CN101013133A - 检测特异性IgM抗体的胶体金层析条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测特异性IgM抗体的胶体金层析条及其制备技术。该层析条以胶体金作为标记物，采用免疫捕获法原理测定IgM抗体，在PVC背板上顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜、吸收垫；硝基纤维素膜包括检测区和控制区，其特征在于：所述复合物垫为涂覆有抗原－胶体金复合物的玻璃纤维素膜，所述检测区包被抗IgM抗体，所述控制区包被与抗原相应的抗体。

Description

检测特异性IgM抗体的胶体金层析条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用免疫测定法检测特异性IgM抗体的层析条，具体地说，涉及一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应对特异性IgM抗体进行检测的层析条及其制备方法。
背景技术
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)是抗原刺激机体后免疫应答中最早出现的抗体，半衰期较短，血清内若出现特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，因此IgM抗体可用于对人或动物疾病的早期诊断。目前检测IgM以酶联免疫吸附试验(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)最为常用。ELISA法以酶作为标记物，具有较好的敏感性和特异性，但操作程序较复杂，测试时间较长，一般需要2.5～4小时才能得出检测结果，且需要专用的酶免分析仪、洗板机等仪器，不适宜单份样品的检测。近年来有文献报道将胶体金免疫技术用于检测IgM抗体，以胶体金作为标记物，采用间接法测定IgM抗体，有效克服了ELISA技术的不足，可实现IgM抗体的快速、简便检测。但是该方法难以避免广泛存在的类风湿因子RF等干扰物质的影响，检测结果易出现假阳性，其总体符合率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于快速检测特异性IgM抗体的层析条，能够有效防止其它抗体对特异性IgM抗体测定的干扰，使得检测结果的总体符合率较高。
本发明的技术方案如下：
一种检测特异性IgM抗体的胶体金层析条，所述层析条在PVC背板上顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜、吸收垫；所述硝基纤维素膜包括检测区和控制区，其特征在于：所述复合物垫为涂覆有抗原-胶体金复合物的玻璃纤维素膜，所述检测区包被抗IgM抗体，所述控制区包被与抗原相应的抗体。
本发明还提供了所述胶体金层析条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备与抗原相应的抗体以及抗IgM抗体：采用常规制法制备与已知抗原相应的动物抗体、抗IgM抗体，浓度分别为3mg/ml～6mg/ml、0.5mg/rml～4mg/ml；
(2)制备抗原-胶体金复合物：用0.1mol/L的K2CO3调节金溶胶pH值至6～7，在金溶胶中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入纯化的已知抗原，所加抗原浓度为1mg/ml～4mg/ml，再加入占总浓度1％～10％的牛血清白蛋白，以封闭胶体金空白位点，静置反应后加入占总浓度0.1％～1％的NaCl，混匀后静置，经初次离心处理后去沉淀，再经两次离心处理去上清，将沉淀用10mmol～50mmol TBS多次重悬，稀释至A530值为0.5～3，备用；
(3)取硝基纤维素膜贴在PVC背板中间，将抗IgM抗体和与抗原相应的抗体分别包被在硝基纤维素膜的检测区和控制区；将抗原-胶体金复合物涂覆在玻璃纤维素膜上制备复合物垫；
(4)在PVC背板上靠近控制区一端贴上吸收垫，在靠近检测区一端依次贴上复合物垫和样品垫；
(5)将PVC背板及其贴附的材料切成适宜宽度的层析条。
所制备的抗IgM抗体可以为单克隆或多克隆抗体。
所述抗原-胶体金复合物可以喷涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纤维素膜上。
所述硝基纤维素膜在包被有两种抗体后可以进行封闭处理，以减少非特异性反应。
所述层析条在制备完成后可以装入塑料板卡内。
本发明以胶体金作为标记物，采用免疫捕获法原理测定IgM抗体，所制备的层析条表现出良好的抗干扰能力和稳定性，且操作简便快捷，特别适用于现场、农村和设备条件差的基层单位使用。
具体实施方式
实施例1：检测人巨细胞病毒(HCMV)IgM抗体的胶体金层析条
具体制备过程如下：
(1)常规法制备浓度为5mg/ml的兔抗HCMV抗体，以及浓度为2mg/ml鼠抗人IgM单克隆抗体，备用。
(2)制备抗原-胶体金的复合物：用0.1mol/L的K2CO3调节金溶胶pH值至6.8，在100ml金溶胶中加入浓度为2mg/ml的HCMV抗原2.0ml，搅拌10分钟。再加入10％牛血清白蛋白10.0ml，搅拌10分钟后加入10％NaCl 10.0ml，搅拌10分钟。在4℃离心(1000r/min)10分钟后去沉淀。再次离心(8000r/min)30分钟后去上清。沉淀用20mM TBS100.0ml重悬，4℃离心(8000r/min)30分钟，去上清。用20mmol TBS10.0ml重悬，稀释至A530为2.0，备用。
(3)包被鼠抗人IgM单克隆抗体和兔抗HCMV抗体：取硝基纤维素膜贴于PVC背板中间，设定划膜机喷涂参数为1μl/cm。取5mg/ml的兔抗HCMV抗体1.5ml和2mg/ml的抗人IgM单克隆抗体1.5ml，分别接到划膜机的A、B管道接口。将贴有硝基纤维素膜的PVC背板置于划膜机的往复运动平台上。开启划膜机，在硝基纤维素膜上喷涂兔抗HCMV抗体和鼠抗人IgM单克隆抗体，37℃干燥2小时。将背板置于1％聚乙二醇溶液中浸泡30分钟，晾干，37℃干燥2小时。
(4)将抗原-胶体金的复合物涂覆在玻璃纤维素膜上：设定划膜机喷涂参数为25.0μl/cm，将抗原-胶体金复合物连接到划膜机的C管道接口。取30cm×1cm的玻璃纤维素膜放置往复运动平台上。开启划膜机，在玻璃纤维素膜上喷涂抗原-胶体金复合物制成复合物垫，37℃干燥2小时。
(5)在PVC背板上靠近兔抗HCMV抗体一端贴上吸收垫，在靠近鼠抗人IgM单克隆抗体一端依次贴上复合物垫和样品垫，将PVC背板及其贴附的材料切成4mm宽层析条。将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。
当加入被检测样品后，通过层析作用，样品和抗原-胶体金复合物向吸收垫一端移动。当样品通过鼠抗人IgM单克隆抗体包被线时，其中的IgM与抗人IgM单克隆抗体结合。如果IgM中含有针对特异性抗原的IgM，则抗原-胶体金复合物与之结合，在该处显示一条紫红色条带，表明被检测样品呈阳性反应，其中含有针对特异性抗原的IgM。如果该处没有显示紫红色条带，判定为被检测样品呈阴性反应，其中不含有针对特异性抗原的IgM。抗原-胶体金复合物移动到兔抗HCMV抗体的包被线处，抗原与抗体结合，显示一条紫红色条带，提示该检测系统的检测结果有效；如果该处没有显示紫红色条带，表明该检测系统失效，检测结果无效。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的阳性血清290份和阴性血清4636份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂检测结果进行了对比，结果分别示于表1和表2。
表1胶体金层析条对临床血清的检测结果
Figure A20071006384400051
表2胶体金检测与ELISA检测的结果比较
Figure A20071006384400052
由表1数据可计算得到约登指数为260/(260+30)+4627/(9+4627)-1＝0.90，说明检测结果的总体符合率很高。
由表2数据可计算得到本发明检测结果与EHSA检测结果的总体符合率为：(264+4626)/4926＝99.3％，这表明两种检测方法具有高度符合性，本发明所制胶体金层析条具有很好的实用性。
实施例2：检测风疹病毒(RV)IgM抗体的胶体金层析条
常规法制备浓度为4mg/ml的兔抗RV抗体，以及浓度为2.5mg/ml鼠抗人IgM单克隆抗体。在金溶胶中所加RV抗原浓度为3mg/ml。其它制备过程及制备参数同实例1。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的阳性血清186份和阴性血清2452份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂检测结果进行了对比，结果分别示于表3和表4。
表3胶体金层析条对临床血清的检测结果
Figure A20071006384400061
表4胶体金检测与ELISA检测的结果比较
Figure A20071006384400062
由表3数据可计算得到约登指数为173/(173+13)+2449/(3+2449)-1＝0.93，说明检测结果的总体符合率很高。
由表4数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为：(175+2455)/(175+1+7+2455)＝99.7％，这表明两种检测方法具有高度符合性，本发明所制胶体金层析条具有很好的实用性。

Claims (6)

1.一种检测特异性IgM抗体的胶体金层析条，所述层析条在PVC背板上顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜、吸收垫；所述硝基纤维素膜包括检测区和控制区，其特征在于：所述复合物垫为涂覆有抗原-胶体金复合物的玻璃纤维素膜，所述检测区包被抗IgM抗体，所述控制区包被与抗原相应的抗体。
2.一种制备权利要求1所述的检测特异性IgM抗体的胶体金层析条的方法，包括以下步骤：
(1)制备与抗原相应的抗体以及抗IgM抗体：采用常规制法制备与已知抗原相应的动物抗体、抗IgM抗体，浓度分别为3mg/ml～6mg/ml、0.5mg/ml～4mg/ml；
(2)制备抗原-胶体金复合物：用0.1mol/L的K2CO3调节金溶胶pH值至6～7，在金溶胶中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入纯化的已知抗原，所加抗原浓度为1mg/ml～4mg/ml，再加入占总浓度1％～10％的牛血清白蛋白，以封闭胶体金空白位点，静置反应后加入占总浓度0.1％～1％的NaCl，混匀后静置，经初次离心处理后去沉淀，再经两次离心处理去上清，将沉淀用10mmol～50mmol TBS多次重悬，稀释至A530值为0.5～3，备用；
(3)取硝基纤维素膜贴在PVC背板中间，将抗IgM抗体和与抗原相应的抗体分别包被在硝基纤维素膜的检测区和控制区；将抗原-胶体金复合物涂覆在玻璃纤维素膜上制备复合物垫；
(4)在PVC背板上靠近控制区一端贴上吸收垫，在靠近检测区一端依次贴上复合物垫和样品垫；
(5)将PVC背板及其贴附的材料切成适宜宽度的层析条。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所制备的抗IgM抗体为单克隆或多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述抗原-胶体金复合物以喷涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纤维素膜上。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述硝基纤维素膜在包被有两种抗体后进行封闭处理。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述层析条在制备完成后装入塑料板卡内。
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