CN1559007A - 致瘫痪水生有壳类动物毒素的分析 - Google Patents

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Abstract

一种检测和/或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)数量的方法，包括下述步骤：1)提供分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；2)将其与样品接触；3)测量样品中PST与所述分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白的结合；并且将结合量与样品中的PST的有无或样品中PST浓度相关联。

Description

致瘫痪水生有壳类动物毒素的分析
技术领域
本发明涉及蛤蚌毒素结合多肽，亲蛤蚌毒素蛋白(saxiphilin)的分离和纯化，以及应用纯化的亲蛤蚌毒素蛋白用来检测、富集、纯化和提取蛤蚌毒素的方法、分析和装置。特别是本发明涉及一种经济、耐用(robust)、高通量的分析方法，其不需要放射性标记的试剂，适合现场使用。
发明背景
致瘫痪的水生有壳类动物中毒由摄取含来自腰鞭毛虫的毒素的鱼，水生有壳类动物或软体动物引起，由于导致严重的人类疾病，通常导致死亡，目前成为一个世界范围问题。中毒由致瘫痪水生有壳类动物毒素(PSTs)引起，其属于原型分子蛤蚌毒素(STX)相关毒素家族。并且，有毒淡水海藻的繁盛能以相同神经毒素污染供水，可以引起致瘫痪的水生有壳类动物中毒。这种毒素污染的水会给人，牲畜以及野生动物造成可怕的后果。
PSTs的一般结构如下：
Figure A0182258000091
    R1     R2     R3     R4
    STX     H     H     H     CONH2
    dcSTX     H     H     H     H
    B1     H     H     H     CONHSO3 -
    B2     OH     H     H     CONHSO3 -
    C1     H     H     OSO3 -     CONHSO3
    C2     H     OSO3 -     H     CONHSO3 -
    C3     OH     H     OSO3 -     CONHSO3 -
    C4     OH     OSO3 -     H     CONHSO3 -
    neoSTX     OH     H     H     CONH2
    dcNeoSTX     OH     H     H     H
    GTX2     H     H     OSO3 -     CONH2
    GTX3     H     OSO3 -     H     CONH2
    GTX1     OH     H     H     CONH2
    GTX4     OH     OSO3 -     H     CONH2
毒素家族可分成3大类：蛤蚌毒素(saxitoxins)，高强活性神经毒素，并且没有被硫酸酯化；gonyautoxin(GTXs)，为单硫酸酯化；以及N-磺基氨基甲酰-11-硫酸氢盐(hydrosulphate)C-毒素，其毒性小于STXs或GTXs。
PSTs毒性源自其与电压依赖性钠通道的结合，其阻断钠离子的内流，因此阻断神经肌肉的传输。这导致呼吸麻痹，目前没有有效的治疗措施。在一些爆发的致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件中，40％以上的受害者已经死亡。PSTs与河豚毒素具有完全不同的结构，但却结合到钠通道的相同位点(Hall等，1990)。在一些场合下，河豚毒素可与PSTs一起发生作用，因此任何用于检测PSTs的分析必须能够将其与河豚毒区分开。
腰鞭毛虫，是PSTs的源头，周期性地形成海藻繁盛，也就是闻名的赤潮(Anderson，1994)。软体动物，鱼，以及水生有壳类动物，包括有商业意义或使用水产技术养殖的物种，可能会吞食腰鞭毛虫从而聚集毒素。不可能检测对每一只海产动物进行检测判断是否包含毒素，因此就存在人类由于不注意而食用包含毒素的动物的风险。因此就需要监控人类消费的物种中存在的PSTs，以避免中毒的危险以及预防社会及经济损失。
目前已经知道有超过20种蛤蚌毒素的天然类似物，以及它们对哺乳动物的毒性。一些天然存在的PSTs列在表1中。
                                                        表1
                                                 一些天然存在的PSTs
俗名 常见文献缩写                                    系统命名 CAS登记号
蛤蚌毒素 STX 2，6-二氨基-4[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-10，10-二醇，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 35523-89-8
α-蛤蚌毒素醇(saxitoxinol) 2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10-羟基-，α-氨基甲酸酯-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-甲醇，[3aS-(3aα，4α，10β，10aR*)] 75420-34-7
蛤蚌毒素醇 2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10-羟基-，α-氨基甲酸酯-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-甲醇，[3aS-(3aα，4α，10α，10aR*)] 75352-30-6
新蛤蚌毒素(Neosaxitoxin) neoSTX 2-氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨基-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-10，10-二醇，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 64296-20-4
Gonyautoxin I GTX I或GTX1 2-氨基-2-[[(氨基羰基)氧基]甲基-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨基-9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9β，10aR*)] 60748-39-2
Gonyautoxin II GTX II或GTX2 2，6-二氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9β，10aR*)] 60508-89-6
Gonyautoxin III GTX III或GTX3 2，6-二氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9α，10aR*)] 60537-65-7
GonyautoxinIV GTX IV或GTX4 -2-氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨基-9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9α，10aR*) 64296-26-0
Gonyautoxin V GTX V，GTX5或B1 氨基甲酸，磺基-，C-[(2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-基)甲基]酯，[3aS-3aα，4α，401aR*)] 64296-25-9
Gonyautoxin VI GTX VI，GTX5或B2 氨基甲酸，磺基-C-[(2-氨基-3a，4，5，6，9，10-六氢-5，10，10-三羟基-6-亚氨基-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-基)甲基]酯，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 82810-44-4
GonyautoxinVIII GTX VIII或GTX8或C2 氨基甲酸，磺基-，C-[[2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基-9-亚砜(sulfoxy)-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-yl]甲基]酯，[3aS-(3aα，4α，9α，10aR*)] 80226-62-6
epi-GonyautoxinVIII epi-GTXVIII或C1 氨基甲酸，磺基-，C-[[2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基-9-亚砜(sulfoxy)-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-yl]甲基]酯，[3aS-(3aα，4α，9β，10aR*)] 80173-30-4
海藻繁盛的发生在全球出现上升的态势，可能是沿海水超营养作用增加及全球变暖的结果，结果导致致瘫痪的水生有壳类动物中毒或水生有壳类动物或带PSTs其他生物污染的发生率也上升。例如，单在2000年，在马来西亚的沙巴就有四人中毒，甲壳类渔业停业四个月。在菲律宾的马尼拉湾，甲壳类渔业停业数月；在华盛顿州，9人中毒并且5人需要住院治疗，在2000年Cape Cod和南缅因州的甲壳类渔业也遭停业数月，这两起事件都发生在美国；2000年5月，新西兰North Island的西海岸的所有甲壳类渔业由于海藻繁盛，都遭停止，其逼近绿色环绕的(greenlipped)蚌类产区，每年产生价值8千4百万新元的蚌类；在苏格兰在2000年6月甲壳类渔业被禁止；并且海藻繁盛导致在南非和中国发生不少致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件；加拿大2000年7月检测到的污染结果，是将3000条养殖的大麻哈鱼(salmon)消灭。特别是，在美国，在过去的10年内发生了约150起水生有壳类动物污染事件，导致甲壳类渔业最长达12个月的停顿；在苏格兰的一些地方，停业达3年之久；1994在摩洛哥，导致4人死亡，74人住院接受治疗；在菲律宾自1983年已有约1600人中毒，而在1983年之前，几乎没有此类事件的发生；1997年在印度爆发了一次，导致7人死亡，500人住院接受治疗，禁止甲壳类渔业导致1000户家庭失去工作。
不幸地，尽管急需简单、耐用及可靠的方法来检测人类食用的海洋生物的中污染，现有方法却不能令人满意。急需常规的水生有壳类动物检测方法以保证有毒产品不进入市场(VanEgmond和Dekker，1995)。目前，唯一获得官方认可的方法是小鼠致死生物分析方法，由官方分析化学家联合会(AOAC)批准：官方分析方法，959.08E部分，1990。这种方法需要对小鼠腹膜内注射潜在的毒性生物体例如水生有壳类动物的盐酸提取物，并且观察从注射到死亡的时间(Sommer和Meyer，1937；Hungerford，1995)。小鼠必须来自小鼠群体，定期地参考毒素样品对其灵敏度进行标准化，并且样品必须进行稀释以保证死亡在5～7分钟内发生。该分析方法不人道、昂贵、不普及，由于动物保护条例也冒着被禁止的风险，特别是在有些国家如欧盟，荷兰和德国。更值得关注的是小鼠生物分析方法的灵敏度只有180μg STX/1(Johnson和Mulberry，1966)。
使用灵敏度较差的方法意味着存在着下列严重危险：可能检测不出足以引起人中毒的PSTs水平。例如，菲律宾的儿童由于食用水生有壳类动物而死亡，但小鼠致死生物分析表明水生有壳类动物只含40μg STX/100g水生有壳类动物肉，将由于提取溶剂以及水生有壳类动物的稀释作用考虑在内，其约等于约200μg。该毒性水平与小鼠致死生物分析的检测限相同。
该问题导致人们致力于开发替代分析方法的尝试，基于
(a)用生物观察的方法检测中毒生物的存在，
(b)利用如DNA探针的方法进行原位检测，或
(c)用生化，生理或化学分析检测海洋生物中的毒素。
一种方法利用阻滞电压门控(voltage-gated)钠通道(VGSC)原理来进行检测，后者为兴奋细胞中大跨膜蛋白，当其响应细胞电位差的改变而开启的时候，导致离子通过中孔(central pore)(参见如Doucette等，1997；Jellett等，1992；Vieytes等，1993)。这些分析都基于放射配体分析方法(Weigele和Barchi，1978)，可以改成微量滴定板形式，以增加样品通量(Doucette等，1997)。也可以使用强刺激(hyperstimulated)细胞培养以增加通过钠通道的离子流量(Jellett等，1992；美国专利5,420,011和5,858,687)。
但是，这些分析方法费用昂贵且技术复杂，需要放射性标记的试剂或细胞培养。并且对pH波动敏感，因为在pH大于6.7时，PSTs很容易被从离子通道上替换下来，类似地，也对阳离子浓度敏感，并且，更重要地，由于它们也能检测河豚毒素，为非特异的方法。这些方法中没有一种方法适合现场使用。化学分析方法由于下列事实而变得复杂：每种毒素在结构上千变万化，从强极性到亲脂性，从低分子量到大分子量。而且，那些化学方法需要用已知毒素的标准样品，且不能用这些方法测量任何一种新的生物活性的PSTs。因此基于抗体检测或用化学方法如高效液相色谱，质谱，或毛细管电泳的分析方法不能检测广谱的毒素。
一种简单快速初步纯化(clean-up)水生有壳类动物粗提物的方法与长形工作台(bench)或桌面(desktop)侧流(lateral flow)免疫色谱分析方法(由JellettBiotek销售)联用，可以在10分钟内得到初步的结果；但是，需要用液相色谱-质谱来确证筛选的结果。初步纯化用甲酸铵流动相在适和亲脂性毒素分离的5cm固相柱上进行，接着用60-90％梯度的四腈(tetranitrile)-2mM甲酸铵(pH3.5)在Tosoh-Haas酰胺40柱上进行LCMS分析。初步的结果由M.A.Quilliam于2000年9月在国际海产生物技术会议(International MarineBiotechnology Conference，Townsville)上报告。
我们使用了一种不同的方法，所述方法基于已知为亲蛤蚌毒素蛋白的受体蛋白，无论是在氨基酸序列还是功能特性上与VGSC完全无关，能特异地与STX结合，但不与河豚毒素结合(Llewellyn和Moczydlowski，1994)。亲蛤蚌毒素蛋白与STX的结合能力已经用于低通量的放射配体结合分析，用于检测蓝色绿藻、甲壳类和软体动物中的PSTs(Carmichael等，1997；Negri和Llewellyn，1998)。该方法利用从亲蛤蚌毒素蛋白中替代3H-标记的STX。我们已经应用包含亲蛤蚌毒素蛋白的粗制提取物来开发检测PSTs的微量滴定板分析方法(Llewellyn等，1998；Llewellyn和Doyle，2000)。尽管这种分析方法提供了高通量、灵敏度和精确性，也具有不受水生有壳类动物提取物中存在的其他化合物干扰的影响或在从水生有壳类动物提取过程中保持毒素稳定性所必须酸性pH的影响的优点，但该方法仍然具有需要放射性标记物的缺点。
分析中使用的亲蛤蚌毒素蛋白是通过在含蛋白酶抑制剂混合液(cocktail)的缓冲液中匀浆蜈蚣Ethmostigmus rubripes样本得到的粗制品。尽管这种制备方法可以提供了良好的灵敏度，在试剂的易得性以及制备的规定及可重复性上仍然存在问题。因此仍然需要一种适合快速，耐用的分析技术，合适现场使用，例如在捕鱼船上，或在水产养殖场，并且能够检测较宽范围的STXs。
可以很清楚地理解，尽管这里参考了许多现有的技术公开，但这些参考并不能形成这样的事实，即这些文献中的任何一种可以形成本领域的共知知识，无论是在澳大利亚或在其他任何国家。
发明概述
本发明一方面提供了一种检测和/或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)的方法，包括下列步骤：
1)提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
2)将其与样品接触；
3)测量PSTs与分离的亲蛤蚌毒素蛋白的结合；以及
将结合量与样品中PSTs的有无或PST浓度相关联。
分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段，可偶联到可检测的标记物或固定到固相支持物上。可检测的标记可为任何合适的标记，如本领域普通技术人员理解的那样，可用任何方便的方法偶联到固相载体上。
本发明另一方面提供了测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的方法，包括下列步骤：
(a)用聚阳离子预处理微量滴定滤板的滤器；
(b)向微孔中加入已知量的标记的亲蛤蚌毒素蛋白，包括用可检测的标记进行标记的分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段，以及怀疑包括致瘫痪水生有壳类动物毒素物质的系列稀释液；
(c)将板孵育足够长时间，以容许存在的任何致瘫痪水生有壳类动物毒素与标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合；
(d)通过孔的滤器吸出每孔中的内容物，以除去除标记的亲蛤蚌毒素蛋白和其化合物结合以外的组分；
(e)清洗每孔以及滤器以除去残留的未结合的化合物；以及
(f)测量滤器截留的标记的亲蛤蚌毒素蛋白量，
其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合程度与对照样品对比时，可以显示出样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素蛋白量。
本发明进一步提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白偶联到固相载体上。
本发明更进一步提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白用可检测标记物进行标记。
本发明进一步提供了无脊椎动物亲蛤蚌毒素蛋白的分离方法，包括下列步骤：
(a)将产生亲蛤蚌毒素蛋白节肢动物的个体在含蛋白酶抑制剂的生理缓冲液中进行匀浆；
(b)将匀浆液进行低速离心以除去细胞碎片；
(c)将从步骤(b)得到上清进行高速离心；以及
(d)从上清用硫酸铵沉淀出亲蛤蚌毒素蛋白。
所述方法进一步包括下列步骤：
(e)纯化沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白。
有利地，亲蛤蚌毒素蛋白用40-60％硫酸铵沉淀。在进行该步骤之前，pH可暂时地降低到5.0以沉淀一些非亲蛤蚌毒素蛋白。
典型地，纯化沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白包括下列步骤：
(i)在pH5.0-6.5重新溶解沉淀，离心除去非亲蛤蚌毒素蛋白分子；
(ii)将从(e)得到的上清与亲蛤蚌毒素蛋白结合到其上的基质，如玻璃纤维聚乙烯亚胺(PEI)载体基质进行接触；以及
(iii)在高盐条件下从基质上洗脱结合的物质。
在步骤(iii)中，亲蛤蚌毒素蛋白典型地用溶解在pH5-9的缓冲液中、浓度为600mM至饱和的NaCl或KCl洗脱。可以使用多种不同的缓冲液。
任选地，可进行进一步的纯化，例如用
(f)在用100ml 25mM乙酸钠在10mM MES-NaOH，EDTA(pH6.0)中的溶液进行平衡的肝磷脂琼脂糖(凝胶)上层析，用300～800mM乙酸钠的MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液进行梯度洗脱，以及
(g)在用25mM三乙胺pH10.5平衡的PBE 118树脂上进行层析聚焦(chromatofocussing)，并用Polybuffer 96溶液(包含8.9ml Polybuffer96，1.8mlPharmalyte 8-10.5)进行洗脱，得到250ml的终体积，pH为8.0。
可以利用大小排阻色谱或在柱上脱盐，例如AmershamPharmaciaBiotech的PD-10柱实现Polybuffer去除以及缓冲液变换。
节肢动物可为任何产生亲蛤蚌毒素蛋白的物种。参见例如Llewellyn等，1997。优选的节肢动物为蜈蚣，例如Ethmostigmus rubripes，等脚类的动物(isopod)，例如Oniscus物种，蜘蛛，例如Araneus.c.f.Cavaticus，Xanthid crab，或Clopterygidae家族的昆虫。
更优选节肢动物为蜈蚣，最优选Ethmostigmus rubripes。从该物种分离的亲蛤蚌毒素蛋白已经被证明可与PST家族所有的结构亚类的PSTs以相似的亲和力进行结合。节肢动物可以方便地通过降低体温使其麻醉。匀浆可用任何方便的仪器进行，如Heidolph组织匀浆器。合适的匀浆缓冲液是20mMHEPES-NaOH，pH7.4，含0.5mM EDTA 1μM亮抑肽酶，1μM抑胃酶肽，0.5μM抑蛋白酶肽，以及1μM苯基甲基磺酰氟。合适地，每克节肢动物材料使用2ml缓冲液。低速离心可方便在8000g进行10分钟，然后在50,000g高速离心20分钟。高速离心后的上清液可在液氮中冻存，进一步处理前保存在80C。
PEI载体基质用常规方法制备，例如将玻璃纤维用0.3％PEI的水溶液(v/v)孵育至少1小时，通过真空排干(draining)或抽吸(aspiration)以除去PEI。
分离的亲蛤蚌毒素蛋白可用来检测PSTs，用我们已经描述的微量滴定板分析方法(Llewellyn和Doyle 2000；Lewellyn等，1998)，利用用非放射性标记物标记的亲蛤蚌毒素蛋白。本领域普通技术人员应该了解合适的标记物，其包括荧光和化学发光标记，胶体金，胶乳微珠，脂质体封装的染料以及酶标记，尽管这些标记物由于需要发生酶反应导致信号增强是时间依赖性的，而显得不太有利。脂质体封装染料可为生物素化或以其他方式标记的，以促进其在分析中的捕获。使用这些标记每一种的合适检测方法都是本领域公知的方法。
本发明分离的亲蛤蚌毒素蛋白也有用于制备PSTs纯化、富集或提取的亲和材料，例如用于怀疑被海藻繁盛污染水的水质测试。例如，分离的亲蛤蚌毒素蛋白可偶联到合适的固相载体上，其可装填在柱或柱体中。在优选的技术方案中，固相载体装填在适合连接到注射器的柱体中。本领域的普通技术人员知道合适的偶联方法及载体，例如溴化氰活化的基质例如琼脂糖；环氧活化的基质；羧基甲基纤维素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及环氧乙烷丙烯酸的珠。PSTs可从亲和材料用小体积(例如1-5ml)的酸，脲或浓缩盐处理而洗脱下来。
对在实验室中进行的分析，这种初步纯化可在怀疑被PSTs污染物质的样品分析之前进行。
适合本发明分析或初步富集方法中使用的物质可为组织提取物，例如从脊椎动物例如鱼或可能吞食PST污染的物质的哺乳动物种类；无脊椎动物例如软体动物，包括水生有壳类动物或头足类动物(cephalopods)；肉眼可见的海藻(macroscopic algae)例如海草；微藻类包括藻青菌，腰鞭毛虫等；或细菌。也可以测试生物体液例如怀疑PST中毒的病人的血，尿或唾液，或水样，例如怀疑被污染的饮用水供应或来自海藻繁盛区域的水，其可能包含由繁盛生物释放的溶解毒素。并且，也可以应用包含合成PSTs的样品。
PSTs可从待测的组织中，使用任何合适的水或醇溶剂进行提取；由于蛤蚌毒素在碱性条件下易于降解，优选溶剂在酸性pH下。任选地提取在升高的温度下进行。所述方法中使用的特别合适的溶剂是，由Association ofOfficial Analytical Chemists认可的，即0.1N HCl。
有多种特异方法可以进行本发明的分析，下面将描述多种优选的本发明技术方案。
本发明的一种技术方案提供了一种测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素量的方法，包括下列步骤：
(a)用聚阳离子预处理微量滴定过滤板的滤器；
(b)向板孔中加入已知量的可检测标志物标记的亲蛤蚌毒素蛋白，以及一系列怀疑包括致瘫痪水生有壳类动物毒素的物质的稀释液；
(c)将板孵育足够的时间以容许致瘫痪水生有壳类动物毒素与亲蛤蚌毒素蛋白的结合；
(d)通过孔的滤器吸出每孔的内容物，以除去除亲蛤蚌毒素蛋白和其结合的化合物以外的组分；
(e)清洗每一个孔及滤器以除去残留的未结合的化合物；以及
(f)测量滤器保留的标记的亲蛤蚌毒素蛋白量，
其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合程度，当与对照样品比较的时候，就可以表示出样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素量。
优选步骤(b)中的样品包括缓冲液，以保持pH的范围为6.5～9，并任选地也包括氯化物盐类，例如氯化钠或氯化钾，浓度可达500mM。典型地孔中的总体积为50～350μl，优选100～200μl，更优选150μl。在步骤(c)中，孵育在0～30℃进行，优选在室温下，至少进行30分钟；孵育优选进行60～120分钟，更优选90分钟，但可以持续到约8小时。在步骤(e)中，可使用任何合适的溶液进行清洗，例如用与步骤(b)相同的pH的缓冲液。单次清洗通常就足够了；但是，每孔典型地清洗2～3次。
依据本发明优选的技术方案，方案使用150μl的总体积，包含20mMMOPS-NaOH(pH7.4)，200mM NaCl，以及1nM标记的STX蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白，通过滤器吸出之前在室温下(～25℃)孵育90分钟。用180μl冰冷的水对每孔清洗三次。亲蛤蚌毒素蛋白的最适宜量可以很方便用常规实验来确定。
本发明进一步提供了一种用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素量的试剂盒，包括
(a)微量滴定板；
(b)依据本发明用可检测标志物标记的亲蛤蚌毒素蛋白；
(c)提取缓冲液，用于从待测试生物体或组织的样品提取测试物质；以及任选地，
(d)一种富集装置(means)，用来富集提取物中的致瘫痪水生有壳类动物毒素或去除去可能干扰分析的污染物。
优选的富集方法为柱或柱体，依据本发明所述方法包括偶联有纯化的亲蛤蚌毒素蛋白的固相载体材料。
本发明进一步提供一种装置，用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量，包括：
固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
将样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段的方法接触的装置；
用来测量样品中包含PSTs与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段结合的装置；以及
用来关联结合量与样品中PSTs有无或PST浓度的方法。
本发明进一步提供一种用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的装置，包括：
固定的PST；
将样品与所述固定的PST接触的装置；
用来测量加到样品中的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段结合与所述固定的PST结合的装置；以及
用来关联结合量与样品中PSTs有无或PST浓度的方法。
典型地使用无脊椎亲蛤蚌毒素蛋白，并且其有利地用上述方法进行纯化。
所述装置可为生物传感器，因此包括将结合结果转化成电信号的装置。
有利地，可以检测结合后蛋白的质量变化。因此应该意识到，由于亲蛤蚌毒素蛋白是相对大的蛋白，使用包含蛤蚌毒素结合位点的片段可以实现提高检测灵敏度的目的。如果使用片段，应该意识到结合后质量的变化将在体系总质量中占更大的比例。
本发明更进一步提供一种用来富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素(PSTs)的方法，包括下列步骤：
提供固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点片段；
将怀疑包含PST的样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白接触足够长的时间，以使PST与固定的亲蛤蚌毒素蛋白结合；以及
任选地，从固定的亲蛤蚌毒素蛋白上洗脱结合的PST。
所述方法也可以用来，作为其他方法中的一种，对水生有壳类动物进行解毒以及纯化水。
本发明也提供将分离的亲蛤蚌毒素蛋白用于制备亲和材料，用来富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素。
本发明也提供一种亲和材料，用于富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素，其包括偶联有分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点片段的固相载体。
有利地固相载体，选自噁唑酮基质，溴化氰活化的基质；环氧活化的基质；羧基甲基纤维素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及环氧乙烷丙烯酸的珠。
为了更好的理解本说明书目的，应该清楚地理解术语″包括″方法指″包括但不限于″。
附图的简单说明
图1为示意性地表示用于检测PSTs有无的诊断测试条的上视图及侧视图。
图2为示意性地表示另一种诊断测试条；
图3为示意性地表示说明微量滴定板分析PSTs的原理；
图4示意性地显示表面等离子体共振(SPR)传感器的竞争性结合；
图5示意性的表示用于PSTs快速定量的基于亲蛤蚌毒素蛋白的表面等离子体共振(SPR)传感器；
图6表示实施例3中的结合实验的放射性洗脱图；
图7的条形图显示图6中pH5.0的峰的放射性的特异结合；以及
图8显示实施例3中描述的稳定性测试中的洗脱曲线。
发明详述
本发明现在将通过只参考下列非限制性的实施例以及附图进行详细描述。
实施1：亲蛤蚌毒素蛋白的纯化
亲蛤蚌毒素蛋白粗品通过对蜈蚣Ethmostigmus rubripes样本在10mMTris-HCl，0.2mM EDTA(pH7.4)(2×10秒脉冲(bursts)，用Waringblender的最大设置；3ml缓冲液：1g蜈蚣)包含蛋白酶抑制剂的混合液(5mM EDTA，1μM胃酶抑制剂，1μM抑蛋白酶肽，100μM苯基甲基磺酰基氟)中匀浆而得到。匀浆液在24,000g离心20分钟后，碎片进行如上所述的再匀浆、离心。合并两次上清，并将其通过0.2μm醋酸纤维素滤器(Nalgene)。亲蛤蚌毒素蛋白然后用40～60％硫酸铵从上清中沉淀出来，接着通过重新溶解在pH5.0-6.5的缓冲溶液中及离心得到包含亲蛤蚌毒素蛋白的上清，从所述沉淀中除去非亲蛤蚌毒素蛋白分子。
上清用玻璃纤维聚乙烯亚胺(PEI)载体基质处理，后者通过将玻璃纤维用0.3％PEI的水溶液(v/v)孵育至少1小时以及在真空下除去PEI通过排水或抽吸进行制备得到。亲蛤蚌毒素蛋白用高盐从基质上洗脱下来，亲蛤蚌毒素蛋白典型地用NaCl或KCl在从600mM到饱和浓度下，在pH5-9进行洗脱。
进一步纯化通过在用100ml 25mM醋酸钠(10mM MES-NaOH，EDTA(pH6.0)中)平衡的肝磷脂-琼脂糖(凝胶)进行色谱而实现，用300～800mM醋酸钠的MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液梯度洗脱亲蛤蚌毒素蛋白。所述蛋白然后在PBE 118树脂上进行层析聚焦，用pH10.5的25mM三乙胺平衡，并且用包含8.9ml Polybuffer 96，1.8ml Pharmalyte 8-10.5的Polybuffer96溶液进行洗脱，得到终体积为250ml，pH为8.0。用大小排阻色谱或脱盐柱，例如Amersham PharmaciaBiotech的PD-10柱实现Polybuffer的去除以及缓冲液交换。
实施例2：纯化的亲蛤蚌毒素蛋白在分析中的应用
a)诊断测试条
本发明使用纯化的亲蛤蚌毒素蛋白来定性检测PSTs的诊断试剂盒是测试条的形式。试剂盒使用固相基质，或″芯(wick)″，反应在其上发生。试剂盒在该固相基质的一端有蛤蚌毒素带，使用已知的″印刷″方法。该过程固定蛤蚌毒素，″印刷″蛤蚌毒素作为流过修饰的亲蛤蚌毒素蛋白(下文将描述)锚定剂。如果修饰的亲蛤蚌毒素蛋白已经结合测试样品中的PST，那么它就不能结合与″印刷″的蛤蚌毒素结合，将继续流动，就没有色斑的形成。如果受试样品中没有PSTs，则修饰的亲蛤蚌毒素蛋白将结合到″印刷″的蛤蚌毒素带上，形成有色斑点。为了使锚定的亲蛤蚌毒素蛋白产生有色斑点，亲蛤蚌毒素蛋白偶联到胶体金或有色的胶乳微珠上。原理是胶体金，一种强成色试剂，当偶联的亲蛤蚌毒素蛋白结合到固定在膜上的STX时候，聚集成人眼可观察的明显斑点。当其流过蛤蚌毒素的印刷带时，将停滞并聚集，或继续前进，并不形成人眼可视的斑点。该过程示意性地在图1中来进行了说明。因此这种分析形式对样品中PSTs的存在提供了定性的″是/否″分析。测试条提供了阳性对照。
另一个替代的方法是使用脂质体封装的染料。脂质体提供了即时的增强，并且具有相当大的自动分析的可能性。
实验体系是竞争性受体分析，并由包含包裹染料的蛤蚌毒素/生物素标记的脂质体的芯试剂以及塑料支撑的硝化纤维素条组成，其以向上的顺序具有固定的亲蛤蚌毒素蛋白竞争区以及脂质体抗生物素蛋白捕获区(图2)。芯试剂以及包含未知量PSTs样品的混合物通过毛细管作用沿测试条迁移。在亲蛤蚌毒素蛋白区，发生与PSTs受体的竞争性结合。未结合的脂质体，与样品中蛤蚌毒素量成正比，被运载到脂质体捕获区，在该区其被富集。亲蛤蚌毒素蛋白区以及抗生物素蛋白区的颜色强度可通过视觉上或扫描密度测定仪(scanning densitometry)进行估计。
固定的亲蛤蚌毒素蛋白量必须尽可能的低以增加检测PST的灵敏度，但也应足够的浓度，以便于脂质体的视觉检测。
典型的迁移分析需要大约100μL的样品溶液，在少于10分钟内应该能达到ppb的检测水平，相应于PSTs在低ng范围内的检测限。脂质体为高度稳定的分子，可以在+4C保存至少1年的时间，在室温可以保存数月。所述分析很方便用于现场检测，不需要任何特殊的仪器或技能。该试剂盒可包括单个测试条使用的特殊容器(holder)，其中有便于加入样品以及光学读数的开口。这种低成本的亲蛤蚌毒素蛋白迁移传感器有利于方便及快速筛选环境样品并构成PSTs风险评估无可比拟的及可靠的工具。
(b)微量滴定板分析
建立微量滴定板形式的分析方法可以使其满足更复杂的应用，并能得到定量结果。一种优选的形式是结合抑制分析。将蛤蚌毒素包被到96孔微量滴定板上。测试样品与标记的亲蛤蚌毒素蛋白混合，并加到96孔板中。无毒素样品不能阻止标记的亲蛤蚌毒素蛋白与96孔板包被孔表面的蛤蚌毒素的结合，形成有色区域。包含毒素的样品抑制有色形成，抑制程度与存在的毒素量成比例。然后用分光光度读板器进行读数并对毒素进行定量。
进一步可能的PSTs定量技术包括高效液相色谱，偶联有柱后(post-column)氧化体系及荧光检测器。该方法复杂且需要昂贵的PSTs标准品。但是，通过表面等离子体共振(SPR)方法的灵敏检测，合并高特异基于亲蛤蚌毒素蛋白的鉴定，克服了色谱技术相关的缺点。
所述装置需要PST，例如蛤蚌毒素偶联到活化的金表面，在分析的过程中与液体样品接触。SPR传感器检测由在金属液体界面折射率变化引起的激光反射变化。因此，当蛤蚌毒素偶联到传感器的活化金表面的时候，由亲蛤蚌毒素蛋白结合诱导折射率发生改变(图4)。在这种PSTs为样品的情况下，在游离PSTs和结合的蛤蚌毒素之间发生竞争，产生的信号下降值可以定量。
这种流动-注射(flow-injection)受体分析由下列步骤组成：i)试剂泵送及样品注射系统，ii)混合池(mixing cell)，在这里发生竞争性受体分析以及iii)SPR传感器，包括流动池及光学装置装置(图5)。该体系可完全自动化，如BiacoreAB制造的BIACORE 2000。
实施例3：亲和柱制备
通过将亲蛤蚌毒素蛋白连接到固相，其与蛤蚌毒素的结合能力可用来从液体样品中分离出蛤蚌毒素，所述样品流过亲蛤蚌毒素蛋白连接的固相载体。由于与蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白的结合为pH依赖的，结合的毒素然后可以洗脱。
亲蛤蚌毒素蛋白亲和柱的制备
分离的亲蛤蚌毒素蛋白用来制备亲和柱，使用UltralinkTM试剂盒(PierceChemical Company制造)。所述树脂使用噁唑酮偶联化学，并使用具有介质快速冲洗特性的惰性半刚性(semi-rigid)树脂。
所述方法按下述步骤进行：
1.硫酸铵沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白重新悬浮于Pierce提供的偶联缓冲液(BupH柠檬酸盐-碳酸盐缓冲液，pH9)中。
2.重新溶解的亲蛤蚌毒素蛋白加到0.15g的3M Emphaze生物载体介质AB1(Pierce提供)，后者可使树脂水合并使可利用的蛋白结合。树脂膨胀到1ml。
3.1小时的轻微混合后，树脂和亲蛤蚌毒素蛋白配制品装填到微柱中，并且树脂沉降。
4.然后用用磷酸盐缓冲液(15mls)洗柱。
5.然后加入4ml终止缓冲液(3M乙醇胺，pH9.0)，在这种缓冲液中轻微混合树脂2.5小时。
6.然后用15ml磷酸盐缓冲液洗柱。
7.用带孔的圆塞(disk insert)密封树脂上部。
8.用15ml 1M NaCl洗柱
9.用15ml 100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗柱，可以用来测试结合蛤蚌毒素的能力。
柱结合蛤蚌毒素能力的测试
氚标的蛤蚌毒素(Amersham Pharmacia Biotech)用来测量柱结合蛤蚌毒素的能力。
3等份发2μl的3H-STX(60nM)计数用闪烁计数器来测量应用到柱的放射性。这些等份样每分钟包含2113±42记数(cpm)。
200μl的3H-STX(＝211，300cpm-参见上述说明)加到柱上，并流进树脂中。3H-STX用商品供应的3H-STX(在含2％乙醇0.01M醋酸溶液中)用1mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)进行150倍的稀释制备得到。柱然后用5ml 100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗。收集流出的液体。柱然后依次用5ml的下列溶液洗，分别收集每一种洗脱的样品：
      第二次洗(2nd wash)100mM HEPES-NaOH(pH7.4)
      第三次洗100mM HEPES-NaOH(pH7.4)
      100mM HEPES-NaOH(pH6.0)
      100mM HEPES-NaOH(pH5.0)
      0.001N HCl
      0.005N HCl
      0.01N HCl
      0.05N HCl
      0.1N HCl
      0.5N HCl。
洗脱放射性描述在图6中。
可以看出，有两个放射性主峰。在第一级分中的第一个洗脱液基本上未结合柱的物质。第二峰用100mM HEPES-NaOH pH5.0洗脱。氚标的蛤蚌毒素包含游离氚，因此这两个峰通过测量其与两个已知的蛤蚌毒素受体，即钠通道及亲蛤蚌毒素蛋白结合的能力，来测试其生物活性。
从亲蛤蚌毒素蛋白柱洗脱峰生物活性的测量
分析条件是：
钠通道：100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化胆碱，100μl的组分1和5(洗以及分别用第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，10μl包含钠通道的大鼠脑囊(vesicles)，终体积为250μl。样品制备成双份；也设置阴性对照，包含过量的非标记的河豚毒素，用来进行确定任何结合的3H-STX特异水平。
亲蛤蚌毒素蛋白：100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化钠，100μl的级分1和5(洗以及分别第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，1.5μl表征的蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白配制品，终体积为250μl。样品制备成双份；也设置阴性对照，包含过量的未标记的蛤蚌毒素，用来确定的任何结合的3HSTX特定水平。
从图7中可以看出，只有pH5.0的放射性的柱洗脱峰保留生物活性，即其可与两个已知的蛤蚌毒素受体结合。pH7.4峰不包含任何这种生物活性(除了亲蛤蚌毒素蛋白分析中最少量的受体结合活性)表明放射性为未掺入到蛤蚌毒素中的氚所导致(商品供应3H-STX的已知性质)。
初处理后柱稳定评价
用最终的0.5N HCl洗后，柱用20ml的100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗，4℃保存过夜。移出该柱并恢复到室温，重复上述洗脱实验，得到图8中的曲线图。
可以看出，有活性的第二峰迁移到洗脱用HEPES-NaOH(pH7.4)进行的第3次冲洗的洗脱，表明亲蛤蚌毒素蛋白有降解。这些峰没有进行生物活性测试。
因此可以理解亲蛤蚌毒素蛋白可以结合到固相色谱树脂上，如Pierce的Emphaze生物载体介质AB1。在该柱上蛤蚌毒素可被亲蛤蚌毒素蛋白结合并与其它物质分离(如游离的氚)，然后蛤蚌毒素可用pH5.0的缓冲液从柱上洗脱下来。洗脱的蛤蚌毒素保留生物活性。用酸(如0.5N HCl)处理可能会裂解连接的亲蛤蚌毒素蛋白。处理后的树脂的3H-STX非特异保留作用不明显。
对本领域普通技术人员而言很明显的是：尽管本发明为了说明清楚和便于理解，进行了详细的描述，也可以对上述描述的技术方案和方法的进行一些修改和改变，只要不偏离本说明书中公开的发明观点的范围。
上述引用的参考文献都列在下页，引入作为参考文献。
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Claims (68)

1.一种检测和/或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的方法，包括下列步骤：
1)提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
2)将其与样品接触；
3)测量PSTs与分离的亲蛤蚌毒素蛋白的结合量；以及
4)将结合量与样品中的PSTs的有无或样品中PST浓度相关联。
2.一种如权利要求1所述的方法，其中分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段，偶联到可检测的标记物上以提供标记的亲蛤蚌毒素蛋白。
3.一种如权利要求2所述的方法，其中预定量的标记亲蛤蚌毒素蛋白结合固定的PST，样品中缺失PST时其结合达到预定的程度，但样品中存在PST时达到较少的程度。
4.一种如权利要求3所述的方法，其中标记物选自荧光标记，化学发光标记，胶体金，胶乳微珠和酶标记物。
5.一种如权利要求4所述的方法，其中标记物选自胶体金和有色胶乳微珠以提供可视信号。
6.一种如权利要求5所述的方法，其中PST被印刷到测试条上，并通过标记的亲蛤蚌毒素蛋白与其的结合形成有色的颜色点，产生可视信号。
7.一种如权利要求2所述的方法，其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白包含在以及PST固定在微量滴定板的孔中，用分光光度板读板器测量形成颜色的程度。
8.一种如权利要求7所述的方法，其中PST包被到微量滴定板的孔上。
9.一种如权利要求3或8中所述的方法，其中固定的PST为蛤蚌毒素。
10.一种如权利要求1所述的方法，其中分离的亲蛤蚌毒素蛋白固定到固体支持物上。
11.一种如权利要求10所述的方法，其中固体支持物为测试条。
12.一种如权利要求11所述的方法，其中标记的PST结合到分离的亲蛤蚌毒素蛋白，其浓度达到在样品中缺少PST时其结合达到预定的程度，但当样品中存在PST时结合的程度较小。
13.一种如权利要求12所述的方法，其中PST为蛤蚌毒素。
14.一种如权利要求13所述的方法，其中标记为蛤蚌毒素结合到脂质体上的脂质体封装染料。
15.一种如权利要求14所述的方法，其中脂质体上还有与其结合的生物素。
16.一种如权利要求15所述的方法，其中样品首先通过蛤蚌毒素固定区，然后通过包括抗生物素蛋白的脂质体捕获区进行分析。
17.一种如权利要求1所述的方法，其中用分光光度法测量结合到分离的亲蛤蚌毒素蛋白上的PSTs。
18.一种如权利要求1所述的方法，其中通过检测一旦结合，质量或折射率的变化来测量结合到分离的亲蛤蚌毒素蛋白上的PSTs。
19.一种如权利要求18所述的方法，一种使用表面等离子体共振(SPR)传感器。
20.一种如权利要求1～19中任一项所述的方法，其中分离的亲蛤蚌毒素蛋白为蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白。
21.一种如权利要求20所述的方法，其中分离的亲蛤蚌毒素蛋白来自Ethmostigmus rubripes。
22.一种测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)的方法，包括下列步骤：
(a)用聚阳离子预处理微量滴定过滤板的滤器；
(b)向板孔中加入已知量的包含亲蛤蚌毒素蛋白的标记的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含用可检测标志物表记的蛤蚌毒素结合位点的其片段，以及怀疑包括致瘫痪水生有壳类动物毒素物质的系列稀释液；
(c)将板孵育足够长的时间以使存在的致瘫痪水生有壳类动物毒素与标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合；
(d)通过孔滤器吸出每孔中的内溶物，以除去除了标记的亲蛤蚌毒素蛋白及与其结合的化合物之外的成分；
(e)清洗每孔及滤器以除去残留的未结合的化合物；以及
(f)检测滤器保留的标记的亲蛤蚌毒素蛋白量，
其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白的结合程度当与对照样品相比时，就可以表明样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素的存在量。
23.一种如权利要求22所述的方法，其中样品包括缓冲液，以保持pH在6.5～9的范围内。
24.一种如权利要求23所述的方法，其中样品进一步包括氯化物盐，如氯化钠或氯化钾，浓度可高达500mM。
25.一种如权利要求22～24中任一项所述的方法，其中每孔中的总体积为50～350μl，优选100～200μl，更优选150μl。
26.一种如权利要求22～25中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，在0～30℃下，优选在室温下，孵育30分钟～8小时；优选进行60～120分钟，更优选进行90分钟。
27.一种如权利要求22～26中任一项所述的方法，其中，在步骤(e)中，清洗用与样品pH等同的缓冲溶液进行。
28.一种如权利要求22～27中任一项所述的方法，其中分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白为蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白。
29.一种如权利要求28所述的方法，其中分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白来自Ethmostigmus rubripes。
30.偶联到固体载体上的分离的亲蛤蚌毒素蛋白。
31.用可检测的标记试剂进行标记的分离的亲蛤蚌毒素蛋白。
32.一种测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的试剂盒，包括
(a)微量滴定板；
(b)标记的亲蛤蚌毒素蛋白，包括用可检测的标记物标记的分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
(c)提取缓冲液，用来对待测物质或生物体或组织进行提取；以及任选地
(d)一种富集方法，用于富集提取液中的PSTs或除去可能干扰分析的污染物。
33.一种如权利要求32所述的试剂盒，其中浓缩方法为柱或柱体，包括偶联有分离和纯化亲蛤蚌毒素蛋白的固体支持材料。
34.一种测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的装置，包括：
固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
将样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段接触的装置；
测量样品中包含的PSTs与所述固定亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段结合量的装置；以及
将结合量与样品中PSTs的有无或PST浓度进行关联的方法。
35.一种如权利要求34所述的装置，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白为蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白。
36.一种如权利要求35所述的装置，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白来自Ethmostigmus rubripes。
37.一种如权利要求34～36中任一项所述的装置，包括诊断测试条，其包括固定亲蛤蚌毒素蛋白区。
38.一种如权利要求37所述的装置，进一步包括抗生物素蛋白区，其位置比固定的亲蛤蚌毒素蛋白区，更远离测试条的样品导入端。
39.一种诊断测试条，包括毛细芯，其包括亲蛤蚌毒素蛋白固定其上的区以及远离毛细芯端的结合抗生物素蛋白的区。
40.一种试剂盒，包括如权利要求39定义的诊断测试条，蛤蚌毒素和生物素标记的脂质体封装染料以及，任选地，缓冲溶液。
41.一种用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的生物传感器，包括：
固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点片段；
将样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段接触的装置；
测量样品中包含的PSTs与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段结合量的装置；以及
将结合事件转变成电信号并且将结合量与样品中PSTs的有无或PSTs的浓度相关联的装置。
42.一种如权利要求41所述的生物传感器，其中将结合事件转化成电信号的装置包括可以检测一旦结合蛋白质量变化的装置。
43.一种如权利要求42所述的生物传感器，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白为包含蛤蚌毒素结合的亲蛤蚌毒素蛋白片段，一旦结合可以最佳地表现出质量变化。
44.一种如权利要求41～43中任一项所述的生物传感器，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白为蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白。
45.一种如权利要求44所述的生物传感器，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白来自Ethmostigmus rubripes。
46.一种用于测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的装置，包括：
固定的PST；
将样品与所述固定PST接触的装置；
测量加到样品中的亲蛤蚌毒素蛋白结合的，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段，与所述固定的PST结合的装置；以及
用来关联结合量与PSTs存在或缺失或与样品中PST浓度的方法。
47.一种如权利要求所述46的装置，其中PST为蛤蚌毒素。
48.一种如权利要求所述47的装置，其中蛤蚌毒素被印刷到诊断测试条上。
49.一种蛤蚌毒素印刷在其上的诊断测试条。
50.一种用来测量样品中存在的致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST)量的生物传感器，包括：
固定的PST；
将样品与所述固定PST接触的方法；
测量加到样品中亲蛤蚌毒素蛋白或包含蛤蚌毒素结合位点片段的方法，与所述固定的PST结合的装置；以及
将结合结果转换成电信号以及结合量与PSTs存在或缺失或样品中PST浓度的关联方法。
51.一种如权利要求41～43中任何一项所述的生物传感器，其中固定的PST为蛤蚌毒素。
52.一种纯化无脊椎动物亲蛤蚌毒素蛋白的方法，包括下列步骤：
(a)在包括蛋白酶抑制剂的生理缓冲液中匀浆产生亲蛤蚌毒素蛋白的节肢动物物种个体；
(b)将匀浆物进行低速离心除去细胞碎片；
(c)将从步骤(b)得到的上清进行高速离心；
(d)用硫酸铵从上清中沉淀出亲蛤蚌毒素蛋白。
53.一种如权利要求52所述的方法，进一步包括下列步骤：(e)纯化沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白。
54.一种如权利要求53所述的方法，其中亲蛤蚌毒素蛋白用下列方法纯化：
(i)将沉淀物在pH5.0～6.5进行再溶解并离心除去非亲蛤蚌毒素蛋白分子；
(ii)将从(i)得到的上清与结合亲蛤蚌毒素蛋白的基质例如玻璃纤维聚乙烯亚胺(PEI)支持基质接触；以及
(iii)在高盐条件下从基质上洗脱结合的物质。
55.一种如权利要求54所述的方法，其中亲蛤蚌毒素蛋白用溶解于pH5-9的缓冲液中的、浓度为600mM至饱和的NaCl或KCl洗脱。
56.一种如权利要求52所述的方法，其中亲蛤蚌毒素蛋白用40-60％硫酸铵沉淀。
57.一种如权利要求52～56中任一项所述的方法，其中节肢动物为蜈蚣。
58.一种如权利要求57所述的方法，其中蜈蚣为Ethmostigmus rubripes。
59.用权利要求52～58中任何一项中所述的方法制备的亲蛤蚌毒素蛋白。
60.一种富集，纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素(PSTs)的方法，包括下列步骤：
提供固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
将怀疑包含PST的样品与所述的固定亲蛤蚌毒素蛋白接触足够的时间，使PST结合到固定的亲蛤蚌毒素蛋白上；并且
任选地，从固定的亲蛤蚌毒素蛋白上洗脱结合的PST。
61.一种如权利要求60所述的方法，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白为蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白。
62.一种如权利要求61所述的方法，其中固定的亲蛤蚌毒素蛋白来自Ethmostigmus rubripes。
63.一种如权利要求60～62中任一项所述的方法，其中所述方法用来使水生有壳类动物解毒。
64.一种如权利要求60～62中任一项所述的方法，其中PSTs提取自饮用水。
65.将分离的亲蛤蚌毒素蛋白用于制备亲和材料，用来富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素。
66.一种用来富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素的亲和材料，包括分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含偶联到固相载体上的蛤蚌毒素结合位点的其片段。
67.一种如权利要求66中所述的亲和材料，其中固相载体装填在柱体或柱中。
68.一种如权利要求66～67中任一项所述的亲和材料，其中固相载体选自噁唑酮偶联基质，溴化氰活化基质；环氧活化基质；羧基甲基纤维素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼和环氧乙烷丙烯酸的珠。
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