CN104357407A - 一种检测腺病毒IgM抗体的免疫荧光试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种腺病毒抗原，由保藏编号为CGMCC No.9596的腺病毒毒株培养获得。本发明还涉及一种腺病毒IgM抗体检测试剂盒，所述试剂盒含有上述腺病毒抗原。与现有技术相比，本发明提供的腺病毒抗原制备的诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、价格优惠等优点，很好的满足了腺病毒感染临床诊断的需要。

Description

一种检测腺病毒IgM抗体的免疫荧光试剂及其应用

【技术领域】

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种腺病毒抗原、含有该抗原的试剂盒及其制备方法，以及所述试剂盒在检测腺病毒IgM中的应用。

【背景技术】

腺病毒(adenovirus)是病毒性肺炎的主要病原之一，较大年龄组儿童或青年人感染腺病毒仅引起上呼吸道疾病，在婴幼儿中可引起严重的急性腺病毒性肺炎。1958年Chang等首先报道1例7A型腺病毒性肺炎，以后各国相继报道。我国于1958年亦开始对腺病毒感染进行研究，发现引起婴幼儿腺病毒性肺炎流行的病原体主要是腺病毒3、7型，轻症及大龄儿童预后较好，重症感染和腺病毒性肺炎则预后不良，病死率高。

腺病毒为DNA病毒，属腺病毒科。因能致淋巴结(腺)、咽及结膜炎症，又称腺―咽―结膜病毒(简称APC病毒)，是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成，大小相当于一根头发丝直径的800分之一。

腺病毒一般通过呼吸道传染。在集体儿童机构中往往同时发生腺病毒上呼吸道感染及肺炎。人群血清学研究说明，生后最初数月常存留从母体传递的腺病毒特异抗体，此后一直到2岁抗体缺乏，2岁以后才逐渐增加。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，可以导致多种疾病，甚至可以导致动物发生肿瘤。人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，主要有：呼吸道感染、流行性结膜炎(俗称：红眼病)、病毒性胃肠炎、急性出血性膀胱炎等，其中腺病毒引起的呼吸道疾病和红眼病最为常见。但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。

腺病毒感染的潜伏期为2-14天，IgM抗体在发病1周左右出现，可持续存在2～3个月。除根据流行病学及临床表现外，确诊需要依靠实验诊断，主要包括病毒分离及鉴定、血清学试验。

中国发明专利申请CN 201310162470.3公开了一种腺病毒IgM、IgG抗体的胶体金法检测试纸条，以及胶体金法检测试剂盒，与单独检测腺病毒IgG或IgM抗体的ELISA试剂具有相似的检测结果。然而，胶体金方法检测IgM抗体存在灵敏度较低的缺陷，准确性相对较低，因此通常只作为辅助诊断试剂。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种腺病毒抗原，以及含有该抗原的试剂盒及其应用。

本发明的腺病毒抗原是由保藏编号为CGMCC No.9596的腺病毒毒株获得，所述腺病毒毒株已于2014年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供上述腺病毒抗原在检测腺病毒中的应用。

在本发明中，所述检测腺病毒IgM抗体的方法包括间接免疫荧光法和酶联免疫法。

本发明还提供包含本发明腺病毒抗原的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测腺病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的检测腺病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有腺病毒IgM抗体，就可用本发明的组合物或试剂盒来检测。

术语“试剂盒”是指利用本发明抗原完成腺病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断腺病毒感染。

特别地，本发明提供一种腺病毒IgM抗体检测试剂盒，所述试剂盒含有上述腺病毒抗原。

根据上述试剂盒的一种有效实施方式，用0.02％的依文思蓝将荧光素标记抗人IgM单克隆抗体按体积比1:32稀释。

优选地，所述试剂盒还含有以体积比1：10稀释的腺病毒IgM阴性血清和阳性血清。

与现有技术相比，本发明提供的腺病毒抗原制备的诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、价格优惠等优点，很好的满足了腺病毒感染临床诊断的需要。

本发明涉及的腺病毒55型YNT-Ad-55毒株，其保藏编号为CGMCCNo.9596，于2014年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

【附图说明】

图1为间接免疫荧光法(IFA)原理示意图。

图2为实施例1的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

【具体实施方式】

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。在本发明中，如无特殊说明，“％”均为体积百分比，“比”均为体积比。

实施例1腺病毒抗原的制备

1.1腺病毒毒种的制备

本申请所使用的腺病毒55型为2011年在山西太原市一位呼吸道患者的咽拭子用A549细胞分离得到的，通过核酸方法扩增、测序，基因序列为GenBank accession number KF911353，如SEQ ID No.1。

具体地，从军事医学科学院微生物流行病研究所引进的A549细胞(人肺腺癌细胞)，用含有10wt％胎牛血清的DMEM进行培养，选用生长良好的单层细胞，倒出培养液，加入0.25％的胰蛋白酶消化细胞，等细胞有圆点出现后，倒掉消化液，加入细胞生长液，吹打细胞，使细胞完全分散后，苔昐蓝计数，按照细胞6×10⁵～8×10⁵个/瓶分别接种到细胞瓶内。37℃CO₂温箱培养24h。

(1)病毒分离：咽拭子经无菌处理后接种A549细胞(含1000U青霉素/mL和1000U链霉素/mL或0.2μm的微孔滤膜过滤)，25mL的细胞瓶接种0.2mL，37℃吸附1小时，吸出接种液，加入含有2％胎牛血清的DMEM细胞维持液7mL，37℃CO₂温箱培养，每日观察细胞病变情况。

(2)结果判定：

a)细胞病变判定；接种A549细胞后约24-48h，细胞出现圆缩、破碎融合、大量脱落为细胞病变(CPE)。病变细胞约占25％为‘+’，50％为‘++’，75％为‘+++’，90％以上为‘++++’。

b)接种后3～5d如出现细胞病变，则收集培养上清夜，并再连续传三代后，待CPE为‘+++～++++’时，收取培养上清液，-70℃或冷冻干燥，保存毒种。

c)接种6d后，如无CPE，可收集培养上清夜，再连续盲传3代，如仍无CPE，即作未分离出病毒处理。

(3)病毒核酸鉴定

将分离到的病毒培养液用QIAamp DNAMini Kit进行DNA提取，并用以下引物进行PCR扩增：

F：5’-GCTACTCATGGCTCGGGATCCATGGCCACCCCATCGATGC---3’

R：5‘-ATACTCGAG TTACGTGGTAGCGTTACCGGCCGAGAACGG--3’

以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图2所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行，并将目的片段送送赛百胜公司测序鉴定，测序结果为GenBank accession number KF911353。

将经过测序确定的病毒毒种(保藏编号为CGMCC No.9596)用含有2％胎牛血清的DMEM稀释成10^-3，然后接种已单层良好的A549细胞，每瓶细胞接种0.2mL，然后放37℃吸附1小时，加细胞维持液6mL，放37℃培养，等80％的细胞病变后，把细胞放-20℃冻融三次。分装，每支1mL，放-70℃备用。

1.2腺病毒TCID50(半数组织培养感染剂量)的滴定

从-70℃冰箱取1支腺病毒毒种，解冻后5000×g离心10分钟，取上清液滴定病毒。

取9支无菌试管，分别标上-1至-9，这些数字代表稀释度的指数。每管中加入0.9mL细胞维持液。取0.1mL混匀的病毒悬液，加入到第1管(-1管)中，盖上盖后振荡混匀。换用一支新的枪头，从-1管中取0.1mL移入-2管中，振荡混匀，如此继续稀释至-9管。

将已稀释好的病毒接种到已经单层的A549细胞96培养板上，每个稀释度种4孔，每孔接种0.2mL，从高稀释度到低稀释度顺序接种到96孔A549细胞上。放37℃CO₂培养箱培养，每天观察细胞病变情况，最终确定腺病毒TCID50(半数组织培养感染剂量)为10^-8。

实施例2腺病毒IgM抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法)的制备

2.1腺病毒抗原片的制备

(1)腺病毒抗原片制备感染细胞程度的选择

从-70℃取出腺病毒毒种，用含有2％胎牛血清的DMEM(细胞维持液)将病毒稀释成10^-8。选用A549生长良好的单层细胞，倒掉细胞生长液，每瓶细胞接种10^-8的病毒0.2mL，37℃CO₂培养箱吸附1小时，加细胞维持液6mL，放37℃CO2培养箱。

分别等细胞病变15％、25％、35％时，用0.25％的胰酶消化细胞。用一定量的细胞生长液吹打细胞，制备成细胞悬液。

将上述3个不同程度的细胞病变(15％、25％、35％)细胞悬液滴到10孔的镀膜玻片上，每孔滴40μL。把滴好的10孔的镀膜玻片放在湿盒内，37℃CO₂培养箱培养12小时，使滴在玻片上的细胞进行舒展。玻片用0.005M的PBS洗一次，让玻片在生物安全柜自然干燥，然后把玻片放入丙酮液内，-20℃固定过夜。取出后风干即为制备好的腺病毒抗原片。

用复筛过的不同强度的ADV-IgM抗体阳性血清和ADV-IgM阴性血清同时检测细胞病变15％、25％、35％时制备的抗原片，然后加入荧光素标记抗人IgM单克隆抗体进行反应。

选用在荧光显微镜下观察阳性和阴性比例适中的作为研究好生产抗原片的条件。

(2)腺病毒抗原片制备最佳细胞量的选择

取上一实验结果选取的最佳细胞病变程度25％，用10⁵、10⁶、10⁷/ml细胞含量滴细胞在镀膜玻片的孔内。

用复筛过的ADV-IgM抗体阳性和ADV-IgM抗体阴性同时检测抗原片；选取最佳细胞浓度制备腺病毒抗原片，作为研究及生产用制片的最佳细胞用量为10⁶/mL。

(3)滴片后培养时间的选择

在上述实验的基础上，细胞滴到镀膜玻片上后选用6、8、12小时培养，让细胞更好的苏展和贴壁。用复筛过的ADV-IgM抗体阳性血清和ADV-IgM抗体阴性血清检测抗原片；最终选取在荧光染色过程中，细胞脱落较少的培养时间(8小时)作为ADV-IgM抗体免疫荧光检测试剂的研究和生产用。

(4)抗原片制备固定剂的选择

在选取上述实验确定的最佳细胞病变程度25％和最佳细胞的用量(10⁶/mL)的基础上滴片，分别用乙醇固定和丙酮固定过夜制备抗原片；用复筛过的ADV-IgM抗体阳性和ADV-IgM抗体阴性同时检测两种抗原片；选取在荧光染色过程中，细胞脱落较少的丙酮作为ADV-IgM抗体免疫荧光检测试剂研究和生产用固定剂。

(5)抗原片固定时间的选择

取以上实验结果选取的最佳细胞用量、细胞病变百分比滴片，然后用丙酮-20℃固定过夜或-20℃固定30分钟制备抗原片；用复筛过的不同强度ADV-IgM抗体阳性血清和ADV-IgM抗体阴性血清同时检测抗原片；最终选取抗原片的最佳固定时间为-20℃固定过夜。

(6)抗原片储存期限的确定

根据以上最佳条件制备的抗原片，真空包装置2℃-8℃保存。分别于6个月、12个月、18个月，用企业参考品N01、N03、N05、P01、P03、P05检测抗原片，最终确定抗原片2℃-8℃可以保存18个月。

2.2最佳反应条件的选择

以阳性和阴性质控品(收集北华大学附属医院、解放军第309医院等医院经临床验证的ADV-IgM抗体阳性、阴性血清，用北京贝尔生物工程有限公司生产的“腺病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)”进行复检筛选，得到的ADV-IgM抗体阳性、阴性血清建立为阳性和阴性质控品)为测试样品。采用交叉配比法确定最佳的样本稀释倍数和加样量，从表1可以看出，当稀释倍数为1：40和1：80时，阳性质控品会出现假阴性反应，当稀释倍数为1：20时，阳性质控品P01的灵敏度很低，为了保证试剂盒的灵敏度和特异性，并在节约样本量的基础上，我们最终选择最佳样本稀释倍数为1：10稀释，加样量为20μL。具体结果如表1：

表1最佳样本稀释倍数和加样量的选择

－：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应(以下解释同)

在已确定样本的最佳稀释倍数为1：10，加样量为20μL的基础上，以阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，选定荧光素标记抗人IgM单克隆抗体反应时间为30分钟，来确定样本的最佳的反应时间。从表2可以看出，只有当反应时间为90分钟时，阳性质控品(P01、P03、P05)才完全凡符合质控要求。具体结果见表2。

表2最佳样本反应时间的确定

－：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

在已确定样本的最佳稀释倍数为1：10，加样量为20μL，样本的最佳反应时间为90min的基础上，以阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，用0.02％的依文思蓝将荧光素标记抗人IgM单克隆抗体按1:16、1:32、1:64、1:128进行稀释，然后分别15μL荧光结合物进行反应，通过采用交叉配比方法来确定荧光结合物最佳使用浓度和最佳的反应时间。从表3可以看出，当荧光素结合物1：16稀释而反应时间较长时，N05出现假阳性反应，而如果反应时间较短，则P01会出现假阴性反应；而当稀释倍数为1：64或1：128时，阳性质控品会出现假阴性反应，所以综合考虑，选择荧光素标记抗人IgM单克隆抗体在使用前，用0.02％的依文思蓝进行1：32的稀释。具体结果见表3。

表3荧光结合物最佳使用浓度和反应时间的确定

－：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

实施例3腺病毒IgM抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法)的性能检定

将实施例1制得的腺病毒抗原按照实施例2的条件制备抗原片，用间接免疫荧光法测定ADV-IgM抗体。

3.1该试剂盒的原理和组分如下：

(1)试剂盒原理：如图1所示，本试剂盒采用间接免疫荧光法(IFA)原理，待测样本中存在的腺病毒特异性IgM抗体与吸附在载玻片上的腺病毒抗原发生反应，未与抗原结合的IgM免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人IgM球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果。

(2)试剂盒主要组成成分：

1)载玻片：2块(1×10孔)，A549细胞中的腺病毒。

2)PBS：1瓶，pH7.2PBS粉末，用1L蒸馏水溶解。

3)阳性对照：1瓶，500μL/瓶。ADV-IgM阴性血清1：10稀释，含叠氮钠。

4)阴性对照：1瓶，500μL/瓶。ADV-IgM阳性血清1：10稀释，含叠氮钠。

5)FITC结合物：2瓶，1.1mL/瓶，荧光素标记的抗人IgM磷酸缓冲液，含有伊文斯蓝、叠氮钠和蛋白稳定剂。

6)封闭介质：3mL，甘油缓冲液，含叠氮钠。

7)吸附剂：1.5mL(羊抗人IgG，含叠氮钠)

3.2试剂盒使用操作方法：

(1)试验前准备：只有PBS洗液需要预先配制。将PBS粉末加入到1L蒸馏水中，摇匀至完全溶解。配好后储存在2-8℃。

(2)使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。

(3)样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本(将25μL血清加入到25μLPBS，阴阳性对照试剂不需要稀释。

(4)用抗人IgG吸附剂处理稀释后的血清：将30μL稀释后的血清加入150μL吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照试剂不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。

(5)在载玻片的孔中依次加入15μL吸附剂处理过的血清、15μL不稀释的阳性对照和15μL不稀释的阴性对照。

(6)将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。

(7)用PBS的缓慢水流冲洗载玻片(避免直接冲入孔内)。

(8)载玻片自然晾干。

(9)每孔加入15μL抗人IgM FITC结合物溶液(已经稀释好)。

(10)将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。

(11)重复6和7的洗涤步骤。

(12)加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。

(13)尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8℃不超过24小时。

(14)检验结果判定：

阳性结果：可以观察到腺病毒对阳性血清的l-15％细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光

阴性结果：可观察到腺病毒的细胞呈现红色。

无效：阳性对照和阴性对照分别没有出现苹果绿色荧光和红色荧光。

3.3试剂盒性能检测实验

(1)特异性(准确性)测定：按前述实验确定的间接免疫荧光测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份肺炎衣原体IgM抗体阳性血清标本、50份细小病毒IgM阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

(2)灵敏度测定：按前述实验确定的间接免疫荧光测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

(3)与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与西班牙VIRCELL,S.L.公司生产的“九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法)检测200份血清样本的比较实验结果如表4。

表4与VIRCELL,S.L公司试剂盒的比较测试结果

检测总符合率：(32+165)/200＝98.5％，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

(4)本发明试剂盒与北京贝尔生物工程有限公司生产的《腺病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)》对1000例血清样本进行了对比试验，结果表5：

表5与北京贝尔公司酶免试剂盒的比较测试结果

阳性符合率为：131/(131+2)＝98.50％

阴性符合率为：863/(4+863)＝99.54％

检测总符合率：(131+863)/1000＝99.40％，

初步表明本试剂盒与酶免试剂盒具有高度一致性，并且灵敏度略高于酶免试剂盒，也明显高于其他现有的腺病毒IgM抗体试剂盒或测试纸条。

Claims (9)

1.一种腺病毒抗原，所述腺病毒抗原由保藏编号为CGMCCNo.9596的腺病毒55型YNT-Ad-55毒株培养获得，所述毒株已于2014年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的腺病毒抗原在检测腺病毒IgM抗体中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述检测腺病毒IgM抗体的方法包括间接免疫荧光法。

4.一种腺病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有根据权利要求1所述的腺病毒抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有抗人IgM单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于用0.02％的依文思蓝将荧光素标记抗人IgM单克隆抗体按体积比1:32稀释。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有腺病毒IgM阴性血清和阳性血清。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有以体积比1：10稀释的腺病毒IgM阴性血清和阳性血清。

9.权利要求4所述的试剂盒在检测腺病毒中的应用。