DE69917779T2

DE69917779T2 - Zytologische und histologische fixier-zusammensetzung und verfahren zur verwendung

Info

Publication number: DE69917779T2
Application number: DE69917779T
Authority: DE
Inventors: A. Raouf GUIRGUIS; Marianna El-Amin
Original assignee: Lamina Inc
Current assignee: Lamina Inc
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: US20020094577A1; KR100860653B1; ATE268470T1; AU4847199A; CA2335747A1; US6531317B2; MXPA01000215A; EP1092141A1; EP1092141B1; KR20010071636A; CN1310797A; JP3718430B2; WO2000000813A1; DE69917779D1; CN1144034C; JP2002519666A; AU740441B2

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Fixiermittelzusammensetzung und die Verwendung der Fixiermittelzusammensetzung in zytologischen und anderen Verfahren. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von teilchenförmiger Materie, wie Zytologie-, Hämatologie- und Mikrobiologie-Proben für zytologische oder histologische Prüfung unter Sammeln einer Probe von teilchenförmigen Materie in einer gleichmäßigen Schicht, vorzugsweise einer Monoschicht, und das Fixieren der Teilchen in einer Zusammensetzung, wie beschrieben.
In einer großen Vielzahl von Technologien ist die Fähigkeit und/oder Leichtigkeit der Abtrennung von Materie, typischerweise teilchenförmiger Materie, von einem Fluid eine kritische Komponente bei der Fähigkeit, hinsichtlich der Gegenwart von Substanzen in dem Fluid zu testen. Zu oft machen Störungen, die mit der Probenherstellung verbunden sind, die Zielzellen unscharf, so daß ein Grad entsteht, der das Verfahren ungenügend zuverlässig oder zu kostspielig macht. Solche Gewebe gehören zu vielen anderen Gebieten, die das Auffinden und/oder die Diagnose mit Testen der Umgebung, Strahlungsuntersuchung, Krebserkennung, zytologische Prüfung, mikrobiologisches Testen und Verunreinigung mit gefährlichen Abfallstoffen, um nur einige zu nennen, einschließen.
Alles, was für eine zytologische Prüfung einer Probe erforderlich ist, ist, daß eine Probe von Zellen von dem Patienten erhalten wird, die typisch mit irgendeiner der Anzahl von bekannten Techniken behandelt werden kann, einschließlich einer der folgenden Techniken: direktes Schaben, Schaben oder Schruppen eines Bereichs (wie im Fall von Halsproben), Bürsten, Sammeln und Konzentrieren einer Fluidprobe mit einer präparativen Standardzentrifuge, Beatmung mit feinen Nadeln oder mit irgendeiner anderen bekannten Methode oder durch Sammeln von Körperflüssigkeiten, wie jene, die man aus dem Brustkasten, der Blase oder dem Rückenmarkskanal bekommt. In einer herkömmlichen manuellen zytologischen Prüfung werden die Zellen in dem Fluid dann auf einen Objektträger aus Glas zur Betrachtung überführt. In einer herkömmlichen automatisierten zytologischen Prüfung wird eine Filteranordnung in die flüssige Suspension gegeben, und die Filteranordnung dispergiert die Zellen und fängt die Zellen auf dem Filter ein, und der Filter wird entfernt und in Berührung mit einem Objektträger eines Mikroskops angeordnet. In allen diesen Fällen ist ein beschränkender Faktor in dem gleichen Herstellungsprotokoll die adäquate Abtrennung von fester Materie von ihrem Fluidträger (zum Beispiel verschiedenen Flüssigkeiten, wie physiologische, biologische und Umweltfluide) sowie ein leichtes und wirksames Sammeln und Konzentrieren der Feststoffmaterie in einer Form, die leicht für die mikroskopische Prüfung zugänglich ist.
Ein anderer beschränkender Faktor bei der optimalen Präparierung der teilchenförmigen Materie für mikroskopische Prüfung schließt ein, daß die Lösung und/oder Lösungen für ein Fixieren der teilchenförmigen Stoffe auf einem Objektträger für ein Mikroskop oder dergleichen geeignet sind.
Eine Anzahl von Urin- oder anderer biologischer Fluidprobenbehälter wurde entwickelt um zu erlauben, daß flüssige biologische Proben ohne Entfernung des Deckels des Urin- oder biologischen Fluidbehälters getestet werden können. Keiner der bekannten Behälter löst das Problem einer Überführung von Zellen in einer gleichmäßigen Schicht auf einen Objektträger zur Prüfung, während gleichzeitig das Fluid bewahrt bleibt, aus welchem die Zellen genommen wurden.
Derzeit werden Körperflüssigkeitsproben für zytologische Prüfungen unter Verwendung spezieller Behälter gesammelt. Diese Behälter enthalten gewöhnlich eine Konservierungsmittellösung zum Konservieren der zytologischen Probe während des Transports von der Sammelstelle zu dem zytologischen Laboratorium. Außerdem werden zytologische Proben aus den Körperhöhlen unter Verwendung eines Wattabauschs, Abstrichs, durch Abspülen oder Bürsten auch in speziellen Behältern mit Fixiermitteln (zum Beispiel Alkohol oder Aceton als Fixative) konserviert, bevor Zellen auf den Objektträger oder eine Membran zum Anfärben oder Prüfen überführt werden.
Diagnostische Mikrobiologie und/oder Zytologie, insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Pathologie, basieren auf Diagnosen bei einer mikroskopischen Prüfung der Zellen und anderen mikroskopischen Analysen. Die Genauigkeit der Diagnose und die Herstellung optimal interpretierbarer Proben hängt typischerweise von einer adäquaten Probenherstellung ab. Neue Methoden, wie Immunozytochemie und Bildanalyse erfordern Herstellungsmethoden, die reproduzierbar, schnell, biologisch gefahrfrei und billig sind. Verschiedene Zellpräparationsmethoden der vorliegenden Erfindung sind auf nicht gleichmäßige Zelldichten, ungleichmäßige Zellverteilung und lufttrocknende Artefakte ausgerichtet. Diese Herstellungsmethoden führten zu einer gleichmäßigen Verteilung der Zellen, die überlegene Morphologie haben, was lichtmikroskopische Visualisierung verbessert und für die Verwendung von Bildzytometrie-Instrumenten erlaubt hat.
Die Herstellungstechniken für die feste Materie, die hier beschrieben werden, richten sich auf ungleichmäßige Materiedichten, ungleichmäßige Verteilung und Probenverlust bei der Verwendung von Bildzytometrie-Instrumenten.
Die Herstellungstechniken mit fester Materie richten sich hier an die Ergebnisse nicht-gleichmäßiger Stoffdichten, ungleichmäßiger Materieverteilung und Probenverlust infolge der Anzahl der in dieser Probenherstellung enthaltenen Stufen. Die Präparationen führen zu einer gleichmäßigen Verteilung von Feststoffen, die eine bessere Morphologie, verbesserte Visualisierung haben und leicht positioniert und für lichtabsorbierende Analyse verfügbar sind, ohne daß es weiterer Manipulation oder Probenherstellung bedarf.
Richtiges Fixieren (d. h. Bewahren) von zytologischem Material, wie Zellen, Zellaggregaten und kleinen Gewebefragmenten, die von zytologischen Sammlungen von menschlichem oder tierischem Gewebe stammen, ist eine Voraussetzung für die genaue Diagnose von Krankheiten, besonders von Krebs. Zytologisches Material muß so bald wie möglich nach Erhalten des Materials fixiert werden, um Zellverformung zu verhindern.
Zytologische Proben, die eine prüfbare Form des zytologischen Materials darstellen, können mit gut verstandenen Abstrich- oder Fließtechniken hergestellt werden. Da es ein beachtliches Verstreichen von Zeit geben kann, bevor diese Proben weiter durch Anfärben, Aufbringung auf einem Objektträger mit Deckglas usw. verarbeitet werden, ist es jedoch wichtig, ein Fixativ auf dem zytologischen Material als Mittel zur Erhaltung und zum Fixieren der Zellen aufzubringen.
Luftgetrocknete und im Vierfarbverfahren angefärbte zytologische Proben sind zwar im Ausland populär, werden aber in den Vereinigten Staaten nicht generell verwendet. Eher ist Naßfixieren eine bekannte Methode zum Fixieren von Zellen entweder durch Eintauchen von Objektträgern in Alkohollösung, durch Sättigung von Objektträgern mit einem Sprühfixativ oder durch direkte Abgabe von zytologischem Material in eine Alkohollösung. Zellfixierung ist eine Voraussetzung für interpretierbares Papanicolaou, Hematoxylin und Eosin oder andere Scheiben von angefärbtem zytologischem Probenmaterial.
Allgemein sind Alkohollösungen mit oder ohne andere Additive, wie Polyethylenglycol im Bereich von 50% bis 95% (v/v: Methanol, Ethanol, Isopropanol) bekannte Lösungen für die Verwendung beim Naßfixieren. Wenn Alkohollösungen stärker als 50% (v/v) zum Sammeln und Fixieren von Flüssigkeiten mit hohem Proteingehalt verwendet werden, bildet sich jedoch ein Proteinsediment, welches anschließend härtet. Proteinsedimentation macht das fixierte zytologische Material schwierig auf Glasobjektträger zur Prüfung zu überführen, unabhängig davon, ob die Überführung durch direkte Aufbringung auf dem Glasobjektträger, durch Zytofiltration durch ein kleinporiges Filter oder durch Zyto-Zentrifugieren auf Glasobjektträgern, die mit einem Klebstoff, wie Chromaluminiumgelatine, beschichtet sind.
Für über ein Jahrhundert basierten Gewebefixiermittelzusammensetzungen, die zum Erhalten und Herstellen von Gewebeproben für analytische Bewertung verwendet wurden, auf Formaldehyd. Die Standardzusammensetzung, die für Gewebebewahrung und die Herstellung von Dünnschnittgewebe für mikroskopische Prüfung verwendet wird, ist Formalin. Formalin ist eine 3- bis 10-prozentige Lösung von Formaldehyd in Wasser, gewöhnlich mit einem Gehalt von etwa 15 Prozent Methylalkohol. Alkohol verbessert die erhaltenden Eigenschaften der Lösung. Trotz zahlreicher Nachteile, am bemerkenswertesten die hohe Toxizität und die Reizeigenschaften, bleibt Formalin das Fixativ der Wahl in typischen Laboratoriumsanwendung wegen seiner schnellen Reaktion mit ihm ausgesetzten Gewebeoberflächen und folglich maximierter Zellerhaltung. Methanol kann nachteilig auf die Textur des Gewebes wirken, es zu brüchig machen oder noch üblicher, zu weich für leichtes Schneiden zu Präparaten auf Objektträgers. Es kann auch pigmentierte Artefakte oder Verunreinigungen erzeugen, die das Anfärben stören. Formalin, das Methanol enthält, liefert nichtsdestoweniger haltbare Gewebe, die zufriedenstellend geschnitten und für mikroskopische Prüfung angefärbt werden können.
Die EP-0 743 519 A beschreibt eine Reagenzzusammensetzung, die ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ein ionisches oberflächenaktives Mittel, Formaldehyd oder Paraformaldehyd und einen Zucker oder Zuckeralkohol umfaßt. Die US-4,801,549 beschreibt eine Reagenzläsung, die Formaldehyd oder Paraformaldehyd, einen Zucker oder Zuckeralkohol und einen Puffer umfaßt. Die US-4,978,624 beschreibt eine Reagenzlösung, die Formaldehyd oder Paraformaldehyd, einen Zucker oder Zuckeralkohol und einen Puffer umfaßt. Die Reagenzlösungen sind geeignet für die Verwendung bei der Herstellung einer Blutprobe für die Bestimmung einer unterschiedlichen Auszählung weißer Blutzellen.
Histologen haben seit langem sich eifrig bemüht, wirksame immunohistochemische Fixative und morphologische Fixative zu entwickeln. Außerdem ist es erwünscht, morphologisches Detail erhaltende Antigengewebe zu bewahren, um ein immunohistochemisches Ermitteln und Lokalisieren von Antigenen in Gewebe zu gestatten.
Solche Fixative machen Protein unlöslich. Beispielsweise kann Formaldehyd als Vernetzungsmittel verwendet werden, das kovalente Bindungen zwischen den Aldehydgruppen und speziellen Aminosäuren bildet, um die Proteinstruktur zu stabilisieren und das Zellzytoplasma in ein Gel umzuwandeln, welches eine Bewegung autolytischer Enzyme verbietet. Alternativ kann Alkohol als ein Fixiermittel zur Ausfällung von Protein durch Denaturierung verwendet werden.
Vorzugsweise sollte ein Fixiermittel die Autolyse und Verwesung verlangsamen und morphologische Details und Antigenizität bewahren. Leider ist ein wirksames morphologisches Fixativ nicht notwendigerweise auch ein wirksames immunohistochemisches Fixativ.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Fixiermittelzusammensetzung und ein Verfahren zum Bewahren einer zytologischen, hämatologischen, mikrobiologischen oder histologischen Probe. Die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet für die Abtrennung von Materie von biologischen, physiologischen und Umweltfluiden und die Darstellung der feinteiligen Materie in einer für die Prüfung verbesserten Weise.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein zytologisches und histologisches Fixiermittel gerichtet, das einen Aldehydvernetzer, ein Polyol, ein Detergens und ein mukolytisches Mittel enthält. Die Aldehyd zusammensetzung ist typischerweise ein C₁-C₆-Alkanal oder ein C₁–C₈-Alkylendialdehyd, wie Glutaraldehyd, Formaldehyd, Paraformaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd. Das Polyol der Zusammensetzung kann typischerweise Ethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Sorbit und Mannit sein. Das bevorzugte Detergens ist ein nicht-ionisches Detergens, wie Triton X-100, Nonidet P-40, Igepal CA-630, Tween^® 85, Tween^® 80 oder Tween^® 65.
Die Fixativzusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann weiterhin einen der folgenden Stoffe enthalten: einen Puffer, der die Lösung auf einem pH-Wert zwischen etwa 4 und etwa 7 hält, wie Tris- oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, einen Nukleoproteinausfäller, wie Essigsäure, ein hämolytisches Mittel, wie Essigsäure, ein Osmolarität-haltendes Mittel, wie Dextrose oder Natriumchlorid, ein Lösungsmittel, wie Ethanol, Isopropanol, Methanol und Wasser, ein Keton, wie Aceton oder Methylethylketon, eine zellbeschichtende Substanz, wie Polyethylenglycol (PEG) oder Carbowachs, ein mukolytisches Mittel, wie Dithiothreitol (DTT) oder Acetylcystein.
Die Fixiermittelzusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise eine Aldehydkonzentration von etwa 0,2 bis 0,4%, eine Glycerinkonzentration von etwa 0,5 bis etwa 2,0% und eine Detergenskonzentration von etwa 0,01 bis 0,05%. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Alkohol in einer Konzentration von etwa 35 bis etwa 45%, Aceton mit einer Konzentration von etwa 2,0 bis 3,0%, Polyethylenglycol mit einer Konzentration von etwa 1,0 bis 3,0% und/oder einen Puffer enthalten.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zur Erhaltung einer zytologischen, hämatologischen, mikrobiologischen oder histologischen Probe durch Fixieren der Probe mit einer wirksamen Menge der Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung gerichtet.
Die Gewebe-Fixativzusammensetzung ist geeignet für die Verwendung in histopathologischen Anwendungen und durchdringt schnell Gewebeoberflächen für maximale zellförmige Bewahrung, hinterläßt minimale pigmentierte Artefakte und gestattet ein genaues Anfärben. Die zytologische und histologische Fixativ-Formulierung fixiert und bewahrt Zellen, Zellaggregate und kleine Gewebefragmente in einer flüssigen Suspension.
Die Fixativ-Formulierung bewahrt weiterhin Gewebeproben, die anfangs zusammen mit zytologischem Material für weitere histologische Verarbeitung gesammelt wurden.
Die Fixiermittelformulierung erlaubt einen Transport der flüssigen Suspension von Zellen, Zellaggregaten und Gewebefragmenten unter Bedingungen, die typischerweise mit Postbeförderung verbunden sind und erlaubt entfernten Benutzern ohne verfügbare Zytologen, Zytotechnologen, Ärten oder anderem Personal, das bei der Herstellung zytologischer Proben erfahren ist, eine zytologische Probe für spätere Verarbeitung zu fixieren und dabei technisch zufriedenstellende zytologische Proben auf Objektträgern damit zu produzieren.
Wir beschreiben weiter ein Verfahren zur Herstellung von Gewebe zum Schneiden, Anfärben und/oder mikroskopischen Bewerten, wobei das Probengewebe vor der Entwässerung einer Präservierung mit einer lagerbeständigen Gewebefixativlösung nach der vorliegenden Erfindung unterzogen wird.
Eine einzigartige zytologische und histologische Fixiermittelformulierung und Methoden zur Verwendung jener Formulierung sind beschrieben. Die Formulierung fixiert und bewahrt die einzelnen Zellen, Zellaggregate und kleine Gewebefragmente in einer flüssigen Suspension, minimiert Protein-Ausfällung in der flüssigen Suspension, eliminiert oder reduziert selektiv rote Blutzellenverunreinigung von zytologischem Material und zytologischen Proben-Objektträgern, hält Gewebeproben zurück, die zufällig zusammen mit zytologischem Material für weitere histologische Verarbeitung gesammelt wurden, und gestattet einen Transport von zytologischem Material unter typischen Postbeförderungsbedingungen, erlaubt entfernte Benutzung ohne verfügbare Zytologen, Zytotechnikern oder anderem erfahrenem Personal bei der Herstellung zytologischer Proben, technisch zufriedenstellende zytologische Proben-Objektträger zu haben.
Eine Zusammensetzung nach der Erfindung kann vorzugsweise ein oder mehrere Lösungsmittel einschließen, vorzugsweise ein Alkanol, zwischen etwa 35 und etwa 45 Volumenprozent, Keton zwischen etwa 2 und etwa drei Volumenprozent, ein Verdünnungsmittel, vorzugsweise ein Diol oder Triol, etwa 1 bis etwa 3 Volumenprozent, einen Vernetzer, vorzugsweise einen Aldehyd, etwa 0,2 bis etwa 4 Volumenprozent, Glycerin etwa 0,5 bis etwa 2 Volumenprozent, einen oder mehrere Detergenzien und/oder Dispergiermittel, vorzugsweise nicht-ionische, etwa 0,01 bis etwa 0,05 Volumenprozent, und einen Puffer, etwa 45 bis etwa 65 Volumenprozent. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt der pH-Wert der Zusammensetzung zwischen etwa 4 und etwa 7.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung einer Fixiermittelzusammensetzung, wie oben beschrieben, in zytologischen, hämatologischen, mikrobiologischen und/oder histologischen Verfahren ein. Die Fixativzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist besonders geeignet für die Verwendung mit einer teilchenförmigen Ansammlung, die aus der US-Patentschrift 5,471,994, der US-Patentschrift 5,301,685, der US-Anmeldung Serien-Nummer (USSN) 08/905,833, angemeldet am 4. August 1997, der USSN 08/963,873, eingereicht am 4. November 1997, der USSN 09/042,005, eingereicht am 13. März 1998, der USSN 09/053,010, angemeldet am 1. April 1998, der USSN 08/963,873, der PCT/US98/16349, der U SSN 09/050,010, der PCT/US98/18524, de er USSN 09/185,606 und der PCT/US98/23222.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung zytologischer oder histologischer Proben ein. Wir beschreiben zusätzlich ein Verfahren zur Herstellung teilchenförmiger Materie, wie Zytologie-, Hämatologie- und Mikrobiologie-Proben für die Prüfung durch Sammlung des teilchenförmigen Materials in einer gleichmäßigen Schicht, vorzugsweise einer Monoschicht, und Fixierung der Teilchen in einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 1 stellt den Bereich und die bevorzugten Konzentrationen der bevorzugten Komponenten einer Fixiermittelformulierung nach der vorliegenden Erfindung zusammen.
Eine beispielhafte Formulierung einer Zusammensetzung nach der Erfindung umfaßt etwa 40 Vol.-% Alkohol (zum Beispiel Isopropanol und Methanol), etwa 2 bis 3% Aceton, etwa 1,0 bis 3,0% Polyethylenglycol, etwa 2 Vol.-% Formaldehyd (zum Beispiel den als Formalin im Handel erhältlich, eine 3 bis 37% (v/v) Lösung in Wasser, manchmal mit einem Gehalt an Ethylalkohol) und etwa 58 Vol.-% eines Puffers (zum Beispiel Tris). Der bevorzugte pH-Wert dieser Formulierung ist etwa 5.0 ± 0,5. Eine andere brauchbare Formulierung ist in Beispiel 1 angegeben.
Eine Zusammensetzung nach der Erfindung kann ein oder mehrere Lösungsmittel enthalten, um das Gewebe oder Zellen zu durchdringen, die Zellen zu entwässern und/oder bakterielle und lebenswichtige Aktivität zu hemmen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Lösungsmittel ein Gemisch von Alkanolen, die langsame penetrieren und bei Vereinigung mit anderen Reagenzien die Probe rasch fixieren. Es denaturiert Protein durch Ausfällung, fällt Glycogen und löst Fette und Lipide. Das Alkanol kann irgendeines der bekannten Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sein, zum Beispiel Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol und verschiedene verzweigte Butanole. Das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist ein Gemisch von Methanol und Isopropanol, typischerweise mit etwa 30 Vol.-% bzw. etwa 10 Vol.-%.
Das Keton ist ein Fixiermittel mit ähnlicher Wirkung wie jene von Alkohol, ausgenommen daß Glycogen nicht gut erhalten bleibt. Das Keton wirkt als ein Fixiermittel und ermöglicht zusätzlich, daß die Gesamtzusammensetzung in die Zellen penetriert. Das bevorzugte Keton ist Aceton.
Die Beschichtung über der Probe trägt dazu bei, die Zellen oder das Gewebe vor den Wirkungen des Trocknens zu schützen. Die bevorzugte Beschichtung ist Polyethylenglycol (PEG) oder Carbowachs. Die Beschichtung ist wichtig zur Verhinderung einer Schrumpfung der Zellen und, um Nukleardetails zurückzuhalten.
Das Polyol, wie Glycerin, verhindert die Trocknung von Zellen während der Probenverarbeitung. Zellen, die in Fixativlösung über eine längere Zeit gehalten wurden, werden typischerweise steif infolge des Fixierens und sind weniger leicht in der Lage, sich auf dem Objektträger auszubreiten. Das bevorzugte Polyol ist Ethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Sorbit, und Mannit, am meisten bevorzugt ist Glycerin.
Der Vernetzer reagiert mit Proteinendgruppen, um Moleküle zu vernetzen, und erzeugt ein unlösliches Produkt. Proteingruppen, die hier mitwirken, sind beispielsweise Amino-, Imino- und Amidogruppen, Peptid-, Hydroxyl-, Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen. Methylenbrücken werden auch üblicherweise zwischen ähnlichen Gruppen, wie NH₂ und NH, gebildet, dürften aber auch üblicherweise durch Waschen mit Wasser reversibel sein. Einige Vernetzer, wie Formaldehyd, sind ein Antiseptikum.
Die bevorzugten Vernetzer sind Aldehyde, wie ein C₁-C₆-Alkanal oder ein C₁-C₈-Alkylendialdehyd. Der bevorzugte Aldehydvernetzer ist Glutaraldehyd, Formaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd, am meisten bevorzugt Formaldehyd.
Das Detergens, wie ein nicht-ionisches Detergens, wird als ein Dispergiermittel und zum Löslichmachen der Proteine und Membrankomponenten verwendet, um Zellaggregation zu vermindern. Die bevorzugten Detergenzien sind Triton X-100, Nonidet P40, Igepal Ca-630, Tween^® 85, Tween^® 80 und Tween^® 65.
Der Puffer hält die Lösung auf einem pH-Wert zwischen etwa 4 und etwa 7 und ergibt ein Medium für das Transportieren. Der bevorzugte Puffer ist Tris, ein bekannter Puffer. Der Puffer kann auch ein Fixiermittel einschließen, das Nukleoproteine ausfällt, und kann ein oder mehrere Osmolarität haltende Stoffe enthalten. Der bevorzugte Nukleoprotein-Präzipitator ist Essigsäure, die auch als ein hämolytisches Mittel zum Auflösen roter Blutzellen dient. Typischerweise liegt die Essigsäure in einem Bereich von etwa 0,2 Vol.-% bis etwa 2,0 Vol.-%. Mit der Steigerung der Konzentration von Essigsäure in dem Puffer bekommt man Hämolyse. Die bevorzugten Osmolarität haltenden Stoffe sind Dextrose, typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 0,2 Gew.-% und Natriumchlorid, typischerweise in einem Bereich von etwa 0,7 bis 0,8 Gew.-%.
Ein mukolytisches Mittel wird in der Fixiermittelzusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung verwendet bei der Herstellung einer teilchenförmigen Monoschicht aus Mucoidproben, wie Sputum, Bronchialalveolarwaschflüssigkeiten und Spülflüssigkeiten, Magen- und Spülflüssigkeit. Beispiele von mukolytischen Mitteln zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind etwa Dithiothreitol (DTT), Acetylcystein, Bromhexin, Carbocystein, Domiodol, Letostein, Lysozym, Mecystein, Hydrochlorid, Mesna, Sobrerol, Stepronin, Tiopronin und Tyloxapol. Das bevorzugte mukolytische Mittel ist Dithiothreitol (DTT) oder Acetylcystein, typischerweise in einem Bereich von 0,1 bis 1,0 g-% verwendet. Der bevorzugte Bereich liegt bei 0,2 bis 0,5%. DTT ist ein wasserlösliches Reagenz, ideal geeignet für den Schutz von Sulfhydrylgruppen. DTT dringt leicht in Zellmembranen ein und verhindert mit seinem niedrigen Redoxpotential die Oxidation von Proteinen. DTT hält auch Monothiole in dem reduzierten Zustand und reduziert Disulfide quantitativ.
Bei der bevorzugten Ausführungsform können die aktiven beschriebenen Fixiermittelbestandteile in einem geeigneten Lösungsmittel, wie destilliertem Wasser, gelöst werden, und diese Lösung kann dann als ein Fixiermittel in einer Anzahl von Wegen eingesetzt werden, wie für einen Fachmann auf der Hand liegt. Beispielsweise kann Fixiermittellösung verwendet werden, um Proben des Gewebes zu konservieren, die zu einer Prüfungsstelle transportiert oder getragen werden. In diesem Prozeß werden kleine Kolben oder Flaschen, die flüssigkeitsdichte Deckel haben, mit der Zusammensetzung der Erfindung gefüllt, und Gewebeproben werden in den Kolben gegeben, um die Proben zu konservieren, bis sie einen Bereich erreichen, wo sie weiter verarbeitet werden können. Wasser oder anderes Verdünnungsmittel wird auch in einer Menge von etwa 80 bis etwa 0 Vol.-% verwendet. Irgendein geeignetes Verdünnungsmittel, das die wichtige Chemikalie und physikalische Eigenschaften der Formulierung nicht verändert, kann verwendet werden.
Für Studien unter Verwendung des Fixiermittels nach der Erfindung präparierte Gewebe können für histologische Studien in bekannter herkömmlicher Weise bereitet werden, wie unter Verwendung von Paraffin, Schneideinrichtungen, Anfärben, Befestigen auf Objektträgern oder andere übliche Stufen, die vor der mikroskopischen oder anderweitigen Prüfung benutzt werden. Die vorliegende Erfindung liefert somit eine sichere, bequeme und wirksame Fixiermittellösung, die in den zahlreichen bekannten histologischen Verfahren verwendet werden kann, die solche Lösungen benutzen.
Weiterhin beschreiben wir Vorrichtungen und Verfahren zum Sammeln von Fluiden, wie biologischen, physiologischen oder Umweltflüssigkeiten, unter Entfernung des erwünschten Materials aus dem Fluid ohne Zentrifugieren und Diagnostizieren und Testen das Material. Teilchenförmiges Material wird zweckmäßig auf einer Sammelstelle gesammelt, vorzugsweise in einer Monoschicht, typischerweise in einer vorbestimmten Raumanordnung.
Die Fixiermittelzusammensetzung, wie oben beschrieben, kann mit einer Vorrichtung und einem Verfahren verwendet werden, die ein Dispergieren von feinteiligem Material in der Probe, vorzugsweise durch Rotieren des Probenbehälters um einen ortsfesten Rührer oder dergleichen, einschließt.
Die Fixiermittelzusammensetzung, wie oben beschrieben, kann mit einer verbesserten Vorrichtung zum Sammeln und Verarbeiten einer Flüssigkeit, typischerweise einer biologischen Flüssigkeit, verwendet werden, wobei die Vorrichtung eine Sammelkammer für teilchenförmiges Material einschließt, die eine oder mehrere der folgenden Bestandteile hat: Eine Sammelstelle, eine Membran zum Abtrennen von feinteiligem Material aus einer Flüssigkeit, einen porösen Träger, einen porösen Träger mit wenigstens einer durchgehenden Bohrung, vorzugsweise einer Bohrung, die nahe dem Umfang des porösen Trägers liegt, wobei diese Bohrung zusätzliche Oberflächenspannung liefert, so daß eine Filtermembran auf dem porösen Träger gehalten wird, wenn das Gehäuse geöffnet wird, um die Membran für weitere Bearbeitung freizulegen, eine poröse Anordnung, die wenigstens zwei Fluidflußwege durch die Sammelkammer bereitstellt, einen porösen Anordnungssitz, der das gesammelte teilchenförmige Material in einem vorbestimmten Muster anordnet, eine Sammelkammer mit einem konzentrischen Kanal, einem Kanal mit einem oder mehreren elastischen Teilen, einem Kammersitz mit einem oder mehreren vorbestimmten Oberflächenmodifikationen, einen Sitz mit einem oder mehreren Elementen, die eine vorbestimmte Raumanordnung des feinteiligen Materials auf der Sammelstelle fördern, und Strukturen, die den Fluidfluß durch die Kammer verbessern.
Eine Apparatur zur Verwendung mit der Fixiermittelzusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann auch Strukturen einschließen, die dafür gestaltet sind und/oder angepaßt sind, die in der Sammelkammer gesammelte Probe zu durchmischen. Beispiele von Strukturen sind etwa, aber nicht ausschließlich, eine Sammelkammer mit einem drehbaren Deckel oder einem Teil des Deckels, der sich dreht, einem Deckel oder Deckelabschnitt, der in Bezug auf den Sammelbehälter drehbar ist und ein Rohr oder dergleichen, das sich in den Sammelbehälter erstreckt, wobei dieses Rohr ein oder mehrere Elemente einschließt, die die Probe durchmischen. Der Deckel kann auch einen Teil enthalten, der in Paßsitz in einen Teil des Abschnitts des Deckels in einer flüssigkeitsdichten, aber fluiddichten Dichtung eingreift.
Die Zusammensetzungen, Vorrichtungen und Methoden, die hier beschrieben sind, können in ein von Hand geführtes manuelles System eingearbeitet oder in einer solchen Struktur, einem teilautomatisierten System oder einer solchen Struktur oder einem vollautomatisierten System oder einer solchen Struktur verwendet werden.
Eine Probe kann für mikroskopische Prüfung durch Verarbeitung einer Probe unter Verwendung einer oben beschriebenen Einrichtung und Sammeln von teilchenförmigem Material auf einer Sammelstelle in der Einrichtung bereitet werden.
Wir beschreiben ein Verfahren zum Analysieren von Material, das ein Sammeln einer Probe in einem Sammelbehälter, Sammeln von Material auf einem Sammelelement und Überführen des gesammelten Materials auf dem Sammelelement zu einem Objektträger eines Mikroskops oder dergleichen umfaßt. Vorzugsweise erfolgen die Sammelstufen in derselben Apparatur.
Ein Probenbecher kann verwendet werden, der eine Kammer für das Sammeln einer Flüssigkeitsprobe einschließt, und in Fließverbindung mit der Kammer eine Abtrennkammer für teilchenförmiges Material oder ein Modul für die Abtrennung von teilchenförmigem Material in dem Fluid und Sammeln des abgetrennten teilchenförmigen Materials in einer Sammelzone. Das abgetrennte teilchenförmige Material kann in einer Monoschicht auf der Sammelzone gesammelt werden. Ein hohles Rohr in Fluidverbindung mit der Abtrennkammer für teilchenförmiges Material kann auch eingeschlossen sein. Das hohle Rohr kann Einrichtungen zum Mischen der Probe und/oder zum Dispergieren des teilchenförmigen Materials in der Probe einschließen. Beispiele von Einrichtung hierfür sind etwa, aber nicht ausschließlich, ein Rührer, Flügel, Bürsten, Pinsel, Besen, Spatel oder dergleichen. Ein Rohr mit einer Bürste kann auch enthalten sein. Ein Beispiel für eine Bürste ist in der US-Patentschrift 47759,376 beschrieben.
Wie hier verwendet, bedeutet „Probe" irgendein Fluid in Kombination mit festem Material, wie einem teilchenförmigen Material, und von welchem es erwünscht sein kann, die teilchenförmige Komponente aus der Probe zum Zweck einer Feststellung seiner Identität oder Gegenwart in der Probe zu sammeln. Typischerweise wird die Fluidkomponente der Probe eine Flüssigkeit sein. Das Fluid kann jedoch auch Luft oder ein Gas sein. Als ein Beispiel kann es erwünscht sein, die Gegenwart von Krebszellen oder bestimmten Proteinen in der biologischen Flüssigkeit, wie Urin, zu bestimmen. Bei einem anderen Beispiel kann es erwünscht sein, die Natur von Verunreinigungen, wie molekularen Verunreinigungen, in ultrareinem Wasser zu bewerten, welches in der Elektronikindustrie Verwendung findet. Andere Beispiele von Fluiden sind etwa, aber nicht ausschließlich, Körperfluide, wie Blut, Rückenmarkflüssigkeit oder amniotische Flüssigkeit, Bronchialspülungsflüssigkeit, Sputum, Atemflüssigkeit bei Verwendung feiner Nadeln, Grundwasser, Industrie-Arbeitsflüssigkeiten und elektronische oder medizinische Dialyseflüssigkeiten, um nur einige zu nennen. Es ist beabsichtigt, daß die Erfindung nicht durch die Type des Fluids beschränkt sein soll, die verarbeitet wird.
Wie hier verwendet, bedeutet teilchenförmiges Material irgendeine Substanz in einem Fluid, welches gesammelt und bewertet werden kann, vorzugsweise durch zytologische, hämatologische oder mikrobiologische Prüfung. Beispiele teilchenförmiger Materialien sind etwa, aber nicht ausschließlich, Zellen oder Zellfragmente, Bakterien, Blutbestandteile, Proteine, Moleküle, Polymere, Kautschukteil chen, Stabilisatoren, Antioxidationsmittel, Beschleuniger, Silikone, Alkydharze, Thiokole, Paraffine, Thermoplasten, Bakterien, Pestizide und Herbizide. Spezielle Beispiele polymerer Materialien sind etwa, aber nicht ausschließlich, Polyethylen, Polypropylen, Polyisobutylen, Polyacrylnitril, Polyethylenglycol, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polysulfid, Polymethylmethacrylate, Polyethylenterephthalate, Ethylcellulose, Nitrocellulose, Polyurethane und Nylon. Eine speziell beispielhafte Umweltverunreinigung ist Bisphenol A. Ein speziell beispielhaftes biologisches Material schließt Krebszellen, einschließlich solcher, die zwischen Metastasen und normalen Krebszellen unterschieden sind, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper oder dergleichen ein. Es ist beabsichtigt, daß die Erfindung nicht durch irgendeine Materialtype beschränkt sein soll, die verarbeitet wird.
Während eine Zytologie-Sammelapparatur und/oder Fixiermittelzusammensetzung für irgendeine biologische Flüssigkeit verwendet werden kann, ist sie besonders brauchbar für die Herstellung von Textproben aus Urin und dessen verbundene Zellen für Pap-Abstriche. Die am weitesten verbreitete Anfärbung für das Sichtbarmachen von Zellveränderungen in der Zytologie ist das Papanicolaou-Anfärbeverfahren. Diese Anfärbung, die sowohl für die Gynäkologie als auch für nicht-gynäkologische Anwendungen genutzt wird, basiert auf blauen Kernen und orangefarbigen, roten und grünen Zytoplasma-Gegenfärbungen. Die Kernfärbung demonstriert die chromatischen Bilder, die mit normalen und anomalen Zellen verbunden, während die Zytoplasma-Anfärbungen dazu beitragen, den Zellursprung zu zeigen. Der Erfolg dieses Verfahrens kann der Fähigkeit zugeschrieben werden, eine Anzahl von Faktoren, einschließlich Definitionen von Kerndetails und Zelldifferenzierung, zu beobachten. Dieses Anfärbeverfahren führt auch zu einem mehrfarbigen Präparat, das für das Auge sehr angenehm ist und möglicherweise Augenspannungen reduziert.
Es ist beabsichtigt, daß die Erfindung nicht durch die Materialart, die verarbeitet wird, beschränkt sein soll. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Fluid Urin und das teilchenförmige Material eine Zelle.
Die Zusammensetzung und Methode der vorliegenden Erfindung gestattet auch eine Isolierung und ein Sammeln von frischen Zellen und/oder Mikroorganismen aus biologischen Fluiden für Anwendung einer DNA-Sonde und Chromosomenanalyse, wenn die Zellen durch den geeigneten Puffer hämolysiert sind.
Wie hier für die Verbindung verwendet, bedeuten Verbindung oder ähnliche Ausdrücke irgendein Mittel, Strukturen oder Methoden, die einen Fluidfluß durch das System bewirken, wie dem Praktiker in der Technik bekannt ist. Beispiele von Strukturen sind in den Figuren der genannten Patente gezeigt. Beispielsweise kann eine Leitung ein Verbindungsstück haben, das so ausgebildet ist, daß es ein dazu passendes Verbindungsstück auf einem anderen Rohr aufnimmt und verbindet. Wie hier verwendet, bedeutet ein Konnektor eine Struktur, die zur Bildung einer Verbindung oder die Verbindung mit einem anderen Stück verwendet. Diese Verbindungen erzeugen einen Fluidflußweg durch verschiedene Elemente der Apparatur, Anordnung oder des Systems. Typische Verbindungen enthalten, wenn auch nicht ausschließlich, Paßverbindungen, wie eine solche vom Luer-Typ, Schraubentyp, Reibungstyp oder Verbindungen, die aneinander gebunden sind.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „angepaßt zum Eingriff", „Eingriff", „eingreifen" oder ähnliche Ausdrücke auf komplementäre Strukturen, die gegeneinander oder miteinander ausgerichtet, bemessen, angepaßt oder nahe beieinanderliegend sind. Beispiele von Strukturen schließen die oben beschriebenen Verbindungen ein.
Auch ist ein Verfahren beschrieben zur Entfernung von teilchenförmigem Material aus einem Fluid und zur Überführung von feinteiligem Material, wie Zellen oder Bakterien oder einer Blutprobe, zu einem Mikroskop-Objektträger. Im Gegensatz zu derzeit verfügbaren Methoden liefert die Verwendung von Membranfiltration eine Methode zur Abscheidung von Zellen in gleichmäßiger Weise über einem Mikroskop-Objektträger mit minimaler Überlappung. Dies erlaubt eine klare Beobachtung und optimale diagnostische Genauigkeit.
Das poröse Medium kann dann gegen eine Mikroskop-Objektträger gepreßt werden, um ein Sammeln auf dem Objektträger zu gestatten. Dies erlaubt die Durchführung einer zytologischen Prüfung bei Zellen durch den Praktiker ohne Störung oder Verzögerung infolge von prozessualen Erfordernissen.
Da ein Zelldetail von der Fixierung abhängig ist, ist es bevorzugt, daß Zellen unmittelbar nach ihrer Abscheidung auf dem Objektträger fixiert werden. Zu lange Verzögerung zwischen Herstellung und Fixierung kann die Zellen einer Trocknung des Zellmaterials aussetzen. Außerdem können lufttrocknende Artefakte nachteilig für die anschließenden Anfärbeergebnisse sein. Eine Ausnahme besteht darin, wenn die Zellen lufttrocknend sind wie eine Fixierstufe.
Die Monoschicht von Zellen kann direkt auf der Sammelstelle fixiert werden. Dies kann ausgeführt werden, indem man zunächst eine Monoschicht von Zellen auf der Sammelstelle der Zytologie-Sammelstellenapparatur abscheidet, wie oben beschrieben ist, und anschließend eine Lösung, die ein Fixativ, wie einen Alkohol oder Aceton enthält, durch die Zytologie-Sammelapparatur schickt.
Es sollte bemerkt werden, daß verschiedene Typen poröser Anordnungen austauschbar mit jener, die hier beschrieben ist, verwendet werden können. Obwohl eine Polycarbonatmembran besonders geeignet für die Verwendung in der Zytologie-Sammelapparatur nach der vorliegenden Erfindung ist, sind auch andere Membranen geeignet. Beispielsweise sind poröse Membranen bekannt und in den US-Patentschriften 5,471,994 und 5,301,685 beschrieben.
Wir beschreiben auch Methoden zur Herstellung eines einzelnen Objektträgers aus einer Patientenprobe, Präparieren von mehreren Objektträgern aus einer einzelnen Patientenprobe oder Erzeugung mehrerer Objektträger aus mehreren Patientenproben. Es ist beabsichtigt, daß eine Patientenprobe in einem einzelnem Schuß, Ansatz oder in kontinuierlicher Weise verarbeitet werden kann. Zusätzliche Objektträger für andere Anfärbeanwendungen können leicht hergestellt werden. Das Testen von menschlichem Papilloma-Virus kann beispielsweise durch neuere Methoden, wie Immunozytochemie oder in situ Hybridisierung auf zusätzlichen Objektträgern durchgeführt werden. Wenn onkogene Produkte oder andere immunozytochemische Tests entwickelt werden, können mehr Objektträger erforderlich sein. Die unterschiedlichen Fixierungen, die diese Tests benötigen können, können leicht in das Verfahren eingearbeitet werden, da die Herstellung nicht die Objektträgerfixierung auf nur einem Weg erfordert.
Das gleiche Objektträgerherstellungsverfahren kann für fast alle Formen der Zytologie angewendet werden. Außerdem betrifft die Verwendung vollständig enthaltener Wegwerfkomponenten biologische Gefahrenbeachtung. Schließlich können die verbesserten Präsentationen von Zellen, die verbesserte Zytologie-Interpretation ergibt, die Zytologierolle erweitern, indem reproduzierbarere und zuverlässigere Patientendiagnose erfolgt.
Die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet für das Präparieren von teilchenförmigem Material, wie in Zytologie-, Hämatologie- und Mikrobiologie-Proben sowie für das Haltbarmachen von Histologieproben.
BEISPIELE
Beispiel 1. Fixativ-Rezeptur
Die folgende Fixiermittelzusammensetzung wurde hergestellt: 40% Alkohol (Methanol und Isopropanol), 2,2% Aceton, 1,8% Polyethylenglycol (PEG), 0,7% Formaldehyd, 1% Glycerin, 0,02% Nonidet P40 und 54% Tris-Puffer (pH 7,4 bis 7,8). Alle Mengen sind ungefähr Volumenprozente.
Die obige Fixierösung wurde in Verbindung mit verschiedenen Herstellungstechniken oder Einrichtungen für Zytologie-Proben einschließlich jener, die in der US-Patentschrift 5,471,994, der US-Patentschrift 5,301,685, der US-Anmeldung Serien-Nummer (USSN) 08/905,833, eingereicht am 4. August 1997, der USSN 08/963.973, eingereicht am 4. November 1997, der USSN 09/042,005, eingereicht am 13. März 1998, der USSN 09/053,010, angemeldet am 1. April 1998, der USSN 08/963,873, der PCT/US98/16349, der USSN 09/050,010, der PCT/US98/18524, der USSN 09/185,606 und der PCT/US98/23222 beschrieben sind. Die Fixierlösung des Beispiels 1 zeigt rasche Penetration in Geweben mit minimalen Mengen von Artefakt; das Anfärben der so fixierten Gewebedisplays ergibt ausgezeichnete histologische und zytologische Details.
Beispiel 2. Zytologische Präparierung

1. Probensammelbehälter werden halb mit der Fixiermittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung gefüllt. Eine Probe, die Zellen enthält, wird in den Behälter mit der Fixativzusammensetzung eingeführt.
2. Die Zytologieprobe wird heftig mit der Fixativzusammensetzung vermischt, um die Probe sorgfältig mit Fixativ zu vermengen.
3. Wenn die Zellen der Zytologieprobe nicht dispergiert sind, kann die Probe homogenisiert werden. Homogenisierung kann unter Verwendung eines mechanischen Flügels erfolgen, der bei etwa 2000 bis 4000 Umdrehungen je Minute (RPM), vorzugsweise bei etwa 3000 RPM rotiert. Der Flügel leistet diese Funktion am Boden des MonoGen^®*-Monoprep. Alternativ kann ein Mischer bei hoher Geschwindigkeit während 5 bis 10 Sekunden oder weniger verwendet werden. Übermäßiges Mischen soll vermieden werden.
4. Die Zellen sollten zum Fixieren während wenigstens 15 Minuten vor weiterer Verarbeitung zugelassen werden. Weitere Verarbeitung schließt Methoden ein, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Monoschichten und Zellanfärbung bekannt sind. Eine Vielzahl zytologischer präparativer Einrichtung kann verwendet werden, wie jene, die in Beispiel 1 aufgelistet sind.

Beispiel 3. Zytologie-Haltbarkeit und mukolytische Lösung
Die folgende Fixierung und mukolytische Zusammensetzung wurde folgendermaßen erzeugt: 40% Alkohol (Methanol und Isopropanol), 2,2% Aceton, 1,8% Polyethylenglycol (PEG), 0,7% Formaldehyd, 1% Glycerin, 0,02% Nonidet P40 und 54% Tris-Puffer (pH 7.4 bis 7,8). Die gesamten Mengen sind ungefähre Volumenprozentsätze. DTT wird im Bereich von 0,2 bis 0,5 g-% zugegeben. Diese Lösung wird als MonoLex^® bezeichnet. Die Monolex^®-Lösung wird zu der Probe in einem Verhältnis von 1 : 1 zugegeben. Die Probe und die mukolytische Fixierlösung werden mit einer Wirbeleinrichtung während etwa 1 Minute behandelt, dann etwa 30 Minuten inkubiert, bevor sie nochmals etwa 1 Minute mit der Wirbeleinrichtung behandelt werden. Weitere Verarbeitung schließt Methoden ein, die in der Technik für die Herstellung einer Monoschicht aus Feinstoffen und die Zellanfärbung bekannt sind. Es können verschiedene Zytologie-Präparationseinrichtungen verwendet werden, wie jene, die in Beispiel 1 aufgelistet sind.
Beispiel 4
Da Zelldetails von der Fixierung abhängen, ist es bevorzugt, daß Zellen entweder unmittelbar nach der Abscheidung auf dem Objektträger, wie für Zervikalproben, oder vor der Präparierung der Zellmonoschicht fixiert werden. Eine zu lange Verzögerung zwischen der Herstellung und Fixierung kann die Zellen austrocknen, was schädlich für die Zellstruktur ist. Außerdem können Lufttrocknungsartefakte die anschließenden Anfärbeergebnisse nachteilig beeinflussen. Eine Ausnahme besteht darin, wenn die Zellen mit Wright-Giemsa Staiu angefärbt werden, wo Lufttrocknung als Fixierstufe angewendet wird.
Die Monoschicht von Zellen kann direkt auf der Sammelstelle fixiert werden. Dies kann geschehen, indem man zunächst eine Monoschicht von Zellen auf der Sammelstelle der Zytologie-Sammelapparatur, wie oben beschrieben, aufbringt und anschließend eine Lösung, die eine Fixierzusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung enthält, durch die Zytologie-Sammelapparatur führt.
Wie beschreiben auch die Herstellung von Mehrfachproben aus einer einzigen Patientenprobe. Zusätzliche Objektträger für andere Anfärbeanwendungen können leicht bereitet werden. Beispielsweise kann ein Testen von menschlichem Papilloma-Virus durch neuere Methoden, wie Immunozytochemie oder Hybridisierung in situ auf den zusätzlichen Objektträgern durchgeführt werden. Wenn Onkogen-Produkte oder andere immunozytochemische Tests entwickelt werden, können weitere Objektträger erforderlich sein. Die unterschiedlichen Fixierungen, die diese Tests benötigen können, können leicht in das Verfahren eingearbeitet werden, da das Verfahren nicht erfordert, daß die Objektträger in nur einer Weise fixiert werden.
Dieses gleiche Objektträger-Präparierverfahren kann für nahezu alle Formen der Zytologie genutzt werden. Außerdem befaßt sich die Verwendung vollständig enthaltener Wegwerfbestandteile mit der biologischen Gefahr. Letztlich kann die verbesserte Präsentation von Zellen, die verbesserte Zytologie-Interpretation ermöglicht, die Rolle der Zytologie ausweiten, indem reproduzierbarere und zuverlässigere Patientendiagnose bereitgestellt werden.
Bei der Beschreibung der Erfindung wurde Bezug genommen auf eine bevorzugte Ausführungsform und erläuternde Vorteile der Erfindung. Die Fachleute jedoch und die, welche mit der vorliegenden Beschreibung der Erfindung vertraut sind, können erkennen, daß zahlreiche andere Abwandlungen, Variationen und Anpassungen gemacht werden können, ohne daß der Erfindungsgedanke, wie er in den Ansprüchen definiert ist, verlassen wird.

Claims

Zytologische und histologische Fixierzusammensetzung, die einen Aldehydvernetzer, ein Polyol und ein Detergens umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung ein mukolytisches Mittel enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der der Aldehyd ein C₁–C₆-Alkanal oder ein C₁-C₈-Alkylendialdehyd ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Aldehyd aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glutaraldehyd, Formaldehyd, Paraformaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd und Butyraldehyd besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Polyol aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ethylenglycol, Propylenglycol, Glycerin, Sorbit und Mannit besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche; worin das Detergens ein nicht-ionisches Detergens ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das nicht-ionische Detergens aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Triton X-100, Nonidet P40, Igepal CA-630, Tween^®, Tween^®, und Tween^® 65 besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich einen Puffer umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin der Puffer die Lösung auf einem pH-Wert zwischen etwa 4 und etwa 7 hält.
Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, worin der Puffer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tris oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich einen Nukleoprotein-Präzipitator oder ein hämolytisches Mittel enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin der Nukleoprotein-Präzipitator oder das hämolytische Mittel Essigsäure ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich ein die Osmolarität haltendes Mittel enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das die Osmolarität haltende Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dextrose und Natriumchlorid besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich ein Lösungsmittel umfaßt, welches aus der aus Ethanol, Isopropanol, Methanol und Wasser bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich ein Keton enthält, das Aceton oder Methylethylketon ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich eine Zellen beschichtende Substanz umfaßt, welche aus der aus Polyethylenglycol (PEG) und Carbowachs bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin das mukolytische Mittel Dithiothreitol oder Acetylcystein ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die eine Aldehydkonzentration von etwa 0,2 bis 4,0 Vol.-%, eine Glycerinkonzentration von etwa 0,5 bis etwa 2,0 Vol.-% und eine Detergenskonzentration von etwa 0,01 bis 0,05 Vol.-% umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich Ethanol in einer Konzentration von etwa 35 bis 45 Vol.-%, Aceton in einer Konzentration von etwa 2,0 bis 3,0 Vol.-%, Polyethylenglycol in einer Konzentration von etwa 1,0 bis 3,0 Vol.-% und einen Puffer enthält.
Verfahren zum Konservieren einer zytologischen, hämatologischen, mikrobiologischen oder histologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 fixiert wird.