CN1922310A - 分离分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供组合物及利用金属改性固体载体分离金属或分子如多肽、核苷酸或内毒素的方法。所述金属或分子通过使用本发明改性固体载体从起始物质中分离出来。另外，本发明还提供与所述发明方法相关使用的试剂盒。

Description

分离分子的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2002年10月18日提交的美国临时申请号No.60/419,614的优先权。
关于联邦资助研究或开发的声明
不适用。
发明背景
本发明广泛地涉及组合物和将金属离子或其它靶物质与非靶物质分离的方法，所述靶物质包括但不限于多肽，核酸或内毒素。
发明概述
一方面，本发明包括从起始物质中分离靶物质的方法，所述方法包括将起始物质和选自如下一组的组合物接触：
其中R1是
Figure A2003801015900021Q2
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基(aralkylene)，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体(solid support)的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A20038010159000221
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1；
以在至少靶物质的一部分和所述组合物之间形成复合物。
参考下面的附图和详细的描述，本发明的这些和其它方面将被更好地理解。
这里所引用的每个出版物或专利申请以其全部内容并入参考。在本公开和并入的出版物之间有冲突的情况下，以本公开为准。
附图简述
图1提供了比较血红蛋白，碱性磷酸酶和B-半乳糖苷酶在氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒(图1A)、Q-琼脂糖树脂(图1B)以及DEAE树脂(图1C)上分级分离的图示。
图2是利用氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒分级分离的FluoroTect-Green标记的萤光素酶和血红蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图3A和3B是由3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获的糖基化膜蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图4是利用3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒分离的在无细胞表达体系中表达的膜蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图5是说明3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒捕获细菌细胞的图示。
图6是利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒纯化的组氨酸标记(his-tag)RNase HI的SDS-PAGE凝胶。
图7是比较利用多种金属3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分级分离血红蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图8A是利用氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒后，再利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分级分离的组氨酸标记RNase HI的SDS-PAGE凝胶。图8B是利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒后，再利用氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒分级分离的组氨酸标记萤光素酶的SDS-PAGE凝胶。
图9A是显示考马斯蓝染料结合附着在镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒上的组氨酸标记萤光素酶照片。图9B是显示用增加咪唑的浓度将考马斯蓝染色的组氨酸标记萤光素酶从镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒上洗脱的图示。图9C是比较考马斯蓝染料结合附着于镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的组氨酸标记蛋白和考马斯蓝染料结合附着于其它金属螯合树脂的组氨酸标记蛋白的照片。
图10A显示镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分级分离后荧光标记的组氨酸标记萤光素酶的SDS-PAGE凝胶。图10B显示铜-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分级分离后荧光标记的组氨酸标记BSA的SDS-PAGE凝胶。
图11是利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离的tRNA的SDS-PAGE凝胶。
图12是利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离的来自无细胞表达体系的组氨酸标记蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图13是比较游离tRNA合成酶的酶活性与结合镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的tRNA合成酶的酶活性的图示。
图14显示改造的包括本发明用于多肽纯化和分析的固体载体的移液管头。
图15是显示利用多种金属3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒从兔网织红细胞裂解物中结合和洗脱复合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝胶。
图16A是利用铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒从兔网织红细胞裂解物中结合和洗脱复合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝胶。图16B是显示各个级分蛋白质浓度(Bradford法A595)的图示。
图17A是显示利用铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒从CHO细胞裂解物中结合和洗脱复合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝胶。图17B是显示各个级分蛋白质浓度(Bradford法A595)的图示。
图18A是说明利用铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒从麦胚细胞裂解物中结合和洗脱复合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝胶。图18B是显示各个级分蛋白质浓度(Bradford法A595)的图示。
图19是说明在不同条件下用铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒序贯洗脱蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图20是说明在不同条件下用铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒序贯洗脱蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图21是利用铁(III)或镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离的磷蛋白卵清蛋白SDS-PAGE凝胶。
图22是利用铁(III)或镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒从兔网织红细胞裂解物中分离的磷蛋白SDS-PAGE凝胶。
图23A是利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离的在诱导后不同时间点回收的细菌裂解物的考马斯染色的组氨酸标记蛋白的图片；图23B是诱导后时间函数的细胞生长(OD600测定)和蛋白质浓度(考马斯染色蛋白A595测定)的图示；图23C是样品中纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图24显示利用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离并用BODIPY染色的组氨酸标记蛋白的SDS-PAGE凝胶荧光图像。
发明详述
本发明提供了从起始物质中分离靶物质的组合物和方法。合适的靶物质包括，但不限于金属离子、多肽、核酸、全细胞和细胞膜等。本发明还提供适合用于本发明方法实施的试剂盒。
本发明的组合物和方法在多种应用中是有用的，包括例如混合物中分子的分级分离，从液体中去除金属离子，从细胞悬液中捕获细胞，分离膜或膜蛋白和从混合物中去除不希望的污染蛋白等。如本领域的技术人员所理解的，本发明的组合物和方法可以单独使用或与其它组合物或方法联合使用。
本发明的组合物和方法允许靶物质轻而易举的分离或纯化，因此它们可用于小型化、机械操作以及用于高通量分析。本发明组合物和方法还适用于结构和功能基因组学或蛋白质组学。
本发明组合物包括改性固体载体，包括次氮基三乙酸(NTA)改性固体载体和金属改性固体载体。
本发明方法使用NTA改性固体载体、金属改性固体载体或胺改性固体载体与起始物质中的靶物质如金属离子、分子、亚细胞组分或全细胞形成复合物，或者说实现靶物质如金属离子、分子、亚细胞组分或全细胞与起始物质中的非靶物质分离。
适于制造本发明改性固体载体的合适固体载体包括，但不限于，凝胶或硬的支持材料、琼脂糖、聚丙烯酰胺、纤维素、塑料、多糖、尼龙、聚苯乙烯、乳胶异丁烯酸盐、二氧化硅、氧化铝、电极、膜、及其衍生物。
合适的二氧化硅固体载体包括，但不限于硅氧化物(siliceousoxide)、磁性二氧化硅颗粒、固体二氧化硅如玻璃或硅藻土等等，或二氧化硅材料的组合(参见，例如“preparation of silica discussion inKurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology”，第21卷，第四版，Mary Howe-Grant编辑，John Wiley &Sons出版，1997，第1021页)。如在下面实施例中所讨论的，合适的硅胶可以从厂商如Silicycle(Quebec City，Canada)、J.T.Baker(Phillipsberg，NJ)以及Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商购获得。在下面的实施例中将进一步描述适用于本发明组合物和方法的合适硅胶。其它合适的二氧化硅载体包括结晶或透明二氧化硅，例如石英、透明石英、可控孔度玻璃(controlled pore glass)颗粒以及玻璃纤维。
可以用孔直径、颗粒大小或比表面积来表征硅胶的特征。合适的硅胶具有大约30到大约1000埃的孔直径，大约2到大约300微米的颗粒大小以及大约50m2/g到大约1000m2/g的比表面积。合适的硅胶包括，例如，那些具有大约40埃、大约60埃和大约150埃孔直径的硅胶；那些具有大约2到大约25微米、大约5到大约25微米、大约15微米、大约63到大约200微米和大约75到大约200微米颗粒大小的硅胶；以及那些具有大约300m2/g、大约500m2/g、大约550m2/g、大约675m2/g和大约750m2/g比表面积的硅胶。
合适地，本发明的固体载体可以包括磁性二氧化硅颗粒。磁性二氧化硅颗粒含有一个用水合硅氧化物吸附表面(例如有硅烷醇或Si-OH基团的表面)涂布的超顺磁(superparamagnetic)核心。合适的可商购获得的磁性二氧化硅颗粒包括可从Promega Corporation(Madison，WJ)获得的MagneSilTM颗粒。在美国专利号No.6,296,937中描述了适于用作本发明载体的磁性二氧化硅颗粒的制备。
合适的纤维素载体包括，但不局限于，硝酸纤维素和醋酸纤维素。
合适的膜包括，但不局限于，用二氧化硅浸渍的玻璃纤维膜。
合适的氧化铝固体载体包括，但不局限于，大约150目和58埃的Brockmann氧化铝。
如本文所述，可以形成胺改性固体载体，例如，使用包括至少一个游离羟基的固体载体以便当所述固体载体与氨基硅烷化合物接触时，氨基硅烷化合物的硅原子通过至少一个硅烷醇键共价结合所述固体载体以形成胺改性固体载体。
氨基硅烷化合物通过厂商如United Chemical Technologies，Inc.(Bristol，PA)可以商购获得。合适的氨基硅烷化合物包括
Figure A20038010159000281
其中X是可达20个碳原子的亚烷基，所述亚烷基可以是饱和的、未饱和的、支链的、线性的或环状的，如亚甲基、乙烯基丙烯、壬烯，或X是可达20个碳原子的亚芳烷基，其中烃基部分可以是饱和的、未饱和的、支链的、线性的或环状的，或X是可达20个碳原子的亚芳基，以及其中X可以是如下面关于烃基所限定的未取代或取代的；
R1是烃基，或取代的烃基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键，键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；以及
RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3独立地选自烃基，取代的烃基或氢原子；合适地，RN1、RN2和RN3可以独立地是最长链可达6个碳原子的烃基，最长链可达6个碳原子的取代的烃基，或氢原子。“最长链”是IUPAC术语中所用的烃基的最长链。
本文所用的术语“烃基”是指可达20个碳原子的烃基基团(alkylgroup)(即烷烃、烯烃或炔烃)，所述烃基可以是饱和的、未饱和的、支链的、线性的或环状的；或可达20个碳原子的芳烃基，其中烷基部分可以是饱和的、未饱和的、支链的、线性的或环状的；或可达20个碳原子的芳基。合适地，所述烃基具有2到15个碳原子，或5到10个碳原子。“取代的烃基”是指本文所定义的其中至少一个碳原子被氧、硫或氮原子取代的烃基。所述取代基可以是，例如氧基(oxo)、烷氧基、烷氧羰基、羟基、酯、硫醚、氨基、烷基胺或氨基甲酰。
用于本发明实施的合适氨基硅烷化合物的例子包括，但不限于，氨丙基硅烷、丙基乙二胺硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺以及N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亚乙基三胺。
如本文所述，NTA改性固体载体可以通过接触有游离-NH2基团的固体载体以在次氮基三乙酸和所述载体的胺基间形成酰胺键。次氮基三乙酸作为能与多价金属离子形成稳定复合物的螯合剂。
任何固体载体都可用于生产NTA改性固体载体，如果其具有能被改性的胺基基团，或能使该固体载体含有可改性的胺基基团。用于制备NTA改性固体载体的合适固体载体具有多个游离NH2基团。本领域技术人员通过化学修饰这些固体载体表面能将游离胺官能团(functionality)附着在固体载体上。参见，例如Greg T.Hermason，A.Krishna Mallia，Paul K.Smith，Immobilized Affinity Legand Techniques，Academic Press(1992)。另外，具有能结合NTA以形成本发明NTA改性固体载体的游离NH2基团的合适固体载体可以商购获得。这些包括但不限于，Sigma-Aldrich Inc.(St Louis，MO)出售的基于琼脂糖的载体；International Dynamics Corporation(Longwood，FL)出售的基于乳胶的载体；Bangs Laboratories Inc.(Fishers，IN)出售的基于聚苯乙烯的载体；Spherotech(Libertyville，Ill)；以及Dynal Biotech(LakeSuccess，NY)。
另一方面，本发明提供金属改性固体载体。如本文所述，可以通过将上文所述的NTA改性固体载体与金属离子溶液接触以形成金属改性固体载体来生产金属改性固体载体。所述的金属离子溶液可以由金属离子盐组成，其中所述盐包括，但不限于，氯化物、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、乙酰丙酮化物、溴化物、氟化物、碘化物、硝酸盐和草酸盐。金属浓度可以是从小于大约10-6M到大约1M。典型地，溶液中的金属离子浓度可以在大约0.1M到大约1M范围内。可以想象所述的金属离子溶液可以仅由一个金属或不同金属的混合物组成。合适地，在金属离子和NTA改性固体载体之间可以形成四配位复合物。参见，例如New multidentate ligands.XV.Chelatingtendencies of diglycine-N，N-diacetic acid，triglycine-N，N-diacetic acidand tetraglycine-N，N-diacetic acid，Inorganic Chemistry(1974)，13(3)，550-9。
“金属离子”用于金属改性固体载体的上下文中，它的意思是指在+1和+6之间氧化态的任何金属。合适地，所述金属可以是镍、铜、钴、铁、锌或镓。另外，认为下述金属离子是适合用于本发明的：铁(III)、铜(II)、钴(II)、镍(II)、锌(II)、铈(III)、镁(II)、钙(II)、镓(III)、铬(III)、铟(III)、镧(III)、镥(III)、钪(III)、铊(III)、镱(III)、钍(IV)、铀酸盐(II)、银(I)、金(I)和铜(I)。本领域技术人员根据待分离的物质能够选择合适的金属。另外，可以想象用螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)可以将结合的金属离子从金属改性固体载体上剥离下来，因此允许NTA改性固体载体的再生。
本发明改性固体载体可用于多种方法中，包括，但不限于本发明实施例或说明书的其它部分所述的方法。如本领域技术人员理解的，根据应用的具体要求，可以以多种不同的形式提供或使用本发明的载体。例如，所述改性固体载体可以用于柱子，旋转柱，微量滴定板孔，掺入或形成滤膜、作为可植入哺乳动物体内的装置，或放于转移工具中(如移液管头)。
用于本发明方法的起始物质可以包括含有或疑有靶物质的任何物质，以及可以任选包括非靶物质。起始物质包括直接从生物来源(例如细胞培养物、用过的培养基或细胞裂解物)或环境来源(如水或空气)获得的物质以及被加工或部分纯化的物质。起始物质可以包括任何形式的(如溶液或悬浮液)靶或非靶物质。起始物质可以来自真核或原核来源，包括培养的真核或原核细胞，也可以包括重组的或天然存在的生物分子。起始物质可以包括，例如，粗细胞裂解物，包括用于表达体系的裂解物，包括但不限于无细胞裂解物如大肠杆菌(E.coli)S-30、麦胚和兔网织红细胞裂解物。起始物质可以是分泌了靶物质的用过的细菌或细胞培养基。合适的起始物质可以包括蛋白质的复合混合物。起始物质可以包括细菌、酵母、真菌或病毒物质、植物或动物物质，包括其产物(如全血、血浆、血清、乳汁等)。起始物质还可包括液体如水、空气或尿。
在本发明的方法中，起始物质和本发明改性固体载体接触以在靶物质和所述载体之间形成复合物。为简便起见，将接触的起始物质从颗粒中机械分离而回收的物质称作“流出物(flow through)”，无论分离是通过什么手段实现的。
本发明的方法取决于起始物质中靶或非靶物质与本发明组合物形成复合物的能力而实现具体效果，即靶物质与起始物质或其组分间空间关系的变化。对于靶和非靶物质，可以将该效果描述为去除、分开、分离、纯化、分级分离等。这些术语并没有限制本发明之意。本领域的技术人员可以理解这些术语是相对的，而不是绝对的，可以替换使用。
在一些应用中，为实现将不希望的靶物质从起始物质中去除(例如从液体如水中将潜在有毒的金属离子去除)可以使用本发明方法。在其它情况中，本发明的目的是从包括靶物质和非靶物质的复合混合物中分离或纯化特定靶物质，或分级分离靶和非靶物质。
本发明方法分离或纯化的靶物质如多肽适用于许多下游应用。可以通过如下任一种技术对分离的靶物质进行进一步的分离、定性或定量，这些技术包括但不限于双向凝胶电泳、质谱、X-线衍射、核磁共振、蛋白质芯片(基于阵列或基于矩阵)以及酵母双杂交系统。
本文所用术语多肽包括通过肽键相连的三个或多个氨基酸单位的聚合体，也可以包括蛋白质。多肽可以包括单链，或两个或多个同源或异源多肽链，因为在天然蛋白质情况下，该蛋白质有多个亚基，或在多种多肽情况下，这些多肽彼此相互作用或形成复合物(例如抗原—抗体复合物，或有一个蛋白质做为底物的酶)。多肽可以包括变性蛋白质或天然蛋白质。合适的多肽可以包括金属结合基团或作为电子密度供体或受体的表面活性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或天冬氨酸)。其表面上有大于三个组氨酸或半胱氨酸残基的多肽尤其适用于根据本发明方法的纯化。所述组氨酸或半胱氨酸可以是天然存在的组氨酸(例如在血红蛋白、肌红蛋白和其它含血红素蛋白中发现的)，也可以通过本领域技术人员公知的遗传工程技术加到多肽上。
合适的多肽包括，但不限于金属蛋白、激素、受体、酶、储藏多肽、血液多肽、抗体、膜多肽、磷酸化多肽、胞质多肽、分泌多肽、细胞器多肽、多肽—核苷酸复合物、多蛋白复合物以及通过本领域技术人员公知的遗传工程技术产生的突变多肽。
靶物质包括靶多肽可以被修饰或设计包括一个“亲和标记”以便促进靶物质与缺乏亲和标记的非靶物质的分离。可以通过本领域公知的化学或重组DNA方法形成亲和标记靶多肽。合适地，通过将编码靶多肽的多核苷酸序列遗传工程化而将亲和标记加到N-或C-末端，或N-和C-末端以使其包括亲和标记。也可以将编码合适亲和标记的序列工程化以便亲和标记位于靶多肽的内部位点。合适的亲和标记可以包括，例如组氨酸(His)标记(例如多组氨酸尾)和金属结合域。适用于本发明的其它亲和标记可以包括多精氨酸标记、Strep-tag、钙调蛋白结合肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、泛素或生物素/抗生物素蛋白。
下面实施例描述了具体组氨酸标记蛋白的分离(例如组氨酸萤光素酶，His-RNaseHI和His-甲硫氨酰tRNA转移酶)。发现本发明方法在分离其它的组氨酸标记蛋白(His-endostatin、His-Tau、His-Karyopherin-α2、His-泛素、His-骨桥蛋白以及His-calcinuerin Bα蛋白)中是有效的(数据未显示)。本领域技术人员将理解这些方法可用于纯化任何组氨酸标记蛋白。
可以想象本发明方法可以用于将任何感兴趣的靶分子与起始物质中的非靶分子分离，如果所述靶分子相对于起始物质中存在的至少一种非靶分子具有与本发明的组合物形成复合物的差异倾向。
NTA改性固体载体可以用于从水、空气、血液或其它感兴趣的液体中去除有毒的金属。例如，NTA改性固体可以用于从工业废水和/或从用于人类消费的用水中去除和/或回收潜在有害或有毒的金属，如铝、砷、铋、锑、过剩的钙、过剩的铁、金、锌、镁、汞、镉、铅、铜和银。尤其有关的是能从家用管道设备的管道和焊接接头处沥滤的铅盐。NTA改性固体载体可以用于与螯合剂相似的方式从水中去除重金属离子(如美国专利号No.4,500,494)、使用螯合化合物联合过滤捕获金属离子以分析重金属离子(如美国专利号No.4,080,171)、纯化水(如美国专利号No.4,348,328)或与树脂联合从液体中回收重金属离子(如美国专利号No.4,220,726)。
本发明NTA改性固体载体在多种其它想要从液体中提取、灭活或去除金属的应用中也是有用的，例如从血浆中去除钙使血浆变为血清，或揩干实验室中溅出的放射性金属离子。NTA改性固体载体还可用于从铅或汞中毒的个体中去除有毒的金属。
已报道干预或耗竭某些金属离子对于健康状态是有用的。因此，本发明NTA改性固体载体可作为诊断工具用于检测和提取指示疾病状态或对某一疾病具有易患性的金属相关分子。
所述NTA改性固体载体可以以与例如美国专利号No.6,428,807所述的常规方法相似的方式用于制备螯合免疫刺激复合物。
金属改性固体载体可以用于将靶物质(例如多肽或核酸)与起始物质中的非靶物质分离。例如，金属改性载体可以用于将组氨酸标记多肽与起始物质中存在的其它分子分离。可以任选地调整起始物质使其包括浓度从大约0到大约60mM的咪唑。使用任何合适的缓冲液从载体上将组氨酸标记蛋白洗脱下来。合适的缓冲液可以含有浓度从大约60mM到1M的咪唑。其它合适的洗脱缓冲液可以是pH比感兴趣的蛋白质的等电点(pI)低的那些洗脱缓冲液，合适的是低于大约pH5。其它合适的洗脱缓冲液包括含有竞争螯合剂如EDTA或EGTA、三氟乙酸、L-组氨酸、二肽、组氨酸肽或聚合体、或咪唑样聚合体的缓冲液。
金属改性固体载体可以单独使用或与其它纯化方法包括，例如利用氨改性固体载体联合使用。
金属改性固体载体还可以用于从起始物质中去除内毒素。合适地，术语内毒素是指与某些种类的革兰氏阴性细菌外膜相关的脂多糖复合物，这些革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟球菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)或任何其它产生内毒素的致病细菌。
金属改性固体载体可以用于分离或鉴定低丰度蛋白、膜蛋白或磷酸化蛋白。
金属改性载体可以用于分离核酸，如WO/02/42398A2中对其它IMAC树脂的描述。
如下面实施例所述，发现本发明金属改性固体载体以及其它含有固定化金属螯合剂的固体载体(例如可以从Qiagen商购获得的镍琼脂糖珠)允许使用可检测标记检测与所述固体载体复合的蛋白质。在这些实施例中，发现考马斯、荧光素或Bodipy定量地与固定到所述固体载体上的蛋白质复合。可以想象任何合适的染料或荧光标记都可以用于检测与含有固定化金属螯合剂的固体载体复合的蛋白质。合适可检测标记的其它例子包括，但不限于remazol亮蓝R、曙红异硫氰酸盐、活性橙、普施安(procion)红、曙红碘乙酰胺、活性黑5、活性橙14、孔雀绿异硫氰酸盐、罗丹明异硫氰酸盐、remasol亮紫5R、罗丹明和香豆素。
金属改性固体载体还可以用于分离或评价多肽—多肽复合物或相互作用；多肽功能的筛选；分离抗体、抗原或抗体—抗原复合物；定量亲和标记多肽；疾病的诊断筛选；抗体筛选；药物拮抗剂和激动剂筛选；报告基因检测；制备多肽表达文库、从细胞制备多肽文库；制备多肽微阵列；筛选遗传工程化酶；共分离相互作用分子(如辅因子)；降低在体内内毒素的浓度；组织剖析(profiling)；或细胞剖析。
如在下面实施例所详述的，发现胺改性固体载体在多种应用中是有用的。胺改性固体载体可以使血红蛋白易于与起始物质中存在的其它物质分离、易于膜小泡的分离、膜蛋白的纯化以及细胞的浓缩和纯化。
胺改性固体载体可用于从起始物质中去除血红蛋白。如下面实施例所述，血红蛋白不结合胺改性二氧化硅磁性颗粒。血红蛋白与其它蛋白质的分离在血红蛋白存在的任何应用中是有用的。例如，通过将裂解物与胺改性固体载体接触来去除血红蛋白可以增强网织红细胞裂解物表达体系中表达的蛋白质的纯化。去除血红蛋白在采用荧光法检测的应用中尤其是有用的，因为血红蛋白通过降低信噪比干扰荧光标记蛋白质的检测。除了促进血红蛋白的去除，本发明方法还可用于去除含血红素基团的其它蛋白质，如肌红蛋白。
为随后的鉴定和定性，可使用胺改性固体载体分离膜相关蛋白质。在下面的实施例中，膜蛋白或膜相关蛋白质在含微粒体膜小泡的无细胞裂解物中表达并且通过裂解物与胺改性固体载体接触而使膜和载体形成复合物从而将表达的膜蛋白或膜相关蛋白质与存在于裂解物中的其它物质分离。该方法可用于筛选体外表达的蛋白质收集物以易于膜蛋白的分离和鉴定，并且该方法适用于这些蛋白质的高通量筛选。从实施例可以看出，所述方法可任选地采用使膜蛋白易于回收的非离子去垢剂。
如下面实施例所述，胺改性固体载体可与其它纯化方法如金属改性固体载体联合使用以纯化感兴趣的分子，包括变性或非变性条件下的亲和标记多肽。所进行的使用胺改性固体载体的纯化步骤相对于纯化方案中的其它步骤的顺序可以改变，这取决于靶物质和可能存在的任何非靶物质的性质。
可以想象结合到胺改性固体载体上的特异靶蛋白随后可在对所述特定靶蛋白特异的适当条件下被洗脱。合适的分级分离条件对于本领域研究人员是公知的。如实施例中所示，含有组氨酸残基如组氨酸标记的靶蛋白不结合胺改性固体载体。可以想象本发明胺改性固体载体可以使遗传工程化而含有降低与胺改性固体载体结合的部分的靶蛋白分离更容易，这些部分包括但不限于金属结合部分或表面活性氨基酸。取决于所用的分离组氨酸标记靶多肽的技术，未结合的组氨酸标记多肽可以存在于流出物中。未结合的组氨酸标记多肽可以用金属改性固体载体进一步纯化。
下面的非限制性实施例完全是试图例证性说明本发明。
实施例
实施例1
制备金属改性的3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基二氧化硅磁性颗粒。
a)制备3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒。
3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒按如下方法制备。一份50ml的3-氨丙基三甲氧基硅烷加入到搅拌的甲醇溶液(900ml)中，之后加入水(50ml)。将该混合物加入100g磁性二氧化硅颗粒(MP-50，W.R.Grace，Columbia，MD)。通过间断搅动使这些颗粒在室温保持悬浮状态4小时。去除残留的甲醇/硅烷/水溶液，载体颗粒用3×1.2L的水漂洗然后重悬在1L甲醇中。通过过滤收集3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒并真空干燥。元素分析确定3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒的成分：C，0.75；H，0.64；N，0.30。
b)制备3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。
通过以下步骤制备3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒：首先将如上所述制备的3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒(100g)悬浮在N，N-二甲基乙酰胺(600ml)中，加入三乙胺(31ml，210mM)并完全混合。加入400ml含200mM 2，6-二酮-N-羧甲基-吗啉(根据美国专利号No.3,621,018制备)的N，N-二甲基乙酰胺，所获得的混合物室温下保持悬浮状态4小时。去除未反应的N，N-二甲基乙酰胺/酐/三乙胺溶液，并用3×1.2L的水漂洗颗粒。元素分析确定3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基改性的磁性二氧化硅颗粒成分：C，1.06；H，0.61；N，0.17。
c)制备镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。
镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒通过如下步骤制备：将如上所述制备的3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒100g悬浮在250mM氯化镍(II)溶液(1L)中，室温4小时。去除过多的镍溶液并将所获得的固体载体用水漂洗5次。
通过使用起始颗粒而不是来自W.R.Grace的磁性二氧化硅颗粒制备与上面实施例1(a)-(c)中所述颗粒相似的改性颗粒。步骤(a)-(c)所用的其它硅胶可购自Sigma-Aldrich Corp(St.Louis，MO)(23，681-0，23，682-9和23，684-5)；Silicyle Inc.(Quebec，CA)(S10030M，10040M，100300T，S10040T和R10030M)；或J.T.Baker(Philipsburg，NJ)(7314-02和7315-20)。商购的硅胶含有直径在大约5到大约500微米范围和孔径大小在大约40到大约1000埃范围的颗粒。
d)制备钴(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。
钴(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒通过如下步骤制备：将如上所述制备的100mg 3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒悬浮在250mM氯化钴(II)溶液中，室温保持2分钟。去除过多的钴溶液并将所获得的磁性二氧化硅颗粒用水漂洗5次。
e)制备铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。
铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒通过如下步骤制备：将如上所述制备的100mg 3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒悬浮在CuCl2(250mM)溶液中，室温保持2分钟。去除铜溶液并将所获得的磁性二氧化硅颗粒用水漂洗3次。
f)制备锌(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。
锌(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒通过如下步骤制备：将如上所述制备的100mg 3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒悬浮在ZnCl2(250mM)溶液中，室温保持2分钟。去除锌溶液并将所获得的磁性二氧化硅颗粒用水洗3次。
实施例2
制备金属改性的3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基硅胶。
(a)制备3-氨丙基改性的硅胶
将3-氨丙基三甲氧基硅烷(125ml)加入到搅拌的甲醇溶液(2000ml)中，之后加入水(125ml)。将该混合物加入250g硅胶(S10040T，1000埃，Silicycle，Inc.，Quebec，Canada)，然后将所获得的混合物在室温保持悬浮状态4小时。树脂沉降残留的甲醇/硅烷/水溶液后将该溶液轻轻倒出，之后用水(3×2.5L)漂洗颗粒并重悬在2L甲醇中。通过过滤收集氨基硅烷改性固体载体并真空干燥。元素分析确定氨丙基改性固体载体的成分：C，0.46；H，0.30；N，0.19。
(b)制备3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基硅胶。
将如上所述制备的3-氨丙基改性固体载体(100g)悬浮在N，N-二甲基乙酰胺(100ml)中，并将三乙胺(31ml，210mM)加入该混合物。将悬浮液彻底混合，然后加入400ml含200mM 2，6-二酮-N-羧甲基吗啉(根据美国专利号No.3,621,018制备，该文全部并入本文)的N，N-二甲基乙酰胺，并将获得的混合物室温下保持悬浮状态4小时。去除未反应的N，N-二甲基乙酰胺/酐/三乙胺溶液，并用4×1.2L的水漂洗固体载体。元素分析确定3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基固体载体成分：C，0.94；H，0.32；N，0.28。
(c)制备镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基硅胶
将一部分如上所述制备的3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基固体载体悬浮在250mM氯化镍(II)溶液中，室温4小时。去除过多的镍溶液并将获得的固体载体用水洗5次。
实施例3
制备丙基乙二胺改性的磁性二氧化硅颗粒
将N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(2ml)加入到搅拌的含有磁性二氧化硅颗粒(2g)的95％甲醇(8ml)中。获得的混合物在室温保持悬浮状态4小时。去除残留的甲醇/二氧化硅溶液然后用甲醇(5×40mL)洗颗粒并真空干燥。元素分析确定氨丙基乙二胺改性的二氧化硅磁性固体载体的成分：C，0.97；H，0.70；N，0.45。
实施例4
制备丙基乙二胺改性的硅胶。
将N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(2ml)加入到搅拌的含二氧化硅颗粒(1.0g，Davisil，644级硅胶，100-200目，孔径大小150A)的95％甲醇溶液(8ml)中。获得的混合物在室温保持悬浮状态4小时。去除残留的甲醇/二氧化硅溶液，然后用甲醇(5×40mL)洗颗粒并真空干燥。元素分析确定氨丙基乙二胺改性的二氧化硅固体载体的成分：C，5.82；H，1.49；N，2.44。
本发明前面的描述仅是示例性的，其目的是说明和解释本发明。对于本领域技术人员明显的是未偏离本发明精神实质和范围的改变和修改是可能的。下面的权利要求应该认为是包含所有这样的改变和修改。
实施例5
利用3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒去除血红蛋白和分级分离靶蛋白。
评价3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒从掺加β-半乳糖苷酶和小牛小肠碱性磷酸酶的兔网织红细胞裂解物中分级分离蛋白质和去除血红蛋白的能力，以Q-琼脂糖(BioRad，Foster City，CA)和DEAE-琼脂糖(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)做为平行对照。制备一包含未处理的兔网织红细胞裂解物(100μl)、1ml 20mM Tris缓冲液(pH8.3)、8μl原液β-半乳糖苷酶(Promega Corp.)、40μl小牛小肠碱性磷酸酶(Promega Corp.)的样品。在1.5ml Eppendorf管中，将一等份分装样品(400μl)加入如上所述制备的预平衡3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒(40mg)中并在室温下混合。通过将所述管放在磁力表架(magnetic stand)上将所述颗粒与上清液(或流出物)分开，然后移去上清液并保留。所述颗粒用400μl 200mM Tris缓冲液(pH8.3)洗两次。通过序贯应用20mM Pipes缓冲液(pH6.7)、20mM柠檬酸钠(pH5.0)，之后两次应用含有1M醋酸铵的20mM Tris缓冲液(pH8.3)将结合蛋白(β-半乳糖苷酶和小牛小肠碱性磷酸酶)洗脱下来。采用如上所述用于分离3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒的分离程序来评价在Q-琼脂糖或DEAE-琼脂糖上血红蛋白的去除和蛋白质的分级分离。
通过将一等份上清液用水1∶20稀释后在415nm处测定吸光度来测定每个上清液中血红蛋白的含量。
通过如下步骤检测β-半乳糖苷酶的活性。用超纯(nanopure)水1∶1稀释Promega 2×测定缓冲液[E203A，14041201]，然后将490μl缓冲液加到1.5ml塑料微量离心管(microfuge tube)中。将10μl测试级分加入管中。作为对照，10μl 20mM Tris缓冲液pH8.3代替测试级分加入。这些管子在室温下孵育45分钟。将0.5ml等份碳酸钠溶液[PromegaE202A，14679601]加入每管中，然后使用对照管作为空白在420nm处读溶液的吸光度。
通过如下的步骤检测磷酸酶活性。通过将48ml 100mM Tris缓冲液pH8.3与对硝基苯磷酸溶液混合制备对硝基苯磷酸饱和溶液的磷酸酶测定试剂，其中通过将固体p-NPP(Sigma Chemical Co.)悬浮在100％乙醇中而制得对硝基苯磷酸溶液，其用量是如果该物质都溶解将产生20mM溶液。将900μl饱和溶液加到1.5ml微量离心管中，然后将2μl所述级分加入管中。作为对照，2μl 20mM Tris pH8.3缓冲液代替测试级分加入。这些管子在37℃孵育120分钟，用对照溶液将分光光度计调零后在420nm处测定吸光度。
结果以图示的形式显示在图1A(氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒)、图1B(Q-琼脂糖)和图1C(DEAE琼脂糖)中。当氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒用于分级分离起始物质中的蛋白质时，发现大部分血红蛋白在未结合的流出物级分中(图1A)。相反，用Q-琼脂糖和DEAE琼脂糖，最大百分比的血红蛋白是与树脂结合并被20mM Pipes缓冲液(pH6.7)洗脱，大量血红蛋白被20mM柠檬酸钠(pH5.0)洗脱。通过使用不同的洗脱缓冲液，从氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒上洗脱结合蛋白实现了β-半乳糖苷酶和小牛小肠碱性磷酸酶的分级分离(图1A)。
实施例6
使用3-氨丙基二氧化硅磁性颗粒将FluoroTect标记的萤光素酶与血红蛋白分离
使用3-氨丙基改性的磁性二氧化硅颗粒从兔网织红细胞裂解物中分级分离蛋白质。根据厂商说明书指导，使用FluoroTect-Green体外翻译标记系统(Promega Corp.，Madison，WI)在兔网织红细胞裂解物中表达FluoroTect标记的萤光素酶。翻译后，在1.5ml Eppendorf管中，将20μl翻译反应混合物与20mM MOPS缓冲液(pH6.8)预平衡的5mg氨丙基改性的二氧化硅磁性颗粒(100mg/ml)混合。在室温混合使颗粒重悬。通过将管子放在磁力表架上将颗粒和上清液分开，然后移去上清液并保留用于随后的分析。将颗粒用1ml 20mM MOPS缓冲液(pH6.8)洗两次。用2M醋酸铵(pH6.5)或1M NaCl处理颗粒，然后收集纯化级分并用SDS-PAGE分析(图2)。关于图2，如下顺序加样凝胶：泳道M，蛋白质分子量标记(Promega Corp.)；泳道1和2，含有10μl反应混合物+40μl缓冲液的对照；泳道4和5，醋酸铵(pH6.5)洗脱物；泳道6-9，1M NaCl洗脱物。
图2所示凝胶泳道1和2与泳道4和5相比，可见萤光素酶被回收在用醋酸铵(pH 6.5)洗脱的级分，血红蛋白显著降低，表明大量血红蛋白在流出物级分出现而没有结合到颗粒上。
实施例7
使用3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获用于体外翻译的膜小泡
体外蛋白质合成：使用兔网织红细胞裂解物(Promega Corp.，Madison，WI)在30℃翻译核心糖基化对照mRNA(啤酒酵母(S.cerevisiae)α-因子)60分钟。按表1所总结步骤制备的反应混合物(25μl)含有17.5μl网织红细胞裂解物、0.5μl RNA酶抑制剂(RNasin)(40单位/μl)、0.5μl 1mM氨基酸(不含甲硫氨酸)、20μCi L-[35S]甲硫氨酸(Amersham)、2μl的0.1μg/μl核心糖基化对照RNA以及任选地或犬微粒体膜(Promega Corp.)或从Hela细胞系(Hela-S3)(BiovestInternational Inc.，Englewood Cliffs，NJ)制备的Hela微粒体膜小泡(Promega Corp.制备)。在4-20％Novex凝胶上通过SDS-PAGE、转移到一张PVDF上，然后曝光磷光成像仪(PhosphorImager)暗盒16小时来分析反应物。
表1
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  兔网织红细胞裂解物 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5
  水   2.5   1.5   1.5   3.5   3.5   3.5   2.5   2.5   3.5   3.5
  RNA酶抑制剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
  氨基酸(-Met) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
  RNA模板*   -   1.0   1.0   1.0   1.0   -   1.0   1.0   1.0   1.0
  35S Met   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0
  CMM**   2.0   2.0   2.0   -   -
  HMM***   1.0   1.0   1.0   -   -
  颗粒   +   +   -   +   -   +   +   -   +   -
*糖基化对照mRNA(啤酒酵母α-因子)
**犬微粒体膜
***Hela微粒体膜
等份3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒(60mg/ml)加入如表1所示的25μl翻译反应混合物中。4×(10μl)SDS缓冲液加到～20-25μl上清液(流出物)中，热变性并用SDS-PAGE检测。颗粒用1ml 20mM MOPS缓冲液(pH 6.8)洗一次并用25μl含1M NaCl的MOPS缓冲液(pH 6.8)洗脱蛋白质。用10μl 4×SDS缓冲液混合洗脱物，加热变性并用SDS-PAGE检测。将10μl含1M NaCl的MOPS缓冲液(pH 6.8)和10μl 4×SDS缓冲液加入氨丙基磁性二氧化硅颗粒中，加热变性并用SDS-PAGE检测。作为对照，未与氨丙基磁性二氧化硅颗粒接触的一等份反应混合物(3μl)用20μl 20mM MOPS(pH6.8)和10μl 4×SDS缓冲液处理，加热变性并用SDS-PAGE检测(图3)。这一实验结果显示使用3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒可以分离和分析体外表达和翻译后修饰的蛋白质。
实施例8
膜蛋白的鉴定和纯化
在Promega公司用Hela细胞系(Hela-S3)(Biovest InternationalInc.)制备的Hela微粒体膜小泡存在的情况下，使用兔网织红细胞裂解物(Promega公司，Madison，WI)在50μl反应体系中翻译啤酒酵母α-因子mRNA 60分钟。翻译反应体系(每50μl)含有35.0μl网织红细胞裂解物、1.0μl RNA酶抑制剂(40单位/μl)、1.0μl 1mM氨基酸(不含甲硫氨酸)、20μCi L-[35S]甲硫氨酸(Amersham Biosciences，Sunnyvale，加利福尼亚)、2μl的0.1μg/μl核心糖基化对照RNA以及Hela微粒体膜小泡。反应混合物的一部分用4×SDS缓冲液处理，加热变性，然后在4-20％Novex凝胶上通过SDS-PAGE分析。将凝胶转移到一张PVDF上，然后曝光磷光成像仪暗盒16小时进行分析(图4)。
下面是多种反应混合物在SDS-PAGE分离前所经历的可选择处理的总结。
(1)翻译反应之后，将反应混合物以1∶1比例(即10μl混合物比10μl颗粒)或1∶1.7比例(即30μl混合物比50μl颗粒)加到3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒中。颗粒混合物用1ml 20mM MOPS缓冲液洗一次。颗粒用20μl含1N NaCl的20mM MOPS缓冲液和10μl 4×SDS缓冲液处理。加热变性颗粒混合物，然后通过SDS-PAGE分析上清液，如图4泳道1A、1B和2A、2B所示。
(2)翻译反应之后，3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获后用蛋白酶K进行有限蛋白酶解。将反应混合物以1∶1比例(即10μl混合物比10μl颗粒)或1∶1.2比例(即40μl混合物比50μl颗粒)加到3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒中。颗粒用1ml 20mM MOPS缓冲液洗一次，然后用10μl 50mM Tris/CaCl2缓冲液和2μl 50mM CaCl2处理。混合物在冰上孵育10分钟。孵育后，加入蛋白酶K(1mg/ml 1μl)或者可替换地加入蛋白酶K(1mg/ml 1μl)和Triton X-100(10％ 1μl)并将所获得的混合物在冰上孵育1小时。通过加入2μl 2mg/ml PMSF终止蛋白酶K反应。另外加入5μl 20mM MOPS缓冲液和10μl 4×SDS。加热变性反应混合物并用SDS-PAGE分析。当所述反应用40μl混合物时，下述试剂也增加4倍：Tris/CaCl2缓冲液、50mM CaCl2、1mg/mL蛋白酶K、TritonX-100(10％ 1μl)、2mg/mL PMSF。取少量的反应混合物用于凝胶分析。然后10μl 4×SDS缓冲液加入反应颗粒中。加热变性颗粒混合物，并用SDS-PAGE分析上清液，如图4泳道3A、3B和4A、4B所示或如图4使用Triton X-100溶解膜蛋白的泳道7A、7B和8A、8B所示。
(3)翻译反应之后，蛋白酶K处理后进行3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获膜小泡。将反应混合物(即10μl)加到2μl的50mM CaCl2中。混合物冰上孵育10分钟。将蛋白酶K(1mg/ml 1μl)或蛋白酶K(1mg/ml1μl)和Triton X-100(10％ 1μl)加入反应混合物中，并在冰上孵育1小时。通过加入2μl的2mg/ml PMSF终止反应。将3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒(10μl)加入混合物中。允许颗粒悬浮液沉降，并用1ml 20mMMOPS洗颗粒一次。为洗脱膜结合蛋白，20μl含1N NaCl的20mMMOPS缓冲液加入颗粒中。为准备SDS-PAGE分析，10μl 4×SDS缓冲液加入混合物中。之后，加热变性所述混合物并用SDS-PAGE分析。当反应使用40μl混合物时，下述试剂也增加4×体积：Tris/CaCl2缓冲液、50mM CaCl2、1mg/mL蛋白酶K、Triton X-100(10％ 1μl)、2mg/mL PMSF。取少量的反应混合物用于凝胶分析。将反应颗粒与10μl 4×SDS缓冲液组合，加热变性颗粒混合物，然后用SDS-PAGE分析上清液，如图4泳道5A、5B和6A、6B所示或图4使用Triton X-100溶解膜蛋白的泳道9A、9B和10A、10B所示。
如下所述加样图4所示凝胶：
泳道M：标记
泳道1：RRL+mRNA
泳道1A：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道1B：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(30μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道2：RRL+mRNA+HMM
泳道2A：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道2B：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(30μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道3A：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道3B：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅捕获---蛋白酶K处理(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道4A：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性颗粒捕获---蛋白酶K处理(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道4B：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道5A：RRL+mRNA---蛋白酶K处理---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl氨基二氧化硅磁性颗粒)
泳道5B：RRL+mRNA---蛋白酶K处理---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道6A：RRL+mRNA+HMM---蛋白酶K处理---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道6B：RRL+mRNA+HMM---蛋白酶K处理---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道7A：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理+Triton X-100(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道7B：RRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理+Triton X-100(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道8A：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理+Triton X-100(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道8B：RRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获---蛋白酶K处理+Triton X-100(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道9A：RRL+mRNA---蛋白酶K处理+Triton X-100---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道9B：RRL+mRNA---蛋白酶K处理+Triton X-100---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道10A：RRL+mRNA+HMM---蛋白酶K处理+TritonX-100---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(10μl反应混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道10B：RRL+mRNA+HMM---蛋白酶K处理+TritonX-100---3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒捕获(40μl反应混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒)
泳道11：RRL
RRL：兔网织红细胞裂解物
HMM：Hela微粒体膜制备物
这一实验结果显示使用3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒可快速鉴定和定性无细胞蛋白表达体系中表达的膜蛋白。
实施例9
3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒对细菌细胞的捕获
细菌细胞(大肠杆菌JM109)在37℃Luria肉汤中培养过夜。将培养物悬液(每份500μl)转移分装在Eppendorff管中。通过将150μl的100％异丙醇和350μl无菌双蒸水加入所述管中而制备用15％异丙醇处理的样品。通过将300μl 100％异丙醇及200μl无菌双蒸水和细胞混合而制备用30％异丙醇处理的样品。通过将150μl 100％异丙醇、200μl5M NaCl及150μl无菌双蒸水和细胞混合而制备用15％异丙醇和1MNaCl处理的样品。通过将300μl 100％异丙醇及200μl 5M NaCl和细胞混合而制备用30％异丙醇和1M NaCl处理的样品。将3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒(10mg)加入每管中并混合1分钟。在对照管中不加入颗粒。通过将管子放在磁铁上以捕获磁性二氧化硅颗粒从而将上清液中未结合的细胞移去，并测定上清液的OD600。结果总结在图5中，该图显示了下面各组的未结合细胞的OD600：(1)不含颗粒的对照组；(2)双蒸水处理的培养物；(3)1M NaCl处理的培养物；(4)15％异丙醇处理的培养物；(5)30％异丙醇处理的培养物；(6)15％异丙醇和1MNaCl处理的培养物；及(7)30％异丙醇和1M NaCl处理的培养物。
3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒能在1分钟或更短的时间内从培养物中直接结合细菌细胞。加入异丙醇和氯化钠能增加所述颗粒结合的细胞数。用15％或30％异丙醇处理的培养物上清液OD600值比未处理细胞的值低得多，这表明3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒在结合用异丙醇处理的细胞时是有效的。
实施例10
使用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离多肽
制备细胞裂解物
表达组氨酸标记蛋白的细菌细胞(大肠杆菌JM109)在50ml含有四环素的LB培养基中37℃生长过夜。这些细胞在新鲜的含有四环素的LB培养基中1∶100稀释，并在37℃生长直到OD600在0.4-0.6之间。加入终浓度为1mM的IPTG，诱导细胞至少3小时。离心沉淀细胞并重悬在100μl含有100mM Hepes(pH7.5)和10mM咪唑的结合缓冲液中。超声破碎细胞并离心去除未破碎的细胞和细胞碎片。之后，上清液用于下面所述的纯化实验。在一些情况下，不是用超声破碎细胞，而是使用通常用于裂解细菌细胞的多种去垢剂裂解来破坏细胞。这些去垢剂的使用不干扰蛋白质的分离。
非变性条件下多肽的纯化
将如上所述制备的镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒(3mg)和超声破碎的含有组氨酸标记蛋白的细胞组合，并通过移液管吹打或振荡约1～5分钟混合。将管置于磁力表架上以将颗粒与上清液分开，并移去上清液。用150μl结合缓冲液洗颗粒3次。用洗脱缓冲液(100mM Hepes pH7.5和0.1～0.5M咪唑)洗脱结合到颗粒上的组氨酸标记蛋白。使用Pierce蛋白质测定系统测量蛋白质浓度，并用SDS-PAGE分析所述蛋白质(图6)。
图6显示使用所述颗粒将his-RNaseHI与细胞裂解物中的其它蛋白质分离。泳道1，未接触所述颗粒的裂解物；泳道2，接触所述颗粒的裂解物的流出物；泳道3，用0.5M咪唑从所述颗粒上洗脱的蛋白质；及泳道4，大小标记。
在变性条件下蛋白质的纯化
超声或用裂解缓冲液裂解细胞前，将尿素或盐酸胍加入细胞，终浓度为6M。将30μl镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒加入细胞裂解物中。通过移液管吹打或振荡约1～5分钟混合颗粒。将管置于磁力表架上以将颗粒和上清液分开，并移去上清液。颗粒用含6M尿素或盐酸胍的结合缓冲液洗3次(每次150μl)。用洗脱缓冲液(100mM Hepes pH7.5，0.1～0.5M咪唑和6M尿素或盐酸胍)洗脱结合到颗粒上的组氨酸标记蛋白。用SDS-PAGE或功能性分析分析纯化的蛋白质。使用Pierce蛋白质测定系统测量蛋白质浓度。6M尿素或盐酸胍的存在并不干扰组氨酸标记蛋白的结合或洗脱(数据未显示)。
实施例11
使用镍/锌/铜/钴(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒纯化和分离血红蛋白
如上所述方法制备镍3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒、铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒、钴3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒和锌3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。用25μl纯化的组氨酸萤光素酶蛋白掺入兔网织红细胞裂解物(Promega公司)(200μl)。将50μl等份裂解物分别加入含有10mg镍、铜、锌或钴3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的四个分开的管中。通过移液管吹打或振荡将裂解物和颗粒混合1～5分钟。将管置于磁力表架上以将颗粒和上清液分开，并移去上清液。颗粒用含100mM Hepes(pH7.5)的结合缓冲液洗3次(每次150μl)。蛋白用100μl洗脱缓冲液(100mM Hepes pH7.5和0.1或0.5M咪唑)洗脱并用SDS-PAGE分析(图7)。结果表明血红蛋白和镍、铜、锌或钴3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒结合，以及这些颗粒能用于将血红蛋白从不结合这些颗粒的蛋白中分离出来。
实施例12
使用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒和3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒将靶多肽和非靶多肽分离
(a)通过用氨丙基改性固体载体预处理含靶混合物纯化靶蛋白。
通过在含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的结合缓冲液中超声表达His-RNaseHI的大肠杆菌JM109细胞来制备细胞裂解物(100μl)。裂解物与3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒(50mg)组合，用移液管吹打10次并孵育2分钟。上清液与3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒分开，然后与3mg镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合并用移液管吹打(10×)2分钟。将主要含有非靶蛋白的上清液移去并弃除。将镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基颗粒用150μl含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的缓冲液洗3次。然后用含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和0.5M咪唑的洗脱缓冲液(100μl)洗脱His-RNaseHI。通过凝胶电泳分析样品(图8)。关于图8A，泳道4含有标记，泳道5含有未分级分离的细菌裂解物，泳道6含有来自3-氨丙基磁性颗粒的流出物溶液，泳道7含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的流出物溶液，泳道8含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的0.5M咪唑洗脱物，泳道9含有来自3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒的流出物级分，泳道10含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的流出物，以及泳道11含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的0.5M咪唑洗脱物。
(b)通过用氨丙基改性固体载体后处理含靶混合物纯化靶蛋白。
通过在含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的结合溶液中超声JM109细胞来制备表达组氨酸标记萤光素酶的大肠杆菌JM109细胞裂解物。通过用移液管吹打(10×)2分钟将裂解物(100μl)与3mg镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合。使用磁铁将颗粒与结合溶液分开，然后用150μl结合溶液洗3次。通过加入100μl的20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和0.5M咪唑pH7.5洗脱靶蛋白。通过与3mg 3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒混合2分钟并将含靶上清液与颗粒分开来从残余的背景多肽中进一步纯化洗脱的靶蛋白。通过凝胶电泳分析样品(图8B)。关于图8B，泳道1含有未分级分离的细菌裂解物，泳道2含有用3-氨丙基磁性颗粒处理的流出物溶液，泳道3含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的流出物以及泳道4含有来自镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒洗脱的蛋白的3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒流出物级分。
这些结果表明3-氨丙基磁性二氧化硅颗粒，与镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒联合使用，有利于污染蛋白质的去除。
实施例13
使用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒定量多肽的方法
将表达组氨酸萤光素酶(100μl)的细菌等份裂解物放入3个Eppendorf管中，并与50μl如上所述制备的镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合，用移液管吹打1～2分钟。不加裂解物的颗粒作为对照。颗粒用1ml的100mM Hepes(pH7.5)漂洗。将一等份(100μl)含有1％考马斯蓝的100mM Hepes(pH7.5)加入漂洗的颗粒或对照颗粒中。颗粒用100mM Hepes pH7.5充分漂洗直到洗液是清亮的。用0.1M咪唑、0.2M咪唑或0.5M咪唑洗脱组氨酸标记萤光素酶，将收集的洗脱物拍照(图9A)。在595nm波长处用分光光度计测定吸光度(图9B)。回收的标记蛋白量和用于洗脱蛋白质的咪唑浓度成正相关。在平行实验中，用镍琼脂糖珠(Qiagen)代替相同μl的镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒，标记的蛋白用0.5M咪唑洗脱，并且将洗脱物拍照(图9C)。
在类似的实验中，表达组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的JM109细胞生长到OD600并用1mM IPTG诱导。在诱导后三小时内每半小时收集等份培养物，并用于制备如前节所述处理的裂解物。图23A是洗脱的考马斯蓝染色的蛋白照片，表明标记蛋白质的回收和诱导后时间成正相关。图23B是描绘作为诱导后时间函数的细胞生长(OD600测定)和蛋白质浓度(通过考马斯染色蛋白A595测定)的图示。图23C是样品中纯化蛋白质的SDS-PAGE凝胶。
纯化的组氨酸标记蛋白与镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒接触并用BODIPY染料处理。通过SDS-PAGE分离蛋白质/颗粒，并用荧光成像仪扫描显像(图24)。关于图24，泳道1含有组氨酸萤火虫萤光素酶(62kDa)；泳道2含有组氨酸-Renilla萤光素酶(36kDa)；泳道3含有组氨酸-RNA酶抑制剂(45kDa)；以及泳道4含有组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶(76kDa)。
该实验描述了使用染料颗粒内标记蛋白质来定量蛋白质的方法。咪唑干扰蛋白质测定法如Bradford或BCA法，使用这些方法测定蛋白质浓度前通过透析必须将咪唑去除。相反，因为咪唑不干扰本发明所述方法，所以不需要先透析样品就可以直接评价样品中的蛋白浓度。
实施例14
检测荧光标记多肽的方法
如上所述制备铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒或镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。颗粒用100mM Hepes(pH7.5)洗一次。将等份(100μl)表达组氨酸-萤光素酶的细菌裂解物或含BSA(10mg/ml)的100mM Hepes(pH7.5)放入不同的Eppendorff管中。每管裂解物中加入等份50μl 10％(w/v)镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒，以及每管BSA中加入50μl 10％(w/v)铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒，然后移液管吹打混合1-2分钟。用1ml 100mM pH7.5 Hepes洗颗粒。然后，将100μl荧光素或Bodipy溶于含有60％乙腈的100mM Hepes(pH7.5)中并加入漂洗的颗粒以及对照颗粒中。颗粒用100mM Hepes(pH7.5)洗三次或直至游离、未结合的荧光素或Bodipy被去除。用0.5M咪唑洗脱结合多肽。通过将样品在SDS-PAGE上跑胶之后在荧光成像仪(Fluoroimager)上UV检测来检测多肽。从图10A可以看出，用Bodipy(泳道1)或荧光素(泳道2)标记的组氨酸萤光素酶是可检测的。从图10B可以看出，用Bodipy(泳道1)或荧光素(泳道2)标记的BSA是可检测的。
这些结果表明当蛋白质附着在所述颗粒上时，蛋白质可以用荧光染料标记。这有利于从样品中去除游离染料，并提供了多肽的快速检测和定量。
实施例15
使用镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒分离tRNA合成酶
在S-30(Promega公司)体外翻译反应中表达编码组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的质粒DNA。反应混合物含有8μg质粒DNA、5μgBodipy f-Met tRNA、氨基酸(25μl)、S-30预混合物(100μl)和S-30提取物(75μl)。在37℃进行反应1小时。每个反应混合物与3mg镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒组合并用移液管吹打混合。颗粒用100mM Hepes(pH7.5)洗三次。结合所述颗粒的物质用10mM醋酸铵洗脱。作为对照，颗粒与反应混合物接触并漂洗，但不用醋酸铵处理。醋酸铵洗脱物和对照颗粒用100μl蛋白变性缓冲液处理，并在70℃放置5分钟，然后通过SDS-PAGE分析(图11)。关于图11，泳道1含有未处理的裂解物；泳道2含有施用于颗粒的裂解物的流出物；泳道3含有醋酸铵洗脱物；以及泳道4含有未用醋酸铵处理的颗粒。这些结果表明tRNA牢固地结合所述颗粒以及使用含10mM醋酸铵的洗脱缓冲液可以将部分所述tRNA洗脱下来。
实施例16
无细胞表达的组氨酸标记GFP的纯化
根据厂商说明书指导，使用快速翻译系统RT500(RapidTranslation System RT500)(Roche)在0.5ml T7-S30反应体积中用15μgDNA模板(pGFP-HIS)进行表达组氨酸标记GFP的原核细胞体外转录/翻译反应，并用RTS 500装置(Roche)在30℃孵育20小时。当使用时，加入Fluoro TectTM或Bodipy-fMet-tRNA，其浓度为1μg/50μlT7-S30反应体积。
通过将反应混合物与镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合纯化组氨酸标记GFP。用100mM Hepes(pH7.5)和10mM咪唑洗颗粒两次。然后颗粒用30％甲醇洗并用含50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水洗脱。
将样品(5μl，或是漂洗或洗脱样品时，10μl)和20μl 4×SDS样品缓冲液混合并在4-20％Novex Tris/甘氨酸凝胶上跑胶，用Gel-Code染色并用数字式相机捕获荧光图像(图12)。关于图12，泳道1和10含有大小标记，泳道2含有无DNA的S-30裂解物，泳道3含有有质粒DNA的S-30裂解物，泳道4含有有质粒DNA和Bodipy-fMet tRNA的S-30裂解物，泳道5含有有质粒DNA的S-30裂解物，泳道4含有有质粒DNA和fluorotect tRNA的S-30裂解物，泳道6含有用0.1％三氟乙酸水洗脱的无质粒DNA的S-30裂解物，以及泳道7-9含有用含50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水洗脱的有质粒DNA的S-30裂解物。
结果表明镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒可用于纯化在无细胞表达体系中表达的组氨酸标记蛋白质。
实施例17
颗粒内tRNA合成酶活性的功能测定。
表达组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的大肠杆菌菌株JM109在50ml含四环素的LB培养基中37℃生长过夜。将一等份15ml的过夜培养物加到3L LB培养物中并在37℃生长。当培养物达到OD600在0.4-0.6之间时，将IPTG加入，终浓度为1mM并诱导细胞至少3小时。细胞离心沉淀，并重悬在10ml 10mM Hepes缓冲液(pH8.0)和5mM MgCl2(缓冲液A)中。将样品超声并离心沉淀。将含有组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的上清液与10ml镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合，并在4℃孵育1小时。颗粒用缓冲液A洗五次，然后用于如下所述的结合tRNA合成酶的功能测定。用于该检测的未结合的纯化tRNA合成酶通过用0.5M咪唑从颗粒样品中洗脱结合蛋白以及透析洗脱物去除咪唑而获得。
结合的tRNA活性通过在37℃孵育下述物质15分钟来测定，所述物质为：84μl如前节所述制备的含有结合的甲硫氨酰tRNA合成酶的颗粒、14.4μl叶酸(0.01M)、8.0μl35S Met、7.2μl(2M)NaCl、12.0μl(1mM)Met、144.0μl(1M)Hepes(pH8.0)、14.4μl(0.1M)MgCl2、57.6μl(0.1M)ATP、14.4μl(0.01M)CTP、14.4μl(0.1M)DTT以及469.6μl无菌双蒸水。作为对照包括的是如上所述制备的游离组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶。加入一等份120μl 10％TCA并将混合物在冰上孵育15分钟。样品通过0.2μm的玻璃微量滴定滤膜(Whatman)过滤，用10％TCA洗，然后用10％乙醇洗。干燥滤膜并用闪烁计数器计数。结果显示在图13中，其示出结合的组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶活性接近游离、纯化的组氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶活性。
实施例18
使用修饰的移液管头制备用于质谱仪分析的蛋白质
使用Promega 200 Barrier Tip 200μl塑料移液管头(Promega公司，Madison，WI)制备用于质谱仪分析的移液管头。将50-100μl镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒或铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒装载移液管头，所述颗粒是通过使用直径从100μm到150μm范围的二氧化硅(Sigma-Aldrich公司，Milwaukee，WI)如上所述将二氧化硅改性而制备的。将颗粒引入移液管头中(图14)。使用前，将移液管头中的颗粒用1ml含10mM咪唑的100mM Hepes缓冲液(pH7.5)洗三次。移液管头可以包括具有10μl到1ml容量范围内的塑料或玻璃移液管头。可以根据样品体积或待纯化蛋白质量调整移液管头中树脂量。
蛋白质纯化/分级分离
为分析复合蛋白，将5μl兔网织红细胞裂解物(Promega)用195μl100mM Hepes(pH7.5)混合。将50μl样品转移到如上所述制备的含有100μl铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的移液管头中。样品通过用移液管将样品吹入和吸出移液管头5或6次而混合。允许蛋白结合颗粒1-2分钟。颗粒用1ml 100mM Hepes(pH7.5)洗三次。结合蛋白用100μl含0.1％TFA的水洗脱。洗脱的样品在快速真空仪(Speed Vac)中干燥并在质谱仪(HT Laboratories)中分析。
为分离组氨酸标记蛋白质，将含有组氨酸标记蛋白质的50μl细菌裂解物转移到含有100μl镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的移液管头中。通过移液管出入吹打至少5或6次将颗粒和样品混合。颗粒用1ml结合缓冲液洗三次。蛋白用100μl含0.1％TFA的水洗脱。洗脱样品在快速真空仪中干燥并在质谱仪(HTLaboratories)中分析。
实施例19
使用固定化金属螯合色谱法(IMAC)进行多肽的序贯多向分级分离和分离
如上所述制备铜(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒、钴3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒和锌3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。通过将1ml等份的10％3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒置于磁力表架上以移去液体并将1ml含250mM硝酸镓(III)的水或1ml含250mM硫酸铁(III)的水加入颗粒中而制备镓3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒和铁3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒。通过移液管吹打将颗粒和金属溶液充分混合。通过置于磁力表架上将颗粒和金属溶液分开并去除金属溶液。另一1ml等份的金属溶液和每管中的颗粒混合，孵育2分钟，然后通过置于磁力表架上而去除金属溶液。颗粒用1ml MilliQ水洗四次，然后用100mM Hepes(pH7.5)洗一次。如下所述进行蛋白质的分级分离。
复合蛋白混合物的结合和洗脱
等份兔网织红细胞裂解物(5μl)(Promega公司)用195μl 100mMHepes(pH7.5)稀释。稀释裂解物与100μl 3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒或与镍、钴、铜、锌、铁或镓3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒在Eppendorf管中通过移液管吹打1-2分钟混合。然后将管子置于磁铁上，移去上清液并用1ml 100mM Hepes(pH7.5)洗颗粒三次。用0.5M咪唑将结合蛋白从颗粒上洗脱下来，并通过SDS-PAGE分析(图15)。泳道1，大小标记；泳道2，未分级分离的兔网织红细胞裂解物；泳道3-9，分别来自3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒，镍、钴、铜、锌、铁(III)或镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的流出物级分；泳道10-16，分别来自3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒，镍、钴、铜、锌、铁(III)或镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒的咪唑洗脱物。这些结果表明在所用的条件下钴和铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒相对牢固地结合兔网织红细胞裂解物中的大多数蛋白质。
1到20μl兔网织红细胞裂解物与铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒组合并如上所述操作(图16A和16B)。泳道1，大小标记；泳道2，未分级分离的兔网织红细胞裂解物；泳道3-6，分别来自3、5、10或20μl裂解物的流出物级分，在铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒上分级分离；泳道7-10，在铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒上来自3、5、10或20μl裂解物的咪唑洗脱物。每个级分的蛋白质浓度用Bradford方法测定。图16B显示作为分级分离裂解物体积函数的流出物或洗脱物的吸光度(595nm)。
通过将8×106细胞悬浮在1ml 100mM Hepes(pH7.5)中并冻溶破碎细胞来制备CHO细胞裂解物。将细胞离心，然后保留上清液。每个实验使用一等份100μl上清液。如对兔网织红细胞裂解物的说明，进行结合、漂洗、洗脱和分析。结果显示在图17中。关于图17A，泳道1含有未分级分离的CHO细胞裂解物；泳道4含有蛋白质分子量标记；泳道2、3、5和6含有分别来自3、5、10或20的流出物；泳道7-9含有来自3、5或10μl CHO裂解物的咪唑洗脱物。
另外，还使用了麦胚裂解物(Promega)用于结合研究。50μl麦胚裂解物加入50μl 100mM Hepes(pH7.5)缓冲液中，用于本实验。如对兔网织红细胞裂解物的说明进行结合、漂洗、洗脱和分析。结果示于图18。
蛋白质的序贯多向分离
用195μl 100mM Hepes(pH7.5)稀释等份兔网织红细胞裂解物(5μl)(Promega公司)。通过在Eppendorf管中用移液管吹打1-2分钟将稀释的裂解物与100μl铜3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒混合。然后将管子放置在磁铁上，移去上清液并用1ml100mM Hepes(pH7.5)洗颗粒3次。通过用1、5、10、20和50％乙腈序贯处理颗粒来洗脱蛋白质。然后，用双蒸水处理颗粒，之后用0.1和1％三氟乙酸(TFA)洗脱。通过SDS-PAGE分析所有这些样品。结果显示在图19中。
在一分开的实验中，首先用100、200、500或1000mM咪唑洗脱蛋白质，然后用pH8.5、9.5、10.5和12.5的缓冲液洗脱相同颗粒。使用SDS-PAGE分析样品，结果显示在图20中。
实施例20
磷蛋白的分离
如上所述制备的铁(III)和镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒用100mM Hepes(pH7.5)平衡。
制备含有10mg/ml卵清蛋白(Sigma)的100mM Hepes(pH7.5)溶液。等份(100μl)溶液加入铁(III)和镓(III)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒中，并用移液管吹打充分混合。包括镍(II)3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒和非荷电3-[[[双(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅颗粒作为对照。结合后，颗粒用100mM Hepes(pH7.5)缓冲液洗三次。结合蛋白用2％氢氧化铵洗脱。样品用SDS-PAGE分析(图21)。平行实验中，使用兔网织红细胞(用100mM Hepes(pH7.5)1∶1稀释)并通过SDS-PAGE分析各级分(图21)。
实施例21
筛选膜蛋白表达文库
使用如上实施例7和8所述的分离膜蛋白方法筛选膜蛋白表达文库。在犬或HeLa微粒体膜存在的情况下，在96孔板中使用cDNA克隆库(pool)(每库50-100个克隆)作为小规模转录/翻译反应的模板以产生蛋白质。将胺改性的二氧化硅磁性颗粒加入反应混合物中捕获膜小泡和任何相关膜蛋白。
本发明的前述描述是示例性的，其目的是说明和解释本发明。对于本领域的技术人员明显的是未偏离本发明的精神实质和范围的改变和修改是可能的。下面的权利要求应该认为包含这些改变和修改。

Claims (48)

1.从起始物质中分离靶物质的方法，包括：
(a)将起始物质与选自如下一组的一种组合物接触以在至少靶物质的一部分和所述组合物之间形成复合物，所述的组为：
Figure A2003801015900002C1
其中R1是
Figure A2003801015900002C2
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900002C3
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
2.权利要求1的方法，其中X是-(CH2)3-，R4是H，以及M+是Ni(II)。
3.权利要求1的方法，还包括：
(b)漂洗步骤(a)的复合物；以及
(c)洗脱靶物质。
4.权利要求1的方法，其中靶物质选自由多肽、多核苷酸和内毒素组成的组。
5.权利要求1的方法，其中靶物质是多肽。
6.权利要求5的方法，其中所述多肽包含一个亲和标记。
7.权利要求6的方法，其中所述亲和标记包含多组氨酸标记。
8.权利要求5的方法，其中所述多肽包含一个可检测标记。
9.权利要求8的方法，其中可检测标记选自荧光团和染料或其组合组成的组。
10.将靶物质与起始物质中非靶物质分离的方法，所述方法包括：
(a)将起始物质与一种组合物在适合组合物和非靶物质之间形成复合物的条件下接触，所述组合物包括：
Figure A2003801015900003C1
其中X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R1是烃基或取代的烃基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；以及
RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3独立地选自具有可达六碳主链的烃基，具有可达六碳主链的取代的烃基，或氢原子；
(b)收集含有靶物质的流出物；
(c)将步骤(b)的靶物质与另一组合物在适合于载体和靶物质之间形成复合物的条件下接触，所述的另一组合物选自如下一组：
Figure A2003801015900004C1
其中R1是
Figure A2003801015900004C2
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900005C1
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
11.权利要求10的方法，其中所述固体载体选自由二氧化硅和磁性二氧化硅颗粒组成的组。
12.权利要求10的方法，其中步骤(c)的载体可逆结合靶物质。
13.权利要求10的方法，其中靶物质选自由多肽、核苷酸和内毒素组成的组。
14.从起始物质中分离膜相关蛋白的方法，所述方法包括
(a)将起始物质和一种组合物在适合所述膜和组合物之间形成复合物的条件下接触，其中所述起始物质包括一种含有微粒体膜小泡的体外表达系统，并且其中所述组合物包括：
Figure A2003801015900005C2
其中X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R1是烃基或取代的烃基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；以及
RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3独立地选自烃基，取代的烃基或氢原子。
15.权利要求14的方法，其中RN1、RN2和RN3独立地选自如下组成的组：最长链可达6个碳原子的烃基，最长链可达6个碳原子的取代的烃基以及氢原子。
16.权利要求14的方法，还包括将步骤(a)的复合物和非离子去污剂接触。
17.将靶物质与起始物质中非靶物质分离的方法，包括：
(a)将起始物质和一种组合物接触以在靶物质和组合物之间形成复合物，其中所述组合物包括：
其中X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R1是烃基或取代的烃基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；以及
RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3独立地选自具有可达六碳主链的烃基，具有可达六碳主链的取代的烃基，或氢原子；
其中至少非靶物质的一部分不与所述组合物形成复合物，其中所述非靶物质包括含有血红素辅基的多肽。
18.权利要求17的方法，其中RN1、RN2和RN3独立地选自如下一组：最长链可达6个碳原子的烃基，最长链可达6个碳原子的取代的烃基以及氢原子。
19.权利要求17的方法，其中非靶物质选自由血红蛋白和肌红蛋白组成的组。
20.将靶物质和起始物质中的非靶物质分离的试剂盒，所述试剂盒包括一种组合物，所述组合物包括选自如下一组：
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
21.权利要求20的试剂盒，其中X是-(CH2)3-，R4是H，以及M+是Ni(II)。
22.权利要求20的试剂盒，还包括至少结合缓冲液，漂洗缓冲液和洗脱缓冲液之一。
23.减少液体中金属离子的方法，所述方法包括：
(a)将液体和一种组合物接触以在金属离子和组合物间形成复合物，所述组合物包括：
Figure A2003801015900008C2
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；以及
n包括整数≥1；
和
Figure A2003801015900009C1
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
24.权利要求23的方法，其中所述组合物是
Figure A2003801015900009C2
其中R1是
X是-(CH2)3-；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是氢原子；以及
n包括整数≥1。
25.从起始物质中去除细胞的方法，所述方法包括：
(a)将起始物质和一种组合物在适合于细胞和组合物之间形成复合物的条件下接触，所述组合物包括：
Figure A2003801015900010C1
其中X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R1是烃基或取代的烃基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；以及
RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3独立地选自烃基、取代的烃基或氢原子。
26.权利要求25的方法，其中RN1、RN2和RN3独立地选自由最长链可达6个碳原子的烃基，最长链可达6个碳原子的取代的烃基以及氢原子组成的组。
27.权利要求25的方法，其中RN1、RN2和RN3独立地选自最长链可达6个碳原子的烃基，最长链可达6个碳原子的取代的烃基以及氢原子。
28.权利要求25的方法，其中所述条件包括存在浓度至少约1％(v/v)的甲醇、乙醇或异丙醇。
29.权利要求25的方法，其中所述条件包括存在浓度至少约15％(v/v)的异丙醇。
30.权利要求25的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
31.检测起始物质中蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)将起始物质与一种包括固体载体的组合物接触以在蛋白质和组合物之间形成复合物，所述固体载体包括一种固定化金属螯合剂；
(b)将步骤(a)的复合物与复合蛋白的可检测标记接触以形成标记的蛋白复合物；
(c)漂洗载体以去除未复合的标记；
(d)检测标记的蛋白复合物。
32.权利要求31的方法，还包括：
(e)检测复合的标记；以及
(f)通过将步骤(e)的复合标记的量与一已知量的标记蛋白复合物相关联而确定所述蛋白质的浓度。
33.权利要求31的方法，其中所述金属改性固体载体选自如下一组：
Figure A2003801015900011C1
其中R1是
Figure A2003801015900011C2
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
34.权利要求31的方法，其中所述可检测标记选自由荧光团和染料，或其组合组成的组。
35.从起始物质中分离核酸的方法：
(a)将起始物质和一种组合物在适合的条件下接触以在核酸和组合物之间形成复合物，所述组合物选自如下一组：
Figure A2003801015900012C2
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900013C2
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
36.权利要求35的方法，还包括：
(b)洗脱步骤(a)的核酸。
37.权利要求35的方法，其中所述核酸包括tRNA。
38.权利要求35的方法，其中所述金属离子是镍。
39.测定起始物质中酶活性的方法，所述酶能催化底物转化为产物，所述方法包括：
(a)将起始物质与一种组合物接触以在酶和组合物之间形成复合物，所述组合物选择如下组成的组
Figure A2003801015900014C1
其中R1是
Figure A2003801015900014C2
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1；
(b)在合适的反应条件下将步骤(a)的复合物与所述酶的底物接触；以及
(c)检测底物的减少或产物的增加。
40.权利要求39的方法，其中所述酶包括多组氨酸标记。
41.从起始物质分离磷蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将起始物质和一种组合物接触以在磷蛋白和组合物之间形成复合物，所述组合物选自如下组成的组：
Figure A2003801015900015C1
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900016C1
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1；
其中所述金属离子选自由铁(III)或镓(III)组成的组。
42.用于从起始物质中分离磷蛋白的试剂盒，其包含一种选自如下一组的组合物：
Figure A2003801015900016C2
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900017C1
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1；
其中所述金属离子选自由铁(III)和镓(III)组成的组。
43.权利要求42的方法，还包括至少结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液之一。
44.用于纯化蛋白质的装置，所述装置含有一种置于装置内的组合物，所述组合物选自如下一组：
其中R1是
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
Figure A2003801015900018C1
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1。
45.权利要求44的装置，其中所述装置包括移液管头。
46.从起始物质中分离靶物质的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求44的装置。
47.权利要求46的试剂盒，还包括至少结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液之一。
48.从含有至少两种不同类型多肽的起始物质中序贯分级分离多肽的方法，所述方法包括：
(a)将起始物质和一种组合物接触以在多肽和组合物之间形成复合物，所述组合物选自如下一组
Figure A2003801015900018C2
其中R1是
Figure A2003801015900019C1
X是取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R2和R3独立地选自R1、烃基、取代的烃基、卤素原子、氢原子、羟基、硫醇、胺、键合所述固体载体的硅烷醇键、键合另一个硅烷配体的键或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3独立地选自烃基或取代的烃基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；以及
n是整数≥1；
和
其中X是取代的或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚芳烷基，或取代或未取代的亚芳基；
R4是烃基，取代的烃基或氢原子；
M+是金属离子；
n是整数≥1；以及
m是0或1；
其中所述金属离子选自由铜和钴组成的组，以在所述多肽和所述组合物之间形成复合物；以及
(b)通过将所述复合物和实现选自如下一组效果的至少一种洗脱缓冲液接触来序贯洗脱多肽，所述的组为：改变pH值、改变至少一种盐的浓度、提供有机溶剂、改变离子条件、改变疏水条件以及提供螯合剂，或其组合。
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