CN105388288B - 人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液 - Google Patents

人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人呼吸道病原体感染的流式细胞检测的细胞固定液、试剂盒和方法，所述细胞固定液，其为含有体积分数为0.1％－1％甲醛和体积分数为60％－80％甲醇的PBS溶液，pH为7.2‑7.4。所述试剂盒包括有上述细胞固定液、细胞通透剂和至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体，每种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体标记有荧光素，且针对不同待检测人呼吸道病原体的荧光素不同。本发明所述方法检测过程自动化，节省人力成本、结果客观准确，并可实现单样本多重检测，能更好的反映病原体感染情况。

Description

人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液
技术领域
本发明属于病原体诊断技术领域，具体涉及一种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法和试剂盒以及细胞固定液。
背景技术
流感病毒A(IA)，流感病毒B(IB)，呼吸道合胞病毒(RSV)和呼吸道腺病毒(ADV)、副流感1、2、3、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体、衣原体是引起呼吸道疾病的主要病原体。其中流感病毒A，流感病毒B，呼吸道合胞病毒和呼吸道腺病毒最为常见，约占呼吸道疾病的病毒性病原体的50％。为了更加快速和灵敏检测呼吸道病毒，合理使用各种抗生素，和治疗流感的新抗病毒药物的使用，早期检测和辨别感染病毒变得非常重要。
目前标准的鉴定病毒的方法仍然是通过细胞培养和使用荧光单克隆抗体。然而，细胞培养法分离率低、耗时长，因此限制了它的使用。目前临床上使用荧光单克隆抗体检测呼吸道病毒感染的方法，具体是指玻片直接免疫荧光法，该方法通过肉眼观察，并且根据在玻片上点样的标本中有绿色荧光细胞的数量来判定结果。因此玻片直接免疫荧光法结果的判定具有主观性。而且由于该检测方法需要人肉眼观察结果，因此只能使用单一荧光素标记抗体，导致该方法一般一次只能鉴定一种病原体。
流式细胞术是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征的技术，主要应用于生命科学的基础研究：免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，用于测定外周血CD4T细胞的数量，监测HIV感染者疾病的进展；利用流式分选干细胞过继回输用于疾病的治疗。现在，流式细胞术还能辅助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。由于流式细胞是以细胞表面因子为检测对象，而人呼吸道病原体一般都位于细胞内部，因此目前尚未见能很好地利用流式细胞术来检测呼吸道病原体的技术和产品。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人呼吸道病原体的流式细胞检测的细胞固定液，检测试剂盒和检测方法。通过本发明所提供的检测方法和试剂盒，实现了人呼吸道病原体感染检测的自动化、且结果客观准确；可实现单样本多重检测，可反映病原体感染情况等技术效果。
本发明的目的之一在于提供一种细胞固定液。
实现上述目的的技术方案如下。
一种细胞固定液，含有体积分数为0.1％－1％甲醛和体积分数为60％－80％甲醇的PBS溶液，pH为7.2-7.4。
在其中一个实施例中，所述甲醛的体积分数为0.3％-0.8％，所述甲醇的体积分数为60％－65％。
本发明的另一目的在于提供一种人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，包括有：上述细胞固定液、细胞通透剂和至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体，每种人呼吸道待检测病原体的抗体标记有荧光素，且针对不同待检测人呼吸道病原体的荧光素各不相同。
在其中一个实施例中，还包括有细胞洗涤液。
在其中一个实施例中，所述人呼吸道病原体为呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IA)、乙型流感病毒(IB)、腺病毒(Adv)、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞通透剂为Triton-X100溶液。
本发明的另一目的是提供一种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法，包括如下步骤：
(1)标本采集和细胞固定：收集呼吸道的标本中的上皮细胞到上述细胞固定液内；
(2)单细胞悬液的制备：洗去所述细胞固定液；
(3)加入细胞通透剂和荧光素标记的待检测的人呼吸道病原体的单克隆抗体进行染色，不同呼吸道病原体的单克隆抗体所标记的荧光素不同；
(4)洗去多余的抗体；
(5)上流式细胞仪进行分析。
所述标本为咽拭子或肺泡支气管灌洗液。
本发明所述细胞固定液，能够很好地使组织和细胞内的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态。对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
本发明通过将细胞固定液固定，以Triton-X100溶液作为细胞通透剂，荧光染色等步骤实现流式细胞仪方法检测呼吸道上皮细胞病原体，计算病原体感染阳性的上皮细胞占总上皮细胞的百分比，以此作为诊断呼吸道病原体感染的依据。与玻片免疫荧光法相比具有如下优势：a、检测过程自动化，节省人力成本；b、仪器自动计算阳性百分比，结果更加客观准确；c、通过针对不同病原体单抗标记不同荧光染料，可实现单样本多重检测，节省资源和时间；d、更为重要的，要反映病原体感染情况，相比于玻片直接免疫荧光法以镜下观察到绝对量的荧光染色的细胞来反映，本发明所述检测方法以相对的阳性百分比来反映更为准确。
附图说明
图1是本发明方法进行Adv检测的结果图，标本为分别采自8位临床疑似呼吸道病原体感染患者的支气管肺泡灌洗液标本；其中A：根据前向散射光信号(FSC-H)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2)；B：根据所述细胞门(P2)，作出细胞荧光信号(FITC-H)的柱形图，在所述柱形图上设定阳性门(M3)，其百分比(M3％)为阳性百分比；
图2是利用玻片直接免疫荧光法进行四项呼吸道病原体(RSV、IA、IB和Adv)感染检测的阳性结果图，标本为分别标本为分别采自3位临床疑似呼吸道病原体感染患者的口咽拭子标本。图2-1、图2-2、图2-3分别为所述3份标本的阳性结果图，图中白色发亮的细胞为阳性细胞。
图3是利用本发明方法检测四项呼吸道病原体(RSV、IA、IB和Adv)感染情况的结果图，标本为分别标本为分别采自3位临床疑似呼吸道病原体感染患者的口咽拭子标本。3份标本的检测结果分别如图3-1、图3-2、图3-3所示，根据前向散射光信号(FSC-H)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2)。根据所述细胞门，作出细胞荧光信号(RSV-H、IA-H、Adv-H、IB-H)的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门(M3、M4、M5、M6)，其百分比(M3％、M4％、M5％、M6％)为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，本例各临界值均设为0.20％，大于0.20％的标本判为相应病毒感染阳性，小于或等于0.20％的标本判为相应病毒感染阴性。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1细胞固定液
本实施例所述的细胞固定液，含有体积分数为0.5％甲醛和体积分数为60％甲醇的PBS溶液。其配制方法为，在PBS溶液中加入甲醛和甲醇，使甲醛的体积分数为0.5％，甲醇的体积分数为60％，调节pH值至7.3，即得。
实施例2：人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒
本实施例提供一种人呼吸道病原体感染的流式细胞检测试剂盒。该试剂盒包含实施例1所述的细胞固定液、细胞通透剂和荧光素(FITC-异硫氰酸荧光素)标记的针对Adv抗原的单克隆抗体(购自广州锐达生物科技有限公司)，流式细胞细胞洗涤液。在本实施例中，细胞通透剂为体积分数为1％的Triton-X100溶液。所述细胞洗涤液为PBST(1×,pH7.4)
实施例3：人呼吸道病原体的流式细胞检测方法
本实施例为利用实施例2中的流式细胞检测试剂盒进行单项病原体(Adv)感染检测的方法，按如下步骤进行：
1、支气管肺泡灌洗液标本采集和细胞固定：由专业医护人员采集，采样完毕后，取3ml放入采样管中。将所述采样管500g离心8分钟，弃去上清，注意不要吸走细胞层。加入3ml细胞固定液并重悬细胞，旋紧管盖。将所述采样管正立置于－20℃保存。
2、单细胞悬液的制备：将上述含有标本的采样管置于振荡器上振荡10－15秒，取出并弃掉拭子。将上述采样管500g离心8分钟，弃去上清，注意不要吸走细胞层。再加入100ul细胞洗涤液，用移液器轻轻吹打细胞层以重悬细胞，得到单细胞悬液。
3、加入细胞通透剂和荧光素标记的抗体进行染色:
以Triton-X100溶液作为细胞通透剂，和荧光素标记的抗体进行染色。
本发明所提供的细胞固定液可将细胞内的蛋白成分进行很好的固定，固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态。具有很好的原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。以Triton-X100溶液作为细胞通透剂，其主要作用是使抗体能进入细胞，与胞内抗原结合。
将上述单细胞悬液转入96孔板内，一个标本对应一个孔，再用水平离心机500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。再加入25ul含有体积分数为1％的Triton-X100和2ug/ml FITC标记的针对Adv抗原的单抗溶液，于室温避光孵育30分钟。之后500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。在其他实施例里，根据检测要求，FITC标记的针对Adv抗原的抗体可以替换为包括FITC标记的分别针对呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体、衣原体抗原的抗体的任一种。
4、洗去抗体：再加入100ul细胞洗涤液，用移液器将细胞轻轻吹打以重悬细胞。再500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。再加入100ul细胞洗涤液，用移液器将细胞轻轻吹打以重悬细胞。
5、上流式细胞仪进行分析。用流式细胞仪(艾森生物，NovoCyte 2060R)检测。
结果分析方法：根据前向散射光信号和侧向散射光信号，划出细胞门。再根据所述细胞门，作出细胞荧光信号的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门，其百分比为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，大于临界值的判为该呼吸道病原体感染阳性，小于或等于临界值的判为该呼吸道病原体感染阴性。所述阳性门临界值根据大量正常人呼吸道标本染色结果划定。
结果如图1所示，图1是本实施例的方法检测Adv感染的结果图，标本为分别采自8位临床疑似呼吸道病原体感染患者的支气管肺泡灌洗液标本。如图1中的A部分所示，根据前向散射光信号(FSC-H)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2)。如图1中的B部分所示，根据所述细胞门，作出细胞荧光信号(FITC-H)的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门(M3)，其百分比(M3％)为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，本实施例临界值设为0.20％，大于0.20％的标本判为腺病毒感染阳性，小于或等于0.20％的标本判为腺病毒感染阴性。这样，所述检测的8个咽拭子标本中，标本1、2、4流式检测为Adv阳性(分别如图1-1、图1-2、图1-4所示)，而标本3、5、6、7、8流式检测为Adv阴性(分别如图1-3、图1-5、图1-6、图1-7、图1-8所示)。上述结果与使用七项呼吸道病毒检测试剂盒(玻片直接免疫荧光法，购自上海贝西生物科技有限公司)对上述标本的检测结果一致。
实施例4：人呼吸道病原体感染的流式细胞检测方法与玻片直接免疫荧光法比较实验
本实施例的对比例为本发明的流式细胞检测方法与玻片直接免疫荧光法的比较实验。
利用玻片直接免疫荧光法进行四项呼吸道病原体(RSV、IA、IB和Adv)感染检测，按如下步骤进行：
1、口咽拭子采集：嘱病人直立或坐位，嘱病人张口发“啊”音，用医用一次性压舌板压舌，暴露出病人口咽部，用医用一次性尼龙植绒拭子迅速擦拭两次腭弓、咽及扁桃体上的分泌物，取出拭子。将所述拭子放入含3ml运送培养基的采样管中，搅拌拭子混匀采样液，折断拭子杆，旋紧管盖。将所述采样管正立置于4℃保存。
上述标本可制备为单细胞悬液：将上述含有标本的采样管置于振荡器上振荡10－15秒，取出并弃掉拭子。将上述采样管500g离心8分钟，弃去上清，注意不要吸走细胞层。再加入0.5－1ml PBS缓冲液，用移液器轻轻吹打细胞层以重悬细胞，得到单细胞悬液。
2、四项呼吸道病原体感染筛查步骤:
(1)在8孔玻片上点样，每个点加25ul单细胞悬液。
(2)电吹风冷风下风干10-15分钟至干燥。
(3)浸没在冷丙酮溶液固定10分钟。丙酮的固定原理是使蛋白质沉淀，溶解膜磷脂及脱水。
(4)取出玻片，风干。
(5)在标本片的每个细胞点加上1滴筛查试剂(FITC标记的针对RSV抗原的单抗、FITC标记的针对IA的单抗、FITC标记的针对IB的单抗和FTIC标记的针对Adv的单抗及生物染色剂Evans Blue的混合溶液，购自上海贝西生物科技有限公司)。
(6)在37℃湿盒孵育15-30分钟。
(7)PBS冲洗一遍，然后浸没入PBS中洗两遍(PBS不能重复使用)。
(8)除去多余的洗液，每个细胞点加上一滴含50％甘油的PBS。最后覆上盖玻片。
(9)在荧光显微镜下观察结果。
(10)结果判断：200倍显微镜下每视野找到≥2个绿色荧光细胞即为阳性，否则为阴性。阴性细胞被Evans Blue染成红色。
3、四项呼吸道病原体感染鉴定步骤(对筛查步骤阳性的标本进行此步骤)
(1)在8孔玻片上的孔内滴加25ul的单细胞悬液，每样本需滴加四孔。
(2)样本完全风干。
(3)在20℃到25℃，用预冷的100％丙酮固定细胞约5-10分钟。
(4)从丙酮中取出载玻片并风干。
(5)在固定并风干的细胞上，每孔分别滴加一滴不同的鉴定染色试剂(分别含有FITC标记的针对RSV抗原的单抗、FITC标记的针对IA抗原的单抗、FITC标记的针对IB抗原的单抗或FTIC标记的针对Adv抗原的单抗的生物染色剂Evans Blue溶液，购自上海贝西生物科技有限公司)，试剂要完全覆盖细胞。
(6)将载玻片放于35℃到37℃的恒温箱内孵育15到30分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。
(7)用PBS漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。
(8)使用新的PBS再洗一次。
(9)用去离子水再洗一遍。
(10)滴加2到3滴含50％甘油的PBS，并加盖盖玻片，要注意避免产生气泡。在200倍放大荧光显微镜下观察结果。
(11)结果判断：200倍显微镜下每视野找到≥2个绿色荧光细胞即为阳性，否则为阴性。阴性细胞被Evans Blue染成红色。筛查和鉴定步骤结果均为阳性的才能判为阳性，否则应判为阴性。
阳性结果如图2所示，图2是利用玻片直接免疫荧光法检测RSV、IA、IB和Adv感染的阳性结果图，标本为分别采自3位临床疑似呼吸道病原体感染患者的口咽拭子标本。图2-1A、图2-1B、图2-2和图2-3分别所示标本9RSV阳性、标本9Adv阳性、标本10IA阳性和标本11IB阳性(图中白色发亮的细胞为阳性细胞)。
本实施例所用的人呼吸道病原体感染的流式细胞检测试剂盒与实施例2的组成大部分相同，不同的是标记的抗体不同，本实施例具体的试剂盒中，荧光素标记的抗体为：FITC标记的针对RSV抗原的单抗、PE(藻红蛋白)标记的针对IA抗原的单抗、PE-Cy7标记的针对Adv抗原的单抗及PE-Cy5标记的针对IB抗原的单抗的混合溶液，检测方法如下：
1、口咽拭子标本采集和细胞固定：嘱病人直立或坐位，嘱病人张口发“啊”音，用医用一次性压舌板压舌，暴露出病人口咽部，用医用一次性尼龙植绒拭子迅速擦拭两次腭弓、咽及扁桃体上的分泌物，取出拭子。将所述拭子放入含3ml细胞固定液中，搅拌拭子混匀采样液，折断拭子杆，旋紧管盖。将所述采样管正立置于－20℃保存。
2、单细胞悬液的制备：将上述含有标本的采样管置于振荡器上振荡10－15秒，取出并弃掉拭子。将上述采样管500g离心8分钟，弃去上清，注意不要吸走细胞层。再加入100ul细胞洗涤液，用移液器轻轻吹打细胞层以重悬细胞，得到单细胞悬液。
3、加入细胞通透剂和荧光素标记的抗体进行染色
以Triton-X100溶液作为细胞通透剂，和荧光素标记的抗体进行染色。
将上述单细胞悬液转入96孔板内，一个标本对应一个孔，再用水平离心机500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。再加入25ul抗体(含有体积分数为1％的Triton-X100和浓度分别为2ug/ml的FITC标记的针对RSV抗原的单抗、PE标记的针对IA抗原的单抗、PE-Cy7标记的针对Adv抗原的单抗及PE-Cy5标记的针对IB抗原的单抗的混合溶液)，于室温避光孵育30分钟。之后500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。
4、洗去抗体：再加入100ul细胞洗涤液，用移液器将细胞轻轻吹打以重悬细胞。再500g离心8分钟，用移液器小心吸去上清。再加入100ul细胞洗涤液，用移液器将细胞轻轻吹打以重悬细胞。
5、上流式细胞仪进行分析。用流式细胞仪(艾森生物，NovoCyte 2060R)检测。
结果分析方法：根据前向散射光信号和侧向散射光信号，划出细胞门。再根据所述细胞门，作出细胞荧光信号的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门，其百分比为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，大于临界值的判为该呼吸道病原体感染阳性，小于或等于临界值的判为该呼吸道病原体感染阴性。阳性门和临界值根据大量正常人呼吸道标本染色结果划定。
结果如图3所示，图3是本发明方法检测本实施例收集的标本中呼吸道合胞病毒、流感病毒A型、流感病毒B型和腺病毒感染情况的结果图。如图3-1、图3-2、图3-3所示，根据前向散射光信号(FSC-H)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2)。根据所述细胞门，作出细胞荧光信号(RSV-H、IA-H、Adv-H、IB-H)的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门(M3、M4、M5、M6)，其百分比(M3％、M4％、M5％、M6％)为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，本例各临界值均设为0.20％，大于0.20％的标本判为相应病毒感染阳性，小于或等于0.20％的标本判为相应病毒感染阴性。这样，所述检测的咽拭子标本9－11中，标本9流式检测为呼吸道合胞病毒和腺病毒感染双阳性(图3-1)，而标本10和标本11流式检测分别为流感病毒A型阳性(图3-2)和流感病毒B型阳性(图3-3)。
从以上的举例可以看出，本发明所述的人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒能很好地实现相应的人呼吸道病原体检测，更为重要的，要反映病原体感染情况，相比于玻片直接免疫荧光法以镜下观察到绝对量的荧光染色的细胞来反映，本发明所述检测方法以相对的阳性百分比来反映更为准确。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，其特征在于，包括有：细胞固定液、细胞通透剂和至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体，每种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体标记有荧光素，且针对不同待检测人呼吸道病原体的荧光素不同；
所述细胞固定液为含有体积分数为0.1％－1％甲醛和体积分数为60％－80％甲醇的PBS溶液，pH为7.2-7.4；
所述人呼吸道病原体为呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、或衣原体中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞固定液中，甲醛的体积分数为0.3％-0.8％，所述甲醇的体积分数为60％－65％。
3.根据权利要求1所述的人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞通透剂为Triton-X100溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，其特征在于，还包括有细胞洗涤液，所述细胞洗涤液为PBST缓冲液。
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