WO2023237914A1 - Kit y metodo para el automuestreo de cera de los oídos y para la medicion de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oidos - Google Patents

Kit y metodo para el automuestreo de cera de los oídos y para la medicion de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oidos Download PDF

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WO2023237914A1
WO2023237914A1 PCT/IB2022/055394 IB2022055394W WO2023237914A1 WO 2023237914 A1 WO2023237914 A1 WO 2023237914A1 IB 2022055394 W IB2022055394 W IB 2022055394W WO 2023237914 A1 WO2023237914 A1 WO 2023237914A1
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biosensor
holder
sample
sponge
measuring biomarkers
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PCT/IB2022/055394
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Andrés HERANE-VIVES
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Herane Vives Andres
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention is related to a method and a kit for taking ear wax samples to measure the concentrations of various biomarkers, and in particular, with a method and a kit for taking ear wax samples and for measuring various biomarkers using a portable kit.
  • earwax cerumen is a reliable sample to reflect the chronic systemic level of substances, which are highly variable in the short term, such as cortisol and glucose.
  • this document described an efficient and safe device for extracting earwax samples for analysis.
  • the applicant developed a kit that includes said device for the extraction of ear wax samples and additionally a portable device that can use batteries or electric current as a power source for the measurement of biomarkers directly from the wax. of ear present in the device for extracting ear wax samples.
  • Said kit basically comprises the device for sample extraction similar to that described in WO2019/123392A1 and a portable device for measuring biomarkers, which is designed to receive the sponge of the device for sample extraction previously impregnated with the wax sample.
  • Said device for measuring biomarkers uses a cylindrical multiplexed lateral flow biosensor that has different assays side by side. However, other biosensors such as those called “amperomethcos” They can also be used.
  • the proposed device for measuring biomarkers has cameras that collect the images of the tests, which are sent to information processing means so that they can interpret the images received from the tests using an immunochromatographic program.
  • the information processing means have a light signal detector that includes photographic cameras. Test results are displayed on a liquid crystal display (LCD).
  • LCD liquid crystal display
  • the device for measuring biomarkers is designed to receive the sponge of the device for sample extraction with the sample of ear wax and uses a cylindrical multiplexed lateral flow biosensor that has different tests next to each other, and where the device for measuring markers has cameras that collect the images of the tests which are sent to information processing means to interpret the images received from the tests using an immunochromatography program, but other methods could also be used.
  • Figure 1 is a left side view of the ear wax removal device of the present invention showing the cross section of the tip including the sponge.
  • Figure 2 is a perspective view of the tip of the ear wax removal device of the present invention without the sponge.
  • Figure 3 is a top view of the tip of the ear wax removal device of the present invention without the sponge.
  • Figure 4 is a left side view of a second embodiment of the ear wax removal device of the present invention showing the cross section of the tip including the sponge.
  • Figure 5 is a perspective view of the device for measuring biomarkers of the present invention.
  • Figure 6 is a top view of the biomarker measurement device of the present invention without the top wall.
  • Figure 7 is a front view of the device for measuring biomarkers of the present invention without the front wall, showing its internal components.
  • Figure 8 is a front view of the biosensor holder of the present invention.
  • Figure 9a is a perspective view of the biosensor unit of the present invention.
  • Figure 9b is a top view of the biosensor unit of the present invention.
  • Figure 10a is a front component diagram of the multiplexed lateral flow biosensor of the present invention.
  • Figure 10b is a perspective view of the biosensor unit of the present invention without the front portion to show the location of the multiplexed lateral flow biosensor adhered to the inner surface of the flexible backing plate.
  • Figure 11 a, 11 b, and 11 c is a front view of the nitrocellulose membrane of the multiplexed lateral flow biosensor of the present invention showing the test line and the control line in various states.
  • Figure 12 is a front view of the device for removing ear wax of the present invention showing its sponge inserted in the biosensor unit which is in turn inserted in the biosensor holder.
  • Figure 13 is a perspective view of the device for measuring biomarkers with the biosensor holder including the biosensor unit about to be inserted into the device for measuring biomarkers through its circular central opening.
  • kit for self-sampling of ear wax and for the measurement of biomarkers in situ from said ear wax
  • kit comprises: a device for the extraction of samples similar to that described in WO2019/123392A1, the description of which is included below for reference: a handle (1) that has a first end (2) and a second end (3), said second end (3) having coupling means that In a preferred embodiment of the invention they may comprise a thread (4); a detachable head (tip) comprising a base (5) and a longitudinally extendable elongated sponge holder (6) directly depending on an upper part of the base, in which the lower part of the base has a shell that includes a pattern internal threading (7) to receive the thread (4) of the handle (1), and in which the sponge of the support (6) has a star-shaped cross section; an elongated sponge (8) having a centrally located longitudinal casing (not shown) having a star-shaped cross section to receive the sponge holder (6) of the base
  • the handle (1) and the base (5) can include any coupling means suitable for coupling the handle, such as a pressure joint (9); and wherein the sponge (8) may preferably be made of cellulose and glued to the sponge holder (6) using a non-allergenic glue.
  • a device for measuring biomarkers from an ear wax sample obtained by means of the sample extraction device comprising: a cube-shaped housing (10), having: an upper wall (11), a lower wall (not shown), a front wall (12), a rear wall (13), a right side wall (14) and a left side (15), where the upper wall has (11) with a central circular opening (16) to receive a cylindrical biosensor holder (17); information processing means (not shown) mounted on the lower wall of the housing (10); a pedestal (18) anchored to a middle portion of the surface of the lower wall of the housing (10), said pedestal (18) having a height less than the walls of the housing (10); four cameras (19a, 19b, 19c, 19d) mounted in the upper third of the pedestal, each camera (19a, 19b, 19c, 19d) being directed to a middle portion of a right lateral (14), left lateral (15) wall , corresponding front (12) and rear (13) and each camera (19a, 19b, 19c, 19d) being connected to the information processing means;
  • Said base membrane (31) having a first end (32), a second end (33), an internal surface and an external surface (34), where the internal surface may have hydrophilic characteristics, to slow down the diffusion of the sample of wax (hydrophobic), thus guaranteeing the time necessary for the immunohistochemical reaction to take place; a nitrocellulose membrane (35), of elongated shape, having a first end (36) and a second end (37) and having a test line portion (38) and a control line portion (39), said nitrocellulose membrane (35) located vertically on the base membrane (31) along its entire length where its first end (36) and second end (37) coincide with the first end (32) and second end ( 33) of the base membrane (31); a conjugate pad (40) located vertically on the nitrocellulose membrane at a first horizontal end (36) thereof, to contain conjugated tracer antibodies; an ear wax sample pad (41) located in a vertical direction on the conjugate pad (40).
  • the sample pad (41) is made of a material with high oil absorption property, such as natural inorganic substances, for example, sand, clay or volcanic ash. It can also be made of other natural organic and synthetic materials and must be pre-treated with a buffer solution; an absorbent pad (42) located in a vertical direction on the nitrocellulose membrane (35) at a second horizontal end (37) thereof;
  • each biosensor (28) are attached to the internal surface of the backing plate (29) of the biosensor unit (27) using an adhesive substance.
  • each component of each biosensor (28) is attached to the base membrane (31) in close contact with each other in such a way that the migration of sample and test components through the biosensor (28) is ensured. (also called a test strip) during a test, and preferably overlap the end where it joins another component by approximately 2 mm.
  • Ear wax diffuses into the sample pad (41), which will act as a filter to facilitate the flow of sample and test components.
  • the conjugates to be used (enzymes or antibodies) are dispensed with a pipette onto the conjugate pad (40).
  • the pads may be pre-prepared separately, dried at room temperature, and stored in deaccectors at 4°C prior to use and attachment to the biosensor.
  • the corresponding capture reagents are dispensed onto the membrane.
  • nitrocellulose (35) where the test lines (38) and control lines (39) are located respectively by any type of device or suitable method.
  • the labels are placed on the pads and nitocellulose membrane and are preferably made of colloidal gold, carbon or latex. Specific tags are chosen based on compatibility with the test components.
  • the resulting complexes move through the principle of capillarity from the area marked (A) to the area marked (D) until they are detected on the test line (38) via a previously deposited detection antibody ( zone (B)). In case there is no junction on the test line (38), a negative result is displayed.
  • the gold-labeled antibody recognizes a unique part of the target molecule, known as an epitope, and binding occurs.
  • control line (39) Unreacted antibody/tracer conjugates are finally detected in the control line (39) by a species-specific antibody (zone (C)).
  • Both lines, test (38) and control (39) contain capture reagents to display the results.
  • the visual control line (39) indicates that the test has been executed correctly.
  • the labels color the control (39) and test (38) lines.
  • the cylindrical biosensor unit (27) that has one or more (preferably up to four multiplexed lateral flow biosensors (28) previously prepared and with the earwax sample, is inserted into the biosensor holder. (17), which in turn is inserted into the central circular opening (16) of the device for measuring biomarkers in such a way that the upper end wall (25) of the biosensor holder (17) serves as a stop. with the upper wall (11) of the device for measuring biomarkers.
  • the internal surface of the backing plate (29) of the biosensor unit (27) surrounds the pedestal (18) with the cameras (19a, 19b, 19c, 19d), in such a way that each chamber (19a, 19b, 19c, 19d) is pointing at the test lines (38) and control (39), also called test strip or staining zone of a lateral flow biosensor multiplexed (28);
  • Each camera (19a, 19b, 19c, 19d) obtains images of the test line (38) and the control line (39) (staining zone) as data from a matrix of points arranged in horizontal and vertical rows.
  • Each point, or pixel is characterized by three numerical parameters, corresponding to three image formation channels - Red, Green and Blue (RGB) - that make up the RGB circuit.
  • RGB Red, Green and Blue
  • the images obtained by each camera (19a, 19b, 19c, 19d) are processed in information processing means by means of Immunochromatography software, which tests four readings, which will correspond to the chronic level of the substances measured in the earwax.
  • the results are shown on the screens (P), where each one corresponds to a camera (19a, 19b, 19c, 19d) and its corresponding biosensor (28).
  • the software processed by the information processing means responsible for processing the information from the cameras (19a, 19b, 19c, 19d) may comprise an Artificial Intelligence algorithm that can be trained to improve the interpretation of the images. obtained and therefore the measurement of the biomarkers.
  • the sample extraction is preferably carried out with the sample extraction device similar to that described in WO2019/123392A1 and whose description was included above as a reference.
  • the extraction can be carried out with any other type of device as long as it has a sponge that can adapt to the shape and size of the cylindrical opening of the biosensor unit (27) inserted in the biosensor holder (17). ) and that has sufficient length to contact the sample pad (41) of each of the biosensors (28) with a sufficient amount of sample.
  • Ear wax is obtained by inserting the sponge tip (8) of the sampling device into the ear canal and rotating the sponge inside the ear canal for approximately 30 to 60 seconds.
  • the user must rotate the sponge (8) in such a way that the sponge (8) rubs the sample pad (41) of each biosensor (28), depositing a biological wax sample to ears (minimum preferably 0.8 mg) in each sample pad (41).
  • the biosensor unit (27) must be inserted into the central circular opening (16) of the device for measuring biomarkers in such a way that The upper end wall (25) of the biosensor holder serves as a stop with the upper wall (11) of the device for measuring biomarkers, as shown in Figure 13.
  • the biosensor holder (17) may include guidance means (not shown). that cooperate with the circular central opening (16) of the housing.
  • the translation of different electro-chemical signals is carried out as a reading mechanism for the different biomarkers, such as the glucose present in human earwax.
  • other optical reading mechanisms could also be used.
  • the degree of fluorescence determines a specific electrical signal and concentration of the analyte to be determined, such as glucose, through specific calibration curves stored in the device's memory.
  • concentration of the analyte to be determined such as glucose
  • Other conjugates such as gold or silver nanoparticles that emit different wavelengths that can also be translated into different concentrations and may also be used.
  • the device for measuring biomarkers of the present invention can use other types of biosensors, such as, for example, but not limited to: amperometric, potentiometric, impedimetric, voltammetric, piezoelectric, thermometric, optical, etc. biosensors.
  • biosensors do not require the use of cameras, since the measurement results can be provided through signals sent to the information processing means either through a direct connection or wirelessly, so in said modalities, they do not require the use of cameras. It would be necessary to use the pedestal with the cameras, nor the lighting or focusing means. In the same way, it is possible that the biosensors used do not require prior preparation by the user (apply the conjugates to be used, apply the corresponding capture reagents).
  • both the sponge (8) of the device for sample extraction and the central opening (16) of the device for measuring biomarkers and the cross section of the biosensor holder (17) and the measurement unit Biosensors (27) can have any cross-sectional shape, as long as it allows the sponge (8) to deposit the appropriate amount of ear wax on the biosensor.
  • the biosensor holder may only comprise a structure and means for holding the one or more sensors.
  • the housing (10) of the device for measuring biomarkers can have any shape of cross section, such as circular, or even only comprise a structure with means to hold the biosensor holder (17).
  • the biosensor holder (17) is not used and only the biosensor unit (27) is inserted into the apparatus for measuring biomarkers, which must have a cavity so that it can be inserted. the sponge of the sampling device to impregnate the sensors with the earwax sample.
  • kit and method for self-sampling of earwax and for measuring in situ biomarkers from said earwax of the present invention is not limited to the modality described above and that those skilled in the art branch will be qualified, by the teachings established here, to make changes in the kit and method for self-sampling of ear wax and for the measurement of biomarkers in situ from said ear wax of the present invention, whose scope will be established exclusively by the following claims.

Abstract

Un kit y un método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos, el cual incluye un dispositivo para la toma de muestras y adicionalmente un kit para la medición de biomarcadores directamente de la cera de oído presente en el kit de toma de muestras.

Description

KIT Y METODO PARA EL AUTOMUESTREO DE CERA DE LOS OÍDOS Y PARA LA MEDICION DE BIOMARCADORES IN SITU A PARTIR DE DICHA CERA DE OIDOS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
A. CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención está relacionada con un método y un kit para tomar muestras de cera del oído para medir las concentraciones de diversos biomarcadores, y en lo particular, con un método y un kit para tomar muestras de cera de oído y para la medición de diversos biomarcadores mediate un kit portátil.
B. DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DEL ARTE
Como se describió en la solicitud de patente internacional con No. de publicación WO2019/123392A1 del mismo solicitante, la cera de oído el cerumen es una muestra fiable para reflejar el nivel sistémico crónico de sustancias, que son muy variables a corto plazo, como el cortisol y la glucosa. Así mismo, en dicho documento se describió un dispositivo eficiente y seguro para la extracción de muestras de cerumen para su análisis.
En adición a dicho dispositivo para la extracción de muestras, sería altamente deseable el contar con un dispositivo que permita medir los niveles de biomarcadores directamente del dispositivo para la extracción de muestras in situ más que in vitro, y el arte previo no describe ni sugiere algún dispositivo o método para medir niveles de biomarcadores a partir de cera de oído.
En vista de lo anterior, el solicitante desarrollo un kit que incluye dicho dispositivo para la extracción de muestras de cera de oído y adicionalmente un dispositivo portable que puede utilizar baterías o la corriente eléctrica como fuente de poder para la medición de biomarcadores directamente desde la cera de oído presente en el dispositivo para la extracción de muestras de cera de oído.
Dicho kit comprende básicamente el dispositivo para la extracción de muestras similar al descrito en WO2019/123392A1 y un dispositivo portátil para la medición de biomarcadores, el cual está diseñado para recibir la esponja del dispositivo para la extracción de muestras previamente impregnado con la muestra de cera para oídos. Dicho dispositivo para la medición de biomarcadores utiliza un biosensor de flujo lateral multiplexado de forma cilindrica que cuenta con diferentes ensayos uno al lado de otro. Sin embargo otros biosensores como aquellos llamados “amperométhcos” también pueden ser utilizados. El dispositivo propuesto para la medición de biomarcadores cuenta con cámaras que recogen las imágenes de los ensayos las cuales son enviadas a medios de procesamiento de información para que realicen la interpretación de las imágenes recibidas de los ensayos mediante un programa de inmunocromatográfica.
Los medios de procesamiento de información cuentan con un detector de señal luminosa que comprende cámaras fotográficas. Los resultados del ensayo se muestran en una pantalla de cristal líquido (LCD).
De esta manera, un usuario puede obtener la concentración de diversos biomarcadores a partir de una muestra biológica de cera de oídos tomada por el mismo usuario, de manera práctica y rápida.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Por lo tanto, es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un kit y un método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos.
Es otro objetivo principal de la presente invención, proporcionar un kit y un método de la naturaleza anteriormente descrita, el cual incluye un dispositivo para la toma de muestras y adicionalmente un kit para la medición de biomarcadores directamente de la cera de oído presente en el kit de toma de muestras.
Es aún un objetivo principal de la presente invención, el proporcionar un kit y un método de la naturaleza anteriormente descrita, en donde el dispositivo para la medición de biomarcadores, está diseñado para recibir la esponja del dispositivo para la extracción de muestras con la muestra de cera para oídos y utiliza un biosensor de flujo lateral multiplexado de forma cilindrica que cuenta con diferentes ensayos uno al lado de otro, y en donde el dispositivo para la medición de marcadores cuenta con cámaras que recogen las imágenes de los ensayos las cuales son enviadas a medios de procesamiento de información para que realicen la interpretación de las imágenes recibidas de los ensayos mediante un programa de inmunocromatografía, pero otros métodos también podrían ser utilizados.
Estos y otros objetivos y ventajas del kit y método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos de la presente invención se harán evidentes para aquellas personas que tengan una habilidad ordinaria en el arte, a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones de la invención que se harán con referencia a los dibujos que lo acompañan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una vista lateral izquierda del dispositivo para la extracción de cera de oído de la presente invención que muestra la sección transversal de la punta incluyendo la esponja.
La Figura 2 es una vista en perspectiva de la punta del dispositivo para la extracción de cera de oído de la presente invención sin la esponja.
La Figura 3 es una vista superior de la punta del dispositivo para la extracción de cera de oído de la presente invención sin la esponja.
La Figura 4 es una vista lateral izquierda de una segunda realización del dispositivo para la extracción de cera de oído de la presente invención que muestra la sección transversal de la punta incluyendo la esponja.
La Figura 5 es una vista en perspectiva del dispositivo para la medición de biomarcadores de la presente invención.
La Figura 6 es una vista superior del dispositivo para la medición de biomarcadores de la presente invención sin la pared superior.
La Figura 7 es una vista frontal del dispositivo para la medición de biomarcadores de la presente invención sin la pared frontal, mostrando sus componentes internos.
La Figura 8 es una vista frontal del porta-biosensores de la presente invención.
La Figura 9a es una vista en perspectiva de la unidad de biosensores de la presente invención.
La Figura 9b es una vista superior de la unidad de biosensores de la presente invención.
La Figura 10a es un diagrama frontal de componentes del biosensor de flujo lateral multiplexado de la presente invención.
La Figura 10b es una vista en perspectiva de la unidad de biosensores de la presente invención sin la porción frontal para mostrar la ubicación del biosensor de flujo lateral multiplexado adherido a la superficie interna de la placa de respaldo flexible.
La figura 11 a, 11 b, y 11 c es una vista frontal de la membrana de nitrocelulosa del biosensor de flujo lateral multiplexado de la presente invención mostrando las línea de prueba y la línea de control en diversos estados. La Figura 12 es una vista frontal del dispositivo para la extracción de cera de oído de la presente invención mostrando su esponja insertada en la unidad de biosensores la cual se encuentra insertada a su vez en el porta-biosensores.
La Figura 13 es una vista en perspectiva del dispositivo para la medición de biomarcadores con el porta-biosensores incluyendo la unidad de biosensores a punto de ser insertado en el dispositivo para la medición de biomarcadores a través de su apertura central de forma circular.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El kit para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos será ahora descrito haciendo referencia a una modalidad preferida del mismo, en donde dicho kit comprende: un dispositivo para la extracción de muestras similar al descrito en WO2019/123392A1 , cuya descripción se incluye a continuación como referencia: un mango (1 ) que tiene un primer extremo (2) y un segundo extremo (3), dicho segundo extremo (3) teniendo medios de acoplamiento que en una realización preferida de la invención pueden comprender una rosca (4); una cabeza desmontable (punta) que comprende una base (5) y un soporte de esponja alargada longitudinalmente extensible (6) directamente dependiendo de una parte superior de la base, en la que la parte inferior de la base tiene una carcasa que incluye un patrón roscado interno (7) para recibir la rosca (4) del mango (1 ), y en el que la esponja del soporte (6) tiene una sección transversal en forma de estrella; una esponja alargada (8) que tenga una carcasa longitudinal situada en el centro (no se muestra) que tiene una sección transversal en forma de estrella para recibir el soporte de esponja (6) de la base (5). en donde el mango (1 ) y la base (5) pueden incluir cualquier medio de acoplamiento adecuado para acoplar el mango, como una junta de presión (9); y en donde la esponja (8) puede hacerse preferible de celulosa y se pega al soporte de esponja (6) utilizando un pegamento no alergénico. un dispositivo para la medición de biomarcadores a partir de una muestra de cera de oídos obtenida mediante el dispositivo para la extracción de muestras, comprendiendo: una carcasa con forma de cubo (10), teniendo: una pared superior (11 ), una pared inferior (no mostrada), una pared frontal (12), una pared posterior (13) una pared lateral derecha (14) y una pared lateral izquierda (15), en donde la pared superior cuenta (11 ) con una apertura central de forma circular (16) para recibir un porta-biosensor de forma cilindrica (17); medios de procesamiento de información (no mostrados) montados en la pared inferior de la carcasa (10); un pedestal (18) anclado a una porción media de la superficie de la pared inferior de la carcasa (10), dicho pedestal (18) teniendo una altura menor que las paredes de la carcasa (10); cuatro cámaras (19a, 19b, 19c, 19d) montadas en el tercio superior del pedestal, cada cámara (19a, 19b, 19c, 19d) estando dirigida a una porción media de una pared lateral derecha (14), lateral izquierda (15), frontal (12) y posterior (13) correspondiente y cada cámara (19a, 19b, 19c, 19d) estando conectada a los medios de procesamiento de información; medios de enfoque para permitir una mejor resolución de la imagen obtenida por las cámaras, dichos medios de enfoque comprendiendo una lente de forma circular (20) que rodea el pedestal (18) que tiene las cámaras (19a, 19b, 19c, 19d) y el porta-biosensor cilindrico (17) y sujetado mediante medios de soporte (no mostrados) anclados a la pared inferior; fuente de luz, en donde en una modalidad preferida comprenden cuatro focos (21 a, 21 b, 21 c, 21 d) montados en el pedestal (18), debajo de las cámaras (19a, 19b, 19c, 19d) y cada foco conectado a una fuente de poder (no mostrada), en donde cada foco (21 a, 21 b, 21c, 21 d) produce una luz con características espectrales monocromáticas especificas en un rango de onda entre 600nm -1400nm para garantizar un alto contraste entre el fondo y la zona de tinción específica dada por la reacción en cada uno de los cuatro biosensores, lo cual será descrito más adelante; al menos una pantalla (P) para la presentación de información, cada una conectada a los medios de procesamiento de información para presentar resultados de mediciones; un porta-biosensor (17) comprendiendo un elemento de forma cilindrica hueca que tiene una pared cilindrica con una superficie externa (22) y una superficie interna (no mostrada), un extremo superior (23) y un extremo inferior (24), una pared de extremo superior (25) que tiene mayor diámetro que el elemento de forma cilindrica, quedando el extremo inferior abierto, en donde una porción superior del elemento de forma cilindrica cuenta con una ranura (26) con una longitud de +/- 4 mm en donde el elemento de forma cilindrica tiene un diámetro tal que le permite pasar de manera ajustada por la apertura central de forma circular (16) del dispositivo para la medición de biomarcadores; una unidad de biosensores (27) de forma cilindrica, que cuenta con por lo menos un biosensor de flujo lateral multiplexado (28), mostrado en la Figura 10, en donde la unidad de biosensores (27) comprende: una placa de respaldo flexible (29) de forma cilindrica hueca con los extremos abiertos hecha de un materia plástico como por ejemplo vinilo, pero otros materiales también pueden ser utilizados que presenten una fuerte unión a proteínas (incluidos anticuerpos o enzimas) y propiedades de absorción variables (diferentes tiempos de flujo capilar) , como por ejemplo la nitrocelulosa, dicha placa de respaldo de forma cilindrica teniendo una superficie externa y una superficie interna y un diámetro y una altura tales que puede insertarse de manera ajustada dentro del porta-biosensor (17), y dicha placa de respaldo teniendo medios de tope (30) en una porción superior de la superficie externa que se enganchan en la ranura (26) del porta-biosensor (17) cuando la placa de respaldo (29) se inserta en el porta-biosensor (17); uno o más biosensores de flujo lateral multiplexado (28) cada uno colocado de manera equidistante en una porción media de la superficie interna de la placa de respaldo flexible (29) siguiendo el diámetro de la placa de respaldo, cada uno comprendiendo: una membrana base (31 ), de forma alargada, hecha de un material flexible seleccionado del conjunto que comprende pero sin limitarse a: vinilo o nitrocelulosa, dicha membrana base siendo sensible a la presión mediante el uso de un adhesivo hecho de acrílico pero, no reactivo y estable. Dicha membrana base (31 ) teniendo un primer extremo (32), un segundo extremo (33) , una superficie interna y una superficie externa (34), en donde la superficie interna puede tener características hidrofílicas, para enlentecer la difusión de la muestra de cera (hidrofóbica), garantizando así el tiempo necesario para que la reacción inmunohistoquimica se lleve a cabo; una membrana de nitrocelulosa (35), de forma alargada, teniendo un primer extremo (36) y un segundo extremo (37) y contando con una porción de línea de prueba (38) y una porción de línea de control (39), dicha membrana de nitrocelulosa (35) ubicada en sentido vertical sobre la membrana base (31 ) a todo lo largo de la misma en donde su primer extremo (36) y segundo extremo (37) coincide con el primer extremo (32) y segundo extremo (33) de la membrana base (31 ); una almohadilla conjugada (40) ubicada verticalmente sobre la membrana de nitrocelulosa en un primer extremo horizontal (36) de la misma, para contener anticuerpos trazadores conjugados; una almohadilla de muestra de cera de oídos (41 ) ubicada en un sentido vertical sobre la almohadilla conjugada (40). La almohadilla de muestra (41 ) está hecha de un material de alta propiedad de absorción de aceite, como las sustancias inorgánicas naturales, por ejemplo, arena, arcilla o ceniza volcánica. También puede estar hecha de otros materiales naturales orgánicos y sintéticos y deberá ser pre-tratada con una solución tampón; una almohadilla absorbente (42) ubicada en un sentido vertical sobre la membrana de nitrocelulosa (35) en un segundo extremo horizontal (37) de la misma;
Los componentes de cada biosensor (28), se unen a la superficie interna de la placa de respaldo (29) de la unidad de biosensores (27) mediante una sustancia adhesiva. A su vez, cada componente de cada biosensor (28) se encuentra unido a la membrana base (31 ) en proximidad de contacto uno con otro de tal forma que se asegura la migración de componentes de muestra y prueba a través del biosensor (28) (también llamado tira de prueba) durante un ensayo, y de manera preferente se superponen del extremo donde se une a otro componente en aproximadamente 2 mm.
La cera de oído (cerumen) se difunde en la almohadilla de muestra (41 ), que actuará como filtro para facilitar el flujo de componentes de muestra y prueba. Los conjugados a utilizar (enzimas o anticuerpos) se dispensan con una pipeta sobre la almohadilla conjugada (40). En otras modalidades, las almohadillas pueden prepararse previamente por separado, secarse a temperatura ambiente y almacenarse en desacectores a 4 °C antes de su uso y de unirse al biosensor. Los reactivos de captura correspondientes se dispensan sobre la membrana de nitrocelulosa (35) donde se ubican las líneas de prueba (38) y control (39) respectivamente mediante cualquier tipo de dispositivo o método adecuado.
Las etiquetas (trazadores) se ubican sobre las almohadillas y la membrana de nitocelulosa y están hechas preferentemente de oro coloidal, carbono o látex. Las etiquetas específicas se eligen en función de la compatibilidad con los componentes de prueba.
Una vez que los analitos específicos en la cera de oído hayan llegado a la almohadilla conjugada (40), rehidratarán anticuerpos trazadores conjugados para que coincidan entre ellos (zona (A) mostrada en la figura 10).
Los complejos resultantes se mueven a través del principio de la capilaridad de la zona marcada como (A) hasta la zona marcada como (D) hasta que se detectan en la línea de prueba (38) a través de un anticuerpo de detección depositado previamente (zona (B)). En caso de que no haya unión en la línea de prueba (38), se muestra un resultado negativo.
Los resultados potenciales (tinción) proporcionados por cada biosensor (28) se muestran en la Figura 1 1a que muestra un resultado positivo, 1 1 b que muestra un resultado negativo y 11c que muestra un resultado inválido..
En la línea de prueba (38), el anticuerpo marcado con oro reconoce una parte única de la molécula objetivo, conocida como epítopo, y se produce la unión.
Los conjugados de anticuerpo/trazador que no hayan reaccionado son finalmente detectados en la línea de control (39) por un anticuerpo específico de especie (zona (C)). Ambas líneas, prueba (38) y control (39) contienen reactivos de captura para mostrar los resultados.
La línea de control (39) visual indica que la prueba se ha ejecutado correctamente. Las etiquetas dan color a las líneas de control (39) y prueba (38).
En última instancia, la presencia de una almohadilla absorbente (42) recolectará cualquier exceso de muestra y reactivos (zona (D)).
Para la realización de una prueba, la unidad de biosensores (27) de forma cilindrica que tiene uno o más (preferentemente hasta cuatro biosensores de flujo lateral multiplexado (28) previamente preparados y con la muestra de cerumen, se inserta dentro del porta-biosensor (17), el cual a su vez se inserta en la apertura central de forma circular (16) del dispositivo para la medición de biomarcadores de tal forma que la pared de extremo superior (25) del porta-biosensor (17) sirve de tope con la pared superior (11 ) del dispositivo para la medición de biomarcadores. Cuando el portabiosensor (17) se encuentra insertado en el dispositivo para la medición de biomarcadores, la superficie interna de la placa de respaldo (29) de la unidad de biosensores (27), rodea al pedestal (18) con las cámaras (19a, 19b, 19c, 19d), de tal forma que cada cámara (19a, 19b, 19c, 19d) queda apuntando a las líneas de prueba (38) y control (39), también llamadas tira reactiva o zona de tinción de un biosensor de flujo lateral multiplexado (28);
Cada cámara (19a, 19b, 19c, 19d) obtiene imágenes de la línea de prueba (38) y de la línea de control (39) (zona de tinción) como datos de una matriz de puntos dispuestos en filas horizontales y verticales. Cada punto, o pixel, se caracteriza por tres parámetros numéricos, correspondientes a tres canales de formación de imágenes -Rojo, Verde y Azul (RGB)- que componen el circuito RGB. Los resultados del registro de cada uno de los canales son dígitos que aumentan a medida que aumenta la intensidad de la tinción.
Las imágenes obtenidas por cada cámara (19a, 19b, 19c, 19d) son procesadas en medios de procesamiento de información por medio de un software de Inmunocromatografía, el cual prueba cuatro lecturas, que corresponderán al nivel crónico de las sustancias medidas en el cerumen. Los resultados se muestran en las pantallas (P), en donde cada una corresponde a una cámara (19a, 19b, 19c, 19d) y su correspondiente biosensor (28). En otras modalidades, el software procesado por los medios de procesamiento de información encargado de procesar la información de las cámaras (19a, 19b, 19c, 19d), puede comprender un algoritmo de Inteligencia Artificial que puede ser entrenado para mejorar la interpretación de las imágenes obtenidas y por lo tanto de la medición de los biomarcadores.
Uso del kit
Previamente, el usuario debe de preparar los biosensores de flujo lateral multiplexado (27) de la siguiente manera:
• Aplicar los conjugados a utilizar (enzimas o anticuerpos) sobre la almohadilla conjugada (40).
• Aplicar los reactivos de captura correspondientes sobre la membrana de nitrocelulosa (35) donde se ubican las líneas de prueba (38) y control (39) respectivamente.
Insertar la unidad de biosensores (27) de forma cilindrica dentro del porta- biosensor (17), de tal forma que los medios de tope (30) de la placa de respaldo (29) se enganchan en la ranura (26) del porta-biosensor, mediante lo cual la unidad de biosensores (27) queda asegurada dentro del porta-biosensor (17).
La extracción de la muestra es realizada preferentemente con el dispositivo para la extracción de muestras similar al descrito en WO2019/123392A1 y cuya descripción fue incluida arriba como referencia. No obstante, la extracción puede ser realizada con cualquier otro tipo de dispositivo siempre y cuando cuente con una esponja que se pueda adaptar a la forma y tamaño de la apertura cilindrica de la unidad de biosensores (27) insertada en el porta-biosensor (17) y que tenga la longitud suficiente para contactar la almohadilla de muestra (41 ) de cada uno de los biosensores (28) con suficiente cantidad de muestra. En una modalidad preferida, es posible analizar cortisol y glucosa de todas las muestras de cerumen previamente obtenidas con una muestra tan pequeña como 0.8 mg de cerumen, por lo que la cantidad mínima de muestra es preferentemente de 0.8 mg.
La cera del oído se obtiene insertando la punta con la esponja (8) del dispositivo para la extracción de muestras en el canal auditivo y girando la esponja dentro del canal auditivo durante unos 30 a 60 segundos.
Una vez obtenida la muestra de cera de oído, el usuario debe insertar la punta de la esponja del dispositivo para la extracción de muestras en la unidad de biosensores de forma cilindrica que se encuentra dentro del porta-biosensor, tal y como se muestra en la Figura 12.
Dentro de la unidad de biosensores (27), el usuario debe de girar la esponja (8) de tal forma que la esponja (8) roce la almohadilla de muestra (41 ) de cada biosensor (28), depositando muestra biológica de cera para oídos (mínimo preferentemente 0.8 mg) en cada almohadilla de muestra (41 ).
Una vez que las almohadillas de muestra (41 ) se encuentran impregnadas con muestra de cerumen, la unidad de biosensores (27) se debe insertar dentro de la apertura central de forma circular (16) del dispositivo para la medición de biomarcadores de tal forma que la pared de extremo superior (25) del porta-biosensor sirve de tope con la pared superior (11 ) del dispositivo para la medición de biomarcadores, tal y como se muestra en la Figura 13.
Para que se pueda asegurar que cada línea de control visual (38), (39) se encuentre alineada con una cámara respectiva (19a, 19b, 19c, 19d) el porta-biosensor (17) puede incluir medios de guía (no mostrados) que cooperen con la apertura central de forma circular (16) de la carcasa. Como se describió anteriormente, en el dispositivo para la medición de biomarcadores se lleva a cabo la traducción de distintas señales electro-químicas como mecanismo de lectura de los distintos biomarcadores, como por ejemplo la glucosa presente en la cera de oídos humana. Sin embargo, otros mecanismos de lectura óptica también podrían ser utilizados.
El grado de fluorescencia determina una señal eléctrica y de concentración específica del analito a determinar como por ejemplo la glucosa, mediante curvas de calibración específicas almacenadas en la memoria del dispositivo. Otros conjugados como nanopartículas de oro o plata que emiten distintas longitudes de onda que también se pueden traducir en distintas concentraciones y podrán también ser utilizados.
En otras modalidades, el dispositivo para la medición de biomarcadores de la presente invención puede utilizar otro tipo de biosensores, como por ejemplo, pero sin limitarse a: biosensores amperométricos, potenciométhcos, impedimétricos, voltaméthcos, piezoeléctricos, termométricos, ópticos, etc.
Algunos de dichos biosensores no requieren el uso de cámaras, ya que los resultados de la medición se pueden proporcionar mediante señales enviadas a los medios de procesamiento de información ya sea mediante una conexión directa o de manera inalámbrica, por lo que en dichas modalidades, no sería necesario el uso del pedestal con las cámaras, ni los medios de iluminación ni enfoque. De la misma manera, es posible que los biosensores utilizados no requieran una preparación previa por parte del usuario (aplicar los conjugados a utilizar, aplicar los reactivos de captura correspondientes).
Así mismo, en otras modalidades, tanto la esponja (8) del dispositivo para la extracción de muestras como la apertura central (16) del dispositivo para la medición de biomarcadores y la sección transversal del porta-biosensor (17) y de la unidad de biosensores (27) pueden tener cualquier forma de sección transversal, siempre y cuando permita que la esponja (8) pueda depositar la cantidad adecuado de cera de oídos en el biosensor. Incluso, el porta-biosensor puede comprender únicamente una estructura y medios para sujetar el uno o más sensores.
De la misma manera, la carcasa (10) del dispositivo para la medición de biomarcadores, puede tener cualquier forma de sección trasversal, como por ejemplo circular, o incluso únicamente comprender una estructura con medios para sujetar el porta-biosensor (17). Finalmente, en otras modalidades, es posible que no se utilice el porta- biosensor (17) y se inserte en el aparato para la medición de biomarcadores, únicamente la unidad de biosensores (27), que debe tener una cavidad para que se pueda introducir la esponja del dispositivo para la extracción de muestras con el fin de impregnar los sensores de la muestra de cera para oídos.
Deberá finalmente entenderse que el kit y método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos de la presente invención no se limita a la modalidad descrita anteriormente y que los expertos en el ramo quedarán capacitados, por las enseñanzas que aquí se establecen, para efectuar cambios en el kit y método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos de la presente invención, cuyo alcance quedará establecido exclusivamente por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un dispositivo para la medición de biomarcadores a partir de una muestra de cera de oídos obtenida mediante un dispositivo para la extracción de muestras, que comprende un mango, una cabeza unida al mango, dicha cabeza teniendo un soporte para esponja y una esponja unida al soporte para esponja para la toma de muestra de cera de oídos mediante su inserción en el canal auditivo, en donde dicho dispositivo para la medición de biomarcadores comprendiendo: una carcasa, teniendo: por lo menos una pared superior en donde la pared superior cuenta con una apertura central; medios de procesamiento de información montados en una porción interna de la carcasa; al menos una pantalla para la presentación de información, cada una conectada a los medios de procesamiento de información para presentar resultados de mediciones de biomarcadores; uno o más biosensores, cada uno colocado dentro de la carcasa y capaz de y cada uno pudiendo ser contactado por la esponja del dispositivo para la extracción de muestras con el fin de que dicha esponja pueda depositar una muestra de cera de oídos en cada biosensor.
2. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 1 , teniendo adicionalmente: una pared inferior: un pedestal porta-cámaras anclado a una porción media de la superficie de la pared inferior de la carcasa; al menos una cámara montada en una porción superior del pedestal, cada cámara estando posicionada de tal manera que queda dirigida a un biosensor respectivo y cada cámara estando conectada a los medios de procesamiento de información; medios de enfoque que rodean el pedestal y las una o más cámaras para permitir una mejor resolución de la imagen obtenida por las cámaras; una fuente de luz ubicada dentro de la carcasa.
3. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 2 en donde los medios de enfoque comprendiendo una lente de forma circular rodeando el pedestal que tiene las cámaras y el biosensor cilindrico y sujetado mediante medios de soporte anclados a la pared inferior; y en donde dicha fuente de luz produce una iluminación luz con características espectrales monocromáticas en un rango de onda entre 600nm -1400nm. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 1 en donde el uno o más biosensores se encuentran unidos a una unidad de biosensores retirable, que comprende: una placa de respaldo flexible de forma cilindrica hueca con los extremos abiertos hecha de un materia plástico que presente una fuerte unión a proteínas, incluidos anticuerpos o enzimas y propiedades de absorción variables (diferentes tiempos de flujo capilar), como por ejemplo la nitrocelulosa, dicha placa de respaldo de forma cilindrica teniendo una superficie externa y una superficie interna, en donde cada biosensor se encuentra unido a la superficie interna de la placa de respaldo de manera; en donde la unidad de biosensores se inserta dentro del dispositivo para la medición de biomarcadores a través de la apertura central. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la apertura central de la carcasa tiene forma cilindrica y en donde el dispositivo para la medición de biomarcadores comprendiendo adicionalmente: un porta-biosensor comprendiendo un elemento de forma cilindrica hueca que tiene una pared cilindrica con una superficie externa y una superficie interna, un extremo superior y un extremo inferior, una pared de extremo superior que tiene mayor diámetro que el elemento de forma cilindrica, quedando el extremo inferior abierto, en donde el elemento de forma cilindrica tiene un diámetro tal que le permite pasar de manera ajustada por la apertura central que tiene forma circular del dispositivo para la medición de biomarcadores; el uno o más biosensores se encuentran unidos a una unidad de biosensores, que comprende una placa de respaldo flexible de forma cilindrica hueca con los extremos abiertos hecha de un materia plástico que presente una fuerte unión a proteínas, incluidos anticuerpos o enzimas, como por ejemplo la nitrocelulosa, dicha placa de respaldo de forma cilindrica teniendo una superficie externa y una superficie interna y un diámetro y una altura tales que puede insertarse de manera ajustada dentro del porta-biosensor, en donde cada biosensor se encuentra unido a la superficie interna de la placa de respaldo de manera y en donde la unidad de biosensores se inserta dentro del porta-biosensor y el porta-biosensor se inserta dentro de la apertura central de la carcasa que tiene forma cilindrica. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la apertura central de la carcasa tiene forma cilindrica y en donde el dispositivo para la medición de biomarcadores comprendiendo adicionalmente: una pared inferior: un pedestal porta-cámaras anclado a una porción media de la superficie de la pared inferior de la carcasa; al menos una cámara montada en una porción superior del pedestal, cada cámara estando posicionada de tal manera que queda dirigida a un biosensor respectivo y cada cámara estando conectada a los medios de procesamiento de información; medios de enfoque que rodean el pedestal y las una o más cámaras para permitir una mejor resolución de la imagen obtenida por las cámaras; una fuente de luz ubicada dentro de la carcasa. un porta-biosensor comprendiendo un elemento de forma cilindrica hueca que tiene una pared cilindrica con una superficie externa y una superficie interna, un extremo superior y un extremo inferior, una pared de extremo superior que tiene mayor diámetro que el elemento de forma cilindrica, quedando el extremo inferior abierto, en donde el elemento de forma cilindrica tiene un diámetro tal que le permite pasar de manera ajustada por la apertura central que tiene forma circular del dispositivo para la medición de biomarcadores; el uno o más biosensores se encuentran unidos a una unidad de biosensores, que comprende una placa de respaldo flexible de forma cilindrica hueca con los extremos abiertos hecha de un materia plástico que presente una fuerte unión a proteínas, incluidos anticuerpos o enzimas, como por ejemplo la nitrocelulosa, dicha placa de respaldo de forma cilindrica teniendo una superficie externa y una superficie interna y un diámetro y una altura tales que puede insertarse de manera ajustada dentro del porta-biosensor, en donde cada biosensor se encuentra unido a la superficie interna de la placa de respaldo de manera y en donde la unidad de biosensores se inserta dentro del porta-biosensor y el porta-biosensor se inserta dentro de la apertura central de la carcasa que tiene forma cilindrica; y en donde: cada biosensor cuenta con una tira reactiva (zona de tinción); la pared de extremo superior del porta-biosensor sirve de tope con la pared superior del dispositivo para la medición de biomarcadores; cuando el portabiosensor se encuentra insertado en el dispositivo para la medición de biomarcadores, la superficie interna de la placa de respaldo de la unidad de biosensores, rodea al pedestal con las cámaras, de tal forma que cada cámara queda apuntando a una tira reactiva (zona de tinción) de un biosensor de flujo lateral multiplexado; las imágenes obtenidas por cada cámara son procesadas en medios de procesamiento de información por medio de un software de Inmunocromatografía, el cual prueba cuatro lecturas, que corresponderán al nivel crónico de las sustancias medidas en el cerumen. Los resultados se muestran en las pantallas, en donde cada una corresponde a una cámara y su correspondiente biosensor.
7. Un dispositivo para la medición de biomarcadores de conformidad con la reivindicación 6, en donde cada sensor es un biosensor de flujo lateral multiplexado comprendiendo: una membrana base, de forma alargada, hecha de un material flexible seleccionado del conjunto que comprende pero sin limitarse a: vinilo o nitrocelulosa, dicha membrana base siendo sensible a la presión mediante el uso de un adhesivo hecho de acrílico pero, no reactivo y estable. Dicha membrana base teniendo un primer extremo, un segundo extremo, una superficie interna y una superficie externa, en donde la superficie interna puede tener características hidrofílicas, para enlentecer la difusión de la muestra de cera (hidrofóbica), garantizando así el tiempo necesario para que la reacción inmunohistoquímica se lleve a cabo; una membrana de nitrocelulosa, de forma alargada, teniendo un primer extremo y un segundo extremo y contando con una porción de línea de prueba y una porción de línea de control, dicha membrana de nitrocelulosa ubicada verticalmente sobre la membrana base a todo lo largo de la misma en donde su primer y segundo extremo coincide con el primer y segundo extremo de la membrana base; una almohadilla conjugada ubicada verticalmente sobre la membrana de nitrocelulosa en un primer extremo horizontal de la misma, para contener anticuerpos trazadores conjugados; una almohadilla de muestra de cera de oídos ubicada verticalmente sobre la almohadilla conjugada. La almohadilla de muestra está hecha de un material de alta propiedad de absorción de aceite, como las sustancias inorgánicas naturales, por ejemplo, arena, arcilla o ceniza volcánica. También puede estar hecha de otros materiales naturales orgánicos y sintéticos y deberá ser pre tratada con una solución tampón; y una almohadilla absorbente ubicada verticalmente sobre la membrana de nitrocelulosa en un segundo extremo horizontal de la misma; en donde: la cera de oído se difunde en la almohadilla de muestra, que actúa también como filtro; los conjugados a utilizar (enzimas o anticuerpos) se dispensan sobre la almohadilla conjugada; los reactivos de captura correspondientes se dispensan sobre la membrana de nitrocelulosa donde se ubican las líneas de prueba y control respectivamente; se incluyen etiquetas (trazadores) ubicadas sobre las almohadillas y la membrana de nitocelulosa y están hechas de material seleccionado pero sin limitarse a: oro coloidal, carbono o látex; los complejos resultantes durante el ensayo se mueven a través del principio de capilaridad hasta que se detectan en la línea de prueba a través de un anticuerpo de detección depositado previamente.
8. Un kit para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos comprendiendo: un dispositivo para la extracción de muestras, que comprende un mango, una cabeza unida al mango, dicha cabeza teniendo un soporte para esponja y una esponja unida al soporte para esponja para la toma de muestra de cera de oídos mediante su inserción en el canal auditivo; el dispositivo para la medición de biomarcadores a partir de una muestra de cera de oídos obtenida mediante un dispositivo para la extracción de muestras de las reivindicaciones 1 a 7. Un método para el auto muestreo de cera de los oídos y para la medición de biomarcadores in situ a partir de dicha cera de oídos comprendiendo: a. extraer una muestra de cera de oídos mediante un dispositivo para la extracción de cera de oídos que comprende: un mango, una cabeza unida al mango, dicha cabeza teniendo un soporte para esponja y una esponja unida al soporte para esponja para la toma de muestra de cera de oídos mediante su inserción en el canal auditivo; b. depositar cera de oídos mediante la esponja del dispositivo para la extracción de cera de oídos en el uno o más biosensores del dispositivo para la medición de biomarcadores de las reivindicaciones 1 a 7. Un biosensor de flujo lateral multiplexado comprendiendo: una membrana base, de forma alargada, hecha de un material flexible seleccionado del conjunto que comprende pero sin limitarse a: vinilo o nitrocelulosa, dicha membrana base siendo sensible a la presión mediante el uso de un adhesivo hecho de acrílico pero, no reactivo y estable. Dicha membrana base teniendo un primer extremo, un segundo extremo, una superficie interna y una superficie externa, en donde la superficie interna puede tener características hidrofílicas, para enlentecer la difusión de la muestra de cera (hidrofóbica), garantizando así el tiempo necesario para que la reacción inmunohistoquímica se lleve a cabo; una membrana de nitrocelulosa, de forma alargada, teniendo un primer extremo y un segundo extremo y contando con una porción de línea de prueba y una porción de línea de control, dicha membrana de nitrocelulosa ubicada verticalmente sobre la membrana base a todo lo largo de la misma en donde su primer y segundo extremo coincide con el primer y segundo extremo de la membrana base; una almohadilla conjugada ubicada verticalmente sobre la membrana de nitrocelulosa en un primer extremo horizontal de la misma, para contener anticuerpos trazadores conjugados; una almohadilla de muestra de cera de oídos ubicada verticalmente sobre la almohadilla conjugada. La almohadilla de muestra está hecha de un material de alta propiedad de absorción de aceite, como las sustancias inorgánicas naturales, por ejemplo, arena, arcilla o ceniza volcánica. También puede estar hecha de otros materiales naturales orgánicos y sintéticos y deberá ser pre tratada con una solución tampón; y una almohadilla absorbente ubicada verticalmente sobre la membrana de nitrocelulosa en un segundo extremo horizontal de la misma; en donde: la cera de oído se difunde en la almohadilla de muestra, que actúa también como filtro; los conjugados a utilizar (enzimas o anticuerpos) se dispensan sobre la almohadilla conjugada; los reactivos de captura correspondientes se dispensan sobre la membrana de nitrocelulosa donde se ubican las líneas de prueba y control respectivamente; se incluyen etiquetas (trazadores) ubicadas sobre las almohadillas y la membrana de nitocelulosa y están hechas de material seleccionado pero sin limitarse a: oro coloidal, carbono o látex; y los complejos resultantes durante el ensayo se mueven a través del principio de capilaridad hasta que se detectan en la línea de prueba a través de un anticuerpo de detección depositado previamente.
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