稳定呼吸道合胞病毒融合蛋白的方法
技术领域
本申请涉及病毒学与免疫学领域。具体而言,本申请涉及一种灭活呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)且稳定所述RSV中的pre-F蛋白的方法,以及通过该方法获得的经灭活的RSV病毒。此外,本申请还涉及一种制备含有pre-F蛋白的免疫原性组合物的方法,以及通过所述方法获得的免疫原性组合物。本申请还涉及,含有所述经灭活的RSV病毒或所述免疫原性组合物的疫苗,以及所述经灭活的RSV病毒、免疫原性组合物和疫苗用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病的用途。此外,本申请还涉及,预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病的方法,其包括使用本发明的经灭活的RSV病毒、免疫原性组合物或疫苗。
背景技术
自从20世纪50年代被发现以来,人类呼吸道合胞病毒(RSV)一直是婴幼儿下呼吸道感染最主要的病原。在美国,RSV是引起1岁以下婴儿住院的首要原因(D.K.Shay,R.C.Holman.et al.,JAMA,282(1999)1440-1446),并且是5岁以下儿童临床约诊的主要原因之一(C.B.Hall,G.A.Weinberg,et al.,N Engl J Med,360(2009)588-598)。全球范围内每年有超过3000万例下呼吸道感染由RSV引起,其中超过300万的人需住院治疗。RSV是小于5岁的儿童最常见的住院原因(H.Nair,W.A.Brooks,et al.,Lancet,378(2011)1917-1930)。早产儿、支气管及肺发育不良者、先天性心脏病及免疫缺陷的婴幼儿RSV感染率高达50-70%(A.C.Cooper,N.C.Banasiak,P.J.Allen,Pediatr Nurs,29(2003)452-456)。每年有16-60万儿童死亡病例与RSV有关(T.S.Howard,L.H.Hoffman,et al.J Pediatr,137(2000)227-232;S.Leader,K.Kohlhase.J Pediatr,143(2003)S127-132)。婴幼儿感染RSV所导致的住院治疗时间可达2.5个月,由此引发的相关医疗费用在美国每年可高达3.6-5.7亿美元(E.A.Simoes.Lancet,354(1999)847-852)。老年人也是RSV易感人群,每年由RSV感染导致死亡的老年人数大于12000位,约为同一人群中流感死亡率的1/3(A.R.Falsey,P.A.Hennessey,et al.N Engl J Med,352(2005)1749-1759;W.W.Thompson,D.K.Shay,E.Weintraub,et al.JAMA,289(2003)179-186)。在我国,由于缺乏本国研发的RSV诊断试剂,RSV检测由于过高的成本而得不到推广,这 导致了RSV在我国的流行情况及危害性至今不完全清楚。然而,针对我国部分地区的研究表明,RSV感染也是中国儿童下呼吸道感染的重要诱因(徐关仁,孙颂文,徐旭卿等.疾病控制杂志,4(2000)37-39;谢健屏,谢健屏,何翠娟等.中华儿科杂志,35(1997)402-403;朱汝南,邓洁,王芳等.21(2003)25-28)。
在19世纪60年代,已在婴儿和儿童上评估了FI-RSV(福尔马林灭活全病毒疫苗,肌注,铝佐剂辅佐)的保护效率。然而结果显示,该疫苗在随后的RSV天然感染中缺乏保护性,并且甚至导致疾病严重程度增强。疫苗导致疾病严重程度增强这一现象严重阻滞了RSV疫苗的发展。迄今为止,还没有能够提供有效保护的抗RSV疫苗。目前,只有一株识别RSV融合蛋白的中和抗体(Palivizumab,商品名:Synagis)能在新生儿身上产生被动免疫效果,降低新生儿发病率。Syangis的应用表明,结合RSV-F蛋白的中和性单抗可以用于临床保护,并且F蛋白上存在有效的中和活性位点。F蛋白位于病毒表面,并且对于病毒入胞和合胞体的形成是必须的。因此,F蛋白是开发抗RSV疫苗以及筛选预防与保护性抗体的重要靶标蛋白。
RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒,其基因组有15222个核苷酸,编码10种主要蛋白;其中,F蛋白(Fusion protein,F protein)是N-糖基化的I型跨膜糖蛋白,其全长为574个氨基酸,并且其作为主要跨膜蛋白,是RSV感染过程中的重要表面分子。F蛋白触发的膜融合的机制及过程尚不清楚。MeLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244)已利用哺乳动物表达系统,获得了稳定的post-F蛋白结构。对于pre-F蛋白,由于其结构不稳定,且存在多种中间体,因此,通过制备晶体来研究pre-F蛋白的结构相当困难。McLellan等(同上)利用结构已知的HPIV3pre-F蛋白,对RSV pre-F蛋白的结构进行了模拟和预测,并提出,RSV F蛋白可能存在pre-F构象。此外,McLellan等(同上)还提出,F蛋白与靶细胞结合后,其构象从处于高能量、亚稳定状态的融合前F蛋白构象(pre-fusion F,pre-F)转变为高度稳定的融合后F蛋白构象(post-fusion F,post-F),从而导致病毒膜与细胞膜的融合。亚稳定的pre-F构象和稳定的post-F构象的自由能差异很大,这导致膜融合的过程是不可逆的。
另外,还已对pre-F和post-F蛋白构象上的中和表位进行了鉴定。结果显示,pre-F和post-F蛋白共享了约50%的蛋白表面,并且,具有高中和活性的表位(强中和表位)例如siteφ主要分布于pre-F构象上,而post-F构象主要包含中和活性较弱的表位(弱中和表位),例如site II和site IV(参见,图1)。
这些研究结果表明,与post-F蛋白相比,pre-F蛋白具有更多、更强的中和表位,从而具有更高的用作疫苗的潜力。然而,由于pre-F蛋白处于亚稳定状态,极易转变为稳定的post-F蛋白,因此,将pre-F蛋白开发为有效的疫苗仍存在着极大的困难和挑战。本领域需要开发,稳定和维持灭活RSV病毒中的pre-F蛋白的方法,以提高灭活RSV病毒用作疫苗的效力。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“RSV融合蛋白”或“F蛋白”是指,呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(Fusion protein,F protein),其是本领域技术人员公知的,并且其示例性氨基酸序列可参见,例如NCBI GENBANK数据库登录号:P03420。在本文中,“RSV融合蛋白”、“融合蛋白”、“F蛋白”可互换使用。
如本文中所使用的,当提及F蛋白的氨基酸序列时,其使用SEQ ID NO:1所示的序列来进行描述。例如,表述“F蛋白的第196-209位氨基酸残基”是指,SEQ ID NO:1所示的多肽的第196-209位氨基酸残基。然而,本领域技术人员理解,在F蛋白的氨基酸序列中,可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于,置换,缺失和/或添加,例如不同基因型或基因亚型的F蛋白),而不影响其生物学功能。因此,在本发明中,术语“F蛋白”应包括所有此类序列,包括例如SEQ ID NO:1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且,当描述F蛋白的序列片段时,其不仅包括SEQ ID NO:1的序列片段,还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如,表述“F蛋白的第196-209位氨基酸残基”包括,SEQ ID NO:1的第196-209位氨基酸残基,以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明,表述“相应序列片段”或“相应片段”是指,当对序列进行最优比对时,即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的序列中位于等同位置的片段。
之前的研究显示,F蛋白至少存在1种确定的构象,post-F。McLellan等结合副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)的F蛋白研究结果推测,RSV的F蛋白可能还存在pre-F构象(McLellan等(2010),J Vriol,84:12236-12244)。在通常情况下, pre-F构象是不稳定的,其将自发转变为稳定的post-F构象。因此,从细胞中表达和纯化的F蛋白主要以post-F构象存在;并且,在灭活的RSV病毒中,F蛋白也主要以post-F构象存在。
如本文中所使用的,术语“pre-F蛋白”是指,以pre-F构象存在的F蛋白。如本文中所使用的,术语“post-F蛋白”是指,以post-F构象存在的F蛋白。关于pre-F蛋白、post-F蛋白以及它们的构象的更详细描述可参见,McLellan等(2010),J Vriol,84:12236-12244;McLellan等(2013),Science,340:1113-1117;McLellan等(2015),Curr Opin Virol,11:70-75;中国专利申请201480013927.7,和PCT国际申请PCT/CN2014/073505(其全文通过引用并入本文,用于所有目的)。在本文中,“pre-F”与“pre-Fusion”可互换使用;“post-F”与“post-Fusion”可互换使用。
如本文中所使用的,表述“稳定pre-F蛋白”是指,至少部分地抑制、减少或延迟pre-F蛋白向post-F蛋白的转化。此外,该表述也指,尽可能维持F蛋白的pre-F构象,避免其转化为post-F构象。
作为病毒最主要的表面结构蛋白之一,F蛋白的表面存在大量的中和抗体识别表位。目前已知的RSV F蛋白的中和抗体主要针对以下抗原表位(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796;和,M.Magro,D.Andreu,et al.J Virol,84(2010)7970-7982):
Site II表位:针对Site II表位的抗体包括已上市的预防性单抗Synagis以及它的等效衍生物motavizumab和47F;它们主要识别F蛋白的aa 255-275。McLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244)通过解析motavizumab单抗与F蛋白肽段aa 254-277的复合物的晶体结构证实,这个区域形成“螺旋-转角-螺旋”二级结构。晶体结构显示,motavizumab单抗结合在“螺旋-转角-螺旋”结构的一端,并且使得氢键和离子键作用于268位的Asn与272位的Lys。进一步的研究结果显示,位于这两个点的突变可引起抗体逃逸。motavizumab结合的Site II表位的结构在post-F构象中保留得非常完整,抗体结合位点暴露充分。motavizumab与post-F蛋白的结构揭示了Synagis和motavizumab单抗具有中和活性的机制。而RSV pre-F蛋白的模拟结构显示,该表位处于pre-F蛋白构象的内部,不能在pre-F蛋白的表面上暴露出来。Graham等证实,Synagis和motavizumab单抗只能够抑制RSV与细胞的融合,却不能抑制RSV的吸附(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796;J.S.McLellan,M.Chen,A.Kim,et al.Nat Struct Mol Biol,17(2010)248-250)。
Site I表位:识别Site I表位的抗体有131-2a,其识别F蛋白的半胱氨酸富集区。这类抗体最多阻断50%RSV病毒感染,表明该表位具有翻译后的多相性,或者这些抗体通过间接效应(例如病毒的聚沉)起中和效果。此外,这些抗体部分地阻断病毒吸附靶细胞。Site I表位在pre-F蛋白的构象中靠近病毒的细胞膜,但是在post-F蛋白的构象中位于顶点。
Site IV表位:Site IV表位是19和101F等单抗抗体的靶点,其主要涉及F蛋白的aa 422-438。该表位位于F蛋白中的构象相对保守的区域。McLellan等(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796)已经解出了101F与F蛋白肽段(aa 422-438)的复合物的晶体结构。结果显示,Site IV表位的核心区域为aa 427-437。
Siteφ表位:Siteφ表位是pre-F特异性抗体D25,AM22和5C4的靶点。McLellan等(McLellan JS,Chen M,et al.Science 2013,340:1113-1117)通过对pre-F特异性抗体与pre-F的复合物的结构进行解析发现,该表位涉及F蛋白中的松散区域(aa 62-69)和F蛋白中的α4螺旋(aa 196-209)。此外,研究结果还显示,当F蛋白由pre-F转变成post-F构象时,该表位发生了至少5A的位移,并且α4螺旋转换了180°。因此,识别该表位的抗体是pre-F特异性抗体,无法识别post-F蛋白。
之前的研究结果(McLellan JS,Chen M,et al.Science 2013,340:1113-1117)已显示,Siteφ表位具有高中和活性,且主要分布于pre-F构象上;Site II表位和Site IV表位的中和活性相对较弱,并且在pre-F和post-F构象中均有分布(图1)。
如本文中所使用的,术语“表位”是指,抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如,表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸,其可以是“线性的”或“构象的”。参见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中,蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于大约10
-5M,例如小于大约10
-6M、10
-7M、10
-8M、10
-9M或10
-10M或更小的亲和力(K
D)结合该抗原。
如本文中所使用的,术语“K
D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体以小于大约10
-5M,例如小于大约10
-6M、10
-7M、10
-8M、10
-9M或10
-10M或更小的解离平衡常数(K
D)结合抗原,例如,如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的,术语“中和表位”是指,能够诱发机体的针对病毒的中和活性的表位。此类表位不仅参与免疫系统(例如抗体)对病毒蛋白的识别,而且通常可诱发机体的免疫系统产生具有中和活性的抗体(即,中和抗体)。如本文中所使用的,“中和抗体”是指,能够显著降低或完全抑制目标病毒的毒力(例如,感染细胞的能力)的抗体。通常而言,中和抗体能够识别并结合目标病毒上的中和表位,并且阻止目标病毒进入/感染受试者的细胞。在本文中,表位的中和活性是指,表位诱发机体产生针对病毒的中和活性的能力。表位的中和活性越高,则其诱发机体产生针对病毒的中和活性的能力越强。
如本文中使用的,术语“免疫原性(immunogenicity)”是指,能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指,抗原能刺激特定的免疫细胞,使免疫细胞活化、增殖、分化,最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性,也指抗原刺激机体后,机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质,一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素:抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中所使用的,术语“分离的”或“被分离的”指的是,从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分,那么可能是其所处的天然环境发生了改变,或从天然环境下分离出该物质,或二者情况均有发生。例如,某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽,而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质,也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,能够被RSV病毒感染并允许RSV病毒在其中进行增殖的细胞。此类宿主细胞可以为贴壁细胞或悬浮细胞,并且包括原代细胞和已建立的细胞系。此类宿主细胞的实例包括但不限于,哺乳动物(例如啮齿类动物和灵长类动物,例如鼠、猴和人)的呼吸道上皮细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、宫颈细胞、卵巢细胞、骨细胞、乳腺细胞、横纹肌细胞、胃上皮细胞、皮肤表皮细胞、成纤维细胞和前列腺细胞;例如Hep-2细胞、CNE1细胞、CNE2细胞、BEL-7404细胞、BEL-7402细胞、QSG-7701细胞、PLC/PRF/5细胞、Huh7细胞、Huh7.5.1细胞、SSMC-7721细胞、BNL-HCC细胞、Hep3B、SNU-739细胞、TIB75细胞、A549细胞、H480细胞、H1299细胞、H441细胞、H368细胞、H1335细胞、H23细胞、L929细胞、293FT细胞、293T细胞、293β5细胞、Vero细胞、BHK-MKL细胞、RK-13细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、SK-OV-3细胞、U2-OS细胞、143B细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、T-47D细胞、RD细胞、BGC-823细胞、AGS细胞、A431NS细胞、MeWo细胞、LNCap细胞、RM1细胞和PC-3细胞。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的,术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂,当其与抗原一起或预先递送入机体时,其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种,包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最 常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如,预防疾病(例如RSV感染或与RSV感染相关的疾病)有效量是指,足以预防,阻止,或延迟疾病(例如RSV感染或与RSV感染相关的疾病)的发生的量;治疗疾病有效量是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如,对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的,术语“受试者”是指哺乳动物,例如灵长类动物,例如人。
本发明人经过大量的实验研究,出人意料地发现:在固定/灭活宿主细胞表面的RSV病毒时,通过使用特定的固定剂(例如甲醇,甲醛,多聚甲醛等),并使用特定的固定/灭活条件(例如特定的固定剂浓度),能够获得特别有利的灭活RSV病毒,其与常规方法获得的灭活病毒相比,包含更高含量的pre-F蛋白(即,在本发明获得的灭活RSV病毒中,更多的F蛋白以pre-F构象存在)。这是特别有利的,因为此类灭活RSV病毒将展示更多的只存在于pre-F蛋白、而不存在于post-F蛋白中的强中和表位,从而能够诱发机体产生更强的针对RSV病毒的中和活性,因而特别适合用于开发抗RSV病毒的疫苗,用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
因此,在一个方面,本发明提供了一种灭活呼吸道合胞病毒(RSV)且稳定所述RSV病毒中的pre-F蛋白的方法,其包括以下步骤:
(1)提供包含活的RSV病毒的宿主细胞;
(2)使用选自下列的固定剂对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活:甲醇溶液,甲醛溶液,和多聚甲醛溶液;其中,甲醇的浓度按重量计为0.3125%-5%(w/w,下同);甲醛的浓度按重量计为0.0069%-0.1185%(w/w,下同);多聚甲醛的浓度按重量计为0.0173%-1%(w/w,下同);和
(3)从步骤(2)的产物中去除所述固定剂,从而获得灭活的RSV病毒。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,通过下述步骤来提供活的RSV病毒:(1a)用RSV病毒感染宿主细胞;(1b)在允许RSV病毒增殖的条件下,培养步骤(1a)获得 的经感染的宿主细胞;和(1c)收集步骤(1b)获得的经培养的宿主细胞,其包含活的RSV病毒。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为贴壁细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为原代细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为已建立的细胞系。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞选自哺乳动物(例如啮齿类动物和灵长类动物,例如鼠、猴和人)的呼吸道上皮细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、宫颈细胞、卵巢细胞、骨细胞、乳腺细胞、横纹肌细胞、胃上皮细胞、皮肤表皮细胞、成纤维细胞和前列腺细胞;例如Hep-2细胞、CNE1细胞、CNE2细胞、BEL-7404细胞、BEL-7402细胞、QSG-7701细胞、PLC/PRF/5细胞、Huh7细胞、Huh7.5.1细胞、SSMC-7721细胞、BNL-HCC细胞、Hep3B、SNU-739细胞、TIB75细胞、A549细胞、H480细胞、H1299细胞、H441细胞、H368细胞、H1335细胞、H23细胞、L929细胞、293FT细胞、293T细胞、293β5细胞、Vero细胞、BHK-MKL细胞、RK-13细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、SK-OV-3细胞、U2-OS细胞、143B细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、T-47D细胞、RD细胞、BGC-823细胞、AGS细胞、A431NS细胞、MeWo细胞、LNCap细胞、RM1细胞和PC-3细胞。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,通过用刮刀刮取或者通过用胰酶消化或者通过过滤或离心来收集所述经培养的宿主细胞。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,在收集所述经培养的宿主细胞之前,对所述经培养的宿主细胞进行洗涤。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,使用缓冲液(例如PBS)来对所述经培养的宿主细胞进行洗涤,随后回收所述宿主细胞(例如通过过滤或离心)。在某些优选的实施方案中,所述活的RSV病毒位于所述宿主细胞的表面。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为甲醇溶液并且甲醇的浓度为0.3125%-5%。在某些优选的实施方案中,甲醇的浓度为0.3125%-0.625%,0.625%-1.25%,1.25%-2.5%,或者2.5%-5%。在某些优选的实施方案中,所述甲醇溶液为甲醇溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用甲醇溶液来对所述包含活 的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用甲醇溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过12h,例如0.5-12h(例如,0.5-1h,1-5h,或5-12h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为甲醛溶液,并且甲醛的浓度为0.0069%-0.1185%。在某些优选的实施方案中,甲醛的浓度为0.0069%-0.0104%,0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%。在某些优选的实施方案中,所述甲醛溶液为甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。在某些优选的实施方案中,使用浓度为0.0069%-0.1185%(例如0.0069%-0.0104%,0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%)的甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续0.5-24h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,或12-24h)。在某些优选实施方案中,使用浓度为0.0104%-0.1185%(例如0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%)的甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为多聚甲醛溶液,并且多聚甲醛的浓度为0.0173%-1%。在某些优选的实施方案中,多聚甲醛的浓度为0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,0.2963%-0.4444%,或0.4444%-1%。 在某些优选的实施方案中,所述多聚甲醛溶液为多聚甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在0-10℃(例如0℃,4℃,或10℃)的温度下,使用浓度为0.0585%-1%(例如0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,0.2963%-0.4444%,或0.4444%-1%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过24h,例如0.5-24h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,或12-24h)。
在某些优选的实施方案中,在0-10℃(例如0℃,4℃,或10℃)的温度下,使用浓度为0.0585%-0.4444%(例如0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,或0.2963%-0.4444%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在20-30℃(例如20℃,25℃或30℃)的温度下,使用浓度为0.0173%-0.1975%(例如0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,或0.1317%-0.1975%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在35-40℃(例如35℃,37℃或40℃)的温度下,使用浓度为0.0173%-0.1317%(例如0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,或0.878%-0.1317%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的 宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过透析、过滤或离心来去除所述固定剂。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过下述步骤来去除所述固定剂:(3a)对步骤(2)的产物进行过滤或离心,并收集经固定的宿主细胞,其包含灭活的RSV病毒;(3b)用缓冲液洗涤步骤(3a)收集的经固定的宿主细胞;和,(3c)回收步骤(3b)中的经洗涤的宿主细胞,其包含灭活的RSV病毒(例如,通过过滤或离心)。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过将步骤(2)的产物透析到不含固定剂的溶液中来去除所述固定剂。例如,在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过将步骤(2)的产物透析到盐浓度为100-600mM的盐溶液中(例如盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM的磷酸盐缓冲液(PBS)),来去除所述固定剂。
在某些优选的实施方案中,所述经灭活的RSV病毒中显著量的pre-F蛋白(例如至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,或更多的pre-F蛋白)能够维持其构象至少24h,例如至少48h,或至少96h。
在另一个方面,本发明提供了一种灭活的RSV病毒,其通过如上所述的方法制备。在某些优选的实施方案中,所述灭活的RSV病毒包含pre-F蛋白。在某些优选的实施方案中,所述灭活的RSV病毒中显著量的pre-F蛋白(例如至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,或更多的pre-F蛋白)能够维持其构象至少24h,例如至少48h,或至少96h。
在另一个方面,本发明提供了一种制备包含pre-F蛋白的免疫原性组合物的方法,其包括以下步骤:
(1)提供包含活的RSV病毒的宿主细胞;
(2)使用选自下列的固定剂对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活:甲醇溶液,甲醛溶液,和多聚甲醛溶液;其中,甲醇的浓度按重量计为0.3125%-5%(w/w,下同);甲醛的浓度按重量计为0.0069%-0.1185%(w/w,下同);多聚甲醛的浓度按重量计为0.0173%-1%(w/w,下同);和
(3)从步骤(2)的产物中去除所述固定剂,从而获得包含pre-F蛋白的免疫原性组合物。
在某些优选的实施方案中,在步骤(1)中,通过下述步骤来提供活的RSV病毒:(1a)用RSV病毒感染宿主细胞;(1b)在允许RSV病毒增殖的条件下,培养步骤(1a)获得的经感染的宿主细胞;和(1c)收集步骤(1b)获得的经培养的宿主细胞,其包含活的RSV病毒。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为贴壁细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为原代细胞。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞为已建立的细胞系。在某些优选的实施方案中,所述宿主细胞选自哺乳动物(例如啮齿类动物和灵长类动物,例如鼠、猴和人)的呼吸道上皮细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、宫颈细胞、卵巢细胞、骨细胞、乳腺细胞、横纹肌细胞、胃上皮细胞、皮肤表皮细胞、成纤维细胞和前列腺细胞;例如Hep-2细胞、CNE1细胞、CNE2细胞、BEL-7404细胞、BEL-7402细胞、QSG-7701细胞、PLC/PRF/5细胞、Huh7细胞、Huh7.5.1细胞、SSMC-7721细胞、BNL-HCC细胞、Hep3B、SNU-739细胞、TIB75细胞、A549细胞、H480细胞、H1299细胞、H441细胞、H368细胞、H1335细胞、H23细胞、L929细胞、293FT细胞、293T细胞、293β5细胞、Veto细胞、BHK-MKL细胞、RK-13细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、SK-OV-3细胞、U2-OS细胞、143B细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、T-47D细胞、RD细胞、BGC-823细胞、AGS细胞、A431NS细胞、MeWo细胞、LNCap细胞、RM1细胞和PC-3细胞。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,通过用刮刀刮取或者通过用胰酶消化或者通过过滤或离心来回收所述经培养的宿主细胞。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,在回收所述经培养的宿主细胞之前,对所述经培养的宿主细胞进行洗涤。在某些优选的实施方案中,在步骤(1c)中,使用缓冲液(例如PBS)来对所述经培养的宿主细胞进行洗涤,随后回收所述宿主细胞(例如通过过滤或离心)。在某些优选的实施方案中,所述活的RSV病毒位于所述宿主细胞的表面。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为甲醇溶液,并且甲醇的浓度为0.3125%-5%。在某些优选的实施方案中,甲醇的浓度为0.3125%-0.625%,0.625%-1.25%,1.25%-2.5%,或者2.5%-5%。在某些优选的实施方案中,所述甲醇溶液为甲醇溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM, 150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用甲醇溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用甲醇溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过12h,例如0.5-12h(例如,0.5-1h,1-5h,或5-12h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为甲醛溶液,并且甲醛的浓度为0.0069%-0.1185%。在某些优选的实施方案中,甲醛的浓度为0.0069%-0.0104%,0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%。在某些优选的实施方案中,所述甲醛溶液为甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续0.5-48h(例如,0.5-1b,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。在某些优选的实施方案中,使用浓度为0.0069%-0.1185%(例如0.0069%-0.0104%,0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%)的甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续0.5-24h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,或12-24h)。在某些优选实施方案中,使用浓度为0.0104%-0.1185%(例如0.0104%-0.0156%,0.0156%-0.0234%,0.0234%-0.0244%,0.0244%-0.0351%,0.0351%-0.0527%,0.0527%-0.079%,0.079%-0.0977%,或0.0977%-0.1185%)的甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(2)中,所述固定剂为多聚甲醛溶液,并且多聚甲醛的浓度为0.0173%-1%。在某些优选的实施方案中,多聚甲醛的浓度为0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,0.2963%-0.4444%,或0.4444%-1%。在某些优选的实施方案中,所述多聚甲醛溶液为多聚甲醛溶于无机溶剂的溶液。优选地,所述无机溶剂选自水、培养基和缓冲液。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。在某些示例性实施方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),并且其盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,600-650mM,例如150mM,330mM,550mM。在某些优选的实施方案中,在0-40℃的温度(例如0-4℃,4-10℃,10-15℃,15-20℃,20-25℃,25-30℃,30-35℃,35-37℃,或37℃-40℃;例如4℃,25℃或37℃)下,使用多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活。在某些优选的实施方案中,使用多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在0-10℃(例如0℃,4℃,或10℃)的温度下,使用浓度为0.0585%-1%(例如0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,0.2963%-0.4444%,或0.4444%-1%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过24h,例如0.5-24h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,或12-24h)。
在某些优选的实施方案中,在0-10℃(例如0℃,4℃,或10℃)的温度下,使用浓度为0.0585%-0.4444%(例如0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,0.1317%-0.1975%,0.1975%-0.25%,0.25%-0.2963%,或0.2963%-0.4444%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如,0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h,或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在20-30℃(例如20℃,25℃或30℃)的温度下,使用浓度为0.0173%-0.1975%(例如0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,0.878%-0.1317%,或0.1317%-0.1975%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例 如0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在35-40℃(例如35℃,37℃或40℃)的温度下,使用浓度为0.0173%-0.1317%(例如0.0173%-0.0585%,0.0585%-0.0625%,0.0625%-0.878%,或0.878%-0.1317%)的多聚甲醛溶液来对所述包含活的RSV病毒的宿主细胞进行固定和灭活,持续不超过48h,例如0.5-48h(例如0.5-1h,1-5h,5-12h,12-24h或24-48h)。
在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过透析、过滤或离心来去除所述固定剂。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过下述步骤来去除所述固定剂:(3a)对步骤(2)的产物进行过滤或离心,并收集经固定的宿主细胞,其包含灭活的RSV病毒;(3b)用缓冲液洗涤步骤(3a)收集的经固定的宿主细胞;和,(3c)回收步骤(3b)中的经洗涤的宿主细胞,其包含灭活的RSV病毒(例如,通过过滤或离心)。在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过将步骤(2)的产物透析到不含固定剂的溶液中来去除所述固定剂。例如,在某些优选的实施方案中,在步骤(3)中,通过将步骤(2)的产物透析到盐浓度为100-600mM的盐溶液中(例如盐浓度为100-600mM,例如100-150mM,150-200mM,200-250mM,250-300mM,300-350mM,350-400mM,400-450mM,450-500mM,500-550mM,550-600mM,例如150mM,330mM,550mM的磷酸盐缓冲液(PBS)),来去除所述固定剂。
在某些优选的实施方案中,所述免疫原性组合物中显著量的pre-F蛋白(例如至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,或更多的pre-F蛋白)能够维持其构象至少24h,例如至少48h,或至少96h。
在另一个方面,本发明提供了一种免疫原性组合物,其通过如上所述的方法制备。在某些优选的实施方案中,所述免疫原性组合物包含pre-F蛋白。在某些优选的实施方案中,所述免疫原性组合物中显著量的pre-F蛋白(例如至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,或更多的pre-F蛋白)能够维持其构象至少24h,例如至少48h,或至少96h。
在另一个方面,本发明提供了一种疫苗,其包含根据本发明的灭活的RSV病毒或根据本发明的免疫原性组合物,以及任选地,药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。本发明的疫苗可用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相 关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,本发明提供了一种制备疫苗的方法,其包括,将根据本发明的灭活的RSV病毒或根据本发明的免疫原性组合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)混合。
在另一个方面,本发明提供了一种用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)的方法,其包括,给有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的灭活的RSV病毒,或根据本发明的免疫原性组合物,或根据本发明的疫苗。
在另一个方面,提供了本发明的灭活的RSV病毒或免疫原性组合物在制备疫苗中的用途,所述蛋白疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,提供了本发明的灭活的RSV病毒或免疫原性组合物,其用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
本发明所提供的灭活的RSV病毒,免疫原性组合物和疫苗可以单独使用或联合使用,也可以与其他药学活性剂(例如干扰素类药物,如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。
发明的有益效果
与现有技术相比,本发明的技术方案具有以下有益效果:
(1)本发明的方法能够用于制备包含pre-F蛋白的灭活RSV病毒和免疫原性组合物,并维持和稳定pre-F蛋白的构象。
(2)本发明的灭活RSV病毒和免疫原性组合物,与常规方法获得的灭活病毒相比,包含更高含量的pre-F蛋白。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了pre-F和post-F蛋白上的中和表位的分布。结果显示,pre-F和post-F蛋白共享了约50%的蛋白表面,并且,具有高中和活性的表位(强中和表位)例如site中主要分布于pre-F构象上,而post-F构象主要包含中和活性较弱的表位(弱中和表位),例如site II和site IV。
图2显示了用9F7抗体(图2A)、5C4抗体(图2B)或8C2抗体(图2C)孵育的样品的流式细胞分析结果,其中,所述样品为未经固定的hRSV感染的Hep-2细胞(重悬于PBS中);横坐标(GaM-FITC(FITC标记的山羊抗小鼠抗体))表示FITC的信号强度;纵坐标(count)表示细胞计数。在图2A中,根据阴性对照样品的流式细胞分析结果,设定了FITC信号的阈值(以虚线表示);在该阈值下,所述阴性对照样品中阳性细胞的百分比为0.472%。在图2B和2C中,根据图2A设定的阈值可以确定,用5C4抗体孵育的样品中阳性细胞的百分比为53.9%;用8C2抗体孵育的样品中阳性细胞的百分比为53.0%。
图3显示了在4℃用指定浓度的β-丙内酯处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图3A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图3B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示β-丙内酯的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图4显示了在4℃用指定浓度的戊二醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图4A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图4B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示戊二醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图5显示了在25℃用指定浓度的甲醇处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图5A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图5B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醇的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图6显示了在37℃用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图6A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图6B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图7显示了在4℃用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图7A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F 构象)的细胞的阳性率(图7B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图8显示了在37℃用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图8A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图8B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图9显示了在4℃用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图9A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图9B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图10显示了在4℃、25℃或37℃下用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图10A-10C,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图10D-10F,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图11显示了在1*PBS缓冲液中保存的经甲醛处理的样品和未经固定剂处理的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率随时间的变化情况;其中横坐标表示在1*PBS缓冲液中保存的时间(小时),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
图12显示了,用经不同固定条件处理的样品免疫小鼠后,小鼠血清中的RSV中和抗体的水平。其中,纵坐标表示,各个免疫组的待测血清样品相对于8C2单抗的中和能力(以1mg/mL的8C2抗体为1个中和单位);横坐标表示各种固定条件,F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,no immuno表示未进行免疫的小鼠;线型则显示了各个免疫组的多个小鼠血清样品的平均中和能力(即,平均值和标准误)。
图13显示了,用hRSVA2对小鼠进行攻毒后第5天,小鼠肺组织的组织切片的HE染色结果,所述小鼠在攻毒之前用经不同固定条件处理的样品进行了免疫,其中F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,No immuno表示未进行免疫但进行了攻毒的小鼠,No infection表示未进行攻毒的小鼠。
图14显示了用hRSVA2对小鼠进行攻毒后第5天,小鼠肺组织的组织切片的炎症评分结果,所述小鼠在攻毒之前用经甲醛(图14A-14C)或多聚甲醛(图14D-14F)处理的样品进行了免疫,其中,图14A和14D显示的是血管围管现象(perivascular cuffing)的评分结果;图14B和14E显示的是间质性肺炎或肺泡炎(interstitial pneumonia or alveolitis)的评分结果;图14C和14F显示的是细支气管炎(bronchiolitis)的评分结果;F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,No immuno表示未进行免疫但进行了攻毒的小鼠,No infection表示未进行攻毒的小鼠。
序列描述
本申请涉及的序列的信息如下:
SEQ ID NO:1(F蛋白的氨基酸序列)
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.宿主细胞的固定和RSV病毒的灭活
1.材料和仪器:
hRSV(pSynkRSV A2D46F):人呼吸道合胞病毒标准株,获自美国国立卫生院NIH。
5C4抗体:实验室自制。5C4抗体特异性识别并结合pre-F蛋白,而不识别或结 合post-F蛋白。5C4抗体识别pre-F蛋白上的Siteφ表位,并且其为强中和抗体,中和活性显著高于Palivizumab。有关5C4抗体的详细信息可参见,中国专利申请201480013927.7和PCT国际申请PCT/CN2014/073505。
8C2抗体:实验室自制。8C2抗体与pre-F蛋白和post-F蛋白均能够发生特异性结合。8C2抗体识别pre-F蛋白和post-F蛋白上的Site II表位,并且其为中和抗体,中和活性与Palivizumab基本上相当。
9F7抗体:实验室自制。9F7抗体为特异性识别戊型肝炎病毒的抗体,与pre-F蛋白或post-F蛋白均不能够发生特异性反应。有关9F7抗体的详细信息可参见,例如,Min Zhao et al.J Biol Chem,2015,290:19910-19922)。
GaM-FITC:FITC标记的山羊抗小鼠抗体,获自Sigma公司。
Facsaria III流式细胞仪:获自BD公司。
2.感染病毒的细胞的准备
将Hep-2细胞
接种于细胞培养板中,并用含有10%FBS(Gibco,货号:10099141)和100U/ml青霉素-链霉素(Gibco,货号:15140122)的MEM培养基(Gibco,货号:11095072)进行培养。当细胞密度达到80%-90%汇合时,用hRSV(pSynkRSV A2D46F)感染细胞,MOI=0.3。感染后,继续培养细胞72h。培养后,用细胞刮刀收集细胞。
3.宿主细胞的固定和RSV病毒的灭活
在各个EP管中分别加入指定类型和浓度的固定液。在37℃化冻病毒,将病毒液与各固定液混合均匀,并在指定的温度下固定指定的时间。所使用的固定液如下:
甲醇(CH
3OH,AR,西陇化工,货号:1030003AR500);
β-丙内酯(SERVA,货号:57-57-8);
甲醛(CH
2O,CP,西陇化工,货号:50-00-0);
多聚甲醛(HO(CH
2O)
nH,n=10-100,SIGMA-ALDRICH,货号:16005)。
固定后,在25℃,在1*PBS(0.27g/L磷酸二氢钾,1.42g/L磷酸氢二钠,8g/L氯化钠,0.2g/L氯化钾;pH 7.4)中透析18h,以除去残余的固定液。透析完毕,取出样品,置于1.5ml EP管中待用。
4.pre-F蛋白和post-F蛋白的检测
在室温下,用100μl一级抗体(20ng/μl,稀释于1*PBS中)孵育EP管中的病毒和细胞20min。所使用的一级抗体包括:特异性结合pre-F蛋白的5C4抗体;结合pre-F蛋白和post-F蛋白的8C2抗体;以及,不结合pre-F蛋白和post-F蛋白的9F7抗体。孵育后,在25℃以200g离心EP管3min,并弃去上清。用100μl 1*PBS洗涤EP管中的病毒和细胞一次。随后,在室温下,用100μl二级抗体GaM-FITC(Sigma,货号:F5387-2mL;稀释于1*PBS中)孵育EP管中的病毒和细胞20min。使用Facsaria III流式细胞仪(BD公司,出厂编号:P64828200155)对所获得的样品进行检测,记录实验数据。
5.数据处理
对于每一种固定液而言,将用等体积的9F7抗体作为一级抗体孵育的样品用作阴性对照。根据阴性对照样品的流式细胞分析结果,设定FITC信号的阈值。在该阈值下,阴性对照样品中被判定为阳性的细胞(即,FITC信号高于该阈值的细胞)的百分比不高于0.5%。然后,根据该阈值,确定经相同固定液处理的、用5C4抗体或8C2抗体孵育的样品中被判定为阳性的细胞的百分比。
图2显示了用9F7抗体(图2A)、5C4抗体(图2B)或8C2抗体(图2C)孵育的样品的流式细胞分析结果,其中,所述样品为未经固定的hRSV感染的Hep-2细胞(重悬于PBS中);横坐标(GaM-FITC(FITC标记的山羊抗小鼠抗体))表示FITC的信号强度;纵坐标(count)表示细胞计数。在图2A中,根据阴性对照样品的流式细胞分析结果,设定了FITC信号的阈值(以虚线表示);在该阈值下,所述阴性对照样品中阳性细胞的百分比为0.472%。在图2B和2C中,根据图2A设定的阈值可以确定,用5C4抗体孵育的样品中阳性细胞的百分比为53.9%;用8C2抗体孵育的样品中阳性细胞的百分比为53.0%。
通过类似的方法,可以确定各个测试样品中阳性细胞的百分比。随后,以未经固定液处理的样品(即,“感染病毒的细胞的准备”步骤中获得的细胞,其重悬于1*PBS中,且不进行固定和灭活,而被直接用于抗体孵育和随后的流式细胞分析;下文中也简称为“0h组”)中阳性细胞的百分比为参照,对在不同固定条件下进行固定和灭活的各个样品中阳性细胞的百分比进行标准化(即,计算各个样品中阳性细胞的相对比例(阳性率))。
某一样品的阳性率=该样品中阳性细胞的百分比/未经固定液处理的样品中阳性细胞的百分比×100%
6.实验结果
6.1固定剂及其浓度的选择
我们首先评估了几种固定剂在指定浓度下的固定和灭活效果。对于这些固定剂而言,我们采用了药典或参考文献中推荐的用于固定的条件(包括温度)。
简言之,将甲醇用1*PBS配制为指定的浓度(80%、20%、5%、1.25%、0.3125%或0%),并于25℃静置30min。随后,在25℃下,将配制的甲醇溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(1h、5h、12h或24h)。0%的浓度表示,样品用1*PBS重悬,并孵育指定的时间(下同)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
将β-丙内酯用1*PBS配制为指定的浓度(1.6%、0.4%、0.025%、0.00625%、0.001563%或0.000391%),并于4℃静置30min。随后,在4℃下,将配制的β-丙内酯溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(1h、5h、12h或24h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
将戊二醛用1*PBS配制为指定的浓度(0.15625%、0.039063%、0.009766%、0.002441%、0.00061%、0.000153%、0.000038%、0.00001%或0%),并于4℃静置30min。随后,在4℃下,将配制的戊二醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(0.25h、0.5h、1h、5h或12h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
将甲醛用1*PBS配制为指定的浓度(25%、6.25%、1.5625%、0.3906%、0.0977%、0.0244%、0.0061%、或0.0015%),并于37℃静置30min。随后,在37℃下,将配制的甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(1h、5h、12h、24h或48h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
将多聚甲醛用1*PBS配制为指定的浓度(4%、1%、0.25%、0.0625%、0.0156%、0.0039%或0.001%),并于4℃静置30min。随后,在4℃下,将配制的多聚甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(1h、12h、24h或48h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
实验结果如图3-7所示。图3显示了用指定浓度的β-丙内酯处理指定时间的样 品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图3A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图3B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示β-丙内酯的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。结果显示,用指定浓度的β-丙内酯处理样品12h或24h后,样品中的细胞几乎不含有pre-F蛋白。这一结果表明,β-丙内酯无法稳定或维持pre-F蛋白的构象,不适合用于灭活RSV病毒。
图4显示了用指定浓度的戊二醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图4A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图4B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示戊二醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。结果显示,用指定浓度的戊二醛处理样品12h后,样品中的细胞几乎不含有pre-F蛋白。这一结果表明,戊二醛无法稳定或维持pre-F蛋白的构象,不适合用于灭活RSV病毒。
图5显示了用指定浓度的甲醇处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图5A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图5B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醇的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。结果显示,在用浓度为0.3125%-5%的甲醇处理样品1、5或12h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明,在进行长达12小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.3125%-5%范围内的甲醇能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。
图6显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图6A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图6B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。结果显示,在用浓度为0.0244%-0.0977%的甲醛处理样品1、5、12h、24h或48h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明,在进行长达48小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0244%-0.0977%范围内的甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。
图7显示了用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图7A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图7B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%), 纵坐标表示细胞的阳性率(%)。结果显示,在用浓度为0.0625%-1%的多聚甲醛处理样品1、5、12h、或24h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明,在进行长达24小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0625%-1%范围内的多聚甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。此外,结果还显示,在进行长达48小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0625%-0.25%范围内的多聚甲醛依然能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。
此外,图4-5的结果还显示,在不使用固定剂,而仅用1*PBS温育样品的情况下,在温育12小时后,样品与抗体5C4的反应性显著降低,甚至消失,但仍然保持与8C2抗体的高反应性。这一结果表明,样品中的pre-F蛋白不稳定,在1*PBS温育过程中发生了变构;并且,温育12小时后,样品中几乎不再存在pre-F蛋白。
图3-7的结果还显示,不同的固定剂对pre-F蛋白的影响各不相同。特别地,图3-4的结果显示,与低浓度的β-丙内酯(或戊二醛)的处理相比,高浓度的β-丙内酯(或戊二醛)的处理导致样品与5C4抗体的反应性更快速地下降(即,pre-F蛋白的变构更快速地进行)。这些结果表明,β-丙内酯与戊二醛对pre-F蛋白的变构起促进作用。β-丙内酯与戊二醛不利于RSV F蛋白pre-fusion构象的维持和稳定。
相比之下,图5-7的实验结果则显示,甲醇、甲醛及多聚甲醛对F蛋白的pre-F构象的影响与其浓度有关;它们各自具有适于稳定pre-F蛋白的最佳浓度范围。特别地,当用浓度为0.3125%-5%的甲醇进行固定时,固定时间可长达12小时,且固定后的样品中仍然保留显著量的pre-F蛋白。当用浓度为0.0244%-0.0977%的甲醛进行固定时,固定时间可长达48小时,且固定后的样品中仍然保留显著量的pre-F蛋白。当用浓度为0.0625%-1%的多聚甲醛进行固定时,固定时间可长达24小时,且固定后的样品中仍然保留显著量的pre-F蛋白。当用浓度为0.0625%-0.25%的多聚甲醛进行固定时,固定时间可长达48小时,且固定后的样品中仍然保留显著量的pre-F蛋白。
此外,图5-7的实验结果还显示,当甲醇、甲醛或多聚甲醛以低于最佳浓度范围的浓度使用时,在12小时的处理后,样品与5C4抗体的反应性(pre-F蛋白)显著降低,趋于完全消失;但样品与8C2抗体的反应性未发生显著变化。当甲醇、甲醛或多聚甲醛以高于最佳浓度范围的浓度使用时,在12小时的处理后,样品与5C4抗体和8C2抗体的反应性(pre-F蛋白和post-F蛋白)均显著降低,这表明F蛋白(pre-F和post-F)的表位易于被高浓度的固定剂彻底破坏。
F蛋白的pre-F构象已被证实是能够诱导抗RSV保护性抗体应答的优选构象。并且,之前的研究已显示,pre-F蛋白诱导的中和抗体滴度比post-F蛋白高1-2个LOG。如上文分析的,通过本发明方法获得的灭活RSV病毒(免疫原性组合物)保留了显著量的pre-F蛋白,因此,特别适合用作抗病毒疫苗,用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病。
6.2甲醛及多聚甲醛的浓度的选择
我们进一步研究了甲醛及多聚甲醛的最佳使用浓度范围。简言之,将甲醛用1*PBS配制为指定的浓度(0.4%、0.2667%、0.1778%、0.1185%、0.079%、0.0527%、0.0351%、0.0234%、0.0156%、0.0104%、0.0069%、0.0046%、或0.0031%),并于37℃静置30min。随后,在37℃下,将配制的甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(24h或48h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
此外,将多聚甲醛用1*PBS配制为指定的浓度(1%、0.6667%、0.4444%、0.2963%、0.1975%、0.1317%、0.0878%、0.0585%、0.039%、0.026%、0.0173%、0.0116%或0%),并于4℃静置30min。随后,在4℃下,将配制的多聚甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(24h或48h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
实验结果如图8-9所示。图8显示了用指定浓度的甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图8A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图8B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
结果显示,在用浓度为0.0069%-0.1185%的甲醛处理样品24h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明,在进行长达24小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0069%-0.1185%范围内的甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。此外,结果还显示,在进行长达48小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0104%-0.1185%范围内的多聚甲醛依然能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。另外,结果还显示,当处理时间为24h时,用浓度为0.0156%-0.079%的甲醛处理的样品中pre-F蛋白阳性的细胞的含量最高;并且,当处 理时间为48h时,用浓度为0.0234%-0.0527%的甲醛处理的样品中pre-F蛋白阳性的细胞的含量最高。
图9显示了用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图9A,用5C4抗体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图9B,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
结果显示,在用浓度为0.0585%-0.4444%的多聚甲醛处理样品24h或48h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。这一结果表明,在进行长达48小时的固定和灭活的情况下,浓度在0.0585%-0.4444%范围内的多聚甲醛能够稳定和维持pre-F蛋白的构象,从而特别适合用于灭活RSV病毒。另外,结果还显示,当处理时间为24h时,用浓度为0.0585%-0.4444%的多聚甲醛处理的样品中pre-F蛋白阳性的细胞的含量最高;并且,当处理时间为48h时,用浓度为0.0878%-0.2963%的甲醛处理的样品中pre-F蛋白阳性的细胞的含量最高。
6.3温度的选择
我们进一步研究了温度对固定剂的固定作用的影响。一般而言,甲醇溶液和甲醛溶液是相对稳定的固定剂,其固定作用基本上不受温度变化的影响。我们的实验结果也已显示,最佳浓度范围内的甲醇溶液和甲醛溶液在0-40℃的温度下,均能够用于固定和灭活RSV病毒,并稳定和维持灭活病毒中的pre-F蛋白。
多聚甲醛在低温条件(0-10℃)下是相对稳定的,但在较高的温度下可发生降解,形成甲醛。因此,通常在低温条件下(例如4℃)使用多聚甲醛。为了研究温度对多聚甲醛的作用的影响,我们进一步进行了以下实验。
简言之,将多聚甲醛用1*PBS配制为指定的浓度(0.44%、0.1975%、0.1317%、0.0585%、0.0173%、或0.0116%),并于指定的温度下(4℃、25℃或37℃)静置30min。随后,在所述指定的温度下,将配制的多聚甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行指定的时间(24h或48h)。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品用于抗体孵育和流式细胞分析。
实验结果如图10所示。图10显示了在4℃、25℃或37℃下用指定浓度的多聚甲醛处理指定时间的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率(图10A-10C,用5C4抗 体孵育)以及含有F蛋白(pre-F构象和/或post-F构象)的细胞的阳性率(图10D-10F,用8C2抗体孵育);其中横坐标表示多聚甲醛的浓度(%),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
结果显示,在4℃下用浓度为0.0585%-0.44%的多聚甲醛处理样品24h或48h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。在25℃下用浓度为0.0173%-0.1975%的多聚甲醛处理样品24h或48h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。在37℃下用浓度为0.0173%-0.1317%的多聚甲醛处理样品24h或48h后,样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,稳定和维持了样品中的pre-F蛋白的构象)。
这些结果表明,多聚甲醛能够在不同温度下发挥其作用(即,灭活RSV病毒,且稳定和维持病毒中的pre-F蛋白),但是其最佳浓度范围需要根据实际使用的温度进行适当的调整。然而,最优选地,在低温条件(0-10℃)下使用多聚甲醛来固定和灭活RSV病毒,并稳定和维持pre-F蛋白。
实施例2.经固定的样品中pre-F蛋白的稳定性
在本实施例中,我们进一步研究了经固定的样品中pre-F蛋白的稳定性。简言之,将甲醛用1*PBS配制为0.0351%的浓度,并于37℃静置30min。随后,在37℃下,将配制的甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行24h。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品保存于1*PBS缓冲液中。另外,还将未经固定剂处理的样品保存于1*PBS缓冲液中,用作对照。随后,在室温保存指定的时间(48h或96h)后,将样品用于上文描述的抗体孵育和流式细胞分析。
实验结果如图11所示。图11显示了在1*PBS缓冲液中保存的经甲醛处理的样品和未经固定剂处理的样品中,含有pre-F蛋白的细胞的阳性率随时间的变化情况;其中横坐标表示在1*PBS缓冲液中保存的时间(小时),纵坐标表示细胞的阳性率(%)。
结果显示,在保存长达96h后,经甲醛处理的样品中仍然包含显著量的pre-F蛋白阳性的细胞(即,样品中的pre-F蛋白保持稳定,未发生变构)。相比之下,在保存48h后,未经固定剂处理的样品中pre-F蛋白阳性的细胞的量即显著下降,趋近于消失。这些结果表明,本发明的固定和灭活RSV病毒的方法能够有效稳定RSV病毒中的pre-F蛋白,避免其转化为post-F蛋白。
实施例3.免疫保护性的检测
在本实施例中,我们研究了经甲醛固定液处理之后的样品(包含灭活RSV病毒的宿主细胞)的免疫保护性。简言之,将甲醛用1*PBS配制为25%、0.0527%、0.0351%的浓度,并于37℃静置30min。随后,在37℃下,将配制的各甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行24h。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品保存于生理盐水缓冲液中,用于对SPF级Balb/C小鼠进行皮下免疫(n=14)。免疫剂量为1*10
7个细胞/只小鼠,不加佐剂,免疫周期为每10天一次,共进行4次。免疫结束后10天,通过眼球采血采集小鼠血液,检测血清的中和抗体的水平。
此外,我们还研究了经多聚甲醛固定液处理之后的样品(包含灭活RSV病毒的宿主细胞)的免疫保护性。简言之,将多聚甲醛甲醛用1*PBS配制为4%、0.2963%、0.1975%的浓度,并于4℃静置30min。随后,在4℃下,将配制的各多聚甲醛溶液用于重悬(固定)样品,进行24h。随后,如上文所述,去除固定剂,并将经固定的样品保存于生理盐水缓冲液中,用于对SPF级Balb/C小鼠进行皮下免疫(n=14)。免疫剂量为1*107个细胞/只小鼠,不加佐剂,免疫周期为每10天一次,共进行4次。免疫结束后10天,通过眼球采血采集小鼠血液,检测血清的中和抗体的水平。
通过如下方案来检测血清的中和抗体的水平。在96孔板(SIGMA-ALDRICH)中,将小鼠血清用培养基稀释。初始浓度为10倍稀释(即,90μl培养基+10μl血清),随后进行4倍连续稀释,共稀释9梯度。将75μl稀释后的血清与75μL RSV-A mkate病毒(滴度为9*10
4FFU;该病毒在感染细胞后可在细胞中表达荧光蛋白mkate,由此可通过mkate荧光强度判定感染强度)混匀,并于37℃孵育1小时。随后,将100μl血清和病毒的混合液加入到预先铺好Hep-2细胞(ATCC)(3*10
4个细胞每孔)的96孔细胞板中,并且将细胞板于37℃培养24小时。然后,用PARADIGM多功能读板仪(BECKMAN COULTER)读取各个孔的荧光值。用Graph Prism软件对检测结果进行统计分析,并通过曲线拟合计算每个血清样品中和病毒的IC
50。另外,在实验中将8C2单抗用作阳性对照,并且利用IC
50数据,计算各个血清样品相对于8C2单抗的中和能力(以1mg/mL的8C2抗体为1个中和单位)。
实验结果如图12所示。图12显示了,用经不同固定条件处理的样品免疫小鼠后,小鼠血清中的RSV中和抗体的水平。其中,纵坐标表示,各个免疫组的待测血清样品相对于8C2单抗的中和能力(以1mg/mL的8C2抗体为1个中和单位);横坐标表示 各种固定条件,F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,no immuno表示未进行免疫的小鼠;线型则显示了各个免疫组的多个小鼠血清样品的平均中和能力(即,平均值和标准误)。
结果显示,用0.0351%或0.0527%的甲醛溶液或者0.1975%或0.2963%多聚甲醛溶液固定的样品能够在小鼠体内激发较高水平的中和抗体。相比之下,用25%甲醛溶液和4%多聚甲醛溶液处理的样品在小鼠体内激发中和抗体水平的能力较低。
此外,在免疫结束后第10天,还使用hRSVA2对各个免疫组的小鼠进行攻毒。攻毒方案为鼻腔施用100μL病毒悬液,攻毒剂量为1*10
7PFU/只小鼠。攻毒后第5天,取小鼠肺组织,并进行脱水包埋(徕卡ASP200)和组织切片(徕卡石蜡切片机RM2235)。随后,对获得的组织切片进行HE染色,并在显微镜下进行观察。按照之前报道的炎症评分标准对组织切片进行炎症评分(Mucosal delivery of a vectored RSV vaccine is safe and elicits protective immunity in rodents and nonhuman primates)。
实验结果如图13和14所示。
图13显示了,用hRSVA2对小鼠进行攻毒后第5天,小鼠肺组织的组织切片的HE染色结果,所述小鼠在攻毒之前用经不同固定条件处理的样品进行了免疫,其中F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,No immuno表示未进行免疫但进行了攻毒的小鼠,No infection表示未进行攻毒的小鼠。
图14显示了用hRSVA2对小鼠进行攻毒后第5天,小鼠肺组织的组织切片的炎症评分结果,所述小鼠在攻毒之前用经甲醛(图14A-14C)或多聚甲醛(图14D-14F)处理的样品进行了免疫,其中,图14A和14D显示的是血管围管现象(perivascular cuffing)的评分结果;图14B和14E显示的是间质性肺炎或肺泡炎(interstitial pneumonia or alveolitis)的评分结果;图14C和14F显示的是细支气管炎(bronchiolitis)的评分结果;F表示甲醛,PF表示多聚甲醛,No immuno表示未进行免疫但进行了攻毒的小鼠,No infection表示未进行攻毒的小鼠。
图13-14的结果显示,与使用经25%甲醛溶液和4%多聚甲醛溶液处理的样品的免疫组以及对照组(未进行免疫)相比,使用经0.0351%或0.0527%的甲醛溶液或者0.1975%或0.2963%多聚甲醛溶液处理的样品的免疫组的小鼠在接受攻毒后肺组织炎症的严重程度显著更低,炎症细胞浸润以及血管、气管和支气管壁的增厚均显著降低。这进一步说明,利用本发明方法处理的样品具有更强的免疫保护能力,能够更好地帮 助小鼠抵抗RSV病毒的感染以及由此引发的病症。因此,利用本发明方法处理的样品可用作预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病的疫苗。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。