ES2284210T3 - Un dispositivo de ensayo y un metodo para detectar la presencia de un analito residual en una muestra. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de ensayo (50, 101) para detectar la presencia de un analito residual en una muestra, que comprende: a) una composición (34, 110) de fase móvil que tiene un receptor para unirse con el analito, en el que dicha composición de fase móvil se puede portar en la muestra; b) una membrana (36, 107) de fase estacionaria que tiene un primer extremo de membrana, en contacto con la composición de fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el que dicha membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra desde el primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de membrana; c) una zona de ensayo (38) sobre la membrana (36, 107) de fase estacionaria entre el primer extremo de membrana y el segundo extremo de membrana, y con un primer aglutinante para unirse con un receptor desunido; d) una zona de control (40) sobre la membrana de fase estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor de unión a analitos, caracterizado porque la composición de fase móvil incluye además un anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un analito seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por ello la sensibilidad al analito seleccionado.

Description

Un dispositivo de ensayo y un método para detectar la presencia de un analito residual en una muestra.

Se han desarrollado kits y métodos de ensayo inmunocromatográfico o de flujo lateral para detectar la presencia o concentración de residuos químicos o analitos, o clases de los mismos, a partir de muestras líquidas. Un ejemplo de uno de tales kits de ensayo incluye un kit de prueba de embarazo. Se describen ejemplos adicionales en los documentos US 5.451.504, EP 0 279 573 y WO 96/38720.

Particularmente, hace mucho que se ha reconocido en el área de salubridad de los alimentos que se debería efectuar de modo preciso, económico y sencillo la detección de residuos. Los consumidores y los gobiernos son cada vez más conscientes de la necesidad de hacer ensayos con los alimentos para detectar la presencia de residuos no deseables que se presentan naturalmente, o de otro modo.

Ya que una gran parte de los consumidores son niños, la salubridad de los alimentos hace mucho que es crítica en la industria láctea. Los residuos antibióticos usados en una granja láctea aparecen ocasionalmente en el suministro de leche. Los peligros asociados con estos residuos no deseables incluyen las reacciones alérgicas, la ayuda a la propagación de nuevos microbios, y a veces resistentes a los medicamentos, y otros riesgos sanitarios a largo plazo.

Los organismos públicos han establecido, en algunos casos, límites legales para ciertos residuos en los alimentos, por ejemplo, residuos antibióticos en la leche. Los residuos por encima del límite legal se consideran inseguros para el consumo humano. Los niveles de residuos por debajo del límite legal se consideran "seguros". Es importante, por lo tanto, que los métodos de detección, además de ser efectuados de modo económico y sencillo, no proporcionen resultados positivos cuando los residuos están por debajo de los límites legales, de manera que la leche u otros alimentos, por otra parte aceptables, no se descarten o se traten de otro modo como que contienen residuos por encima de los límites legales.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se ha previsto un dispositivo de ensayo para detectar la presencia de un analito residual en una muestra, que comprende:

a) una composición de fase móvil que tiene un receptor para unirse con el analito, en el que dicha composición de fase móvil se puede portar en la muestra;

b) una membrana de fase estacionaria que tiene un primer extremo de membrana, en contacto con la composición de fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el que dicha membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra desde el primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de membrana;

c) una zona de ensayo sobre la membrana de fase estacionaria entre el primer extremo de membrana y el segundo extremo de membrana, y con un primer aglutinante para unirse con un receptor desunido;

d) una zona de control sobre la membrana de fase estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor de unión a analitos, en el que la composición de fase móvil incluye además un anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un analito seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por ello la sensibilidad al analito seleccionado.

Habitualmente, un líquido, tal como leche, tiene una o más impurezas o analitos que están en cantidades mínimas que se tienen que analizar. A fin de detectar el analito, una realización de la presente invención emplea un receptor marcado que reacciona con el analito para formar un complejo analito-receptor. El receptor marcado está situado dentro de o próximo a una membrana y, cuando se expone al líquido, se presenta flujo capilar lateral sobre el mismo. En el flujo, el líquido porta con él el complejo analito-receptor y cualquier receptor marcado desunido. Una zona de ensayo está situada sobre la membrana en la trayectoria de flujo. La zona de ensayo tiene un analito conjugado representativo fijado a la membrana, para unir un receptor desunido a fin de formar un primer complejo analito-conjugado-receptor que, como consecuencia del marcador, tiene una señal que se puede ver a simple vista o leer con un instrumento.

El flujo capilar del líquido sigue sobre la membrana hasta una zona de control. La zona de control incluye un aglutinante fijado a la membrana, que se une con el receptor marcado. Una vez unido, la zona de control cambia a una señal que se puede ver a simple vista, leer con un instrumento o ver bajo condiciones especiales de luz, tal como con luz ultravioleta. Si la señal en la zona de ensayo es más intensa que la señal en la zona de control, el ensayo indica que el analito no está presente en una cantidad suficiente (un ensayo negativo). Si la señal en la zona de ensayo es menos intensa que la señal en la zona de control, el ensayo indica que el analito está presente en una cantidad en exceso de los niveles permisibles (un ensayo positivo).

El receptor puede unir una familia de analitos (uno o una pluralidad de analitos) que tengan puntos de unión estructural similares. Los miembros de una familia de analitos pueden tener diferentes requisitos de niveles de detección y, por lo tanto, se pueden emplear aglutinantes adicionales de analitos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales, que unen una porción del analito en competencia con el receptor, en la muestra, disminuyendo por ello la sensibilidad del ensayo. Los anticuerpos se mezclan con el receptor marcado en una cantidad a fin de ajustar la sensibilidad frente a un analito específico o un grupo de analitos. La sensibilidad del ensayo se ajusta de manera que no se obtenga un resultado positivo en las pruebas a menos que un cierto umbral de analito esté presente en la muestra.

La presente invención incluye muchas ventajas, tales como la combinación de receptores o anticuerpos de amplio espectro y alta pureza con alta actividad específica por área superficial, combinados con anticuerpos específicos frente a residuos contrarrestantes (por ejemplo, monoclonales) para conseguir la detección de residuos del orden de niveles de partes por mil millones (ppb) (10^{-9}) o partes por billón (ppt) (10^{-12}) en o próximos a las disposiciones reglamentarias. Al seleccionar como objetivo el resto activo del residuo químico se permite la detección de un amplio espectro de fármacos activos (por ejemplo, medicamentos veterinarios, productos químicos agrícolas (por ejemplo, plaguicidas) o toxinas microbianas y sus metabolitos activos). Además, se pueden añadir anticuerpos adicionales para ajustar la sensibilidad umbral del ensayo.

La presente invención se refiere a un dispositivo y un método de ensayo para detectar la presencia de un analito residual en una muestra. El ensayo y el dispositivo usan análisis de amplio espectro basado en el reconocimiento por color directo, por fluorescencia o por infrarrojos para detectar rápidamente la baja presencia en partes por mil millones (ppb) de un producto químico o de una familia de residuos químicos que comparten en común puntos de reconocimiento. Los kits están diseñados para ensayar con antibióticos, toxinas y plaguicidas en muestras alimenticias o medioambientales en el campo o en el laboratorio. Los análisis son no competitivos, al usar química de saturación.

Los anteriores y otros objetos, propiedades y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente proporcionada sólo a modo de ejemplo, tal como se ilustra en los dibujos que se acompañan, en los que caracteres de referencia semejantes hacen referencia a las mismas partes por todas las vistas diferentes. Los dibujos no están necesariamente a escala, poniéndose énfasis, en cambio, en ilustrar los principios de la invención. Todos los porcentajes y las partes son en peso, a menos que se indique de otro modo.

La figura 1 es una vista en perspectiva y en despiece ordenado de un dispositivo de ensayo de carcasa moldeada.

Las figuras 2, 3 y 4 son vistas esquemáticas, ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la figura 1.

La figura 5 es una vista en perspectiva de una estufa de incubación y del dispositivo de ensayo con una muestra líquida.

La figura 6 es una vista en planta frontal a escala ampliada de la tira de ensayo de las figuras 1-5, con vistas frontales en sección a escala ampliada de resultados positivos y negativos en las pruebas.

La figura 7 es una vista en perspectiva y en despiece ordenado de un dispositivo de ensayo tipo blíster.

Las figuras 8, 9 y 10 son vistas laterales esquemáticas, ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la figura 7.

Las figuras 11 y 12 son vistas en perspectiva de una estufa de incubación y del dispositivo de ensayo con una muestra líquida.

La figura 13 es una vista en planta frontal a escala ampliada de la tira reactiva de las figuras 7-12, con vistas en sección frontales a escala ampliada de resultados positivos y negativos en las pruebas.

La figura 14 es una vista en perspectiva y en despiece ordenado de un dispositivo de ensayo tipo blíster con refuerzo y estrechamiento sobresalientes de blíster para producir lugares de apriete.

Las figuras 15, 16 y 17 son vistas laterales, esquemáticas e ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la figura 14.

La figura 18 es una vista a escala ampliada de la zona de restricción de movimiento de la tira de la figura 14.

En los dibujos, las figuras 1-6 muestran un dispositivo de ensayo 10 de analitos que incluye una carcasa 12 alargada moldeada. La carcasa 12 puede estar formada por un polímero de estireno transparente en una pieza, moldeado por inyección. La carcasa 12 define una cavidad 14 alargada de carcasa con un extremo abierto 16, y con una cavidad de expansión 18 de aplicación agrandada y rectangular en el extremo abierto 16 de la carcasa 12. La carcasa 12 incluye una cavidad inferior alargada formada durante el procedimiento de moldeo por inyección. La carcasa incluye una tapa protectora 22 opcional amovible ajustada por rozamiento o con salto elástico, adaptada para ajustar sobre el extremo abierto 16 de la carcasa 12, y unas aberturas 19 de expansión de líquido en la cubierta superior de la cavidad de aplicación de carcasa para aumentar el rendimiento de la expansión de una matriz de absorción de muestras, tal como una esponja 32, en el tiempo de ensayo.

La cavidad 14 de carcasa incluye en su interior, sobre la superficie inferior, una tira reactiva 28 de flujo lateral adaptada para detectar la presencia de un analito en una muestra líquida, tal como leche. La tira reactiva 28 incluye una tira de soporte 30, con la esponja 32 fijada en un extremo. La esponja 32 puede incluir una pluralidad de capas secuenciales, que comprenden una almohadilla rectangular de material celulósico seco y comprimido, como un absorbente de líquidos-muestras asegurado a la superficie frontal de la tira de soporte 30. La esponja 32 se selecciona para que al expandirse en contacto con el líquido, tal como leche, llene la cavidad de expansión 18, esponja 32 que se representa en dos dimensiones. Por ejemplo, con la leche, la esponja 32 tiene unas medidas aproximadamente de 3-4 mm por 12-14 mm, mientras que la cavidad 18 tiene aproximadamente de 5-6 mm por 15-16 mm, y por 4-6 mm de altura. La cavidad de expansión 18 puede estar dimensionada aproximadamente del 60% al 30% menor que la expansión completa del material de esponja.

La tira de soporte 30 incluye un soporte 33 tratado de fase móvil con una composición 34 de fase móvil, una membrana 36 de fase estacionaria, que incluye una zona de ensayo 38 y una zona de control 40 para el analito a detectar, y una zona de eliminación 43 en el segundo extremo de la tira de soporte 30 para capturar la muestra líquida en exceso. La carcasa 12 incluye una cubierta superior 42 transparente para la observación visual de la zona de ensayo (zona de referencia) 38 y la zona de control 40. La tira reactiva 28 está colocada y situada de modo flojo en la cavidad 14 alargada, con la esponja 32 situada debajo de la cavidad de expansión 18, extendiéndose la esponja 32, de modo general, hasta aproximada o ligeramente más allá del plano del extremo de aplicación abierto, estando cubierto el extremo antes del uso por la tapa protectora 22.

En funcionamiento, la tapa protectora 22 se retira antes del uso y el extremo de aplicación abierto de la carcasa 12 se inserta brevemente (aproximadamente de uno a diez segundos) en el líquido a ensayar, tal como leche, empleando la carcasa 12 alargada como mango. Véase la figura 2. Se retira el dispositivo de ensayo 10 y se permite que la esponja 32 se expanda para llenar la cavidad de expansión 18 y para comenzar el flujo lateral de la muestra de leche a través de la tira reactiva 28 (de 2 a 6 minutos). Véanse las figuras 3 y 4. Preferiblemente, se inserta la tapa protectora 22 para proteger contra contaminación cruzada, y se coloca entonces el dispositivo de ensayo 10 en una posición horizontal, extendiéndose hacia abajo la cavidad de aplicación 18 en una estufa de incubación 46 calentada eléctricamente, estando conformada una cavidad 47 de estufa de incubación para recibir el dispositivo de ensayo, y llevándose a cabo la incubación, por ejemplo, por un tiempo de tres a diez minutos. La temperatura de incubación se observa a través de una escala 48 indicadora de temperaturas. Véase la figura 5. Se retira e invierte entonces el dispositivo de ensayo 10 incubado, y se observa la vista frontal del dispositivo de ensayo, con la zona de ensayo 38 y la zona de control 40. Véase la figura 6. Las lecturas de las líneas para los controles positivos y negativos se ilustran en la figura 6, adyacentes a la vista frontal del dispositivo de ensayo 10. En la esponja 32, la expansión está controlada por el volumen y tamaño de la cavidad de expansión 18, dando como resultado que la esponja 32 llena completamente la cavidad de expansión 18 con un volumen preseleccionado de líquido, por ejemplo de 0,1 a 1,0 ml, de manera que la cantidad de muestra líquida tomada para el ensayo se controla hasta la cantidad correcta. Las dimensiones de la cavidad de expansión 18 impiden que la almohadilla 32 de esponja se expanda completamente, de manera que se mantiene la presión en la esponja expandida, tal como se muestra en la figura 4, para ayudar a forzar el flujo capilar lateral de la muestra líquida a través de la tira reactiva 28 en la carcasa 12.

Los dibujos de las figuras 7-13 ilustran otro dispositivo de ensayo 50 en un blíster transparente, que incluye una tira de sellado 52 de plástico de cinta transparente, con una etiqueta de desprendimiento 54 en un extremo, y un blíster 56 transparente asegurado de manera adhesiva a la tira 52, para encerrar en su interior la tira reactiva 28. El blíster 56 incluye una cavidad alargada para contener la tira 28 y una cavidad de expansión 58 de carcasa en un primer extremo para constituir una cavidad, generalmente en forma de cepillo de dientes, dentro del blíster 56 de plástico y la tira 52. La tira reactiva 28 seleccionada está sellada y encerrada dentro del blíster 56.

La figura 8 muestra una vista en sección lateral del dispositivo 50 de ensayo tipo blíster antes del uso. La figura 9 muestra el dispositivo 50 de ensayo tipo blíster con un extremo desprendido hacia atrás por la patilla de desprendimiento 54, para exponer la cavidad de expansión 58 de carcasa y la esponja 32 de la tira reactiva 28, de manera que se puede añadir una cantidad definida de una muestra líquida, por ejemplo, con una pipeta, tal como se muestra. En una realización preferida, la cavidad 18 tiene forma triangular similar a la esponja 32, tal como se muestra en la figura 9.

La figura 10 ilustra el dispositivo de ensayo 50 después de la adición de la muestra líquida, con la patilla de desprendimiento 54 vuelta a sellar y con la esponja 32 completamente expandida por la muestra líquida dentro de la cavidad 58 de carcasa, y listo para ser incubado.

La figura 11 ilustra el dispositivo de ensayo 50 al revés y colocado en una de las dos cavidades 47 en la estufa de incubación 46. La figura 12 ilustra la técnica de añadir la muestra líquida con una pipeta, mientras se arranca la patilla de desprendimiento 54 lejos del extremo del dispositivo de ensayo 50 en la estufa de incubación 46. Se sella e incuba el dispositivo de ensayo 50. Los resultados en las pruebas del ensayo terminado se pueden leer entonces a través de una cubierta superior transparente del blíster 56, tal como se muestra en la figura 13, para proporcionar resultados positivos o negativos en las pruebas.

La tira reactiva 28 del análisis de inhibición (figura 7) seleccionada para betalactámicos en leche es para un ensayo rápido de betalactámicos en la leche mezclada, cruda y pasteurizada. En funcionamiento, se verifica un calibrador 48 de temperaturas en la estufa de incubación 46 para asegurar una temperatura de la estufa de incubación de aproximadamente 55°C. Por ejemplo, el indicador 48 de temperaturas puede estar coloreado, por ejemplo, en verde, para su uso. El dispositivo de ensayo 50 se coloca en una cavidad 47 de la estufa de incubación 46, con el lado plano mirando hacia arriba y la patilla de desprendimiento 54 suficientemente desprendida hacia atrás para exponer la esponja 32, por ejemplo, un centímetro. La leche se mezcla a fondo antes del ensayo, y se añaden aproximadamente de 0,2-0,7 ml, preferiblemente de 0,3-0,5 ml, con una pipeta a la esponja 32 expuesta. La patilla 54 con cinta adhesiva se vuelve a sellar por presión manual y se cierra la cubierta de la estufa de incubación 46. Se incuba el dispositivo de ensayo 50, por ejemplo, al menos de 6 a 8 minutos y, luego, se retira de la estufa de incubación 46, se mantiene verticalmente y se hace una comparación aproximadamente en una hora entre la zona de ensayo 38 y la zona de control 40. Si no aparece ninguna zona de control 40, el ensayo no es válido. Se presenta un ensayo negativo cuando la zona de referencia 38 es la misma o más oscura que la zona de control 40. Se indica un ensayo positivo cuando la zona de ensayo 38 está ausente o evidentemente más clara que la zona de control 40.

Con más detalle, el dispositivo de ensayo 10, capaz de detectar analitos en fluidos biológicos, incluye los siguientes componentes:

una esponja 32, un material comprimido, tal como celulosa, es capaz de absorber un fluido biológico y actuar como un prefiltro para eliminar impurezas macroscópicas, tales como pelo, suciedad, etc. La esponja 32 está dimensionada para absorber una cantidad fija de muestra requerida a fin de completar el análisis. Este material comprimido, cuando se expande y contacta con la pared interior de la carcasa 12, ocasiona una presión suficiente para activar el flujo capilar a lo largo de la esponja 32 de componentes, el soporte 33 de fase móvil, la membrana 36 de fase estacionaria y la zona de eliminación 43, y en el tiempo requerido (aproximadamente de 3 a 8 minutos) para un ensayo comercialmente vendible. La esponja 32 solapa el soporte de fase móvil (almohadilla de conjugados) 33 de 1 a 10 mm, de manera que, cuando se añade una muestra acuosa, tal como leche, a la esponja 32, la muestra circula sobre el soporte 33 de fase móvil.

El dispositivo de ensayo puede usar un receptor biológico que esté etiquetado con cantidades abundantes de tintes de color, infrarrojos, fluorescentes o luminescentes. La muestra licuada (por ejemplo, leche, maíz, pienso, extracto de cacahuete, extracto de carne, suero, muestra ambiental, etc.) vuelve a poner en suspensión el receptor etiquetado, que se estabiliza previamente con aditivos fácilmente solubles en una composición de fase móvil. El receptor etiquetado liberado de control temporal reacciona con el analito en la muestra, al tiempo que entra en una zona de reacción sobre la membrana 36 de fase estacionaria.

Los anticuerpos monoclonales específicos frente a residuos se incluyen también en la composición de fase móvil para unir específicamente el residuo en exceso con alta sensibilidad, ajustando, así, la sensibilidad para esos residuos específicos hacia abajo (para hacer el ensayo menos sensible). Como la menor parte de estos residuos están disponibles para competir con el receptor de amplio espectro, la sensibilidad se ajusta más próxima a las disposiciones reglamentarias. Por ejemplo, la sensibilidad inicial del receptor de betalactámicos a cefapirina es 3-5 ppb. Incluyendo los anticuerpos específicos frente a cefapirina, la sensibilidad se ajusta a 15-20 ppb. El nivel "seguro" normativo de la Food and Drug Administration en leche cruda y mezclada es 20 ppb.

Se apreciará que un complejo de anticuerpos específicos con antibióticos libres en una muestra, hace que los antibióticos con complejos no estén disponibles para una medición adicional en cualquier análisis de inhibición de receptores o de unión.

La carcasa 12 se debería usar para permitir la adición de muestra biológica, por inmersión, vertido o pipetado. La carcasa 12 puede estar construida de un material flexible o duro, tal como poliestireno, polipropileno o polietileno.

El soporte 33 de fase móvil puede estar hecho de una membrana de vidrio o un polímero, tal como poliéster o polietileno, que actúa como un filtro secundario para la eliminación de materiales más microscópicos (células somáticas). El soporte se pretrata con una disolución química, tal como una de citrato de sodio de 0,01 a 0,2 M, pH 6-8, capaz de neutralizar las interferencias encontradas en las muestras biológicas. El soporte de fase móvil solapa la membrana 36 de fase estacionaria (tira reactiva) aproximadamente de 1 a 4 mm.

Las microesferas de colores o fluorescentes revestidas con receptores/anticuerpos están en suspensión en una disolución que contiene proteínas, por ejemplo, albúmina sérica bovina (BSA), glicerol, azúcar o equivalentes de los mismos, por ejemplo, sacarosa (SUC) o trehalosa (TRE), polietilenglicol 8.000 MW (PEG), mezclas de aminoácidos (AA) o detergentes, como estabilizadores y agentes de humectación, y se absorben o se rocían en la membrana usando un instrumento de rociado, tal como el disponible de la firma Biodot. Además, los anticuerpos específicos frente a residuos se secan o se inmovilizan por rociado en esta matriz. La amortiguación de la muestra se optimiza aquí también usando un tampón con un pH dado, sal o cualquier cofactor requerido necesitado para optimizar la cinética de unión con receptores/anticuerpos.

Una fase móvil incluye proteínas de unión altamente específicas, tales como una enzima o unos anticuerpos monoclonales, capaces de unirse a un analito y tituladas hasta una concentración conocida para hacer que no esté disponible para reacción/detección adicionales de una cantidad conocida de analito. Esta no disponibilidad para reacción/detección adicionales permite el ajuste de un nivel de detección de uno o más analitos hasta un nivel especificado de interés. Por ejemplo, en ceftiofur, a un betalactámico con un nivel de tolerancia de 50 ppb en la leche, se le puede cambiar la sensibilidad desde 5 ppb hasta entre 40-50 ppb, por la adición de un anticuerpo monoclonal específico frente a ceftiofur. El anticuerpo monoclonal específico compite con el receptor marcado para impedir que un analito específico se una a un receptor o anticuerpo, que es capaz de unirse a una familia de compuestos relacionados.

Las proteínas altamente purificadas, tales como receptores de betalactámicos o IgG antitetánicas, preparadas mediante purificación de afinidad y/o una combinación de cromatografía hidrofóbica/de intercambio iónico, están fijadas a una sonda coloreada, fluorescente o infrarroja que se puede observar por medios ópticos/de instrumental, o por ambos. La fijación de proteínas a una sonda se denomina complejo de proteínas de unión/sonda.

La composición 34 de fase móvil, tal como esferillas de oro, se realizan con un tamaño de partícula entre 10 y 60 nm. Las esferillas se pueden rociar sobre un soporte 33 de fase móvil, tal como un polietileno de alta densidad pretratado. La composición de fase móvil se rocía usando una máquina, tal como la de las firmas Ivek, Biodot o Camag, o se absorbe en la esponja 32, en una disolución que contiene del 5 al 20% en azúcar, tal como sacarosa o trehalosa, del 5 al 20% en proteínas, tal como BSA o Primatone, de 5 a 100 mM de una disolución tampón (base de fosfatos o trizma base) con un pH final entre 6-8. La composición de fase móvil se rocía sobre la porción superior del soporte de fase móvil, de manera que la esponja 32 no solape la porción rociada de la composición de fase móvil del soporte de fase móvil, al colocar la porción más alta de la esponja 32 de 1 a 7 mm por delante de la porción rociada de la composición de fase móvil.

Una membrana de fase estacionaria puede consistir en nitrocelulosa o nailon, que tiene múltiples zonas de reacción. La zona de control, que contiene el anticuerpo frente al receptor, se rocía al mismo tiempo y se seca la nitrocelulosa. El grosor de la zona se ajusta por la BSA añadida a la composición de fase móvil. La composición de fase móvil se rocía sobre la porción superior del soporte 33 de fase móvil, de manera que la composición 34 de fase móvil no solape la esponja 32, sino más bien el soporte 33 de fase móvil solape la esponja 32, al colocar la porción más alta de la esponja 32 aproximadamente de 1 a 7 mm por delante de la porción rociada de la fase móvil. El soporte de fase móvil se seca y se ensaya en un sistema de análisis para sensibilidad de todos los medicamentos. Se ajustan entonces, tal como se necesiten, las concentraciones de anticuerpos en la disolución de la composición de fase móvil.

Para que la fase móvil obtenga la mejor respuesta en color o fluorescencia, se pueden preparar proteínas altamente purificadas (por ejemplo, receptores de betalactámicos o IgG antitetánicas) mediante (i) purificación de afinidad y/o (ii) una combinación de cromatografía hidrofóbica/de intercambio iónico.

Para sondas de color, infrarrojas o fluorescentes, el receptor/anticuerpo puede ser un tinte de color, infrarrojo o fluorescente inmovilizado, por ejemplo, en una microesfera de 0,02-10 micrómetros o en oro coloidal. Estos soportes absorben proteínas o presentan grupos funcionales, tales como NH_{2}, COOH o CHO, para unión covalente a proteínas. La microesfera está, de modo general, revestida con una alta concentración de proteínas de unión altamente específicas.

Típicamente, la membrana de fase estacionaria está formada por nitrocelulosa, nailon, polietileno u otro material adecuado. En la fase estacionaria, el medicamento representativo de analitos está fijado con alta relación específica a un portador, por ejemplo, una proteína, tal como BSA, IgG o proteína A. La membrana 36 de fase estacionaria presenta múltiples zonas de reacción e incluye la zona de ensayo 38 rociada en una línea, usando un instrumento adecuado de rociado. El fin de la zona de ensayo es capturar un complejo sin reaccionar de proteínas de unión/sonda para su visión o medición. La zona de ensayo 38 (figura 6) consiste en un analito de detección; es decir, ceforanida o un miembro de la familia de analitos, es decir, betalactámicos, acoplado a una proteína portadora, es decir, BSA, IgG, KLH, en suspensión en una disolución tampón de 5 a 100 mM (tal como una base de fosfatos o tampón) en un intervalo de pH de 3-10, preferiblemente de 6-8. La concentración de proteínas total de la disolución de anticuerpos varía desde 0,2 hasta 100 mg/ml. El analito-portador, disuelto en una disolución tampón, por ejemplo, un tampón de fosfatos 10 mM, pH 6,9, que contiene azúcares, tales como trehalosa u otros aditivos, se rocía como una línea sobre la membrana de fase estacionaria. La inmovilización de tentáculos del analito conjugado a una portadora de múltiples puntos de unión, tales como proteínas A o microesferas de látex, aumenta la estabilidad y la capacidad de unión. Un tratamiento térmico posterior de la membrana estabiliza además la adhesión. Sobre el dispositivo de ensayo, se puede añadir una segunda zona de ensayo a la zona de reacción para ensayar un segundo analito. Por ejemplo, la primera zona de ensayo puede tener un primer aglutinante para amoxicilina, ampicilina, ceftiofur, cefaparina y penicilina G. La segunda zona de ensayo puede tener un segundo aglutinante para cloxacilina. Alternativamente, la primera zona de ensayo puede hacer ensayos con betalactámicos y la segunda zona de ensayo puede hacer ensayos con sulfonamidas. Se pueden añadir zonas de ensayo adicionales para hacer ensayos con analitos adicionales.

La zona de reacción incluye también la zona de control 40, mostrada en la figura 13, rociada en forma de línea, usando un instrumento adecuado de rociado. Un objetivo de la zona de control 40 es capturar un complejo de proteínas de unión/sonda que no se ha unido a la zona de ensayo 38. La zona de control 40 puede consistir en un anticuerpo específico frente a las proteínas de unión/sonda en suspensión en una disolución tampón de 5 a 100 mM (de fosfatos o trizma) en un intervalo de pH de 3 a 10. La concentración de proteínas total de la disolución de anticuerpos varía, de modo general, desde 0,2 hasta 100 mg/ml.

En una realización, el material para ceforanida-SM se añade a la disolución SMCC-BSA-NEM y la reacción sigue con agitación durante la noche a 4°C. La ceforanida-BSA se dializa para eliminar la ceforanida libre. La zona de control incluye un anticuerpo frente al receptor etiquetado o un anticuerpo de amplio espectro, que está inmovilizado como una línea paralela a la zona de ensayo. Así, el receptor/anticuerpo de la composición de fase móvil se captura en esta línea, independientemente de la presencia o ausencia de analitos en la muestra. La zona de control consiste en un an-
ticuerpo realizado frente al receptor de betalactámicos. El receptor es purificado mediante cromatografía de afinidad.

Una comparación de la zona de control con la zona de ensayo produce el resultado en las pruebas. Típicamente, si la zona de control es más oscura que la zona de ensayo, un analito está presente al nivel de detección o a un mayor nivel (véase la figura 6).

La zona de eliminación 43, mostrada en la figura 7, está realizada típicamente de celulosa prensada u otro material absorbente para mantener consistente el flujo de muestra y para retener la muestra reaccionada. La zona de eliminación solapa, de modo general, la membrana 36 de fase estacionaria aproximadamente de 1 a 5 mm.

La movilidad de la muestra (leche, suero sanguíneo u otros fluidos) se ensaya para optimizar los tiempos y la uniformidad de reacción. Se usan membranas de poros de gran tamaño (15 a 140 \mum) para permitir el flujo de muestras viscosas, como leche o suero.

La zona de eliminación 43 incluye típicamente una almohadilla absorbente que es una membrana de absorción hecha de una esponja sintética de celulosa, o de otro material. Esta almohadilla mantiene la muestra circulando y detiene el flujo en la saturación, proporcionando así al análisis control temporal y reduciendo el ruido de fondo.

Se añade una muestra biológica acuosa a la esponja 32 del dispositivo de ensayo. La esponja 32 sirve como una almohadilla para muestras que se expande a medida que absorbe la muestra. La almohadilla 32 de esponja solapa al soporte 33 de fase móvil, y al flujo de fluido sobre el soporte 33 de fase móvil, en el que los materiales de fase móvil se disuelven en el fluido biológico. Los analitos presentes en la muestra empiezan a unirse con la o las proteínas de unión específicas fijadas a la muestra. Al mismo tiempo, anticuerpos específicos unidos o desunidos o proteínas de unión se unen con analitos específicos para ajustar su sensibilidad al ensayo. El soporte 33 de fase móvil solapa la membrana 36 de fase estacionaria, y el fluido biológico, junto con la composición 34 de fase móvil (esferillas coloreadas), siguen reaccionando, a medida que los materiales fluyen hacia arriba de la membrana 36 de fase estacionaria. Cuando el complejo de proteínas de unión/sonda alcanza la zona de ensayo 38, una porción del complejo de proteínas de unión/sonda se une a la zona de ensayo. En una muestra positiva, el analito en la misma se une al complejo de proteínas de unión/sonda, reduciendo la cantidad de complejo de proteínas de unión/sonda capaz de unirse a la zona de ensayo 38. Cuando el material alcanza la zona de control 40, una porción del complejo de proteínas de unión/sonda se une a la zona de control 40. El reactivo en exceso se absorbe entonces en la almohadilla de elimina-
ción 43.

En una muestra negativa, los reactivos se titulan de manera que la zona de ensayo 38 tenga la misma cantidad o, preferiblemente, una mayor cantidad de la sonda uniéndose a ella que en la zona de control 40. Al contrario a esto, en una muestra positiva, la zona de control 40 tiene una mayor cantidad de la sonda uniéndose a ella que la zona de ensayo 38.

En una realización de la invención, se realiza un ensayo de betalactámicos para analizar los mismos en la leche con un nivel seguro. Se une un receptor de betalactámicos parcialmente purificado a partir del BST (Bacillus stearothermophilus) a una disolución de oro coloidal para conseguir una sonda de proteínas de unión a betalactámicos/esferillas de oro. Ésta es rociada sobre el soporte 33 de fase móvil, junto con anticuerpos monoclonales frente a ceftiofur, cefapirina, ampicilina y amoxicilina, a fin de reducir la sensibilidad de estos cuatro antibióticos, de manera que el ensayo proporcione una respuesta deseada a la dosis. Se rocía sobre la zona de ensayo 38 una ceforanida-BSA conjugada, y se rocía en la zona de control 40 un anticuerpo frente al receptor de betalactámicos BST. Se aplica una muestra de leche cruda, preferiblemente entre 0,1-1,0 ml, a la almohadilla para muestras con una pipeta y se incuba la tira reactiva a 55°C. Después de aproximadamente ocho minutos, se retira la tira reactiva 10 de la estufa de incubación, y se analiza. Si la zona de ensayo 38 es más oscura o del mismo color que la línea de la zona de control 40, la muestra es negativa y, si la zona de ensayo 38 es más clara que la zona de control 40, la muestra es positiva.

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Los resultados en las pruebas se muestran en la siguiente Tabla 1:

TABLA 1 Análisis de betalactámicos en leche usando un dispositivo de ensayo de flujo lateral

100

El ensayo descrito es un análisis de tipo inhibición. El analito en la muestra se une con una sonda de proteínas de unión a betalactámicos/de composición de fase móvil e impide la unión a un betalactámico estacionario unido a la superficie de la membrana. La adición de un anticuerpo monoclonal específico frente a ceftiofur ha alterado su nivel de inhibición desde aproximadamente cinco ppb hasta entre 40 y 50 ppb. La adición de un anticuerpo monoclonal específico frente a cefapirina ha reducido su sensibilidad desde aproximadamente 3-5 ppb hasta entre 15 a 20 ppb.

El dispositivo de ensayo de la invención se puede usar con tiras reactivas para detectar una variedad de analitos, tales como toxinas tipo alfatoxinas, plaguicidas, tales como organofosfatos y carbamatos; así como betalactámicos, tales como penicilina, ampicilina, amoxicilina, cloxacilina, dicloxacilina, oxacilina, ceftiofur y cefapirina; tetraciclinas, tales como clorotetraciclina, oxitetraciclina y tetraciclina; sulfonamidas, tales como sulfametazina, sulfadimetoxina, sulfamerazina, sulfatiazol y sulfadiazina; macrolidas, tales como eritromicina, espiramicina y tilosina; aminoglicosidas, tales como gentamicina, neomicina y DH/estriptomicina; y otros, tales como dapsona, cloramfenicol, novobiocina, espectinomicina y trimetoprima, para detectar los límites de residuo-analito máximos en la muestra. La mayoría de los elementos para cada ensayo son los mismos, excepto las sustancias químicas de la fase móvil, la zona de ensayo y la zona de control, que están adaptados a la detección de analitos específicos.

A medida que la muestra entra desde la membrana 36 de fase estacionaria en la zona de eliminación 43 (hasta que se satura la almohadilla absorbente), el receptor etiquetado sin reaccionar es capturado en la zona de reacción por un analito inmovilizado representativo de grupo. El residuo químico en la muestra reacciona con el receptor etiquetado, haciéndolo que no reaccione a la línea de ensayo. Así, cuantos más residuos hay en la muestra, menos señales se detectan en la zona de ensayo.

La membrana de fase estacionaria está construida a partir de una matriz altamente porosa adecuada para muestras viscosas, tales como leche o extractos de carne. En cada zona, está embebida una combinación de polímeros solubles (por ejemplo, proteínas, polietilenglicol, etc.) para controlar la cinética de movilidad de la muestra desde la composición de fase móvil hasta la zona de reacción, y en la propia zona de reacción.

Se generaron datos con un receptor de betalactámicos microbianos, unos anticuerpos específicos frente a sulfametazina, tretraciclina y aflatoxina (pt CHII AOAC) para detectar la presencia de residuos correspondientes en la leche o en otras matrices, tal como suero. Se detectaron con estos experimentos unos niveles de 3-5 ppb de penicilina G (PEN G), de 5-20 ppb de cefapirina, de 30-100 ppb de oxitetraciclina (OXT), de 10-100 ppb de sulfametazina (SMZ) y de 2-40 ppb de aflatoxina B1.

Se prefiere, de modo general, una estufa de incubación con temperatura ajustable que varíe hasta 70°C. El dispositivo de ensayo puede emplear un colorímetro portátil, un fluorímetro de refracción o un lector de infrarrojos. En una realización preferida, el dispositivo de ensayo incluye un lector que se usa para leer una tira reactiva que contiene dos líneas. La línea de control es una línea de referencia que asegura que el ensayo ha discurrido correctamente. La línea de control se usa también como una referencia cuando el lector determina si la muestra es positiva o negativa. La línea de ensayo indica la concentración de la sustancia que se está ensayando. Cuanto más oscura es la línea de ensayo, mayor es la concentración de la sustancia en la muestra. El lector incluye dos componentes, un controlador y un medidor.

El medidor lee la tira, cuando ésta se inserta en el medidor, al que se da la orden de leer la tira. El medidor selecciona entonces una serie de diodos emisores de luz (LED), preferiblemente, siete. La luz emitida desde los LED rebota en la tira que se está leyendo. La luz se refleja entonces en un optosensor 128 x 1. El sensor envía 128 valores de fecha que representan la intensidad de la luz en cada uno de los 128 píxeles para un microcontrolador a bordo. La fecha del píxel se almacena en la memoria del medidor. Las áreas oscuras de la tira tienen un valor inferior al de las áreas claras. Esta información se usa más tarde para calcular la intensidad de las dos líneas que se están leyendo.

El controlador envía una orden al medidor a fin de pedir la fecha leída por este último. El controlador realiza cálculos con la fecha para determinar la intensidad de las dos líneas. Si la línea de ensayo es más oscura que la línea de control, entonces, se dice que el ensayo tiene un resultado negativo. Si la línea de ensayo es más clara que la línea de control, entonces, se dice que el ensayo tiene un resultado positivo. El controlador presenta al usuario el resultado, así como un valor sin procesar que representa la diferencia en la intensidad de las dos líneas.

La integración de la estufa de incubación con fibra óptica para leer los resultados puede hacer que el ensayo esté completamente automatizado.

La unidad de ensayo, con una forma tal como de blíster, se coloca en una estufa de incubación, que se calienta hasta aproximadamente 56,5°C \pm 1°C. Se desprende hacia atrás la cinta y se añade una muestra líquida, de 0,3 ml, al pocillo para muestras, y se vuelve a sellar la cinta. La unidad de ensayo se incuba al menos durante cinco minutos.

Una vez que la muestra se añade al pocillo para muestras, es absorbida por la esponja para muestras, que se expande en el interior del pocillo. La porción superior del pocillo de plástico impide que la esponja se expanda completamente. La presión de la esponja contra el pocillo, en la parte superior, y contra el soporte de fase móvil, en la parte inferior, proporciona algo de fuerza añadida para propulsar la muestra líquida hacia arriba de la tira de ensayo con un régimen mayor que el que se presentaría de otro modo. La esponja se expande, y la muestra se mueve, a continuación, sobre el soporte de fase móvil e interactúa con la composición de fase móvil. La composición de fase móvil comienza a moverse sobre la nitrocelulosa. Durante este tiempo, los residuos o analitos producidos en la muestra se unen al receptor o anticuerpo fijado al conjugado de fase móvil.

Cuando la composición de fase móvil alcanza la zona de ensayo, el receptor marcado libre se une a la zona de ensayo, dando como resultado una línea inferior oscura. El receptor o anticuerpo con analito unido no se une a la línea de ensayo, dando como resultado una línea de zona de ensayo no coloreada o ligeramente coloreada. Este es un análisis de tipo inhibición secuencial, en el que el compuesto de interés no se une a la zona de ensayo. La composición de fase móvil se mueve hasta más allá de la zona de control y sobre una almohadilla absorbente, que sirve como depósito para recoger la composición desunida de fase móvil.

Las figuras 14-17 ilustran una realización del dispositivo 101 en el blíster 103 transparente, que incluye una tira de sellado 111 de plástico de cinta transparente para encerrar en su interior la tira reactiva 105. El blíster 103 incluye una cavidad alargada para contener la tira 105 y una cavidad-carcasa de expansión 104 para formar una cavidad, generalmente en forma de cepillo de dientes, dentro del blíster 103 de plástico y la tira 105. Tal como se muestra, la cavidad-carcasa de expansión 104 está conformada triangularmente. El blíster 103 incluye una zona 114 de restricción de movimiento que rodea la almohadilla de eliminación 106 y otra zona 115 de restricción de movimiento que rodea el refuerzo adhesivo 113 en el punto en el que éste sobresale por delante de la esponja 109 de absorción de muestras. Las zonas 114, 115 de restricción de movimiento forman lugares de apriete que aseguran la tira 105 dentro del blíster 103. El dispositivo, por lo tanto, está diseñado de manera que una posición en la que se presenta estrechamiento está en la almohadilla de eliminación 106, zona en la que hay situado un material absorbente que actúa como almohadilla absorbente. Preferiblemente, el dispositivo está diseñado, y los componentes están situados, de manera que aproximadamente un cm de refuerzo adhesivo sobresale por delante de la almohadilla de esponja de muestra contenida dentro de la zona de aplicación de muestra. Por lo tanto, la tira está asegurada en su sitio en uno cualquiera o en ambos extremos, permitiendo por ello un flujo libre de muestra.

La figura 15 muestra una vista en sección lateral del dispositivo 101 de ensayo tipo blíster antes del uso. La figura 15 muestra el dispositivo 101 de ensayo tipo blíster, con un extremo desprendido hacia atrás por una patilla de desprendimiento 112, para exponer la cavidad-carcasa de expansión 104 y secar la almohadilla 109 de esponja absorbente de filtro de la tira reactiva 105, de manera que se puede añadir una cantidad definida de una muestra líquida, por ejemplo, con una pipeta, tal como se muestra. La figura 17 ilustra el dispositivo de ensayo 101 después de la adición de la muestra líquida, con la patilla de desprendimiento 112 vuelta a sellar y con la almohadilla 109 de esponja completamente expandida por la muestra líquida dentro de la cavidad-carcasa 104, y listo para ser incubado.

La figura 18 es una vista a escala ampliada de la almohadilla absorbente 109 del dispositivo de ensayo. La figura 18 ilustra el estrechamiento de las paredes interiores de la carcasa en la zona A para formar la zona 114 de restricción de movimiento, asegurando que el refuerzo adhesivo 113, y, por ello, la tira 105 (no mostrada en la figura 18) se mantiene en su sitio dentro del blíster 113 de plástico. La figura 18 ilustra también la zona B de cámara de aire que existe entre la tira 105 y el refuerzo adhesivo 113, lo que permite un flujo consistente de la muestra a lo largo de la tira.

Claims (5)

1. Un dispositivo de ensayo (50, 101) para detectar la presencia de un analito residual en una muestra, que comprende:

a) una composición (34, 110) de fase móvil que tiene un receptor para unirse con el analito, en el que dicha composición de fase móvil se puede portar en la muestra;

b) una membrana (36, 107) de fase estacionaria que tiene un primer extremo de membrana, en contacto con la composición de fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el que dicha membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra desde el primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de membrana;

c) una zona de ensayo (38) sobre la membrana (36, 107) de fase estacionaria entre el primer extremo de membrana y el segundo extremo de membrana, y con un primer aglutinante para unirse con un receptor desunido;

d) una zona de control (40) sobre la membrana de fase estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor de unión a analitos,

caracterizado porque

la composición de fase móvil incluye además un anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un analito seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por ello la sensibilidad al analito seleccionado.

2. Un dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, en el que dicho aglutinante adicional es un anticuerpo seleccionado a partir de los anticuerpos frente a cefapirina, ampicilina, ceftiofur y amoxicilina.

3. Un dispositivo de ensayo según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho receptor es un receptor marcado que se une con una familia de analitos que tienen puntos de unión estructural similares.

4. Un dispositivo de ensayo según la reivindicación 3, en el que los miembros de la familia de analitos tienen diferentes requisitos de niveles de detección y en el que dicho anticuerpo o aglutinante adicional es un anticuerpo y está mezclado con el receptor marcado, en una cantidad que ajuste la sensibilidad para el analito seleccionado, de manera que no se obtenga un resultado positivo a menos que un cierto umbral del analito seleccionado esté presente en la muestra.

5. Un dispositivo de ensayo según cualquier reivindicación precedente, para detectar residuos antibióticos en la leche.