und das Lösungsvolumen wurde mit deionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1,0 Liter eingestellt. Die Lösung wurde durch einen Medienblock mit einer Endporosität von 0,2 μm gefiltert. Nachfolgend wurde die Lösung entgast.
  • ALP Teil B: Die folgenden Chemikalien wurden genau gemessen, gewogen und in einem Behälter mit ungefähr 800 ml deionisiertem oder destilliertem Wasser aufgelöst.
    Tri(hydroxymethyl)aminomethan-HCl 10,2 g
    Tri(hydroxymethyl)aminomethan 166,0 g
    HEDTA 2,1 g
    Polyethylenglykol (FW 20.000) 54,0 g
    Myo-Inosit 10,0 g
    TRITON® X-100 0,8 g
    2-Amino-2-methyl-1-propanol 53,4 g
    Polyvinylpyrrolidon (FW 30.000) 1,0 g
  • Es ist am besten, jede Chemikalie vor dem Zufügen der nächsten Chemikalie vollständig aufzulösen. Nachdem die letzte Chemikalie aufgelöst wurde, wurde der pH-Wert mit verdünntem 2-Amino-2-methyl-1-propanol auf 10,3 eingestellt, und das Lösungsvolumen wurde mit deionisiertem oder destilliertem Wasser auf 1,0 Liter gebracht. Die Lösung wurde durch einen Medienblock mit einer Endporosität von 0,2 μm gefiltert. Nachfolgend wurde die Lösung entgast.
  • Wenn die obigen Lösungen in gleichen Volumen von jeweils 16,7 ml mit 67 ml Wasser oder Verdünnung kombiniert werden, werden sie verwendet, um alkalische Phosphatase in verschiedenen klinischen Proben, wie etwa Serum oder Plasma, zu untersuchen. Das Glycerin wird als Stabilisator zugefügt, TRITON® X-100 wird zugefügt, um die Blasen während der Auflösung zu steuern. Polyethylenglykol, Myo-Inosit und Polyvinylpyrrolidon werden als Füllstoffe zugefügt, um die Bildung eines chemischen Gitters während des nachfolgenden Gefriertrocknens zu erleichtern.
  • Die Lösungen wurden separat durch eine IVEK Pumpe, Modell AAA in einzelnen Tropfen von 2,67 Mikrolitern bei einer Rate von 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde abgegeben. Die einzelnen Flüssigkeitsmengen tropfen durch die Luft, bilden Kugeln und landen auf der Oberfläche von flüssigem Stickstoff. Die Oberfläche des Stickstoffs muß nicht umgerührt werden. Nach dem Gefrieren wurden die Tropfen in einem Virtis-Gefriertrockner (Modell Nr. 12EL console) getrocknet, bis ihre Restfeuchtigkeit weniger als 6 % der verbleibenden Gesamtmasse betrug.
  • Gefriergetrocknete Reagenzkugeln, jeweils eine aus ALP A und ALP B, können in 16 Mikrolitern einer Mischung aus Wasser oder Verdünner (14 Teile) und menschlichem Serum (1 Teil) wieder aufgelöst werden. Die sich ergebende Veränderungsrate der Absorption bei 405 nm ist zur Menge der alkalischen Phosphatase in der Probe proportional.
  • Die Ungenauigkeit (Schwankungskoeffizient) zwischen den Kugeln mit 1,72 Millimetern Durchmesser beträgt:
    ALP A ALP B
    abgegebene gefrorene Kugeln 0,4 % bei 2,8 mg 0,7 % bei 2,9 mg
    gefriergetrocknete Kugeln 1,5 % bei 0,5 mg 2,2 % bei 0,7 mg
  • Die zwei Reagenzkugeln lösen sich in einem Zentrifugalanalysator in 16 Mikrolitern Wasser oder Verdünnung innerhalb von 10 Sekunden auf. Die bei dieser Untersuchung aktiven Bestandteile werden getrennt, um die Reagenzstabilität zu verbessern. Für die ALP-Untersuchung werden jeweils eine von den Kugeln in der gleichen Kammer plaziert.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von gefriergetrocknetem konzentriertem Kaliumreagenz, das für die Kaliumbestimmung makrozyklisches ionophores Trinitroanilincryptohemispherand 12.21 enthält
  • Das aktive Trinitroanilincryptohemispherand [2.2] und die Tenside (Brij® Tenside) wurden wie folgt aus CromoLyteTM Kaliumreagenz (Technicon Instruments Corp., Tarrytown, NY 10961) unter Verwendung des 40 μM chromatographischen Mediums Wide-Pore Butyl (großporiges Butyl) (J. T. Baker Inc., Phillipsburg, NY 08865) isoliert:
    25 g des 40 μM chromatographischen Mediums Wide-Pore Butyl wurden in 360 ml entgastes Isopropanol gegeben und nachfolgend wurden 360 ml entgastes ionisiertes Wasser zugefügt. Ungefähr 80 % der Flüssigkeit wurden dekantiert. Eine zusätzliche Menge von 360 ml entgastem ionisiertem Wasser wurde zugefügt, und der Schlamm im Kolben wurde für zwei Minuten mit Schall behandelt, worauf zwei Minuten Vakuumentgasung folgten. Das zugegebene chromatographische Medium wurde in eine chromatographische Säule geeigneter Größe gegossen, um eine 3-10 cm hohe Ablagerung zu bilden. Die Ablagerung wurde durch das Durchgießen von 250 ml entgastes ionisiertes Wasser durch die Säule ausgeglichen.
  • Der Säule wurden fünf Liter CromoLyteTM Kaliumreagenz zugegeben. Das farbige Trinitroanilincryptohemispherand [2.2] und die Tenside wurden am oberen Ende der Säule absorbiert. Der nicht absorbierte Triethanolamin-Pufferstoff, der außerdem 3 % 2-(2-Ethoxyethoxy)ethanol (EEE) und Stabilisatoren enthielt, wurde gesammelt und für einen späteren Gebrauch aufgehoben. Das Trinitroanilincryptohemispherand [2.2] und die Tenside wurden mit einer Mischung aus zuvor entgastem Isopropanol (98 %) und EEE (2 %) aus der Säule gelöst. Das Isopropanol wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung eines evakuierten Rotationsverdampfers aus dem Eluat entfernt, um ein öliges, dunkelbraunes Konzentrat zu gewinnen.
  • Die zuvor gesammelte Pufferfreaktion wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 35-40 °C zweifach konzentriert. Das Trinitroanilincryptohemispherand [2.2], die Tenside und das verbleibende EEE wurden in 400 ml der zweifach konzentrierten Pufferlösung aufgelöst.
  • Die folgenden Stoffe wurden gemessen, zugefügt und in der obigen Lösung aufgelöst:
    Polyethylenglykol (FW 3400) 40 g
    Isopropanol 5,0 ml
    Polyvinylpyrrolidon K-29-32 0,50 g
  • Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung eines Elektrodenpaars mit einer Calomel-Bezugselektrode gemessen, wobei festgestellt wurde, daß der pH-Wert um weniger als 0,05 pH-Einheiten von dem pH-Wert des Ausgangs-CromoLyteTM Kaliumreagenz verschieden war. Bei Bedarf wurde eine Einstellung des pH-Werts mit einer 20 %-igen Triethanolamin-Lösung oder einer 20 %-igen Triethanolamin-HCl-Lösung durchgeführt. Schließlich wurde das Volumen mit der zweifach konzentrierten Pufferlösung auf 500 ml eingestellt. Das Reagenz wurde durch einen Medienblock mit einer Endporosität von 0,2 μm gefiltert. Die bevorzugte Konzentration des 2-(2-Ethoxyethoxy)ethanols liegt zwischen ungefähr 3 % und ungefähr 4,8 % und die des Polyethoxylaurylethers liegt zwischen ungefähr 0,5 und ungefähr 1,0 %.
  • Wenn 50 ml mit 50 ml Wasser oder Verdünner verdünnt wurden, wird die obige Lösung verwendet, um Kalium in verschiedenen klinischen Proben, wie etwa Serum oder Plasma, zu untersuchen. Der Anteil des 2-(2- Ethoxyethoxy)ethanols ist notwendig, um während des Gefriervorgangs ein gleichmäßiges Gefrieren des Reagenz zu gewährleisten und nach dem Gefriertrocknen beim schnellen Wiederauflösen zu helfen. Das Isopropanol hilft bei der Erzeugung der korrekten Kristallstruktur während des Gefriervorgangs, so daß die Rehydration vereinfacht ist. Das Brij® Tensid (z. B. Brij® –35 oder –38) hilft bei der Rehydration und der Verhinderung von Blasen. Das Polyethylenglykol wird zugefügt, um die Bildung eines chemischen Gitters während des nachfolgenden Gefriertrocknens zu erleichtern.
  • Die Lösung wurde durch eine IVEK Pumpe, Modell AAA in einzelnen Tropfen von 4,0 Mikrolitern bei einer Rate von 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde abgegeben. Die einzelnen Flüssigkeitsmengen tropfen durch die Luft, bilden Kugeln und wurden in einem Virtis-Gefriertrockner (Modell Nr. 12EL console) getrocknet, bis ihre Restfeuchtigkeit weniger als 6 % der verbleibenden Gesamtmasse betrug. Eine gefriergetrocknete Reagenzkugel, die gemäß des obigen Verfahrens hergestellt wird, kann mit 8 Mikrolitern einer Mischung aus Wasser oder Verdünnung (14 Teile) und menschlichem Serum (1 Teil) wieder aufgelöst werden. Die sich ergebende Veränderung der Absorption bei 500 nm minus die Absorption einer Reagenzkugel, die mit 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünner wieder aufgelöst wurde, und minus die Absorption der menschlichen Serumprobe, die im gleichen Verhältnis von Wasser plus Brij® Tensid verdünnt wurde, ist zur Kaliummenge in der Probe proportional.
  • Die Ungenauigkeit (Schwankungskoeffizient) zwischen den Kugeln mit 1,97 Millimetern Durchmesser beträgt:
    abgegebene gefrorene Kugeln 1,5 % bei 2,6 mg
    gefriergetrocknete Kugeln 1,6 % bei 0,5 mg
  • Jede Reagenzkugel löst sich in 8 Mikrolitern Wasser oder Verdünner innerhalb von 5 Sekunden auf.
  • Die obigen Beispiele erläutern die Herstellung von speziellen Reagenzkugeln im Umfang der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen für die Zwecke der Klarheit sowie dem Verständnis der Erfindung.

Claims (5)

  1. Verfahren zum Bilden einer Vielzahl von Reagenzkugeln, die Reagenzien zum Analysieren einer biologischen Probe enthalten und in einer wäßrigen Lösung vollständig gelöst werden können, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: Bilden einer wäßrigen, homogenen Lösung der Reagenzien; Abgeben einzelner, gleichmäßiger, präzise bemessener Tropfen der wäßrigen Lösung mit einem Volumen zwischen ungefähr 2,5 μl und ungefähr 4,0 μl in eine Kryoflüssigkeit, die nicht umgerührt wird, wodurch die Tropfen gefrieren; und Lyophilisieren der gefrorenen Tropfen, wodurch Reagenzbereiche mit einem Gewichtsschwankungskoeffizienten von weniger als ungefähr 3 % gebildet werden.
  2. Eine Vielzahl von im wesentlichen gleichmäßigen, präzise bemessenen Reagenzkugeln, die nach Anspruch 1 hergestellt sind, wobei die Kugeln sich in weniger als etwa zehn Sekunden in einer wäßrigen Lösung vollständig auflösen können.
  3. Eine Vielzahl von im wesentlichen gleichmäßigen, präzise bemessenen Reagenzkugeln, die nach Anspruch 1 hergestellt sind, wobei die Kugeln sich in weniger als etwa zehn Sekunden in einer wäßrigen Lösung auflösen können, wobei die Reagenzkugeln Reagenzien, die für die Analyse einer biologischen Probe notwendig sind, ein Tensid in einer Konzentration, die ausreicht, um Blasenbildung zu verhindern, wenn sich die Kugeln auflösen, sowie einen Füllstoff in einer Konzentration, die ausreicht, um die Bildung eines chemischen Gitters zu erleichtern, das die Lösung in die Reagenzkugeln leiten kann, enthalten.
  4. Reagenzkugel nach Anspruch 3, die sich in weniger als etwa 20 μl Lösung vollständig auflösen kann.
  5. Verfahren zum optischen Analysieren eines biologischen Fluids, wobei das Verfahren umfaßt: Zuführen eines vorgegebenen Volumens des biologischen Fluids in eine Testvertiefung, die eine der Vielzahl von Reagenzkugeln nach den Ansprüchen 2, 3 oder 4 enthält, wobei die Reagenzkugel die Reagenzien zur Analyse der Probe enthält und im Fluid vollständig aufgelöst wird; Senden eines Lichtstrahls durch das in der Testvertiefung befindliche Fluid; und Erfassen des Lichtstrahls, nachdem er durch das Fluid hindurchgegangen ist.
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