ES2313341T3 - Procedimiento para aumentar el margen dinamico de medicion de elementos de ensayo en particular elementos de ensayom inmunologico basados en reacciones especificas de union. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la ampliación del margen dinámico de medición a altas concentraciones de analito, en las cuales el efecto de saturación limita el margen de medición, en particular el "High-Dose-Hook-Effect" ("efecto gancho de las dosis altas"), sin influir en el límite inferior de detección, basado en reacciones de unión específicas, en particular de un elemento de ensayo inmunológico, el cual tiene tanto una zona de detección del analito como también una zona de control, en donde: a) se pone en contacto una muestra con el elemento de ensayo y con los reactivos específicos para un analito; b) el analito - en tanto está presente en la muestra - conduce a una señal detectable mediante la acción recíproca con reactivos específicos, en la zona de detección del analito, la cual depende de la cantidad de analito en la muestra; c) una parte de los reactivos específicos que no han entrado en acción recíproca con el analito o los reactivos en la zona de detección del analito, conduce a una señal detectable en la zona de control, la cual depende igualmente de la cantidad de analito en la muestra; d) se mide la señal en la zona de detección del analito y en la zona de control; e) se efectúa el cálculo con ambas señales mediante un algoritmo apropiado; f) se compara el resultado obtenido con una curva de calibración; y g) se determina la concentración del analito.
Description
Procedimiento para aumentar el margen dinámico
de medición de elementos de ensayo en particular elementos de ensayo
inmunológico basados en reacciones específicas de unión.
La invención se refiere a un procedimiento para
aumentar el margen dinámico de medición de elementos de ensayo en
particular elementos de ensayo inmunológico basados en reacciones
específicas de unión, en particular, tiras cromatográficas
inmunológicas ópticamente evaluables.
Las tiras de ensayo inmunológicas constituyen un
medio auxiliar ampliamente extendido para la rápida determinación
de drogas, hormonas del embarazo, enfermedades infecciosas, o los
llamadas "marcadores cardíacos", como la troponina T. A este
respecto, han encontrado una amplia aplicación tanto los ensayos
cualitativos, que pueden leerse simplemente visualmente y a menudo
proporcionan solamente una respuesta "SI-NO",
como también ensayos cuantitativos que se evalúan mediante un
aparato de lectura.
Los ensayos rápidos para substancias
inmunológicamente detectables son ya conocidos desde hace tiempo
para un gran número de distintos parámetros, por ejemplo, a partir
de las patentes WO 97/06439, EP 0 291 194, US 5.591.645, US 4.861.
711, US 5.141.850, US 6.506.612, US 5.458.852, US 5.073.484. En
este caso se preparan la mayor parte de los reactivos de detección
inmunológicos (esencialmente anticuerpos o respectivamente
antígenos, marcados y sin marcar), en forma seca, sobre un soporte
el cual permite el transporte de un líquido de muestra (en
particular líquidos corporales como sangre, suero, plasma, orina,
saliva, etc.), sobre o en el soporte. De preferencia, el soporte
para ello es capilarmente activo, por ejemplo una membrana o un
soporte de plástico provisto de canales capilares (como por ejemplo
en la patente US 5.458.852). En el campo de la especialidad se habla
a menudo de tiras de ensayo o dispositivos de ensayo inmunológicos
o inmunocromatográficos. Estos conceptos, así como la expresión
"ensayos inmunológicos unidos a un soporte" o "elementos de
ensayo inmunológicos unidos a un soporte", se emplean a menudo
como sinónimos, y de ahora en adelante pueden intercambiarse.
La evaluación de dichos dispositivos de ensayo
inmunológicos se efectúa mediante sistemas sencillos, y en
particular, en análisis puramente cualitativos (en donde solamente
interesa la declaración de "el analito está presente o
respectivamente no está presente"), y a menudo puramente
visualmente. En particular, en el campo del ensayo rápido del
embarazo, este principio se ha extendido ampliamente en el
mercado.
Los ensayos rápidos inmunológicos
semi-cuantitativos se evalúan en la mayoría de los
casos, con ayuda de un correspondiente aparato de medición
coordinado con la correspondiente tira de ensayo. Según el tipo de
marcado de los reactivos del dispositivo de ensayo empleado para la
detección del analito, se emplean diferentes principios de
medición. Ampliamente extendidos y sencillos de manipular son los
métodos ópticos de detección, en particular, la medición de la
remisión y de la fluorescencia.
Muchos sistemas del estado actual de la técnica,
cuidan de que la zona de detección del analito (de ahora en
adelante abreviadamente "zona de detección") y la zona de
control, estén dispuestas en el dispositivo de ensayo,
espacialmente con estrechos límites, y claramente separadas entre
sí. Ante todo, se ha confirmado como conveniente que los
correspondientes reactivos de unión se coloquen en forma de líneas
o rayas sobre el dispositivo de ensayo. En el aparato de medición
para la evaluación de los dispositivos de ensayo, se encuentran con
el fin de evaluar las zonas de detección del analito y de control,
por esta razón a menudo sistemas ópticos desmontables en el lugar,
como p. ej., chips de cámara, o fotodiodos de 2 ó 3 dimensiones.
Las señales de los sistemas ópticos se transforman entonces,
mediante un correspondiente programa de evaluación, en valores de
la concentración y se
visualizan.
visualizan.
En los dispositivos de ensayos inmunológicos del
estado actual de la técnica no es posible registrar
cuantitativamente cualesquiera concentraciones del analito en la
muestra. Hacia abajo, es decir con respecto al límite inferior de
detección del margen de medición, está limitado por ejemplo por la
afinidad y selectividad de los socios de unión empleados (en su
mayoría anticuerpos) y la sensibilidad de la óptica de detección
con respecto a los marcados empleados (señalizaciones). Hacia
arriba, es decir con respecto al margen dinámico de medición, los
efectos de la saturación limitan el margen de medición. En los
analitos que pueden encontrarse en muy altas concentraciones en la
muestra, no es posible a menudo disponer de una cantidad adecuada
del socio de unión en el dispositivo de ensayo. En particular, en
las zonas de detección del analito y de control, en donde los
socios de unión espacialmente muy limitados, están colocados en el
dispositivo de ensayo, no pueden colocarse a voluntad muchos socios
de unión. Esto puede causar problemas en particular en los casos en
los cuales es necesario tanto un límite de detección pequeño para
los analitos (y por esta razón se procura que el socio de unión en
la zona de detección esté lo más concentrado posible, es decir
aplicar en un espacio estrecho y de esta forma, en base a la
limitada disponibilidad de lugares de unión en el dispositivo de
ensayo, solamente puede prepararse una relativamente pequeña
cantidad del socio de unión), el analito sin embargo puede estar
presente en la muestra en cantidades fuertemente oscilables, es
decir pueden haber tanto muy pequeñas como también muy altas
concentraciones de analito. En el caso de altas concentraciones de
analito se logra una saturación de la zona de detección con los
correspondientes reactivos de detección, de manera que tiene lugar
un comportamiento de saturación de la relación concentración de
analito-señal de detección: por encima de una
determinada concentración de analito no tiene lugar ningún aumento
de la señal de detección; la curva de evaluación se aplana y
lógicamente ya no se puede evaluar.
Para agravar el problema, sucede que
principalmente en los inmunoensayos sandwich, a concentraciones muy
altas de analito no solamente se observa un aplanamiento de la
curva que reproduce la relación entre la concentración de analito y
la señal de detección, sino que incluso se constata una
disminución de la señal con concentraciones crecientes del analito.
Se habla aquí del llamado
"High-Dose-Hook-Effect"
("efecto gancho de las dosis altas"): A concentraciones muy
altas del analito se observa que la intensidad de la señal en los
inmunoensayos sandwich, que al principio aumenta con una
concentración creciente de analito, desciende de nuevo. Esto se
explica porque las cantidades de anticuerpos utilizadas en el
ensayo ya no son suficientes para formar en cualquier caso con las
moléculas del analito (antígenos) un complejo sandwich (es decir,
un complejo con dos anticuerpos por cada antígeno). Se forman
complejos múltiples de analito y un anticuerpo cada vez, los cuales
tomados por sí mismos ya no se detectan. De esta forma, según las
circunstancias, se obtienen demasiados resultados de medición
falsos negativos o bien resultados muy pequeños, lo cual,
naturalmente, hay que evitar.
Especialmente las tiras de ensayo inmunológico
cuantitativo, en las cuales se determina una señal mediante
mediciones de la remisión, muestran todavía frente a los
convencionales sistemas de análisis empleados en la mayoría de
grandes laboratorios, claras deficiencias. Son particularmente
insatisfactorios, la precisión y el margen dinámico de medición en
las tiras de ensayo. Esto limita especialmente el campo de
aplicación de los ensayos sandwich altamente sensibles, por ejemplo
para la monitorización de terapias, en donde se desea un margen de
medición lo más grande posible.
A esto se añade, que en varios parámetros, como
por ejemplo la mioglobina o el dímero D, es necesario por una
parte un pequeño margen de detección, y por otro lado pueden
presentarse muy altas concentraciones de estos analitos en el
material de muestra, en parte muy por encima del límite de decisión
"normal - patológico". En estos casos sería deseable disponer
de dispositivos de ensayo que tengan un margen de medición lo más
grande posible para obtener sin una previa dilución de las
muestras, valores de medición fiables. En particular, esto sería
ventajoso para el empleo de dichos dispositivos de ensayo en el
control del curso de las correspondientes sintomatologías.
En el estado actual de la técnica no faltan
proyectos para solucionar los problemas descritos más arriba. De
todas maneras hasta el momento, ninguna de las propuestas ha sido
convincente en todos los puntos. En particular, la conversión del
proyecto al campo de los dispositivos de ensayo
inmuno-cromatográficos no se ha logrado
satisfactoriamente hasta el momento.
La patente US 6.248.597 describe un inmunoensayo
de aglutinación heterogéneo basado en la dispersión de la luz, en
el cual el margen dinámico de medición es ampliado porque se emplea
una mezcla de partículas con diferentes propiedades de dispersión.
A este respecto, se inmovilizan sobre las partículas que ocasionan
una gran dispersión de la luz, los socios de unión que tienen una
alta afinidad para el analito. Sobre las partículas que ocasionan
poca dispersión de la luz se inmovilizan por el contrario los
socios de unión que tienen una afinidad más pequeña para los
analitos.
Un procedimiento semejante está descrito en la
patente US 5.585.241. En la misma se propone en conexión con un
inmunoensayo de flujocitometría, para el aumento del margen
dinámico de medición, emplear dos partículas de diferente tamaño
con dos diferentes anticuerpos afines contra el mismo antígeno
(partículas pequeñas con anticuerpos de alta afinidad; partículas
grandes con anticuerpos de pequeña afinidad) y para la detección
del antígeno mediante la formación de un complejo sandwich, emplear
otro anticuerpo marcado detectable. El sistema propuesto trabaja
por consiguiente con dos distintas curvas estándar (una para cada
lugar de la partícula) y permite la determinación cuantitativa del
analito mediante un complicado programa informático.
Para evitar el efecto "gancho" en el caso
de altas concentraciones de analito ("high dose hook
effect")("efecto gancho de las dosis altas"), la patente US
4.743.542 da a conocer un procedimiento según el cual junto a un
anticuerpo marcado detectable contra el antígeno diana, se añade
sencillamente a la muestra una determinada cantidad del mismo, pero
de anticuerpo sin marcar. Con ello, entran en competencia ambos
anticuerpos para la molécula del analito y para el efecto gancho
típico aparece la sobresaturación - en general - solamente en el
caso de altas concentraciones de antígeno. En consecuencia, se
amplía el margen dinámico de medición a altas concentraciones,
aunque de todas maneras, a coste de la sensibilidad. Con el mismo
efecto, se propone el empleo de anticuerpos de pequeña
afinidad.
La patente US 4.595.661 describe inmunoensayos
sandwich heterogéneos, en los cuales se evita el efecto gancho de
manera que, junto a un anticuerpo captador inmovilizado, se emplean
dos anticuerpos solubles que tienen diferente afinidad y
especificidad para el antígeno. El anticuerpo con poca afinidad
contribuye marcadamente a este respecto, solamente a altas
concentraciones de antígeno, para la señal de medición, y así evita
que se note el efecto Hook.
A partir de la patente 5.073.484 se describe la
detección cuantitativa con ayuda de varias zonas discretas de
unión, dispuestas una después de otra, en un soporte capaz de ser
atravesado por una corriente, de un analito inmunológicamente
detectable. Cuanto más analito está presente en la muestra, en
tantas más zonas tienen lugar las reacciones específicas de unión y
detección. El número de zonas que después del contacto con la
muestra presentan una coloración, es correlativo con la cantidad de
analito en la muestra. La patente US 5.073.484 propone, para
aumentar la exactitud y para la ampliación del margen de medición,
elevar el número de zonas de unión. Es desventajoso para ello, que
una evaluación automática de las zonas de unión requiera una
óptica relativamente costosa, la cual está en situación en
determinadas condiciones, de incluir y valorar simultáneamente un
gran número de zonas para permitir de esta forma una determinación
cuantitativa del analito. Además los dispositivos de ensayo, en
base al relativamente gran número de zonas de unión discretas,
separadas espacialmente unas de otras, deben ser
correspondientemente largos. Para un recorrido seguro de la muestra
a través del dispositivo de ensayo debe operarse con volúmenes de
muestra relativamente grandes, lo cual en particular para el caso
que deba emplearse sangre entera, es igualmente desventajoso en
particular debido a la obtención de la muestra.
La patente WO 00/31538 describe tiras de ensayo
inmunocromatográficas en las cuales junto a una zona de detección
del analito están dispuestas una o varias zonas de control sobre
una matriz absorbente. Los socios de unión provistos de un marcado
detectable, se unen a la matriz, tanto en la zona de detección del
analito como también en las zonas de control. En las zonas de
control se unen cantidades exactamente definidas de socios de unión
marcados, por lo cual estas cantidades son independientes de la
cantidad de analito en la muestra. De preferencia, en las zonas de
control se unen diferentes cantidades del socio de unión marcado,
de manera que en la tira de ensayo se obtienen casi unas escalas
internas de comparación. En la evaluación de la zona de detección
del analito se consultan las zonas de control para la calibración.
Para aumentar el margen dinámico de medición, en particular para
relaciones concentración-señal de medición, no
lineales, la patente WO 00/31538 propone proveer zonas de control
adicionales sobre la tira de ensayo.
La patente US 2003/0119204 describe tiras de
ensayo inmunocromatográficas, las cuales junto a una zona de
detección del analito contienen dos o más zonas de control sobre
una matriz absorbente. Las dos o más zonas de control sirven para
establecer una calibración interna determinando los valores de la
intensidad sobre la tira de ensayo y poniéndolas en relación con
concentraciones de analito previamente conocidas, de manera que se
construye una curva de calibración o respectivamente una relación
de calibración. Con su ayuda se determina en un siguiente paso a
partir de la intensidad determinada de la zona de detección del
analito, la concentración de analito. Un aumento del margen
dinámico de medición a elevadas concentraciones de analito en las
que el efecto de saturación limita el margen de medición, no es
posible con este procedimiento.
En el trabajo de J. Hampl et al.,
"Upconverting Phosphor Reporters in Immunochromatographic
Assays" ("Informadores de la sobreconversión del fósforo en
ensayos inmunocromato-gráficos"), Analytical
Biochemistry 288, 176 - 187 (2001), se describe el utilizar
en las tiras de ensayo inmuno-cromatograficas, el
marcado fluorescente para la detección del analito, en la propia
zona de detección ("línea diana"), la cual contiene una forma
inmovilizada de anticuerpos específicos para el analito, y también
la zona de control ("línea de control") la cual contiene una
forma inmovilizada de un anticuerpo específico de la especie, para
efectuar la evaluación de la señal de medición. Una aplicación
análoga está descrita por OraSure Technologies, Inc., Bethlehem,
PA, U.S.A. en www.orasure.com. La evaluación tanto de la
"línea diana" como también de la "línea de control" tiene
lugar fundamentalmente para eliminar las variaciones en la señal
de medición que son motivadas en la zona opticamente medida
mediante la cantidad efectiva de líquido. Indirectamente con ello,
aumenta la sensibilidad del procedimiento de detección (ensayos)
(ocurre pues una ampliación del margen dinámico de medición para
concentraciones pequeñas). Por el contrario, no se ha informado
sobre una ampliación del margen dinámico de medición para
concentraciones mayores.
Una ampliación del margen dinámico de medición
de dispositivos de ensayo inmunocromatográficos puede de hecho
también lograrse diluyendo correspondientemente el material de
muestra, antes del análisis. Una ampliación del margen de medición
logrado de esta forma es sin embargo insatisfactorio, puesto que
para ello es necesario un paso manual del análisis potencialmente
creador de errores. Además, particularmente en los casos en los
cuales un analito en muestras semejantes puede encontrarse
posiblemente tanto en concentraciones muy altas como también en
concentraciones muy pequeñas, una dilución controlada de la muestra
únicamente es aconsejable cuando el analito está en altas
concentraciones en la muestra, pero no en el caso contrario, puesto
que en este caso, generalmente en determinadas circunstancias, el
límite inferior de detección disminuye con la dilución y el analito
de la muestra, equivocadamente, no se detecta.
Para los dispositivos de análisis
inmunocromatográficos no existen hasta ahora posibilidades
sencillas y seguras de ampliar el margen dinámico de medición para
altas concentraciones de analito, sin perjudicar el límite inferior
de detección, para la detección del analito.
La presente invención tiene como fundamento la
tarea de solucionar las desventajas del estado actual de la
técnica. En particular, un objetivo de la presente invención es el
de ampliar el margen dinámico de medición basándose en reacciones
específicas de unión, en particular elementos de análisis
inmunológicos para concentraciones altas de analito, y cuando esto
en particular sea posible, que no tenga que tolerarse a cambio,
ningún deterioro con respecto al límite inferior de detección.
Esta tarea se resuelve mediante el objeto de la
invención.
El objeto de la invención es un procedimiento
según la reivindicación 1 y un empleo según la reivindicación 9.
Las formas de ejecución preferidas de la invención son objeto de
las reivindicaciones secundarias.
La invención hace posible desplazar el margen
dinámico de medición de elementos de ensayo basados en reacciones
específicas de unión, en particular inmunológicas, para más altas
concentraciones de analito, sin tener que tolerar a cambio,
deterioros con respecto a los límites de detección. Para ello se
propone preparar, según la invención, por lo menos dos zonas en, o
sobre, el elemento de ensayo, las cuales contienen los reactivos,
los cuales en base a la distinta afinidad para los analitos (por
ejemplo en el caso de diferentes anticuerpos afines contra los
analitos), o en base a diferentes principios de la interacción con
los analitos, o con otros reactivos participantes en la detección
del analito (por ejemplo anticuerpos dirigidos contra los analitos
en una zona y el analito o el análogo al analito en otra zona),
producen unas señales detectables fuertemente diferentes.
"Diferentes principios de la interacción" pueden ser por
ejemplo diferentes principios de ensayo, por ejemplo la formación
de complejos sandwich en una zona y la conducción competitiva del
ensayo en otra zona. Para la evaluación de la relación
concentración de analito - intensidad de la señal, se utilizan las
señales por lo menos de dos zonas y mediante un procedimiento
adecuado (correlación) se utilizan para la determinación del
analito.
Las dos zonas importantes en el procedimiento
según la invención, en o sobre el elemento de ensayo, reciben los
nombres, de aquí en adelante, para una mejor comprensión y
diferenciación, de zona de detección del analito (abreviadamente:
zona de detección), y zona de control. Esta denominación debe
también mantenerse aún cuando, según el uso convencional del
idioma, sea inusual, por ejemplo cuando en las zonas se aplican
distintos socios de unión que son afines, y por esta razón se puede
observar una señal solamente a partir de una concentración umbral
del analito.
La invención comprende también un procedimiento
en el cual se evalúan más de 1 zona de detección y/o más de 1 zona
de control sobre un elemento de ensayo. Por ejemplo el
procedimiento puede emplearse también para la evaluación de
elementos de ensayo, los cuales contienen una franja de detección
con socios de unión altamente afines, una franja de detección con
socios de unión muy poco afines, y una zona de control (que
contiene por ejemplo un análogo del analito inmovilizado).
La solución según la invención se refiere en
particular a la ampliación del margen de medición de dispositivos
de ensayo inmunológico mediante la evaluación cuantitativa
adicional de la región de control en los ensayos sandwich. Este
sirve habitualmente solamente como control funcional para el
usuario y no se utiliza para la cuantificación del analito. Con un
contenido creciente de analito se capturan sin embargo cada vez más
conjugado-anticuerpo-marca en la
franja de señales o se satura con analito, de forma que cada vez se
une menos conjugado-anticuerpo-marca
(por ejemplo conjugado- anticuerpo-oro) en la
franja de control. La franja de control disminuye por ello la
intensidad de la señal con una concentración creciente de analito.
Mediante mediciones simultáneas de la intensidad de la señal (por
ejemplo mediante la medición de la remisión o de la fluorescencia)
en la franja de control y en la franja de la señal, y el cálculo
efectuado con ambas intensidades de la señal, con un algoritmo
apropiado, se puede mejorar claramente el margen dinámico de
medición así como la pendiente de la curva de calibración (y con
ello también la precisión a altas concentraciones).
Análogamente, esto sirve naturalmente también
para elementos de ensayo que se basan en otras reacciones de unión
específicas inmunológicas. En correspondencia, las reacciones de
unión específicas son ya conocidas por el especialista. Como
ejemplo pueden citarse los siguientes pares de unión:
Anticuerpos con haptenos, antígenos u otros
anticuerpos (por ejemplo interacciones
anticuerpo-anticuerpo específicas de especies), en
donde parcialmente son suficientes en cada caso también, fragmentos
de estas especies;
Biotina con avidina o estreptavidina;
Hormona con el receptor de la hormona;
Azúcar con lectina;
Ácido nucleico con ácido nucleico
complementario; y similares.
Con el fin de una mejor comprensión y visión
general, a a partir de ahora se debe acceder principalmente sobre
pares de unión inmunológicos, es decir sobre los pares de unión
anticuerpo con hapteno o respectivamente antígeno o respectivamente
anticuerpo, sin que esto deba ser sin embargo limitante sobre esta
forma de ejecución preferida, pero no única, de la invención.
El procedimiento según la invención sirve en
particular para la ampliación del margen dinámico de medición a
altas concentraciones de analito en las cuales aparece el efecto de
saturación limitando el margen de medición, en particular el
"High-Dose Hook-Effect"
"Efecto gancho de las dosis altas", sin ninguna influencia
sobre el límite inferior de detección, con ayuda de un elemento de
ensayo inmunológico. El elemento de ensayo tiene a este respecto
tanto una zona de detección del analito como también una zona de
control. La muestra es puesta en contacto con el elemento de ensayo
y con los reactivos específicos para el analito, y el analito -
siempre que esté contenido en la muestra - conduce mediante la
acción recíproca con los reactivos específicos a una señal
detectable en la zona de detección del analito. La señal de
medición depende de la cantidad de analito en la muestra. Una parte
de los reactivos específicos que no entran en interacción con el
analito o respectivamente los reactivos que no entran en acción
reciproca en la zona de detección, conduce en la zona de control a
una señal detectable. A este respecto, es importante que esta señal
detectable en la zona de control sea igualmente dependiente de la
cantidad de analito en la muestra. Las señales en la zona de
detección del analito y en la zona de control, se miden y mediante
un algoritmo apropiado, por ejemplo entre sí, se utilizan para
efectuar el cálculo. El resultado del cálculo se compara con una
curva de calibración, y finalmente se determina la concentración
del analito.
Los analitos apropiados según la invención, son
analitos, los cuales se pueden detectar en base a una relación
específica de la pareja de unión. En particular, para el caso
preferido de la detección inmunológica, éstos son anticuerpos,
antígenos, haptenos (inclusive en cada caso, los fragmentos de los
mismos). Son particularmente preferidos los analitos detectables
inmunológicamente hCG, BNP, (NT-) proBNP, troponina I, troponina T,
mioglobina, D-dímero, CRP, HIV, HCV, CD40,
CK-MB, TSH, etc.
Como muestra, a partir de la cual deben ser
determinados los analitos, son adecuados según la invención, todos
los líquidos o aquellos materiales de muestra que pueden ser
transformados en una forma líquida. En particular, los más
adecuados son los líquidos corporales como la sangre y las
fracciones derivadas de la misma (suero, plasma), saliva, orina,
líquido cerebroespinal, esperma, líquido intersticial, sudor, y
similares. Son también adecuados aquellos materiales de muestra que
no son líquidos en sí mismos, pero pueden transformarse en una fase
líquida mediante su disolución o suspensión en disolventes, en
particular en disolventes acuosos.
Los elementos de ensayo que pueden emplearse
inmunológicamente según la invención son ya conocidos por el
experto. La detección del analito con ayuda de dichos elementos de
ensayo se basa en una interacción específica entre el analito y un
socio de unión. Estas interacciones comprenden los pares de unión
antígeno/anticuerpo, anticuerpo/anticuerpo, hapteno/anticuerpo,
fragmento de antígeno/anticuerpo, fragmento de
anticuerpo/anticuerpo, etc. Como ya se citó al principio, los
elementos de ensayo contienen en su mayoría un material capaz de
ser atravesado por una corriente (por ejemplo, papel, napa,
membrana, canal capilar), el cual eventualmente está fijado sobre
un soporte inerte. Típicamente un elemento de ensayo presenta una o
varias zonas de entrega de muestras, zonas de absorción, zonas de
cromatografía, zonas de detección, zonas de reacción, y zonas de
control. Es importante para la invención únicamente, que por lo
menos estén presentes una zona de detección (del analito) y por lo
menos una zona de
control.
control.
Como zona de detección del analito sirve
típicamente un material espacialmente de límites estrechos,
separada del margen de la zona de control, en o sobre el material
capaz de ser atravesado por una corriente, en el cual en el curso
del empleo según la determinación del elemento de ensayo puede
detectarse una especie cuya masa está unida a la del analito de tal
manera que puede ser detectada visualmente, ópticamente, o de otra
forma. Típicamente se une un socio de unión detectable para el
analito, por ejemplo un correspondiente anticuerpo anti analito
marcado, mediante una interacción específica en la zona de
detección del analito. Con esta finalidad, se encuentra en la zona
de detección del analito un socio de unión correspondiente,
inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo contra el analito (de forma
que puede formarse un complejo sandwich detectable, del anticuerpo
inmovilizado, del analito y del anticuerpo marcado detectable) o
una especie de otra pareja de unión, por ejemplo la
(poli-)(estrept-)avidina (de manera que puede formarse un complejo
sandwich formado previamente a partir de un anticuerpo biotinilado,
un analito y un anticuerpo marcado detectable). La construcción,
funcionamiento y otras modificaciones de dichas zonas de detección
son ya conocidas en sí mismas por el experto.
Como zona de control sirve típicamente una zona
de límites estrechos separada de la zona de detección del analito,
y en su mayoría situada aguas abajo de la misma, o en el material
capaz de ser atravesado por una corriente, en el cual en el curso
del empleo según la determinación del elemento de ensayo,
independientemente de la presencia del analito en la muestra está
unido de tal forma a una especie, que puede ser detectado
visualmente, ópticamente o de otra manera. La zona de control sirve
habitualmente para el control del funcionamiento del elemento de
ensayo. Una señal en la zona de control prueba que la muestra
atraviesa debidamente el soporte capaz de ser atravesado por una
corriente e idealmente que los reactivos de unión correspondientes
son capaces de funcionar. Típicamente un socio de unión para el
analito, detectable, por ejemplo un
anticuerpo-anti-analito
correspondientemente marcado, está unido mediante una acción
recíproca específica, en la zona de control. Para esta finalidad se
encuentra en la zona de control un correspondiente socio de unión,
inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo contra el
anticuerpo-anti analito marcado (de manera que se
puede formar un complejo detectable a partir del anticuerpo
inmovilizado y el anticuerpo marcado detectable) o un análogo de
analito inmovilizado (de forma que se puede formar un complejo de
analito y anticuerpo marcado detectable). La construcción,
funcionamiento y otras modificaciones de dichas zonas de control ya
son conocidas por el experto.
Los reactivos específicos contenidos en el
elemento de ensayo, o los reactivos específicos añadidos al
elemento de ensayo, o respectivamente a la muestra (llamados
también como sinónimos "socios específicos de unión"), entran
en una reacción de unión selectiva con el analito o con los socios
de unión inmovilizados sobre el soporte. Ellos permiten directa o
indirectamente formular una conclusión sobre la cantidad de analito
presente en la muestra.
Son socios de unión preferidos los anticuerpos
(en alemán Antikörper ó AK; en inglés antibodies ó AB), en
particular los anticuerpos policlonales (en alemán polyklonale
Antikörper ó PAK; en inglés polyclonal antibodies ó PAB) o
anticuerpos monoclonales (en alemán monoklonale Antikörper ó MAK; en
inglés monoclonal antibodies ó MAB), así como antígenos y haptenos,
así como fragmentos de los mismos, mientras sean activos para la
finalidad de la detección específica de analitos.
De preferencia, una parte del socio de unión se
encuentra disponible sobre el dispositivo de ensayo de manera que
puede ser disuelto por éste mediante el líquido de muestra, por
ejemplo, mediante la impregnación de materiales soporte apropiados
como, la napa, membranas, etc. ó mediante la aplicación y secado en
correspondientes estructuras de canales (capilares).
Sin embargo, es también posible, añadir por lo
menos uno de los socios de unión en forma de reactivo disuelto,
para un ensayo rápido, por ejemplo mezclar la muestra con la
solución de reactivos o aplicar la solución de reactivos
independientemente de la muestra, sobre el dispositivo de ensayo.
Según la invención, es también posible, aunque es menos preferido,
poner todos los socios de unión específicos en una solución o en
varias soluciones. Sobre el dispositivo de ensayo se encuentra
entonces en la zona de detección solamente otro socio de unión el
cual puede captar el correspondiente socio de unión específico
marcado, y así crear una unión indirecta del analito en fase sólida
del ensayo rápido. Análogamente se encuentra en la zona de control
un socio de unión, el cual puede captar el correspondiente socio de
unión específico marcado, sin que sea necesaria una participación
directa del
analito.
analito.
Tanto en la zona de detección como también en la
zona de control, un socio de unión allí inmovilizado conduce a una
señal detectable. A este respecto, es posible, aunque no es lo
preferido, que las señales en ambas zonas estén basadas en
principios distintos. Por el contrario, se prefiere que tanto la
señal en la zona de detección del analito así como también en la
zona de control tenga su fundamento en los mismos principios. Las
señales detectables son por ejemplo, las ópticamente o visualmente
registrables, variaciones de color, señales luminiscentes en
particular de fluorescencia, radiación radiactiva y similares. La
señal detectable se origina a este respecto, a partir de una
especie correspondientemente marcada (socio de unión), la cual -
como se ha expuesto más arriba - está unida en la zona de detección
del analito o en la zona de control. Como marcas del socio de unión
entran, según la invención, entre otras, en cuestión: marcas
particulares por ejemplo el empleo de látex coloreado, marcas de
polímero o nano cristales semiconductores (los llamados "Quantum
Dots") o marcas de un metal(sol) (oro, selenio, etc.),
así como marcas no particulares (marcas de enzimas, radioisótopos,
fluorescentes) y similares.
Según la marca empleada son necesarios y
posibles naturalmente, otros métodos de detección (p.ej. medición
por fluorescencia, medición por radiactividad, determinación de la
actividad enzimática, etc.). Con estos métodos de detección se
pueden medir las señales producidas en la zona de detección del
analito y de la zona de control, en particular, con instrumentos de
medición construidos correspondientemente. Los mismos, son ya
conocidos por el experto en el estado actual de la técnica. Según la
invención es importante sin embargo, que se registre tanto la señal
en la zona de detección del analito como también en la zona de
control del aparato de medición. Aparatos de medición y
procedimientos apropiados para la evaluación de elementos de ensayo
son ya conocidos por el experto en el estado actual de la ciencia.
Como ejemplo típico para un aparato de medición puede citarse el
sistema "Cardiac Reader" ("lector cardíaco") de Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim. En este caso, se ilumina una tira de
ensayo inmunológico mediante una o varias fuentes de luz (por
ejemplo LEDs), y mediante la medición de la remisión local
extinguida, se determinan los valores grises de la zona de
detección (franja de señales) y de la zona de control. Un
correspondiente procedimiento de medición y evaluación está
descrito por ejemplo en la patente US
5.717.778.
5.717.778.
Según la invención, se registran tanto las
señales de la zona de control como también de la zona de detección,
y se efectúa el cálculo entre sí, mediante un procedimiento
matemático adecuado. Esto tiene lugar por ejemplo en la unidad
central de cálculo del aparato de medición. Es importante según la
invención, que ambas señales sean dependientes de la concentración
del analito, por lo menos en determinados márgenes de concentración
del analito. Mediante un procedimiento matemático, explicado como
ejemplo más detalladamente en dependencia con los ejemplos
siguientes, es posible ampliar el margen dinámico de medición de
los elementos de análisis (comparar con la evaluación única de la
señal en la zona de detección).
La determinación de la concentración del analito
a partir de las señales medidas de las zonas de detección y de
control, se efectúa como habitualmente, mediante la comparación de
los valores de medición con las correspondientes curvas de
calibración que fueron obtenidas mediante la medición de soluciones
estándar con cantidades conocidas de analito. De preferencia, para
el establecimiento de la curva de calibración se utilizan tanto las
señales de la franja de detección como también de la franja de
control.
Una posible realización del procedimiento según
la invención prevé que los reactivos que conducen a una señal
detectable en la zona de detección del analito y en la zona de
control, tengan una diferente afinidad, o respectivamente capacidad
de reacción, con el analito. De preferencia participan en la zona
de control, reactivos muy poco afines, o respectivamente pocos
anticuerpos reactivos, contra los analitos en la formación de la
señal, como en la zona de detección del analito.
Una posible realización alternativa del
procedimiento según la invención, prevé que los reactivos que
conducen, en la zona de detección del analito y en la zona de
control, a una señal detectable, en base a diferentes principios de
la acción recíproca con el analito o con otros reactivos que
participan en la detección del analito, originen señales distintas
fuertemente detectables. En particular pueden unirse en la zona de
detección del analito, anticuerpos dirigidos contra los analitos, y
en la zona de control, el analito o un análogo del analito. También
es posible que en la zona de control un socio de unión inmovilizado
se una a otro epitopo del anticuerpo o a un elemento estructural
heterólogo, el cual fue añadido sintéticamente al anticuerpo, o que
un anticuerpo específico de la especie contra el anticuerpo a
inmovilizar sea inmovilizado en la zona de control. Todas estas
variantes son ya conocidas por el experto en el estado actual de la
técnica.
Existe una posibilidad, de extender el margen de
medición hasta muy altas concentraciones, mediante la adición de
un llamado "high dose hook effect" ("efecto gancho de las
dosis altas"). En este caso disminuye de nuevo la intensidad de
la franja de la señal a muy altas concentraciones del analito, dado
que la cantidad de anticuerpo disponible ya no es suficiente en
cualquier caso para formar un complejo sandwich. Se forman
complejos múltiples de analito y un anticuerpo (-conjugado) en cada
caso. En este margen de concentración la intensidad o
respectivamente la dependencia de la concentración de la franja de
control puede ser demasiado débil para ser evaluable. Por el
contrario, es evaluable la disminución de la intensidad de la
franja de la señal en dependencia de la concentración. Por lo tanto
para este caso existen tres márgenes de evaluación:
1. Aumento de intensidad de la franja de la
señal en dependencia de la concentración
2. Disminución de la intensidad de la franja del
control en dependencia de la concentración
3. Disminución de la intensidad de la franja de
la señal en dependencia de la concentración
Puede lograrse una diferenciación automática
entre los tres márgenes citados por ejemplo mediante el siguiente
algoritmo:
A) en el caso de que la remisión de la franja de
la señal sea más grande que X1%, y la remisión de la franja de
control sea más pequeña que Y1%; evaluar solamente la franja de la
señal y emplear la curva de calibración para concentra- ciones de
analito de A1 hasta A2 mg/ml.
B) en el caso de que la remisión de la franja de
la señal sea más pequeña que X2% y la remisión de la franja del
control sea mayor que Y2% y más pequeña que Y3%, evaluar solamente
la franja del control y emplear la curva de calibración para
concentraciones de analito desde A3 hasta A4 mg/ml.
C) en el caso de que la remisión de la franja de
la señal sea mayor que X3 y la remisión de la franja del control
sea mayor que Y4%, evaluar solamente la franja de la señal y
emplear la curva de calibración para concentraciones de analito de
A5 hasta A6 mg/ml.
La invención se describe con más detalle a la
vista de los siguientes ejemplos y figuras. Aunque en los ejemplos
se muestran como ejemplos, solamente dispositivos de ensayo
inmunológicos, los cuales trabajan con socios de unión marcados en
oro y se mide fotométricamente la remisión, la invención no está
limitada por los mismos. Junto a las acciones recíprocas
inmunológicas, basadas sobre pares de unión antígeno (o
respectivamente hapteno)-anticuerpo, son también
posibles otros pares de unión, en particular hormona- receptor,
azúcar-lectina, ácido nucleico-ácido nucleico
complementario, biotina-(estrept-)avidina, y similares. Además de
las marcas en oro son posibles también otras marcas particulares
como por ejemplo el empleo de latex de colores, marcas con
polímero, o nanocristales semiconductores (los llamados "Quantum
Dots") u otras marcas de metal(sol), así como marcas no
particulares (marcas de enzimas, de radioisótopos, de
fluorescencia) y similares. Según la marca empleada son también
necesarios y posibles naturalmente, otros métodos de detección (por
ejemplo medición por fluorescencia, medición por radioactividad,
determinación de la actividad enzimática, etc.). Estas variaciones
son ya conocidas por el experto en una gran cantidad de
posibilidades de ejecución.
En la figura 1 se representa esquemáticamente
una forma preferida de ejecución de un dispositivo de análisis a
emplear según la invención en forma de una tira de ensayo
inmunocromatográfica.
En la figura 2 se representan los valores
relativos de la remisión (R en %) en la evaluación de la franja de
detección (NS) y de la franja de control (KS) en dependencia de la
concentración de troponina T en la muestra (C en ng/ml).
En la figura 3 se representan las curvas de
calibración para una tira de ensayo de troponina-T,
que resultan de emplear los algoritmos descritos más exactamente en
el ejemplo 2, en a) (estado actual de la técnica), y b) (invención)
sobre los valores de medición de la figura 2.
En la figura 4 está reproducida la curva de
calibración para una tira de ensayo de troponina T, que resulta de
emplear en la algoritmo descrito más exactamente en el ejemplo 2,
en c) (invención) sobre los valores de medición de la figura 2.
En la figura 5 están representados los valores
de la remisión (R en %) en la evaluación de la franja de detección
(NS) y de la franja de control (KS) en dependencia de la
concentración de NT-proBNP en la muestra (C en
ng/ml).
En la figura 6 están reproducidas las curvas de
calibración para una tira de análisis NT-proBNP, las
cuales resultan de emplear los algoritmos descritos más exactamente
en el ejemplo 3, en a) (estado actual de la técnica), y b)
(invención), sobre los valores de medición de la figura 5.
En la figura 7 están representados los valores
relativos de la remisión (R en %) en la evaluación de la franja de
detección (NS) y de la franja de control (KS) en dependencia de la
concentración del dímero D en la muestra (c en \mug/ml) en tres
figuras parciales (las cuales se refieren cada vez a distintos
márgenes de concentración).
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Los números en las figuras, significan:
- 1
- zona de entrega de la muestra
- 2
- zona de separación de los eritrocitos
- 3
- zona de detección
- 4
- zona de absorción
- 5
- material de soporte
- 6
- matriz de entrega de la muestra ("napa de biotina" y "napa de oro")
- 7
- matriz de separación de los eritrocitos
- 8
- matriz de detección
- 9
- primera zona de inmovilización en forma de una franja (franja de detección; zona de detección del analito)
- 10
- segunda zona de inmovilización en forma de una franja (franja de control; zona de control)
- 11
- matriz de absorción
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo de ensayo (figura 1) consiste en
un material de soporte (5) sobre el cual se aplican, una zona de
entrega de la muestra (1), una zona de separación de los
eritrocitos (2), una zona de detección (3) y una zona de absorción
(4). En la zona de entrega de la muestra (1) está colocada una
matriz de entrega de muestras (6), la cual solapa parcialmente la
matriz de separación de los eritrocitos (7). La matriz de
separación de los eritrocitos (7) por su parte solapa algo la
matriz de detección (8) (zona de detección), sobre la
poliestreptavidina en forma de una franja (9) como franja de
detección, y el antígeno o respectivamente un análogo de antígeno,
por ejemplo un antígeno-péptido sintético o
respectivamente recombinante, en forma de una franja como franja de
control, están inmovilizados. Una matriz de absorción (10) solapa
algo la matriz de detección (8). En la matriz de entrega de
muestras (6) están aplicados todos aquellos reactivos que son
necesarios para la formación de un complejo con el analito a
detectar. En el caso presente, la zona de entrega de la muestra
consta de 2 napas colocadas una encima de otra, en donde la primera
("napa de oro") está impregnada con un anticuerpo contra el
analito marcado en oro, y la segunda napa ("napa de biotina")
contiene un anticuerpo biotinilado contra el analito. El analito es
aquí un antígeno que se encuentra en la sangre, en particular la
troponina T, NT-proBNP ó el dímero D.
Como franja de soporte 5, se emplea una lámina
de poliéster de 350 \mum de grueso (Pütz). Como "napa de
oro" o respectivamente "napa de biotina" de la matriz de
entrega de la muestra 6, se emplea una napa de poliéster de 360
\mum de grueso (Roche Diagnostics). Como matriz de separación de
los eritrocitos 7, se emplea una napa de fibra de vidrio de 1,8 mm
de grueso (Roche Diagnostics). Como matriz de detección 8, se
emplea una membrana de nitrocelulosa de 140 \mum de grueso
(Sartorius). Como matriz de absorción 10, se emplea una napa de
fibra de vidrio de 1,8 mm de grueso (Roche Diagnostics). Los
componentes individuales (6, 7, 8, 11) están pegados ligeramente
solapados sobre la franja del soporte 5, como muestra la figura 1,
mediante un adhesivo de fusión.
Las recetas de impregnación para las "napas de
oro y de biotina" de los ejemplos mencionados son:
Tira de ensayo de probBNP:
- "Napa de biotina":
- 100 mM de Hepes, pH 7,4, 0,1% de Tween®,
- \quad
- anticuerpo biotinilado contra los analitos
- "Napa de oro":
- 100 mM de Hepes, pH 7,4,
- \quad
- anticuerpo contra los analitos como conjugado de oro
\vskip1.000000\baselineskip
Tira de ensayo de troponina T:
- "Napa de biotina":
- 100 mM de MES, pH 5,6
- \quad
- anticuerpo biotinilado contra los analitos
\global\parskip1.000000\baselineskip
- "Napa de oro":
- 100 mM de ácido succínico, pH 5,6, 0,1% de Tween
- \quad
- anticuerpo contra los analitos como conjugado de oro
\vskip1.000000\baselineskip
Tira de ensayo de dímero D:
- "Napa de biotina":
- 100 mM de Hepes, pH 7,4, 0,1% de Tween®,
- \quad
- anticuerpo biotinilado contra los analitos
- "Napa de oro":
- 100 mM de Hepes, pH 7,4,
- \quad
- anticuerpo contra los analitos como conjugado de oro
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron tiras de ensayo de troponina T según
el ejemplo 1, con muestras de sangre entera a la cual se había
añadido troponina T en diferentes cantidades, obtenida
recombinantemente. Las tiras se evaluaron, o bien según dos
procedimientos según la invención (variantes b) y c), ver más
abajo), o bien, con fines comparativos, según el procedimiento
convencional (variante a)). Se determinó la remisión para la franja
de detección (NS) (9) y la franja de control (KS) con un aparato
convencional de medición montado sobre una cámara CCD (Cardiac
Reader, Roche Diagnostics GmbH), y se utilizaron las señales para
el cálculo según el siguiente algoritmo:
- a)
- [Rem NS(0) - Rem NS(c)]
- b)
- [Rem KS(0) - Rem KS(c)] + [Rem NS(0) - Rem NS (c)]
- c)
- [Rem KS(0) - Rem NS(c)] * [Rem NS(0) - Rem NS (c)]
donde la alternativa a) del algoritmo representa
solamente la evaluación habitual de la franja de detección según
el estado actual de la técnica. Según la invención, se utilizan b)
y c) para la evaluación tanto de la señal de la franja de detección
como también la señal de la franja de control.
En las fórmulas, significan:
- Rem NS (0)
- remisión de la franja de detección en % en concentración de analito 0
- Rem NS (c)
- remisión de la franja de detección en % en concentración de analito c
- Rem KS (0)
- remisión de la franja de control en % en concentración de analito 0
- Rem KS (c)
- remisión de la franja de control en % en concentración de analito c
En la figura 2, están representados los valores
relativos de la remisión (R en %) en la evaluación de la franja de
detección (NS) y de la franja de control (KS) en dependencia de la
concentración de troponina T en la muestra (c en ng/ml). La figura
2 muestra la disminución de la señal (aumento de la remisión) de la
franja de control con una concentración creciente de la analito en
un aumento simultáneo de la señal (disminución de la remisión) de la
franja de detección.
En la figura 3 se reproducen las curvas de
calibración para una tira de ensayo de troponina T, las cuales
proporcionan mediante el empleo de los algoritmos más arriba
citados a) (estado actual de la técnica), y b) (invención), los
valores de medición de la figura 2. En la figura 4 se reproduce la
curva de calibración para una tira de ensayo de troponina T, la
cual mediante el empleo del algoritmo c) descrito con mayor detalle
más arriba (invención), proporciona los valores de medición de la
figura 2. Mientras que con la sola evaluación de la franja de
detección (algoritmo a)) en este ensayo de determinación de la
concentración solamente pueden efectuarse determinaciones de la
concentración hasta aproximadamente 10 ng/ml, mediante la
evaluación del KS y NS según los algoritmos b) y c), pueden
determinarse todavía concentraciones de más de 20 ng/ml.
Se trataron tiras de ensayo
NT-proBNP según el ejemplo 1, con muestras de
sangre entera a las cuales se había añadido
NT-probBNP sintético en distintas cantidades. Las
tiras se evaluaron tanto según el procedimiento según la invención
(variante b), ver más abajo), como también con fines comparativos
según el procedimiento convencional (variante a)). Se determinó la
remisión para la franja de detección (NS) (9) y para la franja de
control (KS), con un aparato de medición convencional montado sobre
una cámara CCD (Cardiac Reader, Roche Diagnostics GmbH), y se
utilizaron las señales para el cálculo según el siguiente
algoritmo:
- a)
- 1 - Rem NS (c)
- b)
- Rem KS (c) : Rem (c)
en donde la alternativa a) del algoritmo
representa solamente la evaluación habitual de la franja de
detección según el estado actual de la técnica. Según la invención
se utiliza tanto la alternativa b) para la evaluación de la señal
de la franja de detección como también la señal de la franja de
control.
Las abreviaturas en las fórmulas tienen el mismo
significado que en el ejemplo 2.
En la figura 5 están representados los valores
relativos de la remisión (R en %) en la evaluación de la franja de
detección (NS) y de la franja de control (KS) en dependencia de la
concentración de NT-proBNP en la muestra (c en
ng/ml). La figura 5 muestra la disminución de la señal (aumento de
la remisión) de la franja de control con una concentración
creciente de analito en un aumento simultáneo de la señal
(disminución de la remisión) de la franja de detección.
En la figura 6, se reproducen las curvas de
calibración para una tira de análisis NT-proBNP,
las cuales resultan del empleo del algoritmo a) citado más arriba
(estado actual de la técnica), y b) (invención) sobre los valores
de medición de la figura 5. Mientras que con la sola evaluación de
la franja de detección (algoritmo a) solamente pueden efectuarse
en este ensayo, determinaciones de la concentración hasta
aproximadamente 6 ng/ml, mediante la evaluación del KS y NS según el
algoritmo b), pueden determinarse todavía concentraciones de más de
14 ng/ml.
Se trataron tiras de ensayo de dímero D según el
ejemplo 1 (en la franja de detección el anticuerpo biotinilado el
cual está dirigido contra los analitos, está inmovilizado; por el
contrario la franja de control consta de fragmentos de fibrina
inmovilizados, los cuales contienen el elemento estructural del
dímero D; a los mismos puede unirse el
anticuerpo-oro libre-conjugado), con
muestras de sangre entera a las cuales se había añadido fragmentos
de fibrina conteniendo el dímero D en diferentes cantidades. Las
tiras se evaluaron tanto según el procedimiento según la invención
(variante b, ver más abajo) como también, para fines comparativos,
según el procedimiento convencional (variante a). Se determinó la
remisión para la franja de detección (NS) (9) y para la franja de
control (KS) con un aparato de medición convencional montado sobre
una cámara CCD (Cardiac Reader, Roche Diagnostics GmbH), y se
utilizaron las señales para el cálculo según el siguiente
algoritmo:
- a)
- Rem NS (c)
- b) {}\hskip0.3cm 1)
- en caso de que la remisión en la franja de la señal sea mayor del 30% y la remisión en la franja de control sea más pequeña del 40%, evaluar solamente la franja de la señal de (Rem NS(c)) y emplear la curva de calibración para concentraciones de analito de 0 hasta 3 \mul/ml.
- 2)
- en caso de que la remisión en la franja de la señal sea menor del 50% y la revisión en la franja de control sea mayor del 40% y menor del 70%, evaluar solamente la franja de control a partir de (Rem KS (c)), y emplear la curva de calibración para concentraciones de analito de 3 hasta 20 \mug/ml.
- 3)
- en caso de que la remisión en la franja de la señal sea mayor del 30% y la remisión en la franja de control sea mayor del 70%, evaluar solamente la franja de la señal a partir de (Rem NS (c)), y emplear la curva de calibración para concentraciones de analito de 20 \mug/ml hasta 1000 \mug/ml.
en donde la alternativa a) del algoritmo
representa solamente la evaluación habitual de la franja de
detección según el estado actual de la técnica. Según la invención
se emplea la alternativa b) para la evaluación tanto de la señal de
la franja de detección como también la señal de la franja de
control.
Las abreviaturas de las fórmulas tienen el mismo
significado que en el ejemplo 2.
En la figura 7 están representados los valores
relativos de la remisión (R en %), en la evaluación de la franja de
detección (NS) y de la franja de control, en dependencia de la
concentración del dímero D en la muestra (c en \mug/ml).
Hasta una concentración del dímero D de 3
\mug/ml, puede efectuarse la evaluación como habitualmente
mediante la disminución de la remisión (aumento de la intensidad)
de la franja de la señal. Hasta aproximadamente 20 \mug/ml puede
evaluarse el aumento de la remisión (disminución de la intensidad)
de la franja de control. A una concentración del analito superior a
los 20 \mug/ml, la dependencia a la concentración de la señal de
la franja de control es demasiado pequeña. A partir de
aproximadamente 20 \mug/ml hasta > 1000 \mug/ml el aumento
de la remisión (disminución de la intensidad) de la franja de la
señal puede ser empleado para la evaluación. Dado que el límite
inferior del margen de medición es < 0,5 \mug/ml, puede
alcanzarse con ello un factor dinámico de > 1000.
Claims (10)
1. Procedimiento para la ampliación del margen
dinámico de medición a altas concentraciones de analito, en las
cuales el efecto de saturación limita el margen de medición, en
particular el
"High-Dose-Hook-Effect"
("efecto gancho de las dosis altas"), sin influir en el límite
inferior de detección, basado en reacciones de unión específicas,
en particular de un elemento de ensayo inmunológico, el cual tiene
tanto una zona de detección del analito como también una zona de
control, en donde:
a) se pone en contacto una muestra con el
elemento de ensayo y con los reactivos específicos para un
analito;
b) el analito - en tanto está presente en la
muestra - conduce a una señal detectable mediante la acción
recíproca con reactivos específicos, en la zona de detección del
analito, la cual depende de la cantidad de analito en la
muestra;
c) una parte de los reactivos específicos que no
han entrado en acción recíproca con el analito o los reactivos en
la zona de detección del analito, conduce a una señal detectable en
la zona de control, la cual depende igualmente de la cantidad de
analito en la muestra;
d) se mide la señal en la zona de detección del
analito y en la zona de control;
e) se efectúa el cálculo con ambas señales
mediante un algoritmo apropiado;
f) se compara el resultado obtenido con una
curva de calibración; y
g) se determina la concentración del
analito.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en el paso e), ambas señales se
utilizan entre sí para el cálculo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque existen por lo menos dos distintas
curvas de calibración para la zona de detección del analito y la
zona de control, y en dependencia de las señales medidas en el
paso d) ó bien solamente la señal de la zona de detección del
analito o bien solamente la señal de la zona de control se comparan
con la correspondiente curva de calibración.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque para establecer la curva de calibración
se emplean tanto las señales de la franja de detección como
también las señales de la franja de control.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los reactivos
que conducen en la zona de detección del analito y en la zona de
control a una señal detectable, presentan diferentes afinidades o
respectivamente diferentes reactividades con el analito.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque en la zona de control participan
anticuerpos poco afines o respectivamente pocos anticuerpos
reactivos contra el analito en la formación de la señal como
también en la zona de detección del analito.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los reactivos
que conducen a una señal detectable en la zona de detección del
analito y en la zona de control en base a diferentes principios de
la interacción con el analito o con otros reactivos participantes
de la detección del analito originan señales diferentes fuertemente
detectables.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque en la zona de detección del analito
están unidos, anticuerpos dirigidos contra el analito, y en la zona
de control está unido el analito o un análogo del analito.
9. Empleo de un elemento de ensayo basado sobre
reacciones específicas de unión en particular inmunológicas, para
la ampliación del margen dinámico de medición a altas
concentraciones de analito en las cuales el efecto de saturación
limita el margen de medición, en particular aparece el
"High-Dose-Hook-Efect"
("efecto gancho de las dosis altas"), sin influir el límite
inferior de detección, en donde el elemento de ensayo presenta
tanto una zona de detección del analito como también una zona de
control, y la señal detectada en la zona de detección del analito y
la señal detectada en la zona de control dependen en cada caso de
la cantidad del analito en la muestra, y ambas señales se utilizan
para el cálculo mediante un algoritmo apropiado.
10. Empleo según la reivindicación 9, en
donde:
a) se pone en contacto una muestra con el
elemento de ensayo y con reactivos específicos para un analito;
b) se miden las señales en la zona de detección
del analito y en la zona de control;
c) ambas señales se emplean conjuntamente para
el cálculo;
d) el resultado del mismo se compara con una
curva de calibración; y
e) se determina la concentración del
analito.
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