CN111024468A - 一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法 - Google Patents

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陈建春
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Abstract

本发明提供了一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，包括以下步骤：(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 0.8‑1.5g/L、KH2PO4 0.45‑1g/L和NaCl 4.5‑15g/L；(2)将耗材管振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，离心，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，振荡混匀，离心，弃上清，将剩余的液体混合物震荡混匀，得到细胞混合物样本；(3)将上述细胞混合物样本加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入干燥箱中完全干燥。上述样本的处理方法可以在不进行丙酮固定步骤的情况下很好地实现后续呼吸道病原体免疫荧光检测，且不需要使用危险性化学品，更加安全环保。

Description

一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法。
背景技术
呼吸道病毒抗原七项是采用直接免疫荧光技术检测流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型。将鼻咽拭子的细胞培养液进行清洗、离心，将纯化后的细胞培养液加到反应板上相应的疏水孔位置，然后进行干燥、固定、染色、阅片等步骤。
用于细胞固定的试剂种类较多，常用的主要有醛类和醇类。目前呼吸道病毒抗原七项检测大多使用丙酮进行细胞固定，但丙酮属于易燃、易挥发，化学性质较活泼的化学品，在使用过程中要严格按照公安局化学品使用规定，实际操作比较繁琐，存在一定的危险性。
因此，开发出一种不需要进行细胞固定的免疫荧光检测中样本的处理方法，一方面可以缩短检测时间，另一方面可以避免在检测过程中使用危险性化学品丙酮，具有非常重要的现实意义。
发明内容
基于此，本发明提供一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，所述方法可以在不进行丙酮固定步骤的情况下很好地实现呼吸道病原体免疫荧光检测，且不需要使用危险性化学品，更加安全环保。
具体技术方案为：
一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，包括以下步骤：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 0.8-1.5g/L、KH2PO4 0.45-1g/L和NaCl 4.5-15g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，离心，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后离心，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入干燥箱中至载玻片完全干燥。
在其中一些实施例中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 0.8-1.2g/L、KH2PO4 0.6-1g/L和NaCl 5-10g/L。
在其中一些实施例中，优选所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl 10g/L；使用上述配方的细胞保存液保存拭子样本可以取得更好的检测效果。
在其中一些实施例中，所述步骤(2)中离心的条件为2000rpm/min离心5min。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中每个疏水孔中加入20uL混合物。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中干燥温度为37℃，时间为30-40min。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中干燥温度为37℃，时间为30min。
在其中一些实施例中，所述呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法还包括以下步骤：待步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔处加入鉴定试剂进行反应后，将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留2-4s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留2-4s，取出载玻片。
在其中一些实施例中，优选将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片。
在其中一些实施例中，所述清洗缓冲液为含有0.1-0.2v/v％吐温20和0.05-0.2w/v％叠氮化钠的PBS缓冲液。
在其中一些实施例中，优选所述清洗缓冲液为含有0.2v/v％吐温20和0.1w/v％叠氮化钠的PBS缓冲液。
本发明将采集到的拭子样本放入装有上述细胞保存液的耗材管中，通过振荡和离心，使拭子样本上的待检测细胞脱落，并利用第二次离心弃上清后试管中剩余的细胞保存液将待检测细胞震荡混匀，得到细胞混合物样本；然后再将所述细胞混合物样本加入到载玻片的疏水孔处，待完全干燥后，即可用于鉴定检测。同时，本发明还优化了加入鉴定试剂进行反应后洗涤载玻片的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，经本发明方法处理的样本可以在不使用丙酮对细胞进行固定的情况下很好地实现后续呼吸道病原体的免疫荧光检测，且检测效果与经丙酮固定细胞后的检测效果相当。所述处理方法中利用本发明优化的细胞保存液保存拭子样本，然后再结合合适的洗片步骤，可以保证在不使用丙酮对细胞进行固定的情况下有效地实现呼吸道病原体的免疫荧光检测，尤其是针对流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的免疫荧光检测。
2.本发明样本的处理方法不使用含有危险性化学品，对操作者来说更安全，且对环境友好，绿色环保。
附图说明
图1为利用实施例2和对比例1-3对1号样本的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法
本实施例一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，包括以下步骤：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl10g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，2000rpm/min离心5min，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后2000rpm/min离心5min，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本20uL加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入37℃干燥孵育箱干燥30min；
在呼吸道病原体免疫荧光检测过程中，会向步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔处加入鉴定试剂进行反应，所述鉴定试剂为能与检测相应呼吸道病原体的单克隆抗体。上述样本的处理方法还包括以下步骤：待步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔处加入鉴定试剂进行反应后，将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片。
实施例2一种呼吸道病原体免疫荧光检测方法
本实施例一种呼吸道病原体免疫荧光检测方法，所述方法包括实施例1所述样本的处理方法，具体如下：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl10g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，2000rpm/min离心5min，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后2000rpm/min离心5min，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本20uL加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入37℃干燥孵育箱干燥30min；
(4)向步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔中加入待检测呼吸道病原体的单克隆抗体(带有荧光标记)16uL，然后于37℃水浴箱中孵育20min；
(5)将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片；
(6)将载玻片干燥，封片，在荧光显微镜下观察结果。
对比例1
本对比例一种呼吸道病原体免疫荧光检测方法，除了样本处理过程中使用丙酮对细胞进行固定外，其他均与实施例2相同，具体如下：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl10g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，2000rpm/min离心5min，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后2000rpm/min离心5min，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本20uL加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入37℃干燥孵育箱干燥30min，然后加入预冷的丙酮，20℃固定10min，风干；
(4)向步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔中加入待检测呼吸道病原体的单克隆抗体(带有荧光标记)16uL，然后于37℃水浴箱中孵育20min；
(5)将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片；
(6)将载玻片干燥，封片，在荧光显微镜下观察结果。
对比例2
本对比例一种呼吸道病原体免疫荧光检测方法，除了样本处理过程中除将采集的拭子样本放入装有生理盐水的耗材管中，其他均与实施例2相同，具体如下：
(1)采集拭子样本，放入装有生理盐水的耗材管中；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，2000rpm/min离心5min，弃上清；向沉淀中加入生理盐水，在振荡器上进行振荡混匀，然后2000rpm/min离心5min，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本20uL加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入37℃干燥孵育箱干燥30min；
(4)向步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔中加入待检测呼吸道病原体的单克隆抗体(带有荧光标记)16uL，然后于37℃水浴箱中孵育20min；
(5)将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片；
(6)将载玻片干燥，封片，在荧光显微镜下观察结果。
对比例3
本对比例一种呼吸道病原体免疫荧光检测方法，除了样本处理过程中洗片步骤外，其他均与实施例2相同，具体如下：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl10g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，2000rpm/min离心5min，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后2000rpm/min离心5min，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本20uL加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入37℃干燥孵育箱干燥30min；
(4)向步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔中加入待检测呼吸道病原体的单克隆抗体(带有荧光标记)16uL，然后于37℃水浴箱中孵育20min；
(5)将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上：A、将玻片浸入洗涤液中上下移动至少4次；B、弃去容器中的洗涤液，换成新洗涤液，重复洗涤步骤A；C再用去离子水清洗玻片，重复洗涤步骤A；
(6)将载玻片干燥，封片，在荧光显微镜下观察结果。
利用上述实施例2和对比例1-3中的检测方法分别对15例已知感染的呼吸道病原体类型的咽拭子样本进行检测，其中，针对待检测呼吸道病原体的单克隆抗体来源于七项呼吸道病毒检测试剂盒(免疫荧光法)(Diagnostic Hybrids,Inc.)，包括针对流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的单克隆抗体，且所述单克隆抗体上标记有FITC荧光染料，可在显微镜下显示绿色荧光。
结果如表1所示：
表1检测结果
Figure BDA0002329055880000071
Figure BDA0002329055880000081
由表1可知，实施例2中的样本处理方法能保证后续检测过程中有效地将样本中的呼吸道病原体检出，且检测结果与临床资料吻合。说明本发明样本的处理方法在不使用丙酮对细胞进行固定的情况下能有效地实现呼吸道病原体的免疫荧光检测，且检测效果与使用丙酮固定细胞(对比例1)的检测效果相当(图1，以样本1的检测结果为例)。但是本发明样本的处理方法无需使用危险性化学品，不会对实验人员的身体健康造成危害，对实验人员来说更安全，同时也更加环保。
与实施例2相比，对比例2的样本处理方法中使用生理盐水代替本发明细胞保存液来保存采集的咽拭子样本，导致后续的检测结果不准确，不能有效将样本中的呼吸道病原体检出，且检测阳性的样本中显示绿色荧光细胞的数目也较少。
与实施例2相比，对比例3的样本处理方法中洗片使用的是常规免疫荧光检测的洗片步骤，后续的检测结果也不稳定，有些样本中的呼吸道病原体不能有效检出，且检测阳性的样本中显示绿色荧光细胞的数目也较少。
本发明所述样本处理方法中利用本发明配方的细胞保存液保存拭子样本，然后再结合合适的洗片步骤，可以保证在不使用丙酮对细胞进行固定的情况下有效地实现后续呼吸道病原体的免疫荧光检测，尤其是针对流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的免疫荧光检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集拭子样本，放入装有细胞保存液的耗材管中，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O 0.8-1.5g/L、KH2PO4 0.45-1g/L和NaCl 4.5-15g/L；
(2)将步骤(1)中的耗材管在振荡器上进行振荡，使拭子上的细胞脱落，然后将耗材管中的液体转移到新的试管中，离心，弃上清；向沉淀中加入上述细胞保存液，在振荡器上进行振荡混匀，然后离心，弃上清，将剩余的液体混合物进行震荡混匀，得到细胞混合物样本；
(3)将步骤(2)获得的细胞混合物样本加入到载玻片的疏水孔处，然后将载玻片放入干燥箱中至载玻片完全干燥。
2.根据权利要求1所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O0.8-1.2g/L、KH2PO4 0.6-1g/L和NaCl 5-10g/L。
3.根据权利要求2所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述细胞保存液包含溶剂水和以下浓度的组分：Na2HPO4.12H2O1g/L、KH2PO4 0.8g/L和NaCl10g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心的条件为2000rpm/min离心5min。
5.根据权利要求1-3任一项所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中每个疏水孔中加入20uL混合物。
6.根据权利要求5所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥温度为37℃，时间为30-40min。
7.根据权利要求6所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥温度为37℃，时间为30min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，还包括以下步骤：待步骤(3)获得的完全干燥的载玻片疏水孔处加入鉴定试剂进行反应后，将载玻片上反应液体去掉，将载玻片放到玻片架上，然后将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留2-4s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留2-4s，取出载玻片。
9.根据权利要求8所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，将玻片架垂直放入清洗缓冲液中，停留3s，重复两次，然后再将玻片架垂直放入放到蒸馏水中，停留3s，取出载玻片。
10.根据权利要求9所述的呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法，其特征在于，所述清洗缓冲液为含有0.1-0.2v/v％吐温20和0.05-0.2w/v％叠氮化钠的PBS缓冲液。
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