CN101243320B - 采用带侧向迁移的免疫层析法的分析物检测 - Google Patents
采用带侧向迁移的免疫层析法的分析物检测 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及测定液体样本中分析物的设备。所述发明设备由以下组成：毛细作用装置(1)，其涉及确定参照毛细作用方向的侧向迁移，并包括液体样本沉积区域(3)和设置在所述沉积区域下游的分析物检测区域(5)；第一分析物特异性结合试剂(4)，其被偶联到可见和/或可测定的标记物，所述结合试剂当湿润时通过毛细作用沿所述参照方向在上述毛细作用装置(1)中迁移；以及第二分析物特异性结合试剂(6)，其被固定于所述检测区域中。本发明的特征在于，所述检测区域(5)包含有分析物(7)或所述分析物的类似物，其被固定并与所述第二特异性结合试剂(6)分开设置。
Description
本发明涉及一种带有侧向迁移的免疫层析法设备，使用夹心法试验和竞争法试验，所述设备能够同时测定液体样本中的分析物。
例如，在专利EP 0 284 232中公开了带有侧向迁移的免疫层析设备。这些设备提供以多孔固体支撑物为形式的毛细作用装置，样本和试剂通过毛细作用在所述固体支撑物中迁移。因此，这些设备集成或包括多孔固体(或免疫层析的)支撑物，所述支撑物包括冻干、干燥或脱水形式的第一支撑物区域、偶联到可见和/或可测定标记物的分析物特异性结合试剂、和固定有分析物特异性的捕捉试剂的检测区域。当干燥时，分析物特异性的结合试剂是固定的，但当湿润时，其在固体支撑物中就成为移动的。因此，当固体支撑物与液体样本接触时，后者通过毛细作用在此支撑物中移动，驱动偶联到可见和/或可测定标记物的分析物特异性结合试剂。样本和分析物特异性的结合试剂在固体支撑物中通过毛细作用迁移至载有被固定的分析物特异性的捕获试剂的检测区域。
人们从WO 2004/088320中了解到固相中的免疫层析法，其中即时添加液体形式的偶联到可见和/或可测定标记物的结合试剂。
这些设备通常能够通过夹心法试验或竞争法试验检测分析物。
在夹心法试验中，被标记的结合试剂与分析物结合，后者通过捕获试剂被固定到固体支撑物。样本中分析物的存在或不存在通过存在或不存在捕获试剂水平的可见或可测定信号而被测定。
在竞争法试验中，分析物与结合试剂竞争结合到捕获试剂。样本中分析物的存在或不存在通过存在或不存在捕获试剂水平的可见或可测定信号而被测定。
专利EP 0 291 194、EP 0 560 411和EP 0 560 410描述了几种设备，其中免疫层析固体支撑物以一整体部分被结合到盒子中，所述盒子设置有用于沉积液体样本的开口、以及读取结果的观察窗。
专利EP 1 091 808描述改良的设备，其也包括分为若干部分的多孔固体支撑物，所述支撑物带有捕获部件，用于移动的液体样本，以允许更好的收集样本。
这些设备可以适用于单身或家庭使用。实际上，它们使用起来简易并且快速、需要很少的操作，因为所有试剂都被集成或包括于所述设备中。
但是，这些固相中的免疫层析试验不能测定样本中分析物的量。
此外，在夹心法试验中已经观察到一些分析物的“钩状(Hook)”效应。钩状效应是免疫学试验中熟知的不良效应。其发生于分析物在样本中以非常高的浓度存在时。钩状效应可导致假阴性，错误的断定样本中不存在分析物。
在夹心法类型的免疫学检测过程中出现钩状效应的分析物具有高斯曲线类型的信号/浓度曲线(见图1)。图1显示在限定的时间读取结果期间，对于给定信号(S)对应两种可能的分析物浓度(C1和C2)，一个弱(C1)另一个强(C2)。
使用竞争法检测的信号/浓度曲线在图2中示出。对于竞争法试验，由待测的分析物的两种各自不同的浓度(C1和C2)得到两不同信号(S1和S2)。但是，竞争法试验也很快暴露了它们的局限性，因为分析物在相对低的浓度时信号消退。
为解决夹心法和竞争法试验的这些缺陷而普遍采用的一种方案是由检测来自液体样本的稀释度系列的分析物而组成。但是，稀释度系列的使用不适合于家庭用途。此外，使用样本的稀释度系列需要额外的操作并增加一次性使用的试验设备的耗费，因为每个样本在不同的稀释度被测试若干次。
根据文献DE 10054093，提出由两个不同或独立的部分组成的免疫过滤设备，所述两部分分别分配给夹心法类型试验和竞争法类型试验。对于此设备，被偶联到荧光标记物的特异性结合试剂即时与分析物混合。所得混合物之后被分为两份。第一份在夹心法部分中过滤并与固定的第二结合试剂反应，第二份在设备的竞争法部分中过滤并与被固定且与分析物或所述分析物的类似物相同的捕获试剂反应。分别得到的荧光信号使所述设备能够测定分析物。
此设备就本质来说不会改善分析物测定的敏感性或精确性，因为每个基础试验与特异性结合试剂的初始浓度相关。
根据文献US 2005/0112729(参照，具体第0063段和权利要求1)，此文献描述用于测定分析物和被标记的第一特异性结合试剂之间的络合物的设备，此设备包括：
-毛细作用装置；
-在毛细作用装置的称为竞争区域的一个区域中，也标记了被固定并与配体络合的分析物特异性的结合试剂，
-在毛细作用装置的称为检测区域的区域中，捕获试剂被固定并能够将自身既与前述络合物也与被标记配体相结合，所述被标记配体在竞争区域中通过毛细作用装置上的络合物的循环而能够在竞争区域中被移动或解络合。
由在竞争和检测区域中获得的信号而得到分析物的测定。
此试验的程式复杂而难于实施，并被证明为仅用于分析物的高精确性测定。
本发明的目的是解决之前所述设备的缺陷。尤其是，本发明首先涉及试验设备，并还涉及所述试验设备的使用方法，所述设备和方法允许在所有情况下以足够程度的可靠性和/或精确性测定分析物，即与所述分析物的初始浓度无关，尤其是在此浓度是相对强或相对稀薄的时候。
参考图3，根据发明而提出了一种用于测定液体样本中的分析物的设备，所述设备包括：
-毛细作用装置1，其涉及确定参照毛细作用方向2的侧向迁移，所述毛细作用装置包括液体样本沉积区域3和设置在所述沉积区域下游的分析物检测区域5，
-第一分析物特异性结合试剂4，其被偶联到可见和/或可测定的标记物，且所述结合试剂4当湿润时通过毛细作用沿参照方向在上述毛细作用装置1中迁移，
-第二分析物特异性结合试剂6，其被固定于检测区域5中，
所述设备特征在于，检测区域5包含有分析物或所述分析物的类似物，其被固定并与所述第二特异性结合试剂6分开设置。
此设备优选地具有以下被单独或组合考虑的辅助特征中的一个或若干，仍旧参考图3说明：
-此设备可包括独立于毛细作用装置的液体样本捕获部件，所述捕获部件能够与沉积区域接触，用于将所述样本循环到所述沉积区域中。
-所述毛细作用装置1可包括用于在所述毛细作用装置上或所述毛细作用装置中设置干燥和游离状态的第一结合试剂4的区域；用于设置所述第一试剂的区域与所述样本的沉积区域合并，或被设置于所述样本沉积区域的下游、但在检测区域5的上游。
-在检测区域5中，分析物7或所述分析物的类似物被设置在第二特异性结合试剂的上游或下游。
-第二特异性结合试剂6、和/或分析物7或所述分析物的类似物，可例如沿横切参照方向的线设置于所述毛细作用装置上。
-毛细作用装置可包括检测区域5下游的对照区域(C)。
根据本发明，术语“毛细作用装置”是指通过侧向迁移(即，正交于提供毛细作用的毛细材料的厚度)构成或作用为连续毛细作用单元的任何装置。例如，一种上述毛细装置是矩形支撑物，其沿毛细作用的方向和/或通道(侧向迁移)，由单个并相同的毛细或多孔材料、或由若干不同的毛细元件或材料彼此相关排列(例如重叠)而制成，以得到沿毛细作用方向的从一个元件或材料至另一个元件或材料的毛细循环的连续性。
此类毛细作用装置确定了在一端被接收或沉积的所有液体朝向所述装置的另一端的毛细作用的方向和/或通道。
根据本发明被考虑的、通过侧向迁移的毛细或免疫层析作用必须与免疫过滤技术中所实施的作用相区别，所述免疫过滤技术是根据液体浸透多孔过滤材料的厚度。
根据本发明，被考虑的分析物或所述分析物的类似物形成了除所述第一和第二连接试剂之外的第三试剂。使用任何适合的方法将此第三试剂定位或固定在检测区域中。在毛细作用装置上的此第三试剂可特异性地与第一特异性结合试剂反应以排除所有其他实体。具体而言，一旦沉积在毛细作用装置上，所述第三试剂就不与任何其他实体或试剂络合，例如偶联到可见和/或可测定的标记物。
参考图3，根据下文限定的方法或使用形式，此类型的设备可以被实施：
-将液体样本沉积在毛细作用装置的沉积区域，
-等待充足时间以允许通过液体样本的毛细作用将所述样本传递迁移至检测区域5，
-在检测区域中观察到的程度是：一方面，与分析物络合的特异性结合试剂4将其自身附着到第二特异性结合试剂6以得到第一信号，而在另一方面，第一未络合的结合试剂将其自身附着到分析物7或所述分析物的类似物以得到第二信号，
-由所述第一和第二信号测定分析物
优选的，根据本发明，第一结合试剂4的量大于存在于液体样本中的分析物的量或存在于所述液体样本中的与所述第一结合试剂的络合位点的数量。
在定性模型中，通过不存在第一信号而存在第二信号来检测稀薄的分析物浓度；通过两种信号皆不存在来检测显著的分析物浓度。通过存在第一和第二信号来检测正常的分析物浓度。
有利的，根据本发明的设备和/或方法能够对样本中的稀薄或超强浓缩的分析物进行检测而不会得到假阳性或假阴性的结果。此外，令人惊讶的是，根据本发明的设备和/或方法允许分析物的定性检测。
根据本发明的设备和/或方法尤其适用于检测存在显著钩状效应的分析物，诸如孕激素(hCG)、C-反应蛋白、白蛋白等。
发明的描述
因此，本发明涉及用于测定液体样本中的分析物的设备，所述设备包括毛细作用装置(1)，所述毛细作用装置在毛细作用方向(2)上包括：
a)样本沉积或接收区域(3)；
b)分析物特异性结合试剂，其偶联到可见和/或可测定的标记物，且所述结合试剂当湿润时可在毛细作用装置(1)中通过毛细作用迁移；
c)分析物检测区域(5)；
其中所述分析物检测区域(5)在毛细作用方向(2)上依次包括，一方面，被固定的第二分析物特异性的结合试剂(6)，而另一方面，被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物；使得所述第一分析物特异性结合试剂(4)和第二分析物特异性的结合试剂(6)能够通过夹心法试验来测定液体样本中的分析物，而第一分析物特异性的结合试剂(4)和被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物则允许使用竞争法试验来测定液体样本中的分析物。
在一个实施方式中，偶联到可见和/或可测定的标记物的所述第一分析物特异性结合试剂(4)在支撑物上沉积干燥，因此，发明涉及用于测定液体样本中的分析物的设备，所述设备包括毛细作用装置(1)，所述毛细作用装置在毛细作用方向(2)上包括：
a)样本沉积区域(3)；
b)偶联到可见和/或可测定的标记物的第一分析物特异性结合试剂(4)被沉积干燥并当湿润时在毛细作用装置(1)中迁移；
c)分析物检测区域(5)；
其中，所述分析物检测区域(5)在毛细作用方向(2)上依次包括，被固定的第二分析物特异性结合试剂(6)，被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物；使得第一分析物特异性结合试剂(4)和第二分析物特异性结合试剂(6)能够通过夹心法试验测定液体样本中的分析物，而第一分析物特异性的结合试剂(4)和固定的分析物(7)或所述分析物的类似物则能够通过竞争法试验测定液体样本中的分析物。
在另一个实施方式中，偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性结合试剂(4)以液体形式试剂为形式即时添加。
术语“液体形式试剂”是指其中的结合试剂是在溶液或悬浮液中的任何试剂。制备偶联到可见和/或可测定标记物的液体形式结合试剂根据文献中描述的技术来完成。通常，偶联的结合试剂是在缓冲盐水溶液中的溶液或悬浮液中。这种溶液还可包括稳定剂和其它化合物，例如抗菌剂或抗真菌剂。上述稳定剂包括，例如牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白。
在根据本发明的一些方法中，例如，当液体样本是血浆、血清或全血时，则使用稀释剂。此稀释剂在固体支撑物中迁移来驱动样本和被标记的结合试剂。通常，此稀释剂由缓冲盐水溶液制成，并还可包括洗涤剂或任何对反应必要的成分。
优选地，第一分析物特异性结合试剂(4)偶联到特定标记物。
优选地，毛细作用装置(1)是固定在坚硬支撑物上的层析测试带。
在一个优选实施方式中，毛细作用装置(1)被集成于夹持支撑物(8)中，所述夹持支撑物设有能够观察检测区域(5)的至少一个观察窗(9)。
术语“结合试剂”是指在性质上特异性地与分析物结合，或与所述分析物竞争结合捕获试剂的任何化学的、生物化学的或生物的实体。
术语“结合(lier)”或“结合(liaison)”是指例如共价的任何强结合，或例如抗原/抗体或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素(streptavidine)类型的任何弱结合。
结合试剂是例如抗体、抗原或核酸。
在竞争法试验中，结合试剂是固相并被固定到分析物本身或所述分析物的适当类似物。“分析物的适当类似物”是指与所述分析物特异性地竞争结合第一分析物特异性结合试剂的任何实体。
在夹心法类型的试验中，所述第一被标记的结合试剂是偶联到可见和/或可测定标记物的抗分析物(anti-analyte)，例如偶联到所述标记物的分析物的特定抗体。
在夹心法类型的试验中，第二结合试剂特异性结合所述分析物。因此，第二被标记的结合试剂也是抗分析物，例如偶联到可见和/或可测定标记物的分析物的特定抗体。
术语“可见和/或可测定标记物”是指由于发射的信号而允许直接或间接的通过肉眼，或借助装置检测的任何标记方法，所述信号是，例如荧光、着色、同位素呈现(présence d’isotope)或磁信号。例如，可特地引用着色的标记物，诸如胶体金或荧光的、着色胶乳颗粒、荧光胶乳颗粒和偶联到抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素的颗粒。
因此，本发明涉及用于测定液体样本中的分析物的设备，所述设备包括毛细作用装置(1)，所述设备在毛细作用方向(2)上包括：
a)样本沉积或接收区域(2)；
b)偶联到可见和/或可测定的标记物的分析物的第一特异性抗体(4)，当湿润时所述抗体在所述毛细作用装置(1)中通过毛细作用迁移；
c)分析物检测区域(5)；
所述设备，其中所述分析物检测区域(5)在毛细作用方向(2)上依次包括，在一方面，是被固定的分析物的第二特异性抗体(6)，在另一方面，是被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物；使得所述第一分析物特异性抗体(4)和所述第二分析物特异性抗体(6)能够通过夹心法试验测定液体样本中的分析物，而在所述一方面的第一分析物特异性抗体(4)和在另一方面的被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物则能够通过竞争法试验测定液体样本中的分析物。
在一个实施方式中，偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性抗体(4)在支撑物上沉积干燥，于是所述发明涉及用于测定液体样本中的分析物的设备，该设备包括毛细作用装置(1)，并在毛细作用方向(2)上包括：
a)样本沉积或接收区域(3)；
b)偶联到可见和/或可测定标记物的分析物特异性抗体(4)被沉积干燥，且当湿润时所述抗体在毛细作用装置(1)中通过毛细作用迁移；
c)分析物检测区域(5)；
所述设备，其中分析物检测区域(5)在毛细作用方向(2)上依次包括，在一方面，是被固定的第二分析物特异性抗体(6)，而在另一方面是被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物；使得第一分析物特异性抗体(4)和第二分析物特异性抗体(6)能够通过夹心法试验测定液体样本中的分析物，而在所述一方面的第一分析物特异性抗体(4)和在另一方面的被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物则能够通过竞争法试验测定液体样本中的分析物。
在另一个实施方式中，偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性抗体(4)以液体形式试剂的形式即时添加。
优选地，第一分析物特异性的抗体(4)偶联到可见和/或可测定的标记物。
优选地，毛细作用装置(1)是被固定在坚硬支撑物上的层析测试条。
在一个优选实施方式中，毛细作用装置(1)被集成于夹持支撑物(8)中，所述支撑物设有能够观察检测区域(5)的至少一个观察窗(9)。
本发明还涉及这样一种检测液体样本中分析物的方法，该方法实施上文所限定的设备并包括以下步骤：
a)配备至少一个毛细作用装置，其设置有沉积或接收区域的至少一个以及检测区域，至少一种捕获试剂被固定在检测区域中，
b)至少一次地将液体样本单独地沉积于毛细作用装置的沉积区域中，
c)等待充足时间以使液体样本通过毛细作用迁移至包括第一特异性结合试剂的区域，所述第一特异性结合试剂偶联到可见和/或可测定的标记物，
d)等待充足时间以使偶联到可见和/或可测定标记物的第一特异性结合试剂和液体样本通过毛细作用迁移至检测区域，
e)观测的范围是，偶联到可见和/或可测定标记物的特异性结合试剂将其自身固定于检测区域中，以通过夹心法试验和竞争法试验同时测定分析物。
根据一个实施方式，所述偶联到可见和/或可测定标记物的干燥且游离的第一特异性结合试剂被沉积在多孔固体支撑物之中或之上。
根据一个实施方式，沉积分析物的同时、之后或之前，所述偶联到可见和/或可测定标记物的第一特异性结合试剂以液体形式的试剂为形式即时添加。
根据一个实施方式，液体形式的稀释剂也被添加或沉积在多孔固体支撑物上。
根据所述方法的一个实施方式，在步骤a)期间，所述检测区域包括至少两种捕获试剂，所述两种试剂中的一种是被固定的分析物或所述分析物的类似物，而两种试剂中的另一种是被固定的分析物特异性结合试剂。
术语“结合试剂”是指在性质上特异性地结合分析物或所述分析物的类似物的任何化学、生物化学或生物的实体。
在竞争法试验的情况中，捕获试剂还结合到第一结合试剂。分析物和捕获试剂通常形成配体/抗配体(anti-ligand)、抗原/抗体、DNA/RNA或DNA/DNA对。因此，如果分析物是抗原或半抗原，捕获试剂则是，例如分析物特异性抗体。如果分析物是抗体，捕获试剂则是由所述抗体识别的抗原或是特异性识别所述分析物的抗体。如果分析物是核酸，捕获试剂则是，例如互补的DNA探针。
被固定的捕获试剂是，例如对分析物具有强亲和性的多克隆或单克隆抗体，更具体的，所述捕获试剂可以是单克隆抗体。
为增加敏感性，例如可使用根据本领域技术人员已知的用于间接检测的技术来标记的抗体，所述抗体例如生物素基抗体，间接地能够通过抗生物素蛋白/生物素和抗生蛋白链菌素/生物素的实体的形成来检测。
这些被标记的和生物素基的抗体还可直接沉积在检测区域中的测试线上以增加敏感性，或是与第一特异性抗体一同被沉积并被洗脱和固定，使得分析物和抗体的接触时间增加，并具体的，例如由于固定位点的数量再次增加敏感性。
根据本领域技术人员已知的技术，将分析物特异性的捕获试剂固定在固体支撑物上。固定此捕获试剂使其在湿润时不移动。例如，可通过吸收作用或通过共价结合完成此固定。
术语“抗-分析物”是指就性质来说将其自身特异性地与分析物结合，或与分析物竞争结合捕获试剂的任何化学、生物化学或生物的实体，例如抗体、抗原或核酸。
根据一个实施方式，发明还涉及测定液体样本中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a)配备如前所述的设备；
b)将液体样本沉积于来自步骤a)的设备的毛细作用装置(1)的沉积或接收区域(3)中；
c)等待充足时间使得液体样本通过毛细作用从沉积或接收区域(3)迁移至检测区域(5)，以驱动偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性的抗体(4)；
d)观察到的范围是，偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性抗体(4)固定于检测区域中，以通过夹心法试验和竞争法试验同时测定分析物。在一个有利的实施方式中，步骤b)中，将液体样本和稀释剂沉积于步骤a)的设备的毛细作用装置(1)的沉积或接收区域(3)中。
术语“分析物”是指人们希望在液体样本中检测的任何化学、生物化学或生物实体。通过据本发明的设备和方法来检测的分析物中，其具体而言是蛋白质、肽、抗体、激素、甾类、衍生自传染剂(所述传染剂诸如细菌、病毒或寄生物)或肿瘤细胞的抗原、核酸(DNA或RNA)、治疗化合物、药物或抗生素。
术语“检测”和“测定”是指测定样本中存在或不存在分析物，并测量和定量样本中的分析物。实际上，根据本发明的设备和方法的性能，允许进行定量或半定量的测量。
在发明的一个具体实施方式中，分析物是hCG(绒毛膜促性腺激素)、C-反应蛋白或白蛋白。
术语“液体样本”是指在溶液或悬浮液中的，在其中寻找分析物的任何样本。此液体样本具体而言可以是任何生物制品或体液。液体样本也可以直接或间接从生物制品或体液获得。此样本还可以是固体样本的液体提取物。
通常，液体样本是尿、全血、血浆或血清。
在根据本发明的一些方法中，例如，当液体样本是血浆、血清或全血时，则使用稀释剂。所述稀释剂与样本一同沉积在多孔固体支撑物上。可选地，稀释剂于沉积样本之前或之后被沉积在多孔固体支撑物上。此稀释剂在固体支撑物上迁移，驱动或推进样本和被标记的结合试剂在所述固体支撑物中迁移。通常，这种稀释剂由缓冲盐水溶液制成；所述稀释剂还可包括洗涤剂或对反应必要的任何成分。
术语“毛细作用装置”是指允许液体通过简单毛细作用而迁移的多孔固体支撑物。此支撑物的多孔性实现液体或湿润样本和/或试剂的毛细作用(侧向迁移)。具体而言，上述毛细作用装置广泛用于带有侧向迁移的所有免疫层析技术中。
因此，被实施于根据发明的免疫层析设备中的毛细作用装置是本领域技术人员所熟知的(参考，EP 0 284 232)。作为例子，这些毛细作用装置可由各种免疫层析支撑物制成，例如纤维素、尼龙、硝酸纤维素、聚乙烯或玻璃纤维。
毛细作用装置可由一个或若干不同部分制成。支撑物的各个部分可以由不同材料制成。当毛细作用装置由不同部分或不同材料制成时，可以排列这些组件以便实现毛细作用装置中的毛细循环的连续性。
通常，毛细作用装置由矩形多孔固体支撑物沿毛细作用方向制成。优选地，根据本发明设备的毛细作用装置包括采用免疫层析测试条形式的多孔固体支撑物。所述毛细作用装置例如以免疫层析测试条为形式存在，所述测试条由叠置或重叠的测试条制成。
根据本发明的设备，例如，可由固定在坚硬支撑物上的层析测试条制成。所述坚硬支撑物可由诸如纸板、塑料包被的纸板、或最优选的塑料材料等各种材料制成。优选地，坚硬支撑物由聚苯乙烯制成。
毛细作用装置包括样本沉积或接收区域和样本检测区域。沉积区域和检测区域与毛细作用装置不同并与毛细作用装置分开。排列这些区域以便允许沿毛细作用方向的从沉积或接收区域至检测区域的毛细作用的连续性。通常，沉积区域和检测区域分别对应于毛细作用装置的两个相对的端部。因此，毛细作用装置例如是由矩形多孔固体支撑物沿毛细作用方向制成，所述毛细作用装置具有的近端和远端分别形成沉积区域和检测区域。
例如，这些区域可存在于由单独材料制成的同一测试条上。有利地，特定的多孔材料对应于毛细作用装置的各区域。例如，多孔吸收性材料可被用于样本沉积区域。实际上，毛细作用装置的沉积区域会用于与尿液接触或接收液体样本。因此，将要选择适合的吸收性材料。这些材料为本领域技术人员所熟知。并且，另外的吸收性材料可被施用于检测区域和/或接收第一特异性结合试剂的区域。
毛细作用装置的样本沉积区域可与吸收性材料中的捕获构件相配合。例如，此捕获构件可直接与尿液接触。如WO 00/00288中描述的，捕获构件可在两位置间移动，一个位置与毛细作用装置相分隔，用于收集液体样本，另一位置与毛细作用装置的沉积区域处于连续或毛细接触。
毛细作用装置带有，例如偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性抗体。此抗体在毛细作用装置中被沉积干燥，并当湿润时通过毛细作用迁移。此第一分析物特异性抗体可被局限于样本沉积或接收区域。但，此第一抗体还可被沉积干燥于样本沉积或接收区域下游以避免沉积样本时通过洗涤效应的任何试剂损失。因此，液体样本被沉积在毛细作用装置的沉积区域中，于是此样本借助毛细作用通过毛细作用装置迁移，于是驱动偶联到标记物的第一分析物特异性的抗体。
有利地，毛细作用装置可以结合到夹持支撑物中。此夹持支撑物便于毛细作用装置的操作，并尤其可以保护所述毛细作用装置不受潮。
夹持支撑物可以部分地或全部地围绕毛细作用装置。
所述夹持支撑物可由各种材料制成，所述材料例如纸板、塑料包被的纸板，或更优选的塑料材料。有利地，夹持支撑物可由刚性且不渗透的材料制成。这些夹持支撑物或盒子在专利EP 0 291 194、EP 0 560 411、EP 0 560 410和EP 1 091 808中被具体描述。
夹持支撑物通常以盒子为形式。
在发明的一个实施方式中，毛细作用装置可以包括样本沉积或接收区域，所述区域相对夹持支撑物凸出，用于接纳液体样本。
在发明的另一个实施方式中，夹持支撑物或盒子包括用于沉积液体样本的至少一个开口。
通常，夹持支撑物还设置有至少一个观察窗来观察毛细作用装置的检测区域。
实施于根据本发明的方法中的试剂是本领域技术人员所熟知的，所述试剂能够检测液体样本中的分析物。
偶联到可见和/或可测定标记物的第一分析物特异性抗体在毛细作用装置中或在毛细作用装置上被沉积干燥，但所述第一分析物特异性抗体当湿润时可通过毛细作用迁移。
第二分析物特异性的抗体被永久地固定于毛细作用装置的检测区域中。
术语“分析物特异性抗体”是指能够以抗原/抗体类型的结合特异性地与分析物结合的抗体。它通常包括对分析物具有强亲合性的多克隆或单克隆抗体。优选地，所述分析物特异性的抗体包括单克隆抗体。
根据本领域技术人员已知的技术，第二分析物特异性抗体被固定于毛细作用装置的检测区域中。
将此第二抗体固定，使其当湿润时不移动。例如，通过吸收作用或共价结合可以完成这种固定。
例如，在与分析物相同或不同的两个表位位点(sites épitopiques)，第一和第二抗体分别地且特异性地与分析物结合。
本发明设备的第一和第二抗体能够通过夹心法试验测定液体样本中的分析物。
此外，根据本发明的设备包括被固定在毛细作用装置的检测区域中的分析物本身，或分析物的类似物。
根据本领域技术人员已知的技术，将分析物或所述分析物的类似物固定于毛细作用区域的检测区域中。将分析物或所述分析物的类似物固定，使得它们当湿润时不移动。例如，通过吸收作用或通过共价连接可以完成此固定。
检测区域的此种第二试剂与分析物自身或所述分析物的适当类似物相同。术语“分析物的适当类似物”是指与分析物竞争地将自身特异性地结合到第一结合试剂或所述分析物特异性抗体的任何实体。
在一个实施方式中，一方面，第一分析物特异性的抗体偶联到可见和/或可测定标记物，而另一方面，分析物或所述分析物的类似物被固定在毛细作用装置的检测区域中，使得通过竞争法试验能够检测液体样本中的分析物。优选地，第二分析物特异性抗体相对于毛细作用的方向可被沉积在分析物或所述分析物的类似物的上游。
第一分析物特异性的抗体——其当湿润时迁移——偶联到可见和/或可测定的标记物，使得夹心法试验和竞争法试验的结果皆能够被测量或直接观察。当任何可见的标记物被浓缩于毛细作用装置的检测区域中时，所述标记物可通过肉眼直接观察。测量标记物可直接通过肉眼或借助测量设备来完成。通过直接观察来完成所述测量而不需额外操作。
有利地，根据本发明的设备包括第一分析物特异性抗体，所述抗体偶联到可见和/或可测定的标记物。
根据本发明所用的标记物由于发射信号而能够通过肉眼直接检测、或借助设备间接检测，例如，所述信号是荧光、着色、同位素呈现、磁性信号。
例如，可引用由水不溶性小颗粒制成的着色或荧光的特定标记物，并因此形成液相中的悬浮液、分散系或溶胶。
特定标记物是本领域技术人员所广泛熟知的。具体而言已知的是着色或荧光的特定标记物，诸如胶体金、着色胶乳的颗粒、荧光胶乳颗粒和偶联到例如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的颗粒。
除了通过肉眼能够直接观察的标记物，我们还可引用葡聚糖类型的标记物(Hansen T.M.，IVD Technology 4，35-40，2003)。于是，结合试剂被偶联到带有荧光基团的葡聚糖链(多糖衍生物)。
根据本领域技术人员所熟知的技术，结合试剂偶联到可见和/或可测定的标记物。
在发明的一个优选实施方式中，毛细作用装置的检测区域包括相对于毛细作用方向设置于第二分析物特异性抗体下游和分析物或所述分析物类似物下游的第三试剂。此第三试剂能够具有阳性对照以确保液体样本的从毛细作用装置的沉积区域至检测区域的有效毛细作用。
此种第三试剂永久地被固定于毛细作用装置的检测区域中。
例如，本发明可包括将自身结合到与标记物偶联的第一分析物特异性抗体的抗体。在此情况下，此第三试剂能够检验与标记物偶联的第一特异性抗体向毛细作用装置的检测区域的迁移。可选地，此第三试剂独立于分析物并简单地能够检验液体样本向检测区域的作用。
参考以下附图详细描述本发明。
附图
图1：通过夹心法试验的分析物的免疫分析信号/浓度曲线。
图2：通过竞争法试验的分析物的免疫分析信号/浓度曲线。
图3：根据本发明的通过试验而对分析物同时分析的设备。
图4：根据本发明的快速试验设备，所述设备包括盒中的免疫层析测试条。
图5：用于hCG检测的免疫层析测试条。
图6：在稀分析物浓度情况下的根据图5的试验结果。
图7：在强分析物浓度情况下的根据图5的试验结果。
图1显示从通过夹心法试验的免疫分析所获得的信号/浓度曲线。所获得的曲线是一种高斯曲线类型的曲线，所述曲线显示：在限定时间读取结果时，对于一个给定信号(S)对应两种可能的分析物浓度(C1和C2)，一个是弱的(C1)，而另一个是强的(C2)。
图2显示通过竞争法分析的信号/浓度曲线。可观察到对应于待测分析物的两种浓度(C1和C2)所获得的两种不同信号(S1和S2)。但观察到当分析物浓度相对低时信号消退。
图3显示根据本发明的用于同时分析所述分析物的设备，视图A呈现不带有夹持支撑物的设备，而视图B呈现包括夹持支撑物的设备。
视图3A显示包括毛细作用装置(1)的设备，所述设备在毛细作用方向(2)上包括：
a)在第一毛细材料20上的样本沉积或接收区域(3)；
b)当第一分析物特异性抗体(4)——其偶联到可见和/或可测定标记物——湿润时，其在毛细作用装置(1)中通过毛细作用迁移；在与所述第一毛细材料的连续毛细循环中，此被标记的干燥且游离的第一抗体被沉积在第二毛细材料21上。
c)分析物检测区域(5)在毛细作用方向(2)上依次地包括，一方面是被固定的第二分析物特异性抗体(6)，而另一方面是被固定的分析物(7)或所述分析物的类似物；在与第二毛细材料21的连续毛细循环中，所述第二抗体和分析物(或所述分析物的类似物)被设置或沉积于第三毛细材料上；
视图B)显示被集成于夹持支撑物(8)中的毛细作用装置(1)，所述夹持支撑物设置有能够观察检测区域(5)的至少一个观察窗(9)，和用于收集、沉积或接纳液体样本的开口23。
实施例
妊娠试验(检测尿中的绒毛膜促性腺激素或hCG)
图4显示根据本发明的盒类的快速试验的外部视图，层析测试条被插入所述盒中。
测试条1含有用胶体金标记的抗β-hCG单克隆抗体4，所述单克隆抗体4被沉积于玻璃纤维21上并被脱水(偶联的)。此特定标记物当被沉积在样本孔(S)中时被液体样本溶解，之后，此标记物通过在测试条上迁移而依次与如下区域接触：含有固定的抗-hCG多克隆抗体(T1)的第一区域、含有固定的hCG(T2)的第二区域、以及含有多克隆的羊抗鼠免疫球蛋白抗体(C)的第三区域，见图5。
沉积样本中不存在(或非常稀薄的浓度)hCG激素的情况下，实际上在区域T1中不会发生可见反应，然而线将出现在区域T2和区域C(图6)。
样本中的hCG浓度非常强的情况下，区域T1中的反应将非常弱或不存在(因为之前所述的“钩状”效应)；在区域T2中将不会发生可见反应，因为近似所有的以胶体金标记的抗β-hCG抗体已经与样本的分析物(hCG)反应，而再不能用于与分析物(或分析物的任何类似物)反应，而区域C将是阳性的(图7)。
因此，本系统能够有效区分低分析物浓度情况下的结果(2条阳性线：T2+C)或强分析物浓度情况下的结果(1条阳性线：C)的判读。此外，所述线将出现于不同的位置(T1或T2)。
下表概述根据借助于试验的目视读取样本中分析物浓度而在检测区域(T1、T2和C)中得到的结果。
| hCG浓度(mlU/ml) | 0 | 5 | 50 | 00 | .103 | .104 | 05 | .105 | |
| 线T1 | /- | + | + | + | + | + | |||
| 线T2 | + | + | + | + | + | + | + | ||
| 线C | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
表1：根据样本中hCG浓度的目视读取的试验结果。
除目视判读结果之外，完全可能使用机械进行读取，于是所述机械能够提供分析物浓度的定量或半定量的结果，而不必先稀释样本并且不必使用浓度级。实际上，根据浓度区域，在检测区域中得到的结果是不同的，并且对这种差别的判读——校准后或通过目视观察——可以使对分析物浓度定量成为可能。
Claims (10)
1.一种用于测定液体样本中的分析物的设备，包括：
-毛细作用装置(1)，其涉及确定作为参照的毛细作用方向的侧向迁移，并且包括液体样本沉积区域(3)和设置在所述沉积区域下游的分析物检测区域(5)，
-第一分析物特异性结合试剂(4)，其被偶联到可见和/或可测定的标记物，所述结合试剂当湿润时通过毛细作用沿所述毛细作用方向在所述毛细作用装置(1)中迁移，所述第一结合试剂(4)的所述沉积区域与所述样本沉积区域(3)合并，或被设置于所述样本沉积区域(3)的下游，但在所述检测区域(5)的上游，
-第二分析物特异性结合试剂(6)，其被固定于所述检测区域中，
其特征在于，所述检测区域(5)包含有分析物(7)或所述分析物的类似物，其被固定并与所述第二特异性结合试剂(6)分开设置。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备包括独立于所述毛细作用装置的液体样本捕获部件，所述捕获部件能够与所述沉积区域接触，用于使所述样本在所述沉积区域中流动。
3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细作用装置(1)包括所述第一结合试剂(4)的沉积区域，所述第一结合试剂在所述毛细作用装置中或所述毛细作用装置上是干燥且游离的。
4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，在所述检测区域(5)中，所述分析物(7)或所述分析物的类似物被设置在相对于所述第二特异性结合试剂的上游或下游。
5.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述第二特异性结合试剂(6)，和/或所述分析物(7)或所述分析物的类似物沿横切所述参照方向的线被设置于所述毛细作用装置上。
6.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述毛细作用装置包括在所述检测区域(5)下游的对照区域(c)。
7.用于实施根据权利要求1至6中任一项所述的设备的方法，其特征在于
-将所述液体样本沉积在所述毛细作用装置的沉积区域(20)中，
-等待充足的时间用于使所述液体样本通过毛细作用迁移，
-在所述检测区域中观察到的范围是：一方面，与所述分析物络合的所述第一特异性结合试剂(4)将其自身附着到所述第二特异性结合试剂，从而得到第一信号，且另一方面，所述第一未络合的结合试剂将其自身附着到所述分析物，从而得到第二信号，
-由所述第一和第二信号测定所述分析物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一结合试剂(4)的量大于存在于所述液体样本中的所述分析物的量，或大于存在于所述液体样本中的络合位点的数量。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过不存在所述第一信号而存在所述第二信号可以检测出稀薄分析物浓度。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过两种信号皆不存在可以检测出强分析物浓度。
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