CN1882697A - 样品制备方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从生物样品、环境样品或化学样品中分离和/或检测靶的改进的方法、成分和装置。
Description
相关申请:
本申请要求2003年8月12日提交的美国专利申请No.60/494702的优先权,其公开的内容在此以其全文引为参考。
政府支持
本发明全部或部分得到了研究和工程防卫董事会(DefenseDirevtorate of Research and Engineering)的支持Lincoln合同号F19628-95-C-0002。政府对本发明有确定无疑的权利。
发明背景
生物学、化学和环境研究经常需要从非均一群体的材料中分离出特定的靶。通常情况下,特定靶的分离及其进一步分析受到以下因素的阻碍,包括(a)材料的非均一起始混合物中靶的浓度非常低,(b)存在降解靶的试剂,(c)存在干扰靶的分离的试剂,以及(d)存在干扰分离后的靶的分析的试剂。最有利的方法和成分可以便利从含有非靶材料的非均一混合物的广范围的液体或固体样品中分离出低浓度的靶。这样的方法和成分还可以被改性或与现有的方法结合使用以帮助维持靶的完整性(例如防止其降解或污染),和/或抑制将干扰靶的进一步分析的试剂(例如干扰DNA样品的PCR分析的试剂,干扰蛋白样品的质谱分析的试剂,或干扰细菌或病毒的细胞学分析的试剂)的活性。
在细胞生物学、分子生物学、化学、毒理学和药理学等领域的进展已经涌现了各种各样的分析生物材料、化学材料和环境材料的技术的进展,这些材料包括但不限于DNA、RNA、蛋白、细菌细胞和孢子(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)、病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)、小的有机分子和大的化学化合物。但是,许多有力的分析工具的有效应用经常因为不能将所需的靶材料与样品中包含的非均一群体的材料分离而受到阻碍。本发明提供了促进从环境、生物和化学样品中分离和/或鉴定靶的方法、成分和装置。
发明概述
本发明提供了可以用于从非均一试剂混合物中分离和/或鉴定靶的方法、成分和装置。靶的分离便于靶的进一步分析和鉴定,这些靶可以是DNA、RNA、蛋白、细菌细胞或孢子、病毒、小的有机分子或大的化学化合物。本发明在法医、医学、环境、工业、公共卫生和反生物恐怖主义领域有广泛的应用,适合用于从广泛范围的气体、液体和固体样品中分离靶。
第一方面,本发明提供了改进的从非均一样品中分离靶的方法。在一个实施方案中,该方法包括将含有所需的靶的样品与能够以更高亲和性与靶结合的基材相接触,该基材与靶的亲和性高于基材与非靶材料的亲和性。在另一个实施方案中,基材的表面用改性剂包被,以便进一步增加基材对一种或多种特定靶的亲和性。在另一个实施方案中,基材用一种或多种本文公开的含胺改性剂包被。使用包被有一种或多种简单改性剂的磁性或非磁性基材,对于依赖于使用与特定靶具有免疫反应性的抗体包被的珠子来分离或检测靶的分离技术来说,是一种巨大的改进。本文公开的简单改性剂与抗体包被珠子相比不仅更便宜和更容易生产,而且具有更普遍的应用性,并且不需要鉴定和生产与每种可能的所需靶具有免疫反应性的抗体。这种对可能的靶的更多信息的需要对于目前可用的技术的通用性和性价比来说是极大的限制。
靶可以是DNA、RNA、蛋白、细菌细胞或孢子、病毒、小的有机分子或化学化合物。此外,靶DNA、RNA或蛋白可以来自于人类或非人类的动物、植物、细菌、病毒、真菌或原生动物。本发明预料单独使用本方法,或与以前公开的SNAP方法结合使用,用于抑制核酸降解或核酸样品污染的条件下用抑制靶核酸进一步分析的试剂来分离和分析核酸。
在使用这两种方法中任一种分离靶之后,可以使用细胞生物学、分子生物学、化学或毒理学的常规技术对靶进行进一步分析。所用的具体技术可以基于靶进行选择,本领域的专业技术人员可以容易地选择出适合的技术。在一个实施方案中,靶是从特定的生物或环境样品中获得的DNA,DNA的进一步分析可以包括DNA的PCR分析。DNA可以是人类、动物、细菌、植物、真菌、原生动物或病毒来源的,这依赖于技术的具体应用。在另一个实施方案中,靶是从特定的生物样品或环境样品中获得的RNA,RNA的进一步分析可以包括RNA的RT-PCR分析或RNA的原位杂交分析。RNA可以是人类、动物、细菌、植物、真菌、原生动物或病毒来源的。在另一个实施方案中,靶是从特定的生物样品或环境样品中获得的细菌细胞或孢子。进一步分析可以包括细菌细胞或孢子本身的分析。分析细胞或孢子的示例性的方法包括但不限于显微术、培养、细胞学测试和细菌细胞表面标记物分析。此外,靶细菌细胞或孢子的分析可以包括从靶细胞或孢子中制备的DNA或RNA的分析,以及细胞或孢子本身的分析和从靶细胞或孢子中制备的DNA或RNA的分析。在另一个实施方案中,靶是从特定的生物样品或环境样品中获得的蛋白。蛋白可以是人类、动物、细菌、植物、真菌、原生动物或病毒来源的,这依赖于技术的具体应用。蛋白的进一步分析可以包括肽序列测定、质谱分析和一维或二维凝胶电泳。
在第二方面,本发明提供了能够与基材的表面偶联的特定表面改性剂。用一种或多种表面改性剂改性的基材与未改性的基材和用其它表面改性剂改性的基材相比对特定的靶具有更高的亲和性。本发明预料广范围的基材的改性,包括但不限于板、芯片、盖玻片、培养瓶、管、珠子、探针、光学纤维、滤器、柱体(cartridge)、条带等。此外,本发明预料这样的基材可以由广泛材料中的任何一种制成,包括但不限于塑料、玻璃、金属和二氧化硅,此外材料还可以具有磁性或顺磁性的特性。正如从示例基材的列表中可以分析出的那样,适合的基材实际上可以是任何大小或形状的,本领域的专业技术人员可以根据具体的靶以及必须从中分析靶的具体的材料来容易地选择适合的基材。
在一个实施方案中,基材用一种表面改性剂改性。在另一个实施方案中,基材用两种或两种以上表面改性剂改性。在另一个实施方案中,表面改性剂与基材通过一个可剪切的接头相连接,使得改性剂可以从基材上释放出来。当使用多种表面改性剂时,每种试剂可以对同样的靶具有增加的亲和性,试剂也可以对不同的靶具有增加的亲和性,以便改性的基材能够分离一种以上的靶。此外,当使用多种表面改性剂时,每种试剂可以对特定的靶具有相同的亲和性,试剂也可以对特定的靶具有不同的亲和性。
在第三方面,本发明提供了能够用于从生物样品、化学样品或环境样品中分离靶的装置。本发明包括了两类装置。第一类包括能够便利基材和样品之间的相互作用的装置。这种装置对于大规模执行本发明的方法是特别重要的。例如,当从土壤、水、空气或体液的少量样品中分离靶时,有效地将改性的基材投送到含有靶的样品是容易的。在这种情况下,确保整个样品与基材相接触是容易的,因此基材有机会与整个样品中的靶相互作用。但是,当涉及较大的样品时,确保基材与可能均匀或不均匀地分布在整个大样品中的靶相接触不是那么容易的过程。对于这种情况,本发明提供了便于将基材与整个含有靶的大量样品均匀混合的装置。表明这种装置的应用的一个例子是在工业食品加工厂中。含有食品、饮料和用于生产各种不同食品或饮料的成分的大容器可能在加工和储存过程中污染细菌、病毒或化学材料。但是,有效地检测这样的潜在有害污染物受到样品的大体积的妨碍。这种第一类装置的一个应用是在食品加工工业中,其中装置可以用于日常有效地评估大体积食品或成分的质量。
第二类装置提供了另外的包被基材,例如滤器和柱体,可以用于方便地处理含有靶的样品。这些装置具有广泛的生物学、环境和工业应用,可以用于有效地分析固体、液体或气体样品。值得特别注意的是,基于亲和规程分析样品的滤器和柱体可以单独使用,也可以与其它可用的滤器和柱体结合使用。滤器和柱体可以用于各种情况下。
值得特别注意的是,本发明的方法、成分和装置可用于传统的实验室或医院,或者用于其它实验室设备和装备的使用可能受到限制的领域。此外,使用本发明的成分和装置,分离方法执行的时间可以短于其它传统的分离方法。进行快速样品分析的能力在任何数量的实验室和野外应用中都是关键的。例如,减少样品的分析时间可以使医生和医院立刻给病人提供诊断测试的结果。这缩短了开始治疗之前的时间,并降低了病人走掉或不服从的危险。另一个例子,快速的分析便利了犯罪现场调查。对于进一步分析来说,环境污染的快速分析便于在污染和具体的工业或自然事件之间建立联系。
在上述的任何一种情况下,本发明的分离方法(无论使用滤器、柱体或其它基材执行)可以在少于30分钟内完成。在另一个实施方案中,分离方法可以在少于等于25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分钟内完成。在另一个实施方案中,分离方法可以在少于或等于7、6、5或4分钟之内完成。使用本发明的方法分离的靶也可以或选使用其它快速分析技术进一步分析。
在上述的任何一种情况下,执行本发明的分离方法(如果使用滤器、柱体或其它基材执行)所需的时间包括了靶与基材结合所需的时间(例如捕获时间),也可以包括从基材上释放靶所需的时间(例如洗脱时间)。在一个实施方案中,捕获时间可以少于或等于30、25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分钟。在另一个实施方案中,捕获时间可以少于或等于7、6、5、4、3、2或1分钟。在另一个实施方案中,捕获时间可以是5-10分钟、1-5分钟、1分钟或少于1分钟。由本发明的方法捕获的靶也可以从基材上洗脱下来。洗脱的靶也可以使用其它的快速分析技术来进一步分析。
在另一个实施方案中,洗脱时间可以少于或等于30、25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分钟。在另一个实施方案中,洗脱时间可以少于或等于7、6、5、4、3、2或1分钟。在另一个实施方案中,洗脱时间可以是5-10分钟、1-5分钟、1分钟或少于1分钟。用本发明的方法洗脱的靶也可以或选使用其它的快速分析技术来进一步分析。
在上述的任何一种情况下,本发明的分离方法可能需要使用有效量的基材。尽管使用较大浓度的基材在某些应用中可能具有优势,使用最小浓度的基材可以帮助降低方法的花费,并帮助增加它在野外的易用性(例如减少需要使用的消耗性试剂的量)。在一个实施方案中,基材的量大于10mg/mL样品。在一个实施方案中,基材的量少于或等于10mg/mL样品。在另一个实施方案中,基材的量少于或等于7、6或5mg/mL样品。在另一个实施方案中,基材的量少于或等于4、3、2或1mg/mL样品。在另一个实施方案中,基材的量是5-10mg/mL样品或1-5mg/mL样品。
本发明的实践除特别指明之外,将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些都在本技术领域范围内。这些技术在文献中有描述。参见例如《分子克隆实验指南》(第二版)(Sambrook,Fritsch和Maniatis主编,冷泉港出版社,1989);《DNA克隆》(第一卷和第二卷)(D.N.Glover主编,1985);《寡聚核苷酸合成》(M.J.Gait主编,1984);Mullis等的美国专利No.4683195;《核酸杂交》(B.D.Hames & S.J.Higgins主编,1984);《转录和翻译》(B.D.Hames & S.J.Higgins主编,1984);《动物细胞的培养》(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);《固定化细胞和酶》(IRL出版社,1986);B.Perbal,《分子克隆实验指导》(1984);《酶学方法》专题论文(Academic Press,Inc.,N.Y.);《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos主编,1987,冷泉港实验室);《酶学方法》154和155卷(Wu等主编),《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Mayer和Walker主编,Academic Press,London,1987);《实验免疫学手册》(I-IV卷)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编,1986);《小鼠胚胎操作》(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1986)。
从下面的详细描述和权利要求中,本发明的其它特点和优点将变得显而易见。
附图详述
图1提供了亲和规程的图示。
图2显示了含有表面改性剂的代表性硅片(左图)以及用含有表面改性剂的硅片改性的基材(右图)。
图3显示了代表性的含硅表面改性剂(左图)以及用含硅表面改性剂改性的基材(右图)。与图2中显示的表面改性剂相反,该模型提供了含有多个彼此相同或不同的活性区域的表面改性剂。
图4显示了流式细胞分析,可以用于方便地评估和定量基材和靶之间的相互作用。
图5显示了荧光分析,可以用于方便地评估和定量基材和靶之间的相互作用。
图6图示了轴颈轴承流动的原理。右边的图显示了用于混合颗粒淤泥的轴颈轴承流动的模拟结果。
图7显示了大规模亲和规程的示意图。大规模方法包括了使用无序混合装置以便于标准亲和规程中的基材和靶之间的相互作用。在该图示中,基材(磁珠)、样品土壤和水被混合产生了淤泥。含有靶和基材的淤泥被放置在无序混合装置上以低速混合,以便于靶和基材之间的相互作用。在混合后,内部的圆柱被电磁铁取代,用于移除靶-基材复合物。因为基材是磁珠,靶-基材复合物可以容易地与电磁铁相吸引。在从淤泥中移除靶-基材复合物后,将靶细胞从珠子上分离,然后裂解并使用SNAP处理检查靶细胞中包含的DNA。
图8概述了可商购的磁珠的分析结果。数据被规格化为SNAP单独分析的样品的信号,以便图中出现的示意图表明与SNAP单独分析相比哪个珠子增强了的信号。
图9概述了可商购的非磁珠的分析结果。这些珠子的效力通过在将珠子和样品保温后测量吸附在珠子上的DNA的百分数来评估。
图10显示了用于改性几种不同基材表面的表面改性剂(标记为字母A-Y)的结构。
图11显示了我们的几种胺功能化珠子具有改进的DNA的吸附性。
图12显示了我们的胺功能化珠子和几种可商购珠子对两种不同细菌靶的吸附性。
图13显示了我们的胺功能化珠子和几种可商购珠子对两种不同细菌靶的吸附性。
图14显示了我们的胺功能化珠子和几种可商购珠子对细菌靶的营养体和孢子体形式的吸附性。
图15显示了物理性吸附到不同基材表面上的细菌靶的SEM图象。
图16显示了使用亲和规程和SNAP的组合改进了靶(在这种情况下是细菌DNA)的鉴定。
图17显示了DNA与包被的基材的吸附受到盐浓度的影响。
图18显示了DNA与包被的基材的吸附受到盐浓度和pH的双重影响。
图19显示了基材能够有效地结合存在于各种样品,包括水、培养基和非实验室级的环境水中的靶DNA。
图20显示了温度的操作可以用来从基材上洗脱靶DNA。
图21显示了可以使用电洗脱将靶从基材上释放。图21A显示了GeneCapsule装置的图解,以及基材在装置中的放置。图21B显示了装载基材后GeneCapsule装置的图解。图21C显示了在电洗脱后小牛胸腺DNA从胺珠子上的洗脱。可以看见大量的小牛胸腺DNA从基材上迁移出来。
图22显示了对DNA具有亲和性的各种磁珠的捕获和释放活性的比较。对每种类型的珠子来说,1毫克基材被加入到1mL500pg/mL的DNA标准去离子水溶液中。对每种类型的珠子来说,最左边的条代表被捕获到基材上的DNA的百分数。中间的条代表被捕获的DNA释放到洗脱缓冲液中的百分数,洗脱缓冲液包含150μL 100μg/mL小牛胸腺DNA的0.01N NaOH。这被称为回收的靶的百分数,是回收的DNA与捕获的DNA的比率。最右边的条代表了效率,是回收的DNA与最初样品中存在的总DNA(500pg)的比率。
图23显示了可商购的胺包被的磁珠捕获DNA的效率作为基材量和捕获时间(例如基材和样品之间的接触时间)的函数。
图24显示了可商购的胺包被的磁珠捕获DNA的效率作为基材量和捕获时间(例如基材和样品之间的接触时间)的函数。
图25显示了可商购的胺包被的磁珠释放DNA的效率作为基材量和洗脱时间的函数。
图26显示了可商购的胺包被的磁珠释放DNA的效率作为基材量和洗脱时间的函数。
图27显示了洗脱体积对洗脱效率的影响。
图28显示了pH对洗脱效率的影响。
图29显示了使用干亲和磁性规程将细菌DNA从干土壤样品分离出来后PCR的结果。虚线表明只使用SNAP方法处理分离DNA的土壤样品,实线表明了在SNAP处理前先与带静电荷的非磁珠接触的土壤样品。
图30显示了从含有与水混合形成淤泥的砂土样品中,使用含有磁珠的柱体分离细菌孢子后的PCR结果。从砂土中的靶孢子获得的DNA可以直接用PCR分析,也可以在使用亲和规程从样品中分离后再进行PCR分析。在PCR之前先分离靶与含有靶的样品直接PCR分析相比,导致检测量增加了一个数量级。
图31显示了用于无序混合的装置(无序混合装置)。
图32显示了对只使用SNAP规程分离的DNA(上图)或使用大规模亲和规程加SNAP规程分离的DNA(下图)进行的PCR反应的凝胶电泳。在两个图中,箭头被用来指明扩增的条带。这些结果表明大规模的亲和规程改进了对在大量样品中检测的限制。
图33显示了对只使用SNAP规程分离的DNA或使用大规模亲和规程加SNAP规程分离的DNA进行的PCR反应的凝胶电泳。箭头被用来指明扩增的条带。这些结果表明大规模的亲和规程改进了对在大量样品中检测的限制。
图34显示了表面改性的收集管。
图35显示了含有表面改性基材的滤器的两种设计。尽管图中提供的具体例子表明滤器被用于收集空气样品(气体样品),同样的设计可以容易地改造以构建用于收集液体样品的滤器。
图36显示了可以通过一个或多个基材用于处理样品的LiNK装置的变体。此外,装置还可以在收集后保存样品。
图37显示了改进的双室(LiNK)装置。改进的装置含有二氧化硅柱增强样品的纯化和浓缩。
图38显示了LiNK类装置的两种修改的设计。成对设计或双室设计允许了对样品中的细菌和其它细胞,在缺少用于便利样品核酸的分析所需的离液序列高的盐的情况下进行培养。
发明详述
(1)综述
生物学、化学和环境科学经常需要对首先必须从非均一群体材料中分离或检测的靶进行分析。该过程还可能由于在样品中存在可能降解靶或抑制靶的后续分析的污染物而进一步复杂化。本发明提供了用于从非均一群体材料中纯化靶的方法、成分和装置。这些方法、成分和装置可以用于广范围的靶(例如DNA、RNA、蛋白、细菌和细菌孢子(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)、病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)、小有机分子和化学化合物),具有广泛的生物学、化学和环境应用。
在本文中详细描述的改进的方法和成分极大地增强了从广泛的气体、液体和固体样品中分离或检测靶的能力。此外,本发明可以与以前描述的在分离期间和进一步分析之前帮助维持靶的完整性的方法和装置相结合使用。这些帮助维持靶的完整性的方法和装置在2003年7月10日提交的共同待决的美国专利申请2003/0129614中有详细的描述,在此以其全文引为参考。简单地说,美国专利申请2003/0129614公开了被设计来便利从样品中获得的核酸的分离和分析的方法和成分,该核酸的获得,是通过在能够抑制样品中可以降解靶或可以结合靶并抑制靶的进一步分析的试剂成分存在的情况下对样品进行处理。例如,样品中的试剂能够降解核酸例如DNA。这种降解减少了给定样品中DNA的浓度,也降低了DNA的质量,以至于很难对DNA进行处理以进一步在测试例如PCR中进行分析。
发明用途
本发明的方法、成分和装置具有许多潜在的应用。例如,许多在法医学中使用的分析方法需要纯化DNA、蛋白或有机小分子、例如复杂样品中的非肽类激素。这样的样品包括人类或动物的体液或组织,包括但不限于血液、唾液、痰、尿液、粪便、皮肤细胞、头发毛囊、精液、阴道液、骨骼片段、骨髓、脑材料、脑脊液、羊水等。从这些复杂样品中纯化和进一步分析靶受到下列因素的妨碍:(a)样品中通常较低的靶浓度;(b)样品受到环境污染物或样品中随着时间降解靶的试剂的降解;以及(c)在这些复杂体液中存在着干扰靶纯化后进行分析所需的技术的试剂。因此,本发明对法医科学有重要的应用,将增强分析生物样品的能力。此外,我们注意到本发明的方法和成分能够有效地从材料混合物中分离靶,该材料混合物可能存在于“肮脏”的环境例如土壤或水中。因此,本发明不仅对直接从个体提供的新鲜体液样品或在相对未扰乱的环境中的样品进行的法医和其它研究提供了便利,而且可用于分析必须从土壤、水(包括淡水和海水)或其它可能含有较高浓度的污染物或其它降解试剂的来源中回收的样品。因此,本发明的方法、成分和装置可广泛应用于在实验室、医院和医生办公场所中分析生物材料,以及在野外被警察、医学检查人员、急救医务技术人员、犯罪调查员、Haz-mat人员和其他野外工作人员用于分析生物样品。
但是,本发明在生物科学中的应用不限于法医学。医学和遗传测试领域的进展已经开始改变了我们进行卫生护理的方式。许多诊断测试已经可以使用或目前正在开发。这些测试依赖于分析在人类或动物体液或组织中包含的特定靶(DNA、蛋白、激素)的能力。因此,本发明可用于进一步改进分析生物样品的容易性和效率。此外,既然本发明的方法和成分允许分离较小量的靶,在诊断时使用这些方法和成分将帮助减少必须从特定病人获得的样品的量。此外,本发明提供的方法允许以以前不可能获得的速度和使用最少的试剂从广范围的样品中分离靶。快速廉价分析样品的能力在卫生护理和医学工业、以及在许多本文中详细描述的发明的其它应用中具有优势。
作为另一个例子,本发明可用于筛选血液、血液制品或其它预包装的医学供应品,以确保这些供应品不含特定的污染物例如细菌和病毒。
除了医学应用之外,本发明还具有各种环境应用。可以分析水、土壤或空气样品中特定靶的存在。这样的靶包括DNA、RNA、蛋白、小的有机分子、化学化合物、细菌细胞或孢子(包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)和病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)。DNA、RNA和蛋白可以来自于人类、非人类的动物、植物、细菌、真菌、原生动物和病毒。例如,从当地池塘、湖泊和海滩收集的水样品可以被分析以评估潜在有害的细菌或化学污染物的存在和浓度。这种分析可用于监测这些水源的卫生,并评估它们对于人类消费的安全性。同样地,土壤样品可以被收集和分析以评估自然或工业来源的污染水平。
作为另一个例子,含有本发明成分的柱体和滤器可用于监测空气和水供应。这样的柱体和滤器可以用于评估建筑物、机场和其它依赖循环空气的封闭环境中的空气质量。此外,这样的柱体可用于养鱼箱、水族馆等,以帮助监测水的质量并帮助精确确定水质量的任何变化来源。
本发明的最后一个非限制性的应用例子可以被广泛地分类到本土安全领域。既然存在使用生物和/或化学武器的战争的威胁,能够用来鉴定食物、水、土壤或空气中的生物或化学试剂的存在的方法和成分就具有极大可能的应用。例如,环绕当地水库或其它可能的攻击源的水和土壤样品可以被收集,并分析生物或化学污染物的存在。此外,柱体和滤器可用于监测空气(建筑物、火车、飞机或其它交通工具外部或内部)中生物或化学污染物的存在。本发明预料生物污染物可以通过检测来自特定的生物体(例如细菌或病毒)的DNA或RNA、或通过检测细菌或病毒本身来鉴定。化学污染物可以通过检测有机分子本身、以及检测它的化学副产物或代谢物来鉴定。可以被检测的示例性生物和化学试剂包括炭疽杆菌、篦麻毒素、布鲁氏杆菌、天花病毒、鼠疫菌、Q热立克次氏体、土拉菌、肉毒梭菌、葡萄球菌、和病毒性出血热包括埃博拉病毒、芥子气、产气荚膜梭菌、骆驼痘病毒、沙林、甲氟磷酸异己酯、O-乙基-S-二异丙基氨基甲基甲基膦酰基硫醇、二甲氨基氰磷酸乙酯和氢氰酸。临床和环境相关的示例性病毒可以基于它们的基因型以及它们是否具有包膜进行分类,包括(1)单链、正义链、有包膜、RNA病毒;(2)单链、正义链、无包膜、RNA病毒;(3)单链、反义链、有包膜、RNA病毒;(4)双链、无包膜、RNA病毒;以及(5)双链,有包膜、DNA病毒。单链、正义链、有包膜的RNA病毒包括但不限于东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、SARS、丙型肝炎病毒、HIV和西尼罗病毒。单链、正义链、无包膜的RNA病毒包括但不限于诺沃克病毒、甲型肝炎病毒和鼻病毒。单链、反义链、有包膜的RNA病毒包括但不限于埃博拉病毒、马堡病毒和流感病毒。双链、无包膜的RNA病毒包括但不限于轮状病毒。双链,有包膜的DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒和重型天花病毒。
对于上面描述的本发明的各种潜在的法医、医学、诊断、环境、工业和安全应用,本发明预料到了使用本发明的方法、装置和成分从非均一样品中分离和/或鉴定靶。因此,这些方法、成分和装置不仅可用于特定的靶和样品的进一步分析,而且可用于从样品中移除靶(例如不需要的靶)。使用本发明移除靶的例子包括了样品的去污染。在从样品中分离(例如移除、物理分离)所有或部分靶之后,样品可以比在移除靶之前更安全地操作。被分离的靶也可以被丢弃(例如根据任何可能与靶结合的危险物的本质适当地丢弃),或可以使用根据任何可能与靶结合的危险物的本质来说适合的试剂和预防措施进一步研究。
(2)定义
为了方便起见,在此收集了某些在说明书、实施例和权利要求书中使用的术语。除特别定义以外,所有本文使用的技术和科学术语都与本发明所属的专业领域的技术人员所通常理解的那样具有同样的意义。
本文使用的“一个”和“一种”是指一个或一个以上,和一种或一种以上(即至少一个/种)。例如,一种“元件”意味着一种或一种以上的元件。
术语“靶”被用于指所需的特定分子。示例性的靶包括DNA、RNA、蛋白、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、细菌孢子、DNA病毒和RNA病毒(包括逆转录病毒)、有机小分子(包括非肽类激素)和化学化合物。DNA、RNA和蛋白可以来自人类、非人类的动物、植物、真菌、原生动物、细菌和病毒。对于前述靶中的任何一种,本发明预料通用类别的靶(例如样品中的所有DNA)的纯化,以及一类靶中特定的种类(例如特定的细菌或针对给定抗原的抗体)的纯化。在本发明的范围内,靶是使用本发明的方法、成分和装置从非均一样品中基本上纯化的分子。
术语“样品”指生物、化学或环境材料的非均一混合物。本发明的方法、成分和装置允许从样品中分离、检测或基本上纯化特定的靶。样品可以是气体、液体或固体(例如湿的固体样品或干的固体样品),可以包括生物学、化学或环境材料。示例性的生物样品包括但不限于血液、唾液、痰、尿液、粪便、皮肤细胞、头发毛囊、精液、阴道液、骨骼片段、骨髓、脑材料、脑脊液和羊水等。示例性的环境样品包括但不限于土壤、水、非实验室级的环境水样、淤泥、空气、植物和其它植物性材料、油、液体矿物沉积物和固体矿物沉积物。本发明还预料这些方法和成分在许多商业和工业应用中的应用,包括在食品加工或其它商业产品的生产过程中污染物的纯化。
术语“基材”被用来指任何可以被改性或用“表面改性剂”包被、以便促进或增强包被的基材与一种或多种靶之间相互作用的表面。基材在大小和形状方面可以广泛地改变,具体的基材可以由本领域的专业技术人员根据改性剂、靶、样品和与本发明的具体应用特定相关的其它因素容易地选择。示例性的基材包括但不限于磁珠、非磁珠、管(例如聚丙烯管、聚氨基甲酸乙酯管等)、玻璃载玻片或盖玻片、芯片、匣子、滤器、柱体和探针包括光学纤维探针。
表面改性剂可以与基材共价或非共价地偶联,表面改性剂还可以或选含有可剪切的接头,以便表面改性剂的活性区域可以从基材上释放。术语“活性区域”被用于指改性剂中含有的与靶相互作用的区域的部分。在改性剂含有可剪切的接头的实施方案中,接头被剪切释放出靶和改性剂的活性区域,而留下改性剂的某些部分结合在基材上。
术语“亲和规程”或“AP”被用来指通过将样品与基材相接触从样品基本上纯化或分离靶的方法。基材的表面可以包被有改性剂以促进或增强基材和特定靶之间的相互作用。
术语“亲和磁性规程”或“AMP”被用来指基材具有磁性特征的AP方法的实施方案。与AP方法中使用的基材相同,用于AMP方法的基材可以包被有改性剂以促进或增强基材和特定靶之间的相互作用。
亲和规程和亲和磁性规程包括了靶捕获阶段,其中靶和基材相互作用形成靶-基材复合物。靶和基材结合形成靶-基材复合物所需的时间在本文中称为“捕获时间”。通过“靶和基材结合形成靶-基材复合物”意味着靶和基材之间足够的相互作用,以便样品中超过50%(例如至少51%)的靶与基材结合形成靶-基材复合物。在某些实施方案中,样品中超过60%、70%、75%、80%、85%、90%或超过95%的靶与基材结合形成靶-基材复合物。
在AP和AMP的某些应用中,靶-基材复合物被破坏,被结合的靶从基材上洗脱下来。从基材上洗脱靶所需的时间在此被称为“洗脱时间”。通过“从基材上洗脱或移除靶以破坏靶-基材复合物”意味着破坏了超过50%(例如至少51%)的靶-基材复合物。在某些实施方案中,超过60%、70%、75%、80%、85%、90%或超过95%以前结合到靶的样品中的靶被洗脱。
术语“偶联区域”是指改性剂上与基材相互作用的部分。
术语“SNAP”或“SNAP方法”或“SNAP规程”将完全可以相互交换使用,是指在共同待决的美国公开号2003/0129614(美国专利申请号10/193742)中详细描述的方法。在本文中使用时,这些术语的使用不意味着被限于在共同待决申请中陈述的具体装备和装置的使用,而是意味着在抑制核酸样品的降解和/或抑制样品中会干扰样品的进一步处理和分析的试剂(例如抑制样品的PCR或RT-PCR分析的试剂)的条件下,用于分离核酸样品的通用方法。
在本文中,术语“脂肪基团”是指直链、支链或环状的脂肪族碳氢基团,包括饱和的和不饱和的脂肪基团,例如烷基基团、烯基基团和炔基基团。
术语“烯基”或“炔基”是指不饱和脂肪族基团,在长度和可能的取代方面与上述的烷基类似,只是分别含有至少一个双键或三键。
术语“烷氧基”在本文中被用于指其上连接有一个氧基团的上面定义的烷基基团。代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是指通过氧共价连接两个碳氢化合物。
术语“烷基”是指饱和的脂肪族基团,包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在优选实施方案中,直链或支链烷基在其骨架上具有30个或以下的碳原子(例如C1-C30的直链,C3-C30的支链),更优选的情况下为20个或以下的碳原子。同样,优选的环烷基在它们的环结构上具有从3到10个碳原子,更优选在环结构上具有5、6或7个碳原子。
此外,在本说明书、实施例和权利要求中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)还打算包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”,后者是指在碳氢化合物骨架的一个或多个碳上有取代基代替了氢的烷基基团。这样的取代基可以包括例如卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯、或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或芳香或杂环芳香基团。本领域的专业技术人员将会理解,碳氢链上的取代基团,如果合适的话,本身也可以是取代的。例如,取代烷基的取代基可以包括取代的和未取代形式的氨基、叠氮基、亚氨基、氨酰基、磷酰基(包括膦酸酯和亚膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、亚磺酰氨基、氨磺酰和磺酸酯)和甲硅烷基,以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸和酯)、-CF3、-CN等。示例性的取代烷基在下面描述。环烷基可以进一步用烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN等取代。
除非碳的数量被特别指明,本文所用的“低级烷基”是指上面定义的烷基基团,但是在其骨架结构上具有1到10个碳原子,更优选情况下具有1到6个碳原子。同样地,“低级烯基”和“低级炔基”也具有同样的链长。在整个申请中,优选的烷基基团是低级烷基。在优选的实施方案中,本文指明为烷基的取代基是低级烷基。
术语“烷硫基”是指上面定义的烷基,其上连接有硫基。代表性的烷硫基基团包括甲硫基、乙硫基等。
术语“胺”和“氨基”在本技术领域中是公认的,是指未取代的和取代的胺,例如可以由下面的通用分子式代表的部分:
其中R9、R10和R’10分别独立地代表氢、烷基、烯基、-(CH2)m-R8,或者R9和R10与它们连接在其上的N原子一起构成了在环结构上具有4到8个原子的杂环;R8代表芳香基、环烷基、环烯基、杂环基或多环基;m是0或1-8范围内的整数。在优选实施方案中,R9或R10中只有一个可以是羰基,例如R9;R10和氮原子一起不形成亚胺。在更优选的实施方案中,R9和R10(也可以是R’10)分别独立地代表氢、烷基、烯基、-(CH2)m-R8。因此,本文使用的术语“烷基胺”是指前面定义的胺基团,其上连接有取代的或未取代的烷基,即R9和R10中至少有一个是烷基基团。
术语“酰氨基”在本技术领域中是公认的,是指氨基取代的羰基,包括可以由下面的通用分子式代表的部分:
其中R9和R10定义如上。酰氨基的优选实施方案不包括二酰亚胺,它可能是不稳定的。
本文使用的术语“芳烷基”是指用芳香基团(例如芳香基团或杂环芳香基团)取代的烷基基团。
本文使用的术语“芳香基”包括5-、6-和7-元单环芳香基团,可以包含从0到4个杂原子,例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。这些在环结构上具有杂原子的芳香基团也可以被称为“芳香杂环”或“杂环芳香化合物”。芳香环在一个或多个环位置上可以被上述的那些取代基所取代,例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸盐、膦酸酯、次膦酸盐、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚硫酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳香基、杂环芳香基、-CF3、-CN等。术语“芳香基”也包括具有两个或多个环的多环系统,其中两个或多个碳原子被两个邻近的环(环被称为“稠环”)所共用,这两个邻近的环中至少一个环是芳香族的,例如另一个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳香基和/或杂环基。
本文使用的术语“碳环”是指芳香的或非芳香族的环,其中环的每个原子是碳。
术语“羰基”在本技术领域中是公认的,是指可以由下面的通用分子式代表的基团:
其中X是键或代表氧或硫,R11代表氢、烷基、烯基、-(CH2)m-R8或可药用的盐,R’11代表氢、烷基、烯基或-(CH2)m-R8,其中m和R8定义如上。当X是氧、R11或R’11不是氢时,分子式代表“酯”。当X是氧、R11如上定义时,本文的基团被称为羧基,特别是当R11是氢时,该分子式代表“羧酸”。当X是氧、R’11是氢时,分子式代表“甲酸”。一般来说,当上面分子式的氧原子被硫取代时,分子式代表“硫代羰基”。当X是硫、R11或R’11不是氢时,分子式代表“硫酯”。当X是硫、R11是氢时,分子式代表“硫代羧酸”。当X是硫、R’11是氢时,分子式代表“硫代甲酸”。另一方面,当X是键,R11不是氢时,上面的分子式代表“酮”基。当X是键,R11是氢时,上面的分子式代表“醛”基。
本文使用的术语“杂原子”是指任何碳和氢以外元素的原子。优选的杂原子是硼、氮、氧、磷、硫和硒。
术语“杂环基”或“杂环基团”是指3-到10-元的环结构,更优选的是3-到7-元的环,其环结构包含了1到4个杂原子。杂环也可以是多环。杂环基团包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃、呫吨、吩噁嗪、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩恶嗪、吡咯烷、oxolane、thiolane、唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺例如azetidinone和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺酸内酯等。杂环的环可以在一个或多个位置用上述这些取代基取代,例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香基或杂环芳香基、-CF3、-CN等。
本文中使用的术语“硝基”是指-NO2;术语“卤素”是指-F、-Cl、-Br或-I;术语“巯基”是指-SH;术语“羟基”是指-OH;术语“磺酰基”是指-SO2-。
术语“多环基”或“多环基团”是指两个或多个环(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳香基和/或杂环基),其中两个或多个碳原子被两个邻近的环(环被称为“稠环”)所共用。通过非邻近原子连接的环被称为“桥”环。多环的每个环可以用上面描述的这样的取代基所取代,例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸盐、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香基或杂环芳香基、-CF3、-CN等。
本文使用的词组“保护基团”是指暂时的取代基,它能够保护潜在的反应性官能团不受不想要的化学转化。这样的保护基团的例子包括羧酸酯、醇的甲硅烷基酯、醛和酮的缩醛和缩酮。保护基团化学领域已经被综述(Greene,T.W.;Wuts,P.G.M.《有机合成中的保护基团》(第二版);Wiley;New York,1991)。
“硒烷基”是指其上连接了取代的硒基团的烷基基团。可以在烷基上被取代的示例性的“硒醚”从-Se-烷基、-Se-烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R8中选择,m和R8被定义如上。
本文使用的术语“取代的”预料到包括了所有可允许的有机化合物取代基。从广泛的角度来说,可允许的取代基包括无环和有环的、分支和非分支的、碳环和杂环的、芳香和非芳香的有机化合物取代基。说明性的取代基包括例如本文上面描述的那些。可允许的取代基可以是一个或多个,可以是相同的或不同的适当的有机化合物。对本发明来说,杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或任何上述的可允许的有机化合物取代基,以满足杂原子的化合价。本发明不打算以任何方式限制可允许的有机化合物取代基。
应该理解“取代”或“用…取代”包括了暗指的附带条件,即这样的取代与被取代的原子和取代基的允许的化合价保持一致,取代产生了稳定的化合物,例如不自发地经历例如重排、环化、消除等转变。
类似的取代可以发生在烯基和炔基基团上,产生例如氨基烯基、氨基炔基、酰氨烯基、酰氨炔基、亚氨基烯基、亚氨基炔基、硫代烯基、硫代炔基、羰基取代的烯基或炔基。
本文使用的每种表达例如烷基、m、n等的定义,当在任何结构中出现超过一次时,不依赖于同样结构中别处的定义。
术语triflyl、甲苯磺酰基、甲磺酰基和nonaflyl在本技术领域中是公认的,分别是指三氟甲基磺酰基、对-甲苯磺酰基、甲基磺酰基和九氟丁基磺酰基团。术语triflate、tosylate、mesylate和nonaflate在本技术领域中是公认的,分别是指三氟甲基磺酸酯、对-甲苯磺酸酯、甲基磺酸酯和九氟丁基磺酸酯官能团和含有该基团的分子。
缩写Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Ms分别代表甲基、乙基、苯基、三氟甲基磺酰基、九氟丁基磺酰基、对甲苯磺酰基和甲基磺酰基。具备一般技术水平的有机化学家在本技术领域内使用的缩写的更广泛的列表出现在每一卷《有机化学杂志》的第一期中;该列表一般出现在标题为缩写标准列表的表中。在该列表中包含的缩写以及有机化学家在本技术领域内使用的所有缩写在此引为参考。
本发明的某些化合物可以以特定的几何或立体异构形式存在。本发明预料到了所有这样的化合物,包括顺式和反式异构体、R-和S-对映异构体、非对映立体异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、它们的消旋混合物和它们的其它混合物,这些都落在本发明的范围内。此外不对称碳原子可以出现在取代基例如烷基基团中。所有这样的异构体及其混合物,被打算包含在本发明内。
例如,如果需要本发明的化合物的特定的对映异构体,它可以通过不对称合成来制备,也可以用手性辅助试剂衍生,得到的非对映立体异构体混合物被分离,将辅助基团切下,以提供所需的纯的对映异构体。此外,当分子含有碱性官能团例如氨基或酸性官能团例如羧基时,可以用适当的光学活性酸或碱来形成非对映立体异构体的盐,然后通过本领域内众所周知的分级结晶或层析的方法将形成的非对映立体异构体拆分,然后回收纯的对映异构体。
对于本发明来说,化学元素按照元素周期表(CAS版本,化学和物理学手册,第67版,1986-87,封二)来鉴定。同样对于本发明来说,术语“碳氢化合物”被预料到包含了所有具有至少一个氢和至少一个碳原子的容许的化合物。从广泛的角度来说,容许的碳氢化合物包括无环和有环的、支链和非支链的、碳环和杂环的、芳香和非芳香的有机化合物,它们可以是取代的,也可以是未取代的。
“氨基酸”——是肽、多肽或蛋白的单体单位。在自然存在的肽、多肽和蛋白中发现了大约80种氨基酸,它们都是L-异构体。该术语也包含了氨基酸的类似物及蛋白氨基酸的D-异构体及其类似物。
术语“疏水的”是指具有非极性原子的化学部分彼此相互作用而不与水或其它极性原子相互作用的倾向。“疏水”的材料绝大部分不溶于水。具有疏水性质的天然产物包括脂类、脂肪酸、磷脂、鞘脂、酰基甘油、蜡、甾醇、类固醇、萜烯、前列腺素、凝血恶烷、白三烯、类异戊二烯、retenoids、生物素和疏水的氨基酸例如色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。化学部分如果其物理性质由非极性的原子的存在所决定,它也是疏水的或具有疏水性质。
术语“亲水的”是指对水具有高亲和性的化学部分。“亲水”的材料绝大部分溶于水。
在本文中使用时,“蛋白”是基本上由大约80中氨基酸中的任何氨基酸组成的聚合物。尽管“多肽”通常被用于指相对大的多肽,“肽”通常被用于指小的多肽,这些本技术领域的术语的使用是重叠的和可以变化的。
术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中可以互相交换使用。
术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中也可以相互交换使用。
当用在本文中时,术语“核酸”是指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)、以及适当的地方是核糖核酸(RNA)。该术语应该被理解成包括了单链(正义或反义链)和双链多核苷酸。
术语“小分子”是指分子量少于大约2500原子质量单位的化合物,优选少于大约2000原子质量单位,更优选少于大约1500原子质量单位,更优选少于大约1000原子质量单位,或最优选少于大约750原子质量单位。
(3)示例的方法
本发明提供用于从样品中分离靶的改进的方法,以便靶可以得到进一步的分析。该方法在本文中将被称为“亲和规程”、“AP”或“亲和方法”。该方法的某些实施方案将使用磁性基材,也可以被称为“亲和磁性规程”或“AMP”。
亲和规程使用基材帮助从样品中鉴定一种或多种靶。AP可以用于广范围的靶,包括但不限于核酸(例如DNA和RNA)、蛋白、细菌细胞或孢子(例如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)、病毒(例如DNA病毒和RNA病毒)、小的有机分子(例如毒素、激素等)、以及大的化学化合物。AP可以用于从广范围的样品中鉴定靶,包括气体样品(例如过滤的或未过滤的空气)、环境液体样品(例如淡水、海水、淤泥、泥浆、再水合土壤、汽油、油)、生物液体和半固体样品(例如血液、尿液、痰、唾液、粪便、脑脊液、骨髓、精液、阴道液、脑材料、骨骼片段)、以及环境固体样品(例如干土壤或粘土)。此外,AP可以被用于分析不能完全处理的固体表面上靶的存在。例如,在桌面、计算机键盘、门把手等上靶的存在。在这样的情况下,评估靶的存在可以首先擦拭固体表面的表面,然后对表面擦拭物进行处理以检测靶的存在。此外,AP可以用于鉴定许多工业应用中的靶,例如食品加工、化学加工或任何大规模生产努力,它们可能由于制备物中某些污染的靶的存在而受到妨碍。
本发明预料到亲和规程可单独使用以鉴定样品中的靶,并便利该靶的进一步分析。例如,亲和规程可用于鉴定水样中特定细菌细胞的存在。然后可以对这些细菌细胞进行进一步细胞或分子分析。
亲和规程与其它从非均一样品中提取或分离靶的方法相比有许多明显的优点。用于亲和规程和亲和磁性规程的基材可以是未包被的(例如未衍生的),也可以用相对简单的化学部分衍生。这与许多以前使用的分离技术相反,这些分离技术需要将基材用对特定靶具有免疫反应性的抗体来包被。抗体的生产和与基材的吸附更为昂贵,它们的使用需要对所需的靶具有大量先验的了解,并且每种抗体可能具有狭窄的免疫反应谱。此外,亲和规程和亲和磁性规程允许从非均一样品中快速分离靶,该方法需要使用最少量的试剂。这些特点降低了规程的花费,并且允许它在野外(例如非实验室条件)以及实验室中使用。
但是,本发明还预料到亲和规程可以与以前公开的SNAP方法或其它的方法结合使用以进一步分析核酸。SNAP方法在美国公开号2003/0129614中有详细的描述,在此以其全文引为参考,该方法允许从样品中分离核酸,其方式防止了它们的降解和/或抑制了样品中干扰核酸的进一步分析的试剂。具有SNAP方法特征的一种示例性可商购产品是IsoCode纸。通过将亲和规程与SNAP方法相结合,本发明提供了进行了很多改进的从复杂的非均一样品中鉴定靶的方法。正如本文提供的实施例所表明的那样,亲和规程和SNAP方法的共同使用,改善了在样品中鉴定的靶的质量,因而便利了靶的进一步分析。此外,组合的方法比单独的SNAP方法更灵敏,因此允许鉴定样品中较低浓度的靶。
亲和规程使用能够与样品中存在的靶相互作用的基材。基材实际上可以是任何大小和形状,示例性的基材包括珠子、管、探针、光学纤维、板、滤器、柱体、盖玻片、芯片、薄膜、盘、拭子、纸或其它擦拭巾等。此外,基材可以由多种材料中的任意种类构成,包括但不限于玻璃、塑料和二氧化硅。基材可以被磁化(例如具有磁性性质)。基材可以是多孔的或无孔的,多孔基材可以具有各种孔隙度。
用于亲和规程的基材对靶应该具有与样品中的非靶材料相比更高的亲和性。正如在本文中将会详细描述的那样,一些基材对某些靶具有与某些其它的靶相比较高的亲和性,本领域的专业技术人员可以根据靶、样品等因素容易地选择具体的基材。本发明还预料到基材的表面可以被改性,以进一步促进基材与一种或多种靶的相互作用。连接到基材的表面影响基材与靶的相互作用的部分被称为表面改性剂。本发明预料到一种或多种表面改性剂可以结合到基材的表面以促进基材与特定靶的相互作用。在本文中提供了示例性的表面改性剂,在本发明的一个实施方案中,用一种或多种本文公开的表面改性剂改性的基材被用在亲和规程中,以从样品中鉴定和/或分离靶。
本发明还预料到了使用基材混合物的亲和规程。例如,该方法可以使用两种或多种用不同表面改性剂改性的基材,以鉴定一个以上的靶,和/或该方法可以使用在大小、形状或组成上不同、但用同样的表面改性剂改性的基材。
为了进一步描述亲和规程,图1提供了示意图。我们注意到在图1提供的图解化的方法中,使用了亲和规程和SNAP方法分析样品,以分离和制备核酸用于进一步分子分析。但是,本发明还预料到了单独使用亲和规程来分离多种靶,包括但不限于DNA、RNA、蛋白、细菌细胞和孢子、病毒、小的有机分子和大的化合物。
在图1显示的假定的例子中,我们有一个怀疑含有特定细菌靶的土壤样品(第一步)。采取土壤样品,与水和基材组合(第二步)。在本例子中,基材是对被怀疑的细菌细胞具有亲和性的磁珠。土壤淤泥、水和珠子被混合,以便利基材和靶之间的相互作用(第三步)。在第三步过程中,样品中的靶可以与基材结合。在靶和基材相互作用后,从样品中分离靶-基材复合物。在本例子中,因为基材是磁珠,复合物可以使用磁体容易地分离(第四步)。1-4步概述了亲和规程。在分离基材-靶复合物后,靶可以用任何方式来分析,这依赖于具体的靶和人们希望获得的信息的类型。在一个实施方案中,亲和规程可以容易地和SNAP方法结合使用,以在抑制降解和/或抑制阻止核酸的进一步分析的试剂的条件下从靶中分离核酸并对核酸进行处理。5-7步表明了SNAP方法是如何与亲和规程相结合的。
使用基材从样品中鉴定和/或分离靶具有大量的应用。本领域的专业技术人员将会认识到,术语“分离”在本发明中可以具有两种意义。术语“分离”可以指用基材结合靶(例如形成靶-基材复合物)以便利用靶与基材的结合将靶与样品的其它部分分离开来。术语“分离”还可以指通过物理方法将靶和/或靶-基材复合物与样品的其它部分分离开来。本发明预料到了这两种情况的优选实施方案。
本申请提供了改进的方法(亲和规程),用于从非均一液体、固体或气体样品中鉴定和/或分离靶。正如从本文提供的例子中将会认识到的那样,亲和规程提供了改进的方法,可以用于受控的场所,例如实验室、医院或食品加工厂,以及在控制较少的野外场所。亲和规程适合于快速鉴定和/或分离,适合于与大量的基材一起使用,这些基材可以根据应用的具体需要、样品和靶进行选择。
(4)示例的成分
正如上面详细描述的那样,在亲和规程的一个实施方案中,基材的表面可以用表面改性剂改性。示例性的表面改性剂可用于促进包被的基材与靶的相互作用。优选的表面改性剂在包被的基材和靶之间提供了比其它包被的基材或未包被的基材更高的亲和性。
本发明预料到基材可以用多种表面改性剂包被,此外基材可以用单一的表面改性剂或一种以上的表面改性剂包被。可以预料到某些表面改性剂将对特定种类的靶(例如所有的DNA或所有的RNA或所有的细菌细胞)具有亲和性,同时其它的表面改性剂将对特定的靶(例如特定的细菌种类,或孢子相对于特定的细菌或细菌类的细胞形式)具有亲和性。本领域的专业技术人员可以容易地测试各种表向改性剂,并且选择对所需的靶具有所需的亲和性的试剂。
在鉴定了所需的表面改性剂之后,许多基材中的任何一个可以被包被或衍生,以使基材的表面被表面改性剂包被。本发明预料到某些表面改性剂可以更容易地包被或与特定的基材共价相互作用,因此每种表面改性剂可能不适合于包被每种可能的基材。但是,根据具体的应用、靶、样品等,本领域的专业技术人员可以容易地选择适当的基材用表面改性剂包被。
本发明的一个方面是获得含有硅的表面改性剂,对基材的表面进行改性,得到图2中描述的表面改性基材。基材可以用任何数量的表面改性剂改性,表面改性的程度一般被表达为每克中表面覆盖的摩尔量。基材也可以用一种以上类型的表面改性剂,通过连续地或同时地加上试剂来改性。本发明预料到使用两种或多种对同样的靶都具有亲和性的表面改性剂,以及使用两种或多种对不同的靶具有亲和性的表面改性剂。
图2中左图提供了表面改性剂的图形,右图提供了被改性的基材的图形。图2中显示的改性的基材可用于从多种生物、环境或化学样品中鉴定和/或分离靶(亲和规程)。为方便起见,图2显示的图形使用了几个变量,本发明预料到了使用其变量如下的表面改性剂。我们注意到对于给定的结构,按照化合价和稳定性的许可选择变量。
R1=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
R2=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
R3=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
M=金属
X=NR、O
R=取代的或未取代的烷基、烯基、芳香基或杂芳香基、氢
Y=连接物/间隔物=取代的或未取代的烷基、烯基、芳香基或杂芳香基、硅烷基、硅氧烷基、杂烷基
Z=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R、N(CO)R、PR2、PR(OR)、P(OR)2、SR、SSR、SO2R、SO3R
图2中的例子显示了含有硅的表面改性剂和基材之间的结合仅发生在一个点。本领域的专业技术人员众所周知的是,结合可以通过置换R1、R2或R3包括R1、R2或R3的任何组合而在含有硅的表面改性剂和基材之间给出两个或三个结合点。本领域的专业技术人员也众所周知的是,结合可以通过置换一个含有硅的表面改性剂的和第二个以前结合到基材上的含有硅的表面改性剂的R1、R2或R3而发生。含有硅的表面改性剂和基材之间任何形式的结合(例如共价的或非共价的)对于实现本发明是可以接受的。
表面改性剂典型地含有结合区域,该区域含有与至少一个可水解的部分成键的硅原子,或选含有显示为Y的间隔物/连接物,以及显示为Z的活性区域。硅原子典型地用显示为Y的间隔区所取代,但是该基团是可选的,Z可以直接结合到硅上。硅也典型地用3个标记为R1、R2和R3的基团所取代,这些基团可以是相同的,也可以是不同的,只要一个基团是可水解的就行。可水解的基团可以是但不限于H、F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、NR2、SiR3、NCO和OCOR。
间隔物区一般是烷基(取代或未取代的)、烯基、基于芳香族硅烷或硅氧烷的有机部分,它们可以被其它的有机部分取代,例如酰卤、醇、醛、烷烃、烯烃、炔烃、酰胺、胺、芳烃、杂环芳烃、氮化物、羧酸、二硫化物、环氧化物、酯、醚、卤化物、酮、腈、硝基、酚、硫化物、砜、磺酸、亚砜、硅烷、硅氧烷或巯基。烷基、烯基或基于芳基的有机基团可以含有最多50个碳原子,更优选含有最多20个碳原子,最优选含有最多10个碳原子。基于硅烷或硅氧烷的硅基团可以含有最多50个硅或碳原子,更优选含有最多20个硅或碳原子,最优选含有最多10个硅或碳原子。连接到Y间隔物区、或直接连接到硅上的是显示为Z的活性区。活性区被用来吸引和结合所需的生物体或生物分子(靶)。靶与活性区的结合可以通过多种相互作用而进行。不受理论的束缚,活性区和靶之间的结合可以通过范德华相互作用、氢键、共价键和/或离子键而发生。
此外,我们注意到活性区也可以含有烷基、烯基或基于芳香基的有机基团,它们可以被其它的有机基团取代,例如芳基卤化物、醇、醛、烷、烯、炔、酰胺、胺、芳烃、杂环芳烃、氮化物、羧酸、二硫化物、环氧化物、酯、醚、卤化物、酮、腈、硝基、酚、硫化物、砜、磺酸、亚砜、硅烷、硅氧烷或巯基。烷基、乙烯基或基于芳香基的有机部分可以含有最多50个碳原子,更优选含有最多20个碳原子,最优选含有最多10个碳原子。结合到Y间隔物区,或任选直接结合到硅的是示作Z的活性区域。活性区域用于吸引和结合目的生物体或生物分子(靶)。靶结合到活性区域可以通过多种相互作用进行。不受理论的限制,活性区域和靶之间的结合可以通过范德华相互作用、氢键、共价键,和/或离子键进行。
另外,我们注意到活性区域还可以包括烷基、烯基,或基于芳香族的有机部分,其可以被其它的有机部分取代,例如酰卤、醇、醛、烷烃、烯烃、炔烃、酰胺、胺、芳烃、杂环芳烃、氮化物、羧酸、二硫化物、环氧化物、酯、醚、卤化物、酮、腈、硝基、酚、硫化物、砜、磺酸、亚砜、硅烷、硅氧烷或巯基。烷基、烯基或基于芳基的有机基团可以含有最多50个碳原子,更优选含有最多20个碳原子,最优选含有最多10个碳原子。
本发明的第二个方面是获得含有硅的表面改性剂,并改性基材的表面以给出图3中显示的材料。在本发明的这个方面,表面改性剂中活性区的数目超过一个,彼此之间由间隔物区分开。可以认识到,当在表面改性剂上使用了一个以上活性区时,活性区可以以线性的方式或分支的方式连接到间隔物/连接物区。本发明还预料到一个以上活性区可以结合到间隔物区,该间隔物区本身可以是分支的。表面改性剂上的活性区数目可以是从2到1000的任何数目,优选范围从2到100,更优选范围从2到20,最优选从2到5。
表面改性剂上的活性区可以是相同的也可以是不同,表面改性剂上的间隔物区可以是相同的也可以是不同。基材可以用任何数量的表面改性剂改性,表面改性的程度一般被表示成每克中表面覆盖的摩尔量。基材也可以用一种以上的表面改性剂改性,这些试剂可以连续地或同时地连接上。
图3中左图提供了表面改性剂的图形,右图提供了被改性的基材的图形。图3中显示的改性的基材可用于从多种生物、环境或化学样品中鉴定和/或分离靶(亲和规程)。为方便起见,图3显示的图形使用了几个变量,本发明预料到了使用其变量如下的表面改性剂。我们注意到对于给定的结构,按照化合价和稳定性的许可选择变量。
R1=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
R2=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
R3=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R
M=金属
X=NR、O
R=取代的或未取代的烷基、烯基、芳香基或杂芳香基、氢
Y=取代的或未取代的烷基、烯基、芳香基或杂芳香基、硅烷基、硅氧烷基、杂烷基
Z=F、Cl、Br、I、OH、OM、OR、R、NR2、SiR3、NCO、CN、O(CO)R、N(CO)R、PR2、PR(OR)、P(OR)2、SR、SSR、SO2R、SO3R
对于用图2中显示的改性剂、图3中显示的改性剂或其它改性剂改性的基材来说,本发明预料到了任何可以被改性的基材。此外,基材的大小和形状可以根据技术的具体应用而改变和选择。示例性的形状包括球形、不规则形和杆状,大小和形状参考平均基材的大小和形状。基材可以是实心的、有凹陷的或多孔的,本领域的专业技术人员将会容易地认识到这会影响基材表面积,因此将影响可能的表面覆盖物的量。可以理解,基材的大小可以在平均值附近变化,在本发明的某些情况下,混合不同大小的基材可能是有优势的。例如,在某些实施方案中,使用各种大小的包被的珠子可能是有优势的。一般来说,基材大小可以在0.01到100mm的范围内。在某些应用中,基材的直径将在0.5到10mm、1到5mm、或1到2mm的范围内。在其它的应用中,基材直径将优选在0.01到500μm、从0.1到120μm、或从1到50μm的范围内。但是,本发明还预料到了较大的表面例如板和碟的改性,以及改造本发明的方法和成分用于大规模的工业应用。
基材可以用任何材料制成。优选的基材具有全部或部分由金属氧化物、氢氧化物或卤化物构成的表面。本领域的专业人员将会认识到,任何金属氧化物表面可以含有氢氧化物官能团,它既可以是天生的,也可以是通过处理将金属氧化物部分水解而产生的。此外,任意金属卤化物还可以含有氢氧化物官能团,它既可以是天生的,也可以是通过处理将金属卤化物部分水解而产生的。在本发明中也可以使用有机表面以提供具有现成的或潜在形式的氢氧化物基团的表面。优选的材料是含有二氧化硅或氢氧化硅的材料,其中含有或不含有其它的金属或金属氧化物或金属卤化物。其它用于本发明的方法的基材包括玻璃和塑料。
在本发明的某些情况下,基材将含有足够量的材料使基材具有顺磁性(在本文中称为具有磁性特征),使得基材被吸引到磁场中。在本发明的优选形式中,基材将含有铁、镍或钴,在更优选的形式中,基材将含有铁或铁氧化物。在这种情况下,使用顺磁性基材是具有优势的,因为磁场可以被用来将磁性基材与其它非磁性的材料分离开来。
在本发明的某些其它情况下,基材将含有一个孔,使得一条细绳可以穿过基材。这样的细绳、系绳或其它连接手段可以将基材联系到一起,并可以用来便利后面的基材或基材-靶复合物的回收。
在本发明的某些情况下,将表面改性剂的活性区与基材拆分开来是有优势的。因此,本发明预料到了含有可剪切的连接物的改性剂。可剪切的连接物的存在允许从基材上的其余部分释放出改性剂的活性区和靶。以这种方式释放靶的能力可以极大地便利靶的进一步分析。例如,释放靶的能力在基材和靶之间的结合非常强的情况下可能是特别重要的。
拆分的方法可以包括用任何破坏或反转吸引靶和活性区的结合力的方法或化学材料处理表面改性的基材。这包括改变pH或盐浓度、将复合物暴露到热中、以及将复合物暴露到光中。我们注意到使用这样的方法不会破坏或剪切改性剂本身,而是会从活性试剂上释放出靶,同时留下完整的改性剂。
在其它方面,本发明预料到靶的释放包括了改性剂中位点内的剪切(例如剪切连接物并释放出活性区和靶)。这可以通过剪切间隔物区中的共价键,从而将表面改性剂的活性区与基材分离开来而实现。这也可以通过剪切连接区中的共价键,从而将表面改性剂的活性区与基材分离开来而实现。可用于诱导改性剂中的剪切事件的特别具体的方法的例子可以在实施例中发现。
(5)示例的筛选分析方法
本发明提供了亲和规程用于从样品中鉴定和/或分离靶。基材可以用多种方法改性,以进一步促进基材与特定靶的相互作用。例如,基材的表面可以用一种或多种表面改性剂例如本文提供的含有胺的试剂来改性。
为了鉴定多种促进靶与改性基材的相互作用的表面改性剂,本发明预料到了筛选方法以进一步鉴定能够用做改性剂的试剂。在允许相对有效地评估基材包被物的适当的分析方法的帮助下,本领域的专业技术人员可以容易地筛选多种包被物,并鉴定可用于促进基材与特定靶的相互作用的包被物。例如,人们可以特异性筛选能够促进基材与DNA、RNA、广泛的细菌细胞和孢子、或特定的细菌细胞和孢子的相互作用的包被物。
我们提供了几种筛选分析方法,可用于有效地鉴定用于亲和规程的表面改性剂。用候选表面改性剂改性的基材可以使用这些分析方法中的任何一种来筛选,包被有一种或多种候选表面改性剂的基材与靶的相互作用的能力可以被评估。用候选试剂包被的基材与特定靶的相互作用比未包被的基材与靶的相互作用具有更高的亲和性,该被包被的基材可以进一步分析以确定它们的靶特异性、生产的容易性等。
分析方法1-流式细胞筛选分析。在图4中示意的下面的规程是分析方法的一个代表,可用于容易地评估多种候选基材包被物的有效性。将细菌在适当的条件下培养到对数后期或静止期,并进行荧光染色。使用流式细胞仪计数细菌样品(每毫升105到107细胞,标准偏差少于15%)得出起始浓度。细菌与溶解在具有不同pH(2、7、10)的磷酸盐缓冲液(PBS)或去离子水(pH5)的包被的基材混合。通过基材包被,某些量的细菌将吸附在珠子上。在将基材与靶混合后,将样品缓慢地通过5m的PVDF注射过滤器(Millipore)过滤,以除去结合细胞的基材,允许游离的细胞通过过滤器进入试管。过滤器的孔径可以根据靶的大小和珠子的大小进行调整以进行有效的分离。通过过滤器的未结合的细菌用流式细胞仪分析,并计算出被珠子移除的细菌的百分数(图4)。不加基材的细菌的样品也通过同样类型的过滤器作为对照。
使用这种分析方法,可以快速评估和比较大量的基材包被物。值得进一步分析的侯选包被物是那些比未包被的基材更容易结合细菌细胞(例如促进靶和基材的相互作用)的包被物。
发现样品之间通过流式细胞仪计数的细菌是可重复的,通过流式细胞术计算的细胞密度与通过光学显微镜确定的预期的细胞密度一致,误差在两个标准偏差之内。
分析方法2-荧光筛选分析方法。在图5中示意的下面的规程代表了第二种分析方法,可用于容易地评估多种候选基材包被物的有用性。为了对基材与核酸的的亲和性进行定量,开发了能够用于定量被特定的包被基材捕获的dsDNA的百分数的荧光技术。本分析方法的一个重要应用是用于评估目前可用的和新的包被物作为表面改性剂的能力。
将适当体积的适当混合缓冲液放入离心管中。缓冲液可以根据具体的样品和靶进行选择。在加入任何基材之前计算dsDNA的量。对于体外筛选分析方法,适合的dsDNA的起始浓度在50pg/ml到1μg/ml的范围内。在dsDNA中加入Pico-green dsDNA插入染料。Pico-green具有488nm的激发波长和522nm的发射波长。其它的荧光插入染料也可以使用,本领域的专业技术人员可以选择具有适当的激发和发射特征以易于实验室分析的染料。其它常用的荧光插入染料包括但不限于吖啶橙、碘化丙啶、DAPI、SYBR绿1和溴化乙锭。在加入染料后,将染料与DNA混合,测量荧光。这为分析提供了基线。
在标记的DNA样品中加入包被的基材,允许基材和样品混合。摇动和振荡大约30秒以允许吸附发生。通过离心或沉降将基材与游离的DNA分离,测量溶液中残留的DNA的荧光。
通过比较加入包被基材之前和之后DNA混合物的荧光,人们可以定量每种包被基材的捕获效率。这允许评估多种基材包被物中的任一种。
分析方法3-PCR筛选分析方法。PCR也可以用于通过确定加入包被基材之前和之后样品的循环数来测定吸附。步骤与上面描述的用于荧光分析方法的步骤相同,除了不需要使用插入试剂来染色DNA之外。DNA起始储存溶液的样品,以及加入基材并混合后移除的上清液的样品通过PCR进行比较。从加入基材后的样品扩增DNA所需的循环数的增加表明DNA吸附到了基材上。
(6)示例的装置
本发明提供了两类装置。第一类装置被设计成便于改性的基材与大量样品的有效相互作用。这样的装置对于大规模工业场所中亲和规程的应用是有用的,在这些场所中很难方便地将基材与含有特定靶的样品相接触,因此本装置对于靶在整个样品中分布不均匀的情况是特别重要的。
在本文中详细描述的亲和规程和亲和磁性规程使用基材例如珠子从材料例如液体、淤泥和空气中捕获靶。大量的样品材料需要有效地混合以使基材-靶相互作用和珠子表面的捕获效率最大化。本发明的第一类装置是根据现有的用于混合高粘浆料的技术进行修改而设计的。这些技术利用了无序混合原理,被称为轴颈轴承流动(是指轴颈轴承中流体的流动,轴颈轴承是一个包绕着实心辊(shaft)的中空圆柱,绕其轴旋转)。轴颈轴承流动一般被用来大量地(多加仑量)混合粘稠的流体例如油和水泥。其原理是将材料放置在带有一个环形套筒(annulus)的圆柱状容器中,这是通过将第二个圆柱放置在第一个圆柱内部而形成的。两个圆柱彼此偏心排列,绕它们的纵轴以慢速(一般低于每分钟20转)同向或反向转动。慢速转动使得环形套筒内部的材料拉伸和折叠,因此降低了材料中任何两个微粒之间的相互作用距离。在经过多次旋转的过程后,可以达到有效的混合。图6显示了圆柱体的构型,并显示了模拟的结果,表明在混合后微粒的分配相当均匀。
图7示意了本原理在一个特定情况下的应用,在该特定情况中分析了土壤样品中的靶。样品和基材与水混合形成淤泥。使用无序混合方法将基材与样品完全混合。然后从样品中提取基材,释放到水或其它缓冲液中。
在本发明的实施例部分详细描述了被设计以便于混合基材和样品的具体装置。此外,实施例还提供了证明该装置在代表性情况中的效能的数据。本发明预料到对这类装置的多种改变,在本文中称为“I类装置”、“I类设备”、“无序混合装置”或“无序混合设备”。装置实际上可以是任何大小的,根据必需被容纳的样品的总体积可以将装置的大小放大或缩小。装置的关键特点不是它的总大小,而是(1)存在两个偏心放置的圆柱,(2)外部圆柱比内部圆柱大,以及(3)圆柱以相对低的速度旋转。圆柱的大小和形状可以变化,两个圆柱不必具有同样的形状。此外,一个或两个圆柱可以被改变以增加其表面积,这可以通过例如在内圆柱的外表面和/或外圆柱的内表面上加上翅、叶片或棱状凸起而达成。这些翅或叶片不仅增加了表面积,而且增加了样品在混合中的垂直循环,因此增加了基材-靶相互作用。
本发明预料到圆柱可以是实心的或空心的,圆柱应该是实心的还是空心的可以根据圆柱的大小和用来建造圆柱的材料来决定。这些因素将影响圆柱的重量和强度,以及建造它们的花费。圆柱可以用多种材料制成,两个圆柱不必由同样的材料制成。材料可以根据圆柱的大小和形状以及样品、基材和靶的具体类型而选择。示例性的材料包括但不限于特氟隆、不锈钢、铁或其它金属以及塑料。此外,本发明预料到圆柱可以用材料例如金、铂、铁、特氟隆等进行电镀,以改善圆柱的特定性质。
圆柱的旋转可以以相同的方向或相反的方向(例如两个圆柱可以都是顺时针旋转,两个圆柱可以都是反时针旋转,或者可以一个圆柱顺时针旋转同时另一个圆柱反时针旋转)。圆柱的旋转应该以相对慢的速度进行,范围为5-50rpm,优选为10-20rpm。示例性的装置中圆柱的旋转应该以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20rpm进行,但是本发明预料到最适的旋转可以根据具体的样品、被混合的总体积和具体的靶来选择。
本发明还预料到当珠子在混合物中循环时,可以使用变化的外部磁场例如外圆柱外部的旋转磁场来影响珠子的动力学。当基材具有磁性性质时(例如包被的或未包被的磁珠),这可能是特别有用的。在另一个在这些装置中使用磁场的应用中,内部圆柱可以通过被建造成电线缠绕铁核心而成的电磁铁而适合于双重目的。在使用具有磁性特征的基材的实施方案中,当电磁铁被激活时,内圆柱可以用做基材的收集杆。以这种方式,内圆柱可以发挥两种功能,作为便利基材和靶混合的设备和作为在混合后收集基材-靶复合物的装置。
本发明还预料到了第二类装置。这些装置包含了含有一种或多种基材的滤器或柱体。含有一种或多种能够与靶相互作用的基材的滤器和柱体的设计将便利各种空气和液体样品的监测和分析。例如这些滤器和柱体将允许对在建筑物、飞机和公共运输车辆中循环的空气进行更详细的分析,以及对水库和溪流中的水进行分析。
本发明预料到适合于亲和规程的滤器和柱体可以单独使用,也可以与以前公布的能够便利DNA分析的滤器和柱体(参见美国公开号2003/0129614,在此以其全文引为参考)结合使用,也可以与其它可商购的用于分析空气和水的滤器(例如HVAC空气滤器、HEPA滤器、基于活性炭的水滤器等)结合使用。
图27-30提供了一些示例性的滤器和柱体设计的图。但是,本发明预料到了多种滤器和柱体设计。在某些实施方案中,柱体或滤器含有多层基材。每层可以含有同样的基材,也可以含有不同的基材。在其它的实施方案中,柱体或滤器只含有单层,但是单层可以含有多种基材,或用多种表面改性剂改性的单一基材。
需要特别注意的是,对于本发明的所有基材和改性的基材,适合亲和规程的滤器和柱体适合于在多种条件下使用,可以被容易地改变或加工用于分析,可以被用于工作台(例如医生的办公室、医院、实验室、加工厂)或野外(例如被怀疑有污染的位点、机场跑道、犯罪现场)。
实施例
本发明现在已经进行了大概的描述,参考下面的实施例后将更容易被理解,这些实施例的目的只是为了说明本发明的某些特点和实施方案,并不打算对本发明进行限制。
实施例1、亲和规程的应用
正如在上面详细描述的那样,亲和规程提供了改进的方法用于从样品中鉴定靶。该规程可以单独使用,也可以与SNAP方法结合使用,可以从各种组合的样品中鉴定广泛范围的靶,可以与各种基材一起使用。一种可以用于鉴定特定靶的基材是可商购的磁珠。这样的珠子可以从许多制造商获得,具有各种大小和形状,可以由各种材料制成。这些因素中的每一种都可以根据具体的靶、样品和其它因素而进行最适化。
下面的方法简单地概述了在亲和规程中使用可商购的磁珠作为基材的方法。可商购的磁珠在缓冲液中运输。在使用前,珠子如下清洗:将1mL磁珠放置在微量离心管中,以最大的微量离心速度(14000rpm)将珠子离心下来,从珠子沉淀上面移除所有液体,悬浮在蒸馏水中,如果需要重复洗涤珠子。
为了进行图1中图示的液体样品的亲和规程,人们必须获得含有特定的所需靶的液体样品。短暂地振荡样品以混合,将一部分样品放入微量离心管。对于固体样品例如土壤样品,获取样品并放置在微量离心管中。在样品中加入过滤的蒸馏水,混合后产生淤泥。
在最初制备了样品后,在含有样品的管中加入制备的磁珠,关闭管子。将含有样品和珠子的管放置在旋转混合器中10-20分钟。使用收集磁体将珠子吸到管的边上,放置足够的时间以确保所有的珠子都迁移了。收集时间应该为10-20秒。使用带有过滤嘴的吸管,从管中移出几乎所有液体,只留下少量,注意不要扰动收集在管边的磁珠沉淀。轻轻地使用前面步骤留下的少量液体将基材(应该与靶结合的基材)重新悬浮。在靶-基材复合物被重新悬浮后,移出所有的液体(含有靶-基材复合物),施用到可商购的媒介例如Isocode纸上(这允许对你的样品进行SNAP方法)。
在上面详细描述的亲和规程步骤后,从样品中获得的核酸可以使用Isocode纸或其它SNAP方法进行处理,然后通过PCR或其它常用的分析核酸的技术对核酸进行分析。简单地说,将三角形Isocode纸在碟子中干燥,使用下面四种方法中的一种:将含有三角形的碟子(未覆盖的)在真空炉中于60℃±5℃放置15分钟,将含有三角形的碟子(未覆盖的)在温箱中于60℃±5℃放置15分钟(确保在湿盘中没有水),将含有三角形的碟子(未覆盖的)在生物安全通风橱中于室温放置直到完全干燥,或者将每个含有三角形的碟子装在一个含有干燥剂袋的密封囊中于室温放置直到完全干燥。在样品已经干燥后,继续用SNAP规程处理以从IsoCode上将靶洗脱下来,然后用PCR或其它常用的分子生物学方法分析核酸。
实施例2、表面改性剂的初步分析——可商购基材的分析
我们对19种不同包被和大小的可商购磁珠(表1)进行了初筛以确定它们在亲和规程中的有用性。目标是为了确定哪种可商购珠子能够提供最好的全面效能,与仅使用SNAP规程所获得的相比有增加的信号(减少了使用PCR时的循环数)。对从各种样品中分离和鉴定核酸时能够提供增加的效能的可商购基材和包被物的性质的鉴定,能够用来发展出合理的策略,用来设计其它的基材和包被物。在这些使用可商购珠子的实验中,每种珠子的效能被评估,以与仅用SNAP分析靶时进行比较。每种珠子的结合效能使用前述的荧光和流式细胞分析方法来评估。
表1、可商购的磁珠
珠子号 | 公司 | 描述 | 大小(μm) |
1 | Cortex Biochem | PS-DVB-胺-酰胺 | 3.2 |
2 | Cortex Biochem | PS-DVB-COOH-芳基酸 | 3.2 |
3 | Cortex Biochem | 活性炭上的聚丙烯酰胺 | 1-25 |
4 | Cortex Biochem | 纤维素 | 1-10 |
5 | Cortex Biochem | 丙烯醛 | 1-10 |
7 | AB Gene | 聚苯乙烯-COOH | 3.5 |
8 | MPG | 二氧化硅 | 0.5-5.0 |
9 | BioSource | 链亲和素 | 1 |
10 | Bugs n’Beads | 聚乙烯醇 | ~1 |
11 | Dynabeads | PS-胺 | 2.8 |
12 | Polysciences | COOH | ~1 |
13 | Polysciences | COOH | ~1 |
14 | Sperotech | PS-COOH(光滑/encap/无交联) | 3.0-3.2 |
15 | Sperotech | PS-COOH(encap/无交联) | 3.0-3.2 |
16 | Sperotech | PS-COOH(encap/无交联) | 1.5-1.9 |
17 | Sperotech | PS-COOH(encap/无交联) | 1.1-1.4 |
18 | Sperotech | PS-COOH(encap/无交联) | 4.0-4.5 |
19 | Sperotech | PS(encap/无交联) | 4.0-4.5 |
Cortex Biochem | 羧甲基纤维素(Cat.Exch.) | 1-10 | |
Cortex Biochem | 二乙氨基乙基纤维素(An.Exch.) | 1-10 | |
Cortex Biochem | 链亲和素的胺前体 | ~1 |
简单地说,图8概述了可商购磁珠的分析结果。数据对只用SNAP分析的样品的信号进行标准化,以便图中出现的图示能够表明哪种珠子比仅使用SNAP时增强了信号。土壤样品以每克土壤104细胞的浓度接种营养期的炭疽杆菌(B.Anthracis)。土壤样品与以不同亲和性结合了细菌细胞的珠子相接触。
图8表明亲和规程和SNAP技术的组合与仅使用SNAP相比增强了样品的分析。此外,图还表明某些表面改性剂能够进一步增强基材和靶之间的相互作用。
我们也检测了几种可商购的非磁珠。我们注意到尽管初筛了大量的珠子,只有50μm大小的珠子被直接比较并报道数据。
表2、可商购的非磁珠
珠子号 | 公司 | 描述 | 大小(μm) |
1 | Aldrich | 氨基丙基二氧化硅(NH2) | 50 |
2 | Aldrich | 氯丙基二氧化硅(Cl) | 50 |
Aldrich | 硅藻土 | n/a | |
3 | YMC | 二元醇(OH2) | 50 |
4 | YMC | 二氧化硅(YMC)(SiO) | 50 |
Aldrich | Amberlyst强阴离子交换大孔树脂36 | >1μm | |
Aldrich | amberlitelCR阳离子交换树脂 | >1μm | |
Aldrich | amberliteIRC阴离子交换树脂 | ≥1μm | |
Aldrich | 中性氧化铝 | 25-50 | |
Aldrich | 微酸性氧化铝 | 25-50 | |
Aldrich | 酸性氧化铝 | 25-50 | |
Aldrich s | 碱性氧化铝 | 25-50 | |
5 | YMC | 胺(NH2) | 50 |
YMC | 胺(NH2) | 10 | |
6 | CPG | 氨基丙基(NH2) | 40-70 |
7 | CPG | 长链胺(15A)(NH2) | 40-70 |
8 | CPG | 甘油(OH2) | 40-70 |
9 | CPG | 羧基(COOH) | 40-70 |
10 | CPG | 羧甲基(COOMe) | 70-120 |
11 | CPG | 二氧化硅(SiO) | 40-70 |
这些珠子的效能通过将珠子与样品保温后测量吸附到珠子上的DNA的百分数来评估,这些结果概述在图9中。我们注意到胺官能化的珠子增强了基材和DNA之间的相互作用。因此正如在本文中详细描述的那样,本发明设计了各种其它的胺官能化表面改性剂,并且预料到其它的胺功能化表面改性剂也可以被设计以促进基材和靶之间、特别是基材和核酸之间的相互作用。
我们注意到尽管基材与DNA的相互作用在本实验中被直接测试,基材与其它的核酸例如RNA的相互作用也可以被评估。基于RNA的化学结构,与DNA相互作用的基材可能能与RNA相互作用,可以被用来从样品中分离靶RNA。在靶是RNA的方法中,方法可以进一步改性以防止通常不如DNA稳定的RNA的降解。
实施例3、制备含有胺的表而改性剂
在我们对含有各种可商购包被物的可商购珠子(例如基材)进行分析后,我们制备了多种新包被的基材,以评估这些包被基材在亲和规程中的实用性。具体来说,我们聚焦于含有胺的表面改性剂,但是,同样的实验可以使用其它类别的表面改性剂容易地进行。正如在本文中详细描述的那样,我们制备了大量的表面改性剂,并使用这些试剂改性了各种不同大小、形状和材料的基材。
A、制备50微米的表面改性硅胶
用2.0克从Waters股份公司购买的50微米微粒硅胶(YMC-硅胶)和20ml异丙醇制备了悬浊液。在悬浊液中加入10mmol表面改性剂。将悬浊液轻轻搅拌16小时,然后过滤。硅胶被重新悬浮在20ml异丙醇中,再过滤两次以除去未反应的表面改性剂。表面改性的硅胶在真空炉中于50℃干燥过夜。表面改性的量通过热解重量分析来确定。表3列出了使用的表面改性剂和得到的改性的50微米微粒硅胶确定的表面覆盖度。符号W表示生成的基材是改性的Waters股份公司硅胶,字母被用来表明使用的表面改性剂。
表3
样品 | 表面改性剂 | 表面覆盖度(mmol/gm) |
W-A | 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | 1.00 |
W-B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 | 0.63 |
W-C | N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | 0.76 |
W-D | N-三甲氧基硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵 | 0.61 |
W-E | 双(2-羟基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷 | 0.45 |
W-F | (N,N-二甲基氨基丙基)三甲氧基硅烷 | 0.79 |
W-G | N-(3-三乙氧基硅烷丙基)-4,5-二氢咪唑 | 0.50 |
W-H | 2-(三乙氧基硅烷基乙基)吡啶 | 0.46 |
W-I | (氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷 | 0.75 |
W-J | 2-(二苯基膦基乙基三乙氧基硅烷 | 0.29 |
W-K | 十四烷基二甲基(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 | 0.30 |
W-L | 二乙基磷酸基乙基三乙氧基硅烷 | 0.33 |
W-M | 3-巯基丙基三甲氧基硅烷 | 0.47 |
W-N | N-苯基氨基丙基三甲氧基硅烷 | 0.09 |
W-O | N-(6-氨基己基)氨基丙基三甲氧基硅烷三甲氧基硅烷 | 0.66 |
W-R | N-(三甲氧基硅烷基丙基)乙二胺三乙酸三钠盐 | 0.15 |
W-S | N-(2-氨基乙基)-11-氨基十一烷基三甲氧基硅烷 | 0.67 |
W-T | N-(3-三乙氧基硅烷基丙基)葡糖酰胺 | 0.66 |
W-U | N-(三乙氧基硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷氨基甲酸乙酯 | 0.15 |
W-V | 3-(三羟基硅烷基)-1-丙磺酸 | 0.09 |
W-W | 羧基乙基硅烷三醇 | 0.24 |
W-X | N,N-二癸基-N-甲基-N-(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 | 0.37 |
W-Y | 2-[甲氧基(聚氧乙烯基)丙基]三甲氧基硅烷 | 0.15 |
B、制备1毫米的表面改性钠钙玻璃珠
用2.0克从PGC科技公司购买的1毫米钠钙玻璃珠和2ml 10%的硝酸水溶液制备悬浮液,轻轻搅拌回流30分钟。将硝酸溶液倒掉,珠子被过滤,用去离子水清洗。然后将珠子加入到2ml 10N的氢氧化钠中,轻轻搅拌回流120分钟。将氢氧化钠溶液倒掉,珠子被过滤,再次用去离子水充分清洗。珠子在真空下于100℃干燥4小时。
用干燥的珠子、1ml表面改性剂和19ml无水甲苯制备悬浮液。将悬浮液轻轻搅拌45分钟并过滤。珠子用甲苯清洗,用乙醇清洗,在室温真空干燥3小时,在100℃真空干燥30分钟。表面改性的量通过进行Kaiser试验然后测量575nm处吸收值的变化来确定。表4列出了使用的表面改性剂和得到的改性的1毫米钠钙玻璃珠确定的表面覆盖度。符号PS表示生成的基材是改性的PGC钠钙玻璃珠,字母被用来表明使用的表面改性剂。
表4
样品 | 表面改性剂 | 表面覆盖度(μmol/gm) |
PS-B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 | 0.52 |
C、制备1毫米的表面改性硼硅玻璃珠
用2.0克从PGC科技公司购买的1毫米硼硅玻璃珠和2ml 10%的硝酸水溶液制备悬浮液,轻轻搅拌回流30分钟。将硝酸溶液倒掉,珠子被过滤,用去离子水清洗。然后将珠子加入到2ml 10N的氢氧化钠中,轻轻搅拌回流120分钟。将氢氧化钠溶液倒掉,珠子被过滤,再次用去离子水充分清洗。珠子在真空下于100℃干燥4小时。
用干燥的珠子、1ml表面改性剂和19ml无水甲苯制备悬浮液。将悬浮液轻轻搅拌5小时并过滤。珠子用甲苯清洗,用乙醇清洗,在室温真空干燥3小时,在100℃真空干燥30分钟。表面改性的量通过进行Kaiser试验然后测量575nm处吸收值的变化来确定。表5列出了使用的表面改性剂和得到的改性的1毫米硼硅玻璃珠确定的表面覆盖度。符号P表示生成的基材是改性的PGC硼硅玻璃珠,字母被用来表明使用的表面改性剂。
表5
样品 | 表面改性剂 | 表面覆盖度(μmol/gm) |
P-A | 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | 4.05 |
P-B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 | 2.50 |
P-D | N-三甲氧基硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵 | ND |
D、制备6.0微米表面改性磁性微粒
将0.1克6.0μm的磁性微粒悬浮在1.9ml从MicromodPartikeltechnologie购买的水(Sicastar-M-CT)、0.5mmol表面改性剂和1.25ml异丙醇中制备成悬浮液。将悬浮液轻轻搅动16小时。用磁体将微粒沉降,倒弃液体。下面的步骤执行两次。在微粒中再加入4ml异丙醇,将新的悬浮液剧烈搅拌1分钟,用磁体将微粒沉降,倒弃液体。表面改性的硅胶在真空炉中于50℃干燥过夜。表面改性的量通过热解重量分析来确定。表6列出了使用的表面改性剂和得到的改性的6.0微米磁性微粒确定的表面覆盖度。符号S6表示生成的基材是改性的来自Sicastar的6μm磁性微粒,字母被用来表明使用的表面改性剂。
表6
样品 | 表面改性剂 | 表面覆盖度(mmol/gm) |
S6-A | 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | 0.11 |
S6-B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 | 0.06 |
S6-D | N-三甲氧基硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵 | 0.09 |
E、制备5.0-10.0微米表面改性磁性微粒
将0.1克5.0-10.0μm的磁性微粒悬浮在3.2ml从CPG公司购买的水(未包被的MPG)、0.5mmol表面改性剂和1.25ml异丙醇中制备成悬浮液。将悬浮液轻轻搅动16小时。用磁体将微粒沉降,倒弃液体。下面的步骤执行两次。在微粒中再加入4ml异丙醇,将新的悬浮液剧烈搅拌1分钟,用磁体将微粒沉降,倒弃液体。表面改性的硅胶在真空炉中于50℃干燥过夜。表面改性的量通过热解重量分析来确定。表7列出了使用的表面改性剂和得到的改性的5.0-10.0微米磁性微粒确定的表面覆盖度。符号M表示生成的基材是改性的MPG珠子,字母被用来表明使用的表面改性剂。
表7
样品 | 表面改性剂 | 表面覆盖度(mmol/gm) |
M-A | 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | 0.11 |
M-B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 | 0.07 |
M-D | N-三甲氧基硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵 | 0.07 |
M-K | 十四烷基二甲基(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 | 0.11 |
M-P | 十八烷基二甲基(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 | 0.11 |
M-X | N,N-二癸基-N-甲基-N-(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 | 0.08 |
表8提供了在本文中更详细分析的表面改性剂的化学名。本发明预料到用一种或多种这些表面改性剂包被任何基材,在亲和规程(单独或与SNAP方法结合使用)中使用包被的基材,装置例如滤器和柱体的设计,其中具有含有用一种或多种这些表面改性剂改性的基材的层。
表8-表面改性剂
A | 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 |
B | (3-三甲氧基硅烷基丙基)二亚乙基三胺 |
C | N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷 |
D | N-三甲氧基硅烷基丙基-N,N,N-三甲基氯化铵 |
E | 双(2-羟基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷 |
F | (N,N-二甲基氨基丙基)三甲氧基硅烷 |
G | N-(3-三乙氧基硅烷丙基)-4,5-二氢咪唑 |
H | 2-(三甲氧基硅烷基乙基)吡啶 |
I | (氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷 |
J | 2-(二苯基膦基)乙基三乙氧基硅烷 |
K | 十四烷基二甲基(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 |
L | 二乙基磷酸基乙基三乙氧基硅烷 |
M | 3-巯基丙基三甲氧基硅烷 |
N | N-苯基氨基丙基三甲氧基硅烷 |
O | N-(6-氨基己基)氨基丙基三甲氧基硅烷 |
P | 十八烷基二甲基(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 |
Q | N-(三甲氧基硅烷基丙基)氯化异硫脲 |
R | N-(三甲氧基硅烷基丙基)乙二胺三乙酸三钠盐 |
S | N-(2-氨基乙基)-11-氨基十一烷基三甲氧基硅烷 |
T | N-(3-三乙氧基硅烷基丙基)葡糖酰胺 |
U | N-(三乙氧基硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷氨基甲酸乙酯 |
V | 3-(三羟基硅烷基)-1-丙磺酸 |
W | 羧基乙基硅烷三醇 |
X | N,N-二癸基-N-甲基-N-(3-三甲氧基硅烷基丙基)氯化铵 |
Y | 2-[甲氧基(聚氧乙烯基)丙基]三甲氧基硅烷 |
此外,图10中提供了每种表面改性剂A-Y的化学结构。另外我们记录了下面的信息,是关于偶联试剂A-Y每种的分子量以及称呼它们的常用缩写。
试剂 | 分子量 | 缩写 |
A | 179.29 | AP |
B | 265.43 | DETAP |
C | 226.36 | AEP 3-1-1 |
D | 257.83 | TMAP-Cl |
E | 309.48 | BHOEAP |
F | 207.34 | DMAP |
G | 274.43 | DHIAzP 2-1-1 |
H | 227.33 | PyrE |
I | 298.46 | AEAMPhE |
J | 376.50 | DPhPhoE |
K | 440.18 | TDDMAP-Cl |
L | 328.41 | DEPhaE 3-2-1 |
M | 196.34 | MCP |
N | 255.39 | PhAP |
O | 278.47 | AHAP |
P | 496.29 | ODDMAP-Cl |
Q | 274.84 | PITU |
R | 462.42 | EDTAP |
S | 334.57 | AEAU |
T | 399.51 | GAP |
U | 400-500 | POPEOU |
V | 202.26 | THOSPSA |
W | 196.14 | COESTO |
X | 510.32 | DDMAP-Cl |
Y | 460-590 | MOPEOP |
F、基于肽的表面改性剂
除了上述的基于胺的化学官能团之外,本发明还预料到了完全或部分由肽构成的表面改性剂。这样的肽可以通过可剪切的连接物直接连接到基材表面,也可以通过本身直接连接到基材表面上的化学官能团来连接。
可用做表面改性剂的示例性的肽包括任何能够与靶相互作用、以至于增加了包被的基材与该靶的亲和性的肽。适合用做表面改性剂的肽的具体的例子包括抗微生物肽类、适配体和PNA。与其它类型的基材和基材包被物一起,基于肽的表面改性剂可用于结合广范围的靶,包括DNA、RNA、蛋白、细菌细胞或孢子(包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)、病毒(DNA病毒或RNA病毒)、小的有机分子和化学化合物。优选的基于肽的表面改性剂,在促进基于肽的包被基材与靶的相互作用所需的特定条件下,将是相对稳定的。
实施例4、用于从基材释放活性区-靶复合物的可剪切的连接物
下面是非限制性的方法的例子,可以用于从表面改性剂+基材的残余物上释放活性区-靶复合物。
A、连接反应中氟化物不稳定的烷基甲硅烷基连接物
烷基甲硅烷基部分可以用在偶联区中将表面改性剂与基材相连接。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用氢氟酸剪切硅-氧键,从残余的表面改性剂+基材上释放出活性区。
B、间隔物区中的氟化物不稳定的烷基甲硅烷基连接物
烷基甲硅烷基部分可以用在间隔物区的骨架中,用来将活性区与基材相连接。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用氢氟酸剪切硅-氧键,从残余的表面改性剂+基材上释放出活性区。
C、间隔物区中的酸不稳定的羰基连接物
酸不稳定的羰基部分可以用在间隔物区的骨架中,用来将活性区与基材相连接。酸不稳定的羰基部分的例子是酰胺、酯、碳酸酯、尿烷(urethanes)和尿素。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用酸例如三氟乙酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸和硫酸剪切酸不稳定的羰基基团。
D、间隔物区中的碱不稳定的羰基连接物
碱不稳定的羰基基团可以用在间隔物区的骨架中,用来将活性区与基材相连接。碱不稳定的羰基部分的例子是酰胺、酯、碳酸酯、尿烷和尿素。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用碱例如氢氧化铵、氢氧化钠和氢氧化钾剪切碱不稳定的羰基基团。
E、间隔物区中的亲核试剂不稳定的连接物
亲核试剂不稳定的部分可以用在间隔物区的骨架中,用来将活性区与微粒相连接。亲核试剂不稳定的基团的例子是肟和磺酰胺。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用任何有机胺作为亲核试剂以产生切割。
F、间隔物区中的光不稳定的连接物
光不稳定的部分可以用在间隔物区的骨架中,用来将活性区与微粒相连接。光不稳定的部分的例子是酯、硝基取代的芳羟甲基酯和芳基取代的重氮衍生物。在将靶与表面改性剂的活性区结合后,可以使用光诱导光不稳定基团的剪切。使用的光的波长并不是关键的,但是优选的光的波长在800到100nm之间,更优选的波长在465到190nm之间,最优选的波长在365到240nm之间。
实施例5、测试新的表面改性珠子
正如上面详细描述的那样,我们合成了各种珠形的基材,该基材用各种胺官能化的表面改性剂改性。包被的珠子与双链DNA的相互作用以及它们与细菌细胞和孢子的相互作用被评估。使用字母A-P称呼这些珠子,除非特别指出,A-P也指称上面表8中显示的同样的改性(珠子P对应于珠子W-U)。具体来说,珠子是表3中描述的50μm硅胶珠子,用W表示。
图11概述的结果表明了几种胺官能化的基材增加了对DNA的吸附(图11)。为了筛选珠子的DNA吸附,将5mg 50μm的珠子加入到样品中,样品含有溶解在1.5mL pH5的去离子水中的200ng小牛胸腺dsDNA(靶)。用于吸附的混合时间被设置为5分钟以保证合理的处理时间,而较长的混合时间一般可以提高吸附效率。使用本文描述的荧光检测方法测量双链DNA与珠子的吸附。
用于检测细胞和孢子与珠子的吸附效率的条件基本上与用于检测与DNA相互作用的条件相同。简单地说,将5mg珠子与含有大约109细胞/mL的样品混合5分钟,样品溶解在1.5mL pH5的去离子水中。通过缓慢转动混合含有珠子的样品,在加入珠子之前和之后用荧光或使用流式细胞术测试溶液。样品中靶的量的减少表明较好的吸附,因此是更有效的捕获。为了测量细胞吸附,也进行了吸收值的测量以证实结果。
图12概述了两个不同的细菌细胞(两个不同的靶)与珠子A-P和珠子1-11的相互作用的分析结果。珠子1-11对应于表2中描述的可商购的珠子。简单地说,分析了各种改性的珠子与来自炭疽杆菌(Ba)或苏云金芽孢杆菌(Btk)的细菌细胞相互作用的能力。
图13概述了两个不同的细菌细胞(两个不同的靶)与珠子A-P和珠子1-11的相互作用的分析结果。珠子1-11对应于表2中描述的可商购的珠子。简单地说,分析了各种改性的珠子与来自大肠杆菌或鼠疫杆菌(Yp)的细菌细胞相互作用的能力。
图14概述了珠子A-P和珠子1-11与炭疽杆菌(Ba)细胞(营养体)或孢子体炭疽杆菌(Ba孢子)的相互作用的分析结果。珠子1-11对应于表2中描述的可商购的珠子,分析了各种改性的珠子与炭疽杆菌(Ba)营养体或孢子体形式相互作用的能力。
图15提供了扫描电子显微镜(SEM)图像。使用这些图像显示细胞(靶)物理性吸附到珠子上。简单地说,珠子与含有炭疽杆菌营养体细胞或孢子的样品一起保温,进行SEM成像以证实细胞和孢子是否与珠子物理性结合。正如在检查SEM图像时能够看到的,细胞和孢子吸附到珠子的表面上。但是,我们注意到珠子的表面对靶没有表现出饱和,即使是在大约109细胞或孢子的高浓度之下。在营养体炭疽杆菌的情况下,可以观察到细菌链跨越了几个珠子,使它们凝集到一起。
图16表明,使用亲和规程和SNAP方法分析样品与仅使用SNAP技术相比,提供了对细菌靶DNA的改进的检测。
实施例6、影响吸附的因素
本发明的方法的重要目的是鉴定允许亲和规程技术在下列条件下使用的参数:(1)可以在野外(例如犯罪现场、环境位点、事故现场等)容易地使用,以及(2)可以适应于广范围的样品、基材和靶。因此,我们进行了一系列实验,它们被设计来了解影响DNA与基材吸附的因素。
我们检测了各种pH和盐浓度对用包被物B(三胺包被物)包被的珠子的相互作用的影响。简单地说,该实验包括了调整样品溶液的pH和离子强度,然后测量对靶的捕获和随后从珠子上的释放的相应的影响。pH和离子强度都对DNA与珠子的吸附效率百分数有复杂的影响。
图17-18概述了检测双链小牛胸腺DNA与用包被物B包被的珠子的相互作用的实验的结果。DNA与珠子的相互作用受到盐浓度和pH的影响,盐浓度在0-500mM之间时这种相互作用急剧下降。
在另一组实验中,我们分析了用包被物D包被的珠子与来自水、细菌培养上清液、或非实验室级环境水样品中的DNA的相互作用。图19概述了这些实验的结果,表明了包被的珠子能够有效地结合广范围的样品中包含的靶。
实施例7、影响靶释放的因素
尽管在评估特定的包被或未包被的基材实用性的第一步是确定该基材与靶相互作用的能力,对靶的进一步分析可能需要从基材中回收靶的能力。因为许多分析靶的现代技术具有高度灵敏性,因此并不必需所有的靶都能够容易地从基材上释放下来。但是,回收足够量的靶用于进一步分析的能力是重要的。
正如我们以前对影响DNA与基材吸附的因素进行的分析所表明的那样,基材和靶DNA之间的吸附(例如靶的吸附和释放)受到pH和盐浓度的极大影响。因此,可用于从基材上释放靶的方法包括对pH和盐浓度进行操作。此外,我们发现温度对靶DNA与基材的吸附有影响(图20)。
本发明预料到多种变量的操作可以被用于从基材上释放靶(DNA、RNA、蛋白、细菌细胞等)。本领域的专业技术人员可以容易地从这些变量从选择,最适的洗脱(例如释放)条件可以根据使用的具体的基材、具体的靶、靶的浓度和起始的吸附条件来改变。可以被操作的示例性的变量包括但不限于:盐浓度(例如NaCl、CaCl2、NaOH、KOH、LiBr、HCl)、pH、亚精胺的存在、SDS的存在、缓冲液的类型(例如碳酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸缓冲液)、血清的存在、去污剂的存在、醇的存在、吸附的时间、温度、机械搅拌的使用。示例性的机械操作包括超声、使用弗氏细胞压碎器(French press)、电击、微波、脱水、振荡或使用激光。
本发明还预料到靶的释放可以通过剪切连接表面改性剂与基材之间的部分而达成。
在另一个实施方案中,本发明预料到使用电洗脱从基材中回收靶核酸。
胺表面官能化的珠子已经被开发,并显示出对DNA的高度亲和性。DETAP改性的珠子在各种液体环境中能够极好地捕获核酸。但是,尽管该基材对DNA的高度亲和性是希望的,同样也希望能够有效地从基材上释放靶以便可以对靶进一步分析。
除了其它促进从基材上释放靶的方法之外,我们还使用了电场改进DETAP珠子结合的DNA的回收效率。尽管现在实验的规程还不能有效地从基材中回收痕量的DNA,当较大的起始浓度被吸附到基材上时本方法已被证明能够成功地释放DNA。
琼脂糖和小牛胸腺DNA从Invitrogen(Carlsbad,CA)购买。琼脂糖被熔化在0.5X TBE电泳缓冲液中(45mM Tris-硼酸,1mM EDTA)。DETAP珠子被合成,批量标记PB-7将被用于表示胺官能化的珠子。GeneCapsuleTM装置从Geno技术公司(St.Louis,MO)获得。其它的标准试剂是分子生物学级别纯度的。
20个PB-7珠子放置在1mL含有50μg/mL小牛胸腺DNA的水中过夜。珠子装入正常状态的0.5%琼脂糖-TBE凝胶中,用0.2μg/mL溴化乙锭使凝胶可视化,用含有1N NaOH的上层琼脂糖覆盖。珠子也被使用含有各种浓度NaOH的0.5%琼脂糖-TBE凝胶装入GeneCapsuleTM装置中。100μL的琼脂糖床被放置在GelPICKTM中。装载的珠子被铺在这个支持床上,并放置琼脂糖覆盖层。在加入150μL新鲜的TBE,和将GelPICKTM插入到如图21所示的捕获TBE的水平之前,GelTRAPTM在TBE中平衡15分钟。在两种实验装置中电泳在200V进行15分钟,然后加上3个5秒的反向脉冲,以从GeneTRAPTM膜上释放DNA。从GeneCapsuleTM得到的洗脱物通过用吸管穿透收集孔并吸取液体来取出。
所有的低DNA装载实验都用GeneCapsuleTM装置进行,使用含有0.1N NaOH或0.1N NaOH加上100μg/mL小牛胸腺DNA的0.5%琼脂糖-TBE。每组20个PB-7珠子装载在含有5、50或500pg/mLpCR2.1Topo-BtkCryIA苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种基因拷贝标准质粒的1mL水中30分钟。如上所述,装载的珠子被铺在GelPICKTM中的100μL支持凝胶上,然后放置大约450μL琼脂糖覆盖层以填满剩余的体积。预先平衡的GelTRAPTM用150μL新鲜的TBE充满,插入装载的GelPICKTM。装载的GeneCapsuleTM在200V电泳15分钟或45分钟。通过用吸管穿透收集孔取出吸脱物。对照样品通过在室温下在150μL 0.01N NaOH加上100μg/mL小牛胸腺DNA中保温15分钟而洗脱。样品用TaqMan实时PCR进行分析。
正如图21中的凝胶所显示的那样,高的DNA上样可以使用电洗脱有效地回收。图21C显示了50μg小牛胸腺DNA装载当暴露到电场中时能够容易地从珠子中迁移。
开始我们注意到,我们的实验表明可以使用相对低的电压(大约10V/cm,15分钟)将DNA从胺珠子上分离开。下表概述了使用几个低电压电洗脱从基材释放DNA获得的结果。我们注意到在改变盐浓度的条件下,DNA的收率是好的,但是,最好的回收率是在较高NaOH浓度下(例如更碱性的环境下)观察到的。
珠子 | 琼脂糖 | NaOH | 捕获的 | 回收的 | 回收率% |
无珠子 | 0.5% | 0.00N | 50μg | 50μg | 100% |
PB-7 | 0.5% | 0.00N | 24μg | 2μg | 8% |
PB-7 | 0.5% | 0.01N | 28μg | 1μg | 4% |
PB-7 | 0.5% | 0.10N | 20μg | 9μg | 45% |
这些实验表明电洗脱是另一种能够用于从基材上释放靶的机制。现有的条件还没有被最适化用于非常低浓度的DNA,但是,结果表明电洗脱代表了从基材释放靶的一种快速、安全和高性价比的机制。
实施例8、使用可剪切的连接物从基材释放靶
正如上面详细描述的那样,本发明的一个重要特点是能够从基材释放靶以便靶可以被进一步分析的能力。一种可以便利靶从基材释放的机制是使用含有可剪切的连接物的表面改性剂,该连接物可以被特异地剪切以从基材上释放靶。本发明预料到了多种可水解的连接物的使用。
对于可剪切的连接物的使用的一种可能的担心是,诱导连接物剪切所需的试剂也可能降解靶或可能抑制靶的进一步分析。为了阐明这种可能的担心,我们在存在DETAP或水解产物DETA的情况下对靶DNA进行分析,以评估这些部分通过PCR进行DNA的进一步分子分析中可能的抑制作用。基于我们的分析,我们得出结论,DETAP和水解产物DETA的存在不会妨碍实时PCR的进一步分析DNA。
简单地说,二亚乙基三胺和(3-三甲氧基硅烷基-丙基)-二亚乙基三胺从Sigma-Aldrich获得(DETA 103.2g/mol,0.95g/mL;DETAP 265.4g/mol,1.031g/mL)。使用来自Ambion的高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理的水对每种材料进行连续稀释。
靶DNA是来自苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的粗质粒DNA或基因拷贝标准质粒pCR2.1Topo-BtkCryIA。在ABI 7700序列检测系统上使用Taqman实时PCR化学来分析样品。
Taqman实时PCR分析在标准的50μL体积中进行。除了阴性对照之外,分析试剂中加入50pg/mL靶DNA。样品中加入不同浓度的DETAP或DETA,在阳性对照中加入水。
PCR的抑制被测量为阈值循环相对于不含胺添加剂的阳性对照的阈值循环的变化。抑制百分数被取作阈值循环的变化与阳性对照的阈值循环的比率。我们的结果表明DETAP在较高浓度下可能是PCR的抑制物。但是在与基于珠子的DNA捕获和释放应用相关的浓度(大约25nmol胺官能团)下,抑制水平显著下降。在50μL PCR反应中加入20nmol DETAP导致阈值循环变化大约2(信号抑制大约9%)。
相反,我们的结果表明单独的DETA不显著抑制PCR。在基于珠子的分析中所使用的量和更高的几个数量级下,相对于阳性对照没有由加入DETA所引起的明显的阈值循环的变化。
这些结果表明使用含有可剪切的连接物的表面改性剂是一种可行的方法,可以便利基于基材的靶的捕获、那些靶的释放以及那些靶的进一步分子分析。
可用于可逆地连接表面改性剂和基材的第二类可剪切的连接物是氨不稳定的连接物。因此在第二组实验中,我们分析了氨是否能抑制对靶DNA的进一步PCR分析。
进行了两个实验。靶是将营养体炭疽杆菌在BHI(培养基)中生长过夜,在3000rpm离心5分钟沉淀细胞后获得的上清液。用BHI制备了上清液的稀释液。
不同浓度的氨与各种稀释度的炭疽杆菌上清液混合,在室温下保温。得到的混合物在ABI 7700上的标准TaqMan反应中用作洗脱物。每种洗脱物5μL(从总体积50μL中取出)被加入到PCR反应孔中,使用炭疽杆菌引物探针组。所有的样品制备双份。由上清液稀释液组成的对照(不含氨)直接放置在PCR孔中。
两套独立的实验的结果证实在PCR反应中可以添加氨直到0.005M浓度的水平而不损失任何PCR效率。即使在氨浓度达到0.05M时,也仅仅观察到PCR效率损失大约1-2数量级。此外,我们的观察表明,低水平的氨实际上可以提高PCR反应的效率,这可能是由于PCR反应混合物的pH发生了有利的变化。
实施例9、靶捕获和释放的最适化
亲和规程被广泛用于从非均一液体和固体样品中鉴定和/或分离大量的靶中的任一靶。即使是在相对未最适化的形式下,亲和规程也能提供增加的灵敏度以从非均一样品中检测小浓度的靶,因此即使是本规程的未最适化的形式,在各种场所也有明显的益处。但是对亲和规程的进一步最适化具有其它的优点,包括但不限于(1)检测更小浓度的靶的能力,(2)在较短时间内鉴定和/或分离靶的能力,(3)检测基材对样品中较高百分率可用靶的捕获的能力,(4)从基材释放/洗脱(例如用于进一步分析或分离)较高百分率的结合的靶的能力,以及(5)使用较少起始材料(例如较少的消耗物、较少基材)进行亲和规程的能力。
下面的例子详细描述了为最适化亲和规程所进行的实验,从而获得了上述的一些优点。
(a)包被基材的捕获和洗脱效率
我们试验了几种可商购的和实验室合成的包被基材,以评估每种包被基材捕获和释放靶的效率。在该具体的实施例中,靶是DNA,基材是各种用表面改性剂改性的磁珠。
使用了下面的可商购珠子:Cortex-Biochem的聚苯乙烯-胺珠子、Dynal的M-270聚苯乙烯-胺珠子、Polysciences的聚苯乙烯珠子、Biosource的硅烷化FeO-胺珠子、以及链亲和素功能化珠子。此外还使用了下列的实验室合成珠子:M-B-1、M-B-2和M-B-3。实验室合成的珠子如下制作:将5-10μm的未包被的磁性微粒(aka-5-10μm颗粒大小的珠子或直径5-10μm的珠子;从CPG公司获得)悬浮在水、表面改性剂和异丙醇的混合物中。悬浮液被轻轻搅拌16小时。用磁体将微粒沉降,倒弃液体。下面的步骤执行两次。在微粒中再加入异丙醇,将悬浮液剧烈搅拌1分钟,用磁体将微粒沉降,倒弃液体。表面改性的硅胶珠子在真空炉中于50℃干燥过夜,干燥后,表面改性的量通过热解重量分析来确定。
图22概述了一系列使用珠子M-B-1、M-B-2、M-B-3以及可商购的珠子进行的实验。这些实验使用DNA靶检测了每种包被的磁珠的捕获和释放活性。简单地说,将1毫克包被的珠子加入到1mL 500pg/mLDNA中。珠子捕获DNA的效率被测量,显示为图22中的最左边的条带。DNA从珠子上被释放(例如洗脱)的效率被测量。洗脱效率可以与回收百分数相互交换使用,显示为图22中的中间的条带。DNA被释放到洗脱缓冲液中,该缓冲液包括150μL溶解在0.01N NaOH中的100μg/mL小牛胸腺DNA。回收的DNA与捕获的DNA的比率是洗脱效率。最后,每种珠子的效率百分数被分析,显示为图22中最右边的条带。效率百分数是回收的DNA与起始样品中靶DNA的总量(在本实施例中是500pg)的比率。
在某些实施方案中,本发明预料到捕获效率高于75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或高于99%。在某些其它的实施方案中,本发明预料到捕获效率为100%。
在某些实施方案中,本发明预料到洗脱效率高于75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或高于99%。在某些其它的实施方案中,本发明预料到洗脱效率为100%。
在某些实施方案中,本发明预料到总效率高于75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或高于99%。在某些其它的实施方案中,本发明预料到总效率为100%。
(b)基材数量和捕获时间
亲和规程适合于多种应用。许多这些应用对执行该方法所需的花费、时间和消耗性供应品的数量是敏感的。因此,我们进行了许多实验以检测捕获效率作为基材量和捕获时间(例如分配给基材-样品相互作用的时间量)的函数。这些实验的结果被图示概括在图23和24中。简单地说,可商购的胺包被的磁珠(Dynal)被用来从1mL用水稀释的细菌培养上清液中捕获DNA靶。基材的浓度在1mg和5mg之间变化,捕获时间在1分钟和10分钟之间变化。
我们注意到少至1mg基材(例如珠子)反应1分钟就足够捕获该样品中超过90%的靶。增加基材的浓度、捕获时间或同时增加二者,都可以将捕获效率增加到99.99%以上。人们可以根据亲和规程具体应用的需要操作这些参数,以达到适当的效率和花费的组合。
(c)基材数量和洗脱时间
正如前面详细描述的那样,对于亲和规程的许多可能应用来说,执行本方法所需的时间总量是一个重要因素。因此,我们检测了作为基材量和洗脱时间的函数的洗脱效率。这些实验的结果被图示概括在图25和26中。简单地说,可商购的胺包被的磁珠(Dynal)被用来从1mL用水稀释的细菌培养上清液中捕获DNA靶。洗脱在洗脱缓冲液中进行,该缓冲液包括150μL溶解在0.01N NaOH中的100μg/mL小牛胸腺DNA。基材的浓度在1mg和5mg之间变化,洗脱时间在1分钟和10分钟之间变化。我们注意到在这些基材浓度和洗脱时间下洗脱效率没有明显的变化。
(d)洗脱体积
正如前面详细描述的那样,对于亲和规程的许多可能应用来说,执行本方法所需的试剂的量是重要因素。对试剂的需要不仅增加了方法的花费,而且增加了不在传统的实验室场所下进行的本发明的应用领域中必须被运输和维持的材料的数量。亲和规程所需的可能的试剂之一是从基材回收捕获的靶所需的洗脱缓冲液。因此,我们检测了洗脱缓冲液体积对洗脱效率的影响。
这些实验的结果概述在图27中。简单地说,从5mL样品捕获的靶在洗脱缓冲液中洗脱,该缓冲液包括150μL溶解在0.01N NaOH中的100μg/mL小牛胸腺DNA。洗脱缓冲液体积从1mL到150μL之间变化。在这个洗脱缓冲液体积范围内没有观察到洗脱效率的明显变化。因此洗脱缓冲液体积可以根据亲和规程应用的具体需要而进行选择。
在某些实施方案中,从基材上洗脱靶的方法是在小于从其中捕获靶的起始样品体积的1/5的洗脱缓冲液体积中进行的。在某些实施方案中,从基材上洗脱靶的方法是在小于从其中捕获靶的起始样品体积的1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/15、1/20或1/25的洗脱缓冲液体积中进行的。在某些实施方案中,从基材上洗脱靶的方法是在小于从其中捕获靶的起始样品体积的1/30、1/40或1/50的洗脱缓冲液体积中进行的。
(e)洗脱pH
在这些实验中使用的标准洗脱缓冲液(溶于0.01N NaOH的100μg/mL小牛胸腺DNA)的pH为11.8。我们检测了洗脱缓冲液pH的小量变化对洗脱效率的影响。这些实验的结果概述在图28中。简单地说,我们发现洗脱缓冲液的pH在大约pH11.5-12.3之间变化时对洗脱效率没有统计学上显著的影响。
(f)洗脱缓冲液最适化
正如前面详细描述的那样,小牛胸腺DNA被包含在洗脱缓冲液中。因此,我们进行了实验以评估洗脱效率是否对缓冲液中包含的小牛胸腺DNA的浓度敏感。简单地说,我们在50μg/mL和500μg/mL之间改变洗脱缓冲液中小牛胸腺DNA的浓度。我们观察到小牛胸腺DNA的浓度超过100μg/mL时洗脱效率没有明显的增加。因此,既然使用额外的试剂(例如伴随着花费)对洗脱效率不产生显著的好处,我们选择标准浓度为100μg/mL的小牛胸腺DNA用在洗脱缓冲液中。
(g)清洗
在许多离析或分离规程中一般使用一个或多个清洗步骤。因此,亲和规程的一个实施方案可以在靶捕获后但在靶释放前含有清洗步骤。这样的清洗步骤可以用于从基材中除去低亲和性的材料,从而增加了与基材以更高亲和力结合的靶的特异性捕获和洗脱。但是,对一个或多个清洗步骤的需要增加了执行亲和规程所需的时间、花费和试剂量。因此,我们进行了一系列实验以评估在靶捕获后但在靶释放前对一个或多个清洗步骤的需要。
简单地说,我们在存在或不存在两个1mL清洗步骤的情况下执行了亲和步骤。这些实验的结果表明清洗步骤是不必需的,实际上不明显地改变DNA回收的效率。使用悬浮在其它更非均一的样品例如生长培养基或非实验室水中的DNA进行的其它实验表明清洗的步骤是不必需的。我们注意到两个清洗步骤的存在没有明显地降低DNA回收的效率,因此在某些应用中如果需要或希望,可以使用清洗步骤。例如,如果样品极端非均一、有害、或含有高浓度的能够影响分离的靶的进一步分析的抑制物,那么可以使用清洗步骤而对回收效率没有明显的负面影响。另一方面,如果速度或花费是重要问题,捕获后的清洗步骤可以被忽略。
实施例10、快速亲和规程
亲和规程提供了从非均一样品中使用基材分离和/或鉴定靶的改进的方法。基材实际上可以是任何大小和形状,可以是磁性的或非磁性的,可以用一种或多种表面改性剂改性,与改性剂对样品中其它材料的亲和性相比,这些表面改性剂倾向于增加改性的基材与特定靶的亲和性。
亲和规程适合于大量的实验室或野外应用。此外,正如在实施例9中详细描述的那样,亲和规程可以被操作以(1)减少执行方法所需的时间,(2)减少执行方法所需的材料的花费,以及(3)减少执行方法所需的材料的数量。例如,亲和规程可以在不同的样品体积中进行,例如1mL到5mL。亲和规程可以使用各种基材浓度进行,例如1mg/mL到5mg/mL基材例如珠子。亲和规程可以使用捕获时间5分钟、或甚至少于5分钟进行,可以使用洗脱时间1分钟、少于1分钟或30秒进行。当然,本领域的专业技术人员将会容易地认识到,本发明预料到了多种参数的使用,前述的仅仅是说明性的参数,可以有利地用来减少执行本方法的时间和花费。
在此处我们详细提供了亲和规程的快速应用,被用来从非均一样品中分离靶。在这个例子中,分离靶需要的总时间小于5分钟。在这个例子中,基材是2.7μm的胺衍生的磁珠(Dynal),靶是DNA,样品是用实验室去离子水稀释的细菌上清液。在下面我们提供了示例性的快速规程。在每个步骤旁边提供了执行规程的每个步骤所需的时间和花费的总时间。
规程
步骤 | 步骤时间分:秒 | 总时间分:秒 |
1、吸取33L基材到1.5mL微量离心管中。 | 0:30 | 0:30 |
2、加入1mL液体样品。关闭试管。 | 0:30 | 1:00 |
3、将管振荡至少2秒使珠子分布到整个样品中。将试管放置在非磁性支架上,使其放置30秒(对于痕量水平的检测可以增加捕获时间)。 | 0:45 | 1:45 |
4、打开离心管,如果可用的话放置在磁性分离支架上,或使用独立磁体将珠子吸附到管的一边。 | 0:15 | 2:00 |
5、在将珠子移动到管边后(大约10秒),通过将管倒置在废液器上或吸取残留液或吸取出所有液体来从管中移出液体。在此过程中小心保持管与磁体的接触以避免移出了珠子。 | 0:15 | 2:15 |
6、如果需要从放置处取下管,放置在非磁性支架上。 | 0:15 | 2:30 |
7、加入150μL洗脱液(100μg/m/l小牛胸腺DNA在0.01N NaOH中,pH=11.8)。 | 0:30 | 3:00 |
8、关闭试管,振荡至少2秒使所有珠子暴露到洗脱缓冲液中。将试管放置在非磁性支架上,使其放置30秒。 | 0:45 | 3:45 |
9、打开离心管,如果可用的话放置在磁性分离支架上,或使用独立磁体将珠子吸附到管的一边。 | 0:15 | 4:00 |
10、吸取所需量的液体直接加入到PCR反应管或板中,或者进行处理用于进一步分析(如果需要) | 0:15 | 4:15 |
实施例11、靶的储存
本发明的方法、成分和装置的一个应用是用于从样品中分离的靶的长期储存。这种长期的储存在多种情况下是有用的。例如,有效可靠的长期储存在法医领域可用于为生物学证据编目。此外,长期储存在医学领域可用于保存教育目的的样品,以及保存样品用于不能在收集靶后马上进行的分析。此外,长期储存在环境领域可用于靶的收集可能在野外进行但靶的分析将在地理上与野外地点分离的实验室进行的情况。
长期储存的一个例子包含了使用基材本身作为靶的载体。例如,当靶捕获在基材上之后,靶-基材复合物可以从样品中分离,真空干燥,然后储存。这可以进行得极其快速。在上面概述的快速规程中,干燥和储存步骤可以选择性地插入到第5步之后(例如在操作时问大约2分钟之后)。对于具体的例子而言,含有靶-珠子复合物的管可以在真空炉中于80℃放置大约30分钟或直到珠子沉淀干燥。干燥的沉淀可以储存例如在含有干燥剂的避光容器中。
实施例12、从复杂样品回收靶
正如前面详细描述的那样,亲和规程可以被有效地用于从样品中分离靶。此外我们已经试验了实施例9中详细描述的特定的珠子、捕获和洗脱条件以评估从更复杂的样品中回收靶的效率。这些更复杂的样品可以更精确地模拟该技术所应用的医学和环境样品的类型。示例性的复杂样品包括固体样品例如土壤、泥、粘土以及沙或或其它腐殖土。进一步的示例性的复杂样品包括生物样品例如血液、尿液、粪便、精液、阴道液、骨髓和脑脊液。另外的示例性复杂样品包括海水、池水、油、液体或固体矿物沉积、以及干或湿的食品成分。
简单地说,我们使用亲和规程从多种复杂样品分离靶DNA。分离的靶DNA用PCR扩增。我们的结果表明可以使用亲和规程从复杂样品中分离靶DNA,这种分离足够除去可能抑制PCR的试剂。来自炭疽杆菌(Ba)和苏云金芽孢杆菌(Btk)培养上清液的靶DNA被从含有任何数量没有在实验室级水中发现的复杂污染物的非实验室级环境水中有效地分离。DNA不仅被有效地捕获和洗脱,而且它也与抑制性的污染物分离开来,这足够允许DNA在PCR反应中被扩增。
在第二组实验中,从炭疽杆菌(Ba)和苏云金芽孢杆菌(Btk)培养上清液获得的靶DNA从浓生长培养基(BHI)中被有效地分离,该浓培养基含有任何数量的在实验室或非实验室级水中没有被发现的多种复杂添加物。DNA不仅被有效地捕获和洗脱,而且它也与抑制性的污染物分离开来,这足够允许DNA在PCR反应中被扩增。
在第三组实验中,我们使用亲和规程从复杂样品中分离了靶细菌细胞。简单地说,我们使用亲和规程从多种复杂样品中分离了靶DNA。分离的靶细胞中的DNA用PCR扩增。我们的结果表明可以从复杂样品中有效分离细菌细胞,然后可以通过PCR对来自这些细菌细胞的DNA进行扩增。Ba、Btk和Yp营养体细胞被用作靶细菌细胞,这些靶从含有任何数量没有在实验室级水中发现的多种复杂污染物的非实验室级环境水中被分离。
实施例13、亲和规程对干样品的应用
正如在本文中详细描述的那样,亲和规程可用于从各种样品包括气体、液体和固体样品中分离广范围的靶。我们现在证实,从各种类型的样品中分离靶并不需要首先将样品重新水化或加工成悬浮液。尽管某些类型的样品的重新水化可能是有用的,某些材料例如粘质土既难以重新水化,在重新水化后也难以进一步加工。
干的生物微粒一般带有电荷,该电荷可用于帮助便利从干样品例如土壤样品或空气中分离靶。更具体的说,磁性基材或用表面改性剂包被的磁性基材将被加入到样品中,然后将样品和基材混合以便基材与样品相接触。在混合后形成了靶-基材复合物,可以使用任何本文详细描述的方法进行处理以检测通过亲和规程分离的靶。
图29概述了实验的结果,该实验被执行以说明靶可以从干样品中被有效鉴定。我们用细菌靶接种干土壤样品。对仅使用SNAP从细菌靶中分离的DNA进行PCR分析,并与使用干亲和规程和SNAP相结合从细菌靶中分离的DNA相比较。在该实验中,亲和规程包含了在使用SNAP分离DNA并进行PCR分析之前将土壤样品与带静电荷的非磁珠相接触以浓缩靶。图29显示,在分离DNA和PCR之前,使用干亲和规程与不使用亲和规程对土壤样品进行的分析相比能够增加相对的信号。这种信号的增加表明(a)干亲和规程可以用于从干样品中分离靶,以及(b)亲和规程的使用提供了对来自各种样品包括干样品的靶的改进的检测。
实施例14、亲和规程对干样品的应用
亲和规程对非液体样品的应用具有各种重要的环境、医学、工业和安全应用。正如上面详细描述的那样,从干样品中分离靶可以通过首先重新水化干样品以产生悬浮液、然后与基材接触形成可以被分离的靶-基材复合物、再进行进一步分析来完成。此外,从干样品中分离靶可以不需要首先将干样品重新水化来完成。
我们进行了其它的实验来从干样品中分离和分析靶。在这些实验中,含有表面改性的磁性基材的柱体被用来对干样品进行亲和规程。简单地说,Ba孢子(靶)以不同的稀释度(0-106孢子/mL沙)接种于沙样品中。每个柱体装载有1克沙,其用5mL蒸馏水润湿。在柱体中使用15mg(3mg/mL)磁珠(基材)以捕获靶。在亲和规程的该应用中捕获时间是5分钟,洗脱时间是1分钟。
在洗脱靶孢子后,通过PCR分析来自靶的DNA,以在PCR分析之前评估使用亲和规程检测沙中靶的极限,并与只使用PCR检测的极限相比较。图30概述了这些实验的结果。我们注意到使用亲和规程进行靶分离,导致对靶的检测与只通过PCR进行的检测相比提高了一个数量级。具体来说,我们检测到浓度低至100个孢子/mL的沙土中细菌孢子的DNA。
我们注意到含有磁珠(基材)的柱体对其它含有靶的样品进行的亲和规程具有同样的有效性。例如,该柱体被用来从非实验室级环境水中分离细菌细胞或细菌孢子。使用3mg基材/mL样品的基材浓度、靶捕获时间5分钟、靶洗脱时间1分钟,我们观察到与只使用PCR相比检测增加了一个数量级以上。具体来说,我们检测到的细菌细胞和细菌孢子的浓度低至10个细胞/mL样品。
实施例15、无序混合装置的设计和使用
正如在前面详细描述的那样,亲和规程和亲和磁性规程的大规模应用可以通过改进能够促进大量样品中基材和靶的有效混合的装置而得到便利。我们已经建造了一个装置,能够产生基于图6中详细描述的原理的轴颈轴承流动。本装置在本文中被称为无序混合装置或I类装置,这种装置的一个例子被显示在图31中。图31中显示的装置由两个特氟隆圆柱体组成,每个可以绕着其中心轴通过马达自由转动。较小的圆柱体是实心的,偏心放置在较大的圆柱体内部。样品被放置在两个圆柱体之间的环形空间内,通过将两个圆柱体同时以每分钟16转的速度转动将样品混合。慢的转动速度使通过样品悬浊液的拉伸和折叠形成的流线之间的扩散混合最大化。在使用本装置的某些实施方案中,在将基材和靶混合后将较小的圆柱体取出,然后用电磁铁代替。然后使用电磁铁从样品中收集基材-靶复合物。在这个具体的实施方案中,基材是磁珠,电磁铁被用来有效地收集磁珠。
我们已经使用无序混合装置通过亲和规程从各种类型的土壤中提取细菌靶,每个样品用2克的量。亲和规程的大规模应用表明这些方法和装置不仅适合于小量样品,而且也能够被放大应用于工业。能够放大亲和规程的能力不仅暗示了该技术的工业应用。此处提供的结果也证实了某些靶-基材相互作用在较大的体积中可能更容易被检测。
图32和33显示了使用大规模亲和规程(在无序混合装置中进行的亲和规程)加上SNAP提取的DNA的凝胶电泳的结果,并与在较小体积中仅使用SNAP获得的结果进行了比较。简单地说,使用SNAP规程或大规模亲和规程加上SNAP分析了特定的土壤样品,使用PCR扩增了分离到的靶DNA。在这个具体的例子中,基材是未包被的磁珠。正如可以从图32和33提供的结果中看到的那样,使用大规模亲和规程使得在某些土壤类型中的检测极限得到提高。具体来说,在淤泥样品中,我们可以将检测极限提高一个数量级,在粘质土类型中(含有高水平的腐殖酸,是已知的PCR抑制物),我们可以获得当仅使用SNAP方法时不可能得到的检测。
实施例16、可替代的装置
正如在本文中详细描述的那样,本发明预料到在亲和规程中可以使用广范围的基材。这样的基材可以进一步用一种或多种表面改性剂包被。可以用一种或多种表面改性剂包被的可选择的基材的一个例子被提供在图34中。图34显示了功能化的基材,它在广泛的应用领域中将是有用的。在本实施例中,离心管或PCR管的内壁(其中X是一种或多种表面改性剂)。
功能化的管和培养瓶的使用将帮助消除样品的转移,这将减少可能的错误和污染,减少对其它供应物的需要。此外,使用这样的基材将允许靶的吸附和进一步分析发生在单一的容器中,因此可容易地改造以适应于野外应用和其它供应和时间可能受到限制的场所。
其它可以根据本文描述的亲和规程设计的具体装置是能够便利气体或液体样品收集和分析的装置。这些装置将被广义地称为2类装置。本发明预料到了制造湿的和干的滤器。滤器可以含有一层或多层基材(例如珠子、纸等)。通过滤器或被滤器截留的干或湿样品将通过基材,样品中的靶将吸附到基材上。图35提供了可用于在空气或水样品中检测靶的代表性滤器的示意图。
作为干式滤器的进一步例子,可以填塞一层或多层基材例如珠子。本发明预料到含有多层同样的基材或不同基材的滤器,以及含有单一层的滤器。在滤器含有单一层的实施方案中,层中可以含有单一的基材、用多种表面改性剂衍生的单一基材、或多种基材。空气流过滤器,空气样品中的靶被吸附到珠子上。
本发明预料到这些滤器的单独使用,或与常用于建筑物和车辆中的其它空气滤器结合使用。例如,基于亲和规程的滤器可以被加入到建筑物的HVAC系统中,以提供进一步分析建筑物中空气循环质量的方法。
同样,湿式滤器可以被用来评估水样品中靶的存在。这样的滤器可以被用来监测水库从而评估饮用水的质量、监测湖泊或池塘从而评估这些环境的卫生。这些滤器可以被改性用于水族馆,从而帮助评估水的质量和诊断任何与水相关的问题。此外,这些滤器可以被用在家庭中,与可商购水纯化装置结合使用。本发明预料到了这些滤器的单独使用,或与其它在家庭、环境或工业应用中常用的水滤器结合使用。
本发明还预料到了建造另一种2类装置:亲和规程柱体。这些特殊的柱体是根据以前设计并公开在美国专利公开号2003/0129614(美国专利申请10/193742,在此以具全文引为参考)中的柱体来设计的,但是本发明预料到了只含有一种对样品进行亲和规程的装置的柱体,以及含有进行亲和规程的装置和进行SNAP规程的装置的柱体。
下面的装置被用于收集和纯化含有DNA的环境、临床、生物试剂或法医学样品,该装置被描述在美国专利公开号2003/0129614中。该装置可以被进一步改性以包含对样品进行亲和规程的装置。
图36提供了装置的概述。装置由两个部分组成,一个外部容器和一个内部机体。内部机体含有多孔性材料基材,可以提供纯化DNA和滞留PCR(聚合酶链反应)抑制物的功能,PCR被用来扩增提取的DNA(例如,该多孔性材料提供了对样品进行SNAP方法的装置)。外部容器根据它被制备的方式可以服务于双重目的,如图36中显示的那样。在用于储存和运输时,外部容器含有干燥剂,以增强在施加了样品后多孔性材料基材的干燥。干燥剂与多孔性材料通过一个环分离开来以便多孔性材料基材不接触干燥剂。当用于处理在多孔性材料基材上收集的样品时,外部容器用热密封膜密封,其中含有用于洗脱DNA的液体。样品的处理是通过除去热密封膜,将内部机体压入外部圆柱体,使得液体流过多孔材料,将DNA带入获得的洗脱液中。
外部容器可以通过外部容器底部的系绳和螺丝或按扣与内部机体相连。外部容器在底面上也包含了一个突出的边缘,以便当圆柱体放置在表面上时提供稳定性和防止倾斜。
在本装置的一个改性方案中,加入了附加的层以便在样品与SNAP滤器接触之前先与执行亲和规程的装置(例如能够结合靶的基材)相接触。
对装置的另一种可能的改性包括了在前述的纯化和抑制物结合步骤之后加入处理步骤。众所周知的是在适当的盐和pH条件下,核酸将与二氧化硅和玻璃紧密结合,而其它种类的化合物将不会结合得如此紧密(例如参见Tian等,2000,
Analytical Biochemistry,283:175-191)。通过改变pH和/或盐浓度,核酸可以从二氧化硅/玻璃材料上洗脱,因此允许从混合样品中选择性结合并随后释放核酸。这种效应被描述在“Boom”的美国专利5234809中,是几种现有的可商购核酸纯化技术的基础,已经被几家公司例如Qiagen和Promega生产。我们为这种“Boom”效应提供了新的实施方式,与我们的装置在机械上和化学上相容,可以进一步便利样品中靶的检测和分析。
用装置对样品的处理按照前面的描述进行,直到它与固体基质上的离液序列高的盐接触并从基质上洗脱。在过程中的这个时候,样品中含有高浓度的离液序列高的盐,该盐可以促进核酸与二氧化硅或玻璃的结合。然后将样品与二氧化硅或熔融玻璃基材接触。在优选的实施方案中,样品通过用柱塞(参见图37)施加正压力从二氧化硅柱上洗脱下来。当样品通过二氧化硅柱时,核酸被结合到柱上。流体继续通过二氧化硅柱,进入能够捕获和留存样品流体的吸附性材料材料。二氧化硅柱可以被制造成“滑动块”的形式,以允许用户容易地通过拉动滑动块将二氧化硅柱转移到第二个室中。在一个实施方案中,拉动滑动块的行动打开了第二个室中的一个缓冲液池。在图37中,第二个、低盐的缓冲液池被打开,用户通过用第二个柱塞施加压力迫使液体流过二氧化硅柱,从而将核酸洗脱到一个干净的分隔室中。通向该样品的通路可以通过多种方式中的任何一种,包括隔膜、螺纹塞、或一体化注射器。第二个室的方向相对于第一个室可以旋转180°;也就是说,两个柱塞可以是并排的,也可以是在装置的相反端,只要含有二氧化硅或玻璃柱的滑动块可以从一个室移动到另一个室就行。
本方法和装置可以与已经在本专利和以前的专利申请中描述的现有的样品捕获和细胞裂解技术的大量变形方式相结合。本方法也可以与其它样品捕获和细胞裂解技术相结合,只要在马上开始本过程之前样品的成分中含有高浓度的盐并在实用的pH范围内(例如pH3-12)。
正如以前描述的那样,本装置的优选实施方案包括将样品加入到含有高浓度的离液序列高的盐的多孔性支持物中,这些盐除了其它功能外,还能失活或杀死样品中的试剂。这种效应使得柱体对于随后的操作和运输是安全的。但是,对某些应用来说,用户可能希望培养样品中存在的任何生物体,同时仍然能够获得用离液序列高的盐处理样品的其它优点。应付这些冲突的目标的两种可选择的样品柱体构造被提供(参见图38)。在一种设计中,多孔性支持物上不含有离液序列高的盐的装置被物理地连接到含有离液序列高的盐的装置上。该连接允许含有盐的装置可以独立于不含离液序列高的盐的装置而进行处理,并通过同时保持两个平行的分析便利了样品的跟踪。不含离液序列高的盐的装置含有其它的化学材料,能够支持生物体的生存直到能够进行培养。
在第二种设计中,装置的内室被分成两个小室,它们之间没有流体的联系。多孔性支持物也被分成两个部分,一个部分含有离液序列高的盐,另一个部分不含离液序列高的盐而是含有增强培养的化学材料。该设计较好地适合于档案的目的,因为两半必须被同时处理。尽管希望能够培养从内部圆柱体的不含离液序列高的盐的一边取出的洗脱物,在洗脱前从多孔性支持物获得的培养物将产生较高浓度的生物体。
实施例17、RNA的分离和纯化
正如前面详细描述的那样,DNA和RNA的相似的特点和结构使得与DNA相互作用的基材也将与RNA相互作用。本发明预料到用于从样品分离和/或鉴定DNA的成分和方法也能够用于鉴定和/或分离RNA。但是,由于RNA与DNA相比一般较不稳定并更易于被降解,本发明进一步预料到RNA的分离和/或鉴定可能需要对本方法进行其它的改性。
从所需的样品中快速分离和纯化RNA的能力需要在能够保存RNA的条件下分离RNA。RNA存在于所有生物体中,所以本文描述的方法可以用于从真核生物、原核生物、古菌或病毒中分离RNA。特别是我们探索了从病毒分离RNA。
RNA的分离由于RNA易于被环境中核酸酶快速降解而被复杂化。必须以使这些核酸酶(RNases)失活的方式从病毒粒子中分离病毒RNA。抑制或失活核酸酶的试剂被包含在许多现有的用于分离RNA的实验室规程和可商购试剂盒中,但是许多这些方法是缓慢、繁琐和昂贵的。
我们以前报道了使用SNAP方法和使用试剂例如IsoCode纸在抑制DNA降解的条件下帮助有效地分离DNA。此外,我们以前报道开发了被称为LiNK的装置,将SNAP方法包括在柱体的形式中,以用于容易操作的、便携的、野外相关的应用。本发明预料到SNAP和LiNK技术可以被改变以进一步增强从样品中分离和分析靶RNA的能力。这种关注于RNA的对SNAP和LiNK的修改可以被单独使用,也可以进一步增强本申请中描述的亲和规程的效能。
SNAP和LiNK技术的RNA特异性改性是基于下面的原理。RNA的保护包括防止RNA被RNases的降解,以及防止RNA中磷酸二酯键的非酶促水解。这种水解被高温或极端的pH和二价阳离子所介导。因此,RNA的纯化必须在适当的缓冲溶液中进行。
通过反转录PCR(RT-PCR)鉴定RNA病毒可以分成四个步骤:抽提和分离RNA,防止RNA被RNases和水解的降解,通过RT-PCR将RNA转化为cDNA,以及通过PCR扩增DNA。这些步骤在下面进行更详细的讨论。
a)RNA的抽提和分离
从病毒中分离RNA需要解离外部病毒外壳而不降解RNA。常用的RNA抽提方法包括SDS、酚或高摩尔浓度的离液序列高的盐。用于SNAP规程的IsoCode纸,也能够从施加在纸上的样品中释放出RNA。
b)防止RNA被RNases的降解
存在大量的Rnase抑制物。许多这些抑制物可以单独使用,也可以与快速简单的RNA分离规程组合使用。有用的抑制物必须具有广泛的特异性(某些RNase抑制物仅作用于一类RNases),它们本身必须不抑制下游的RT-PCR反应(某些RNase抑制物是通用的酶抑制物),或者它们必须容易地完全地从抽提的RNA中被除去。
本发明预料到下面的抑制物在分离和/或鉴定RNA靶中的使用:粘土(膨润土、硅藻土);金精三羧酸(ATA);离液序列高的盐包括硫氰酸胍(GT)和盐酸胍(GH);焦碳酸二乙酯(DEPC);SDS;尿素、以及氧钒基核苷复合物(VRCs)。
本发明还预料到抑制由极端pH和温度引起的水解可以通过用pH缓冲液例如Tris-EDTA洗脱RNA来介导。
下面的RNases抑制物的特点使它们成为使用在本发明的方法中的优选试剂:硅藻土、膨润土、ATA、SDS、尿素、DEPC和离液序列高的盐。这些试剂在室温下是稳定的,也不抑制下游的RT和PCR反应,或者不通过有机抽提可以容易地移除或稀释。下面的段落提供了每种这些抑制物的简要描述。
RNases抑制物的简述
两种RNases抑制物,硅藻土和膨润土是粘土型的。它们的抑制性质被认为是由它们的总负电荷引起的,这允许它们结合RNases和其它的碱性蛋白。硅藻土是一种纯化的水辉石(由氟硅酸钠镁锂组成的粘土)。膨润土是一种蒙脱石粘土(Al2O3·5SiO2·7H2O)。从每种粘土制备的级份在室温下是稳定的,并表现出适合于整合到柱体形式中。它们对RNase的抑制具有不同的pH最适性,所以可以分别地或一起使用。
金精三羧酸(ATA)在体外分析中是一种通用的核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)抑制物,已经被用于细菌RNA的分离。ATA是可商购的RNase抑制物RNase block(Innogenex公司)的主要组分。它是一种高度水溶性的暗红色的溶液,可以通过凝胶过滤(通过Sephadex G-100)从纯化的核酸中除去。用ATA分离的RNA可以用于RT-PCR。ATA不表现出抑制DNA的分离,但是痕量ATA可能抑制反转录酶的作用。如果观察到这样的反转录酶抑制,可以容易地在反转录之前使用一个抽提的步骤以消除ATA。
离液序列高的盐例如胍类化合物(GT和GH)是强蛋白变性剂,可以抑制RNases的作用,是许多RNA提取规程的基础。这些化合物是在SNAP规程中使用的IsoCode纸的基础。
氧钒基核苷复合物(VRCs)是RNases的竞争性抑制物。它们优于DEPC、聚乙烯硫酸盐、肝素、膨润土、硅藻土、SDS和蛋白酶K。不幸的是它们具有严重的缺点,因为痕量就会抑制RT和PCR聚合酶活性,需要通过有机提取来除去。此外,VRCs不抑制所有的RNases,特别是不抑制RNase H的活性。另一个尽管不是不能克服的限制是VRCs需要储存在-20℃以下。但是,我们注意到VRCs与特定表面(例如样品所通过的柱体或可以加入到样品中并从样品中除去的珠子)的物理性结合可以结合RNases,这可以通过在随后的分子分析之前在存在改性的基材的情况下混合样品、然后从样品中物理性分离VRCs来进行。
SDS是一种能够变性蛋白包括RNases的去污剂。
对于任何前述的方法,以及所有目前使用的RNA分离规程,相关的溶液将用DEPC进行预处理。对于环境样品来说DEPC不能作为单独的RNase抑制物使用,因为它与胺反应并失活。
c)反转录和PCR
提取的RNA必须与下游的分析相容,即不含有反转录酶和PCR的抑制物。正如在Wilson,1997中所综述的那样,除去抑制物的材料包括5%DMSO、BSA和T4基因32等。此外,RT-PCR反应条件可用于检测许多感兴趣的病毒(De Paula,2002;Drosten,2002;Leroy,2000;Pfeiffer,2002;Warrilow,2002)。
上面描述的分离和进一步分析靶RNA的方法的一个应用是构造含有某些试剂的装置,这些试剂可以帮助防止靶RNA的降解和/或防止抑制随后对RNA靶的分子分析的化合物的作用。这样的装置和方法可以单独使用,或与基于本文描述的亲和规程的方法和装置结合使用。
下面提供了示例性的分层装置的详细描述。但是,本发明预料到了使用同样的或类似的试剂但不以分层构型组织的装置的构造。装置的构造或其中放置样品的柱体的开发改进可以如下所述做成分层的形式:
a)目的生物体的裂解
装置首先与样品接触的部分可以含有裂解病毒、细菌、真核生物或古菌的试剂。这种裂解将生物体分开,允许DNA或RNA被提取。起这种作用的试剂可以由离液序列高的盐、SDS或尿素组成。此外,热或冷可以用于裂解样品。温度的变化可以通过安装在柱体支持结构中的电池供能的基于电阻器的加热电路或通过化学反应来提供。
裂解机制的可能的执行方案可以包括加入含有前述试剂的溶液;将样品加入到含有这些试剂的干式滤器或基质中,通过加入水(对于干样品)或样品本身(对于液体样品)将试剂重新溶解到正确的浓度。
b)RNases的抑制
为了与试剂混合以裂解样品,应该存在能够抑制RNases作用、物理性捕获RNases、或与RNases结合的试剂。这些试剂包括GT、GH、尿素、SDS、膨润土、硅藻土、ATA、VRCs、以及基于纤维素的纸例如IsoCode。GT、GH、尿素和SDS可以存在于溶液中,可以通过加入脱盐步骤来移除或稀释到不抑制下游检测步骤的作用的浓度。粘土膨润土和硅藻土可以铺在IsoCode或其它基于纤维素的纸的上面。ATA和VRCs的掺入可以通过将ATA和VRCs化学连接到固体支持物上、以便它们不出现在含有RNA的洗脱液中而进行,也可以通过加入一个过滤步骤来进行。
c)过滤以除去ATA
在装置中含有ATA作为RNase抑制物的情况下,必需从洗脱液中除去ATA。这可以使用孔径排阻柱(例如Sephadex G-100柱)进行过滤而完成。这样的柱子可以被包括在基于柱体的装置中作为一层。
d)结合核酸并除去RNases
一层孔径分级的二氧化硅、化学处理的珠子或者化学处理的膜或表面可以被用来结合核酸(DNA或RNA)以允许随后的纯化,纯化是通过清洗裂解的样品以除去金属、盐或其它在前面的层中没有被特异性结合的材料。然后可以在适当的条件下从二氧化硅、珠子或表面上将核酸洗脱下来,使
用分子生物学标准方法进行分析。
实施例18、多个靶的同时检测
对于本发明的许多应用来说,同时评估多种靶的存在的能力是有优势的。例如,分离两个不同细菌细胞类型的能力使得能够在单一测试中进行医学诊断以评估多个潜在的传染试剂的存在。同样地,从同样的样品中分离DNA和RNA的能力将允许同时评估细菌和病毒生物体,或同时评估DNA和RNA病毒。
我们评估了使用可商购玻璃纤维滤器分离DNA和RNA的能力,以及使用该滤器的标准规程。我们的结果表明DNA和RNA可以同时从同样的样品中使用标准的规程分离出来,并表明使用亲和规程同时分离多个靶也是可能的。使用亲和规程与目前使用的更费时、费事和费试剂的技术相比,将极大地简化多种因子的分离。
简单地说,含有细菌(苏云金芽孢杆菌Btk)、MS2噬菌体(一种感染大肠杆菌,并作为单链RNA病毒的模式的噬菌体)、或同时含有Btk和MS2的样品被分析。样品用1mL L6缓冲液(缓冲液含:异硫氰酸胍,0.1M Tris-HCl(pH6.5),0.2M EDTA(pH8.0),Triton-X 100)稀释,然后通过一个可商购的玻璃纤维滤器。使用60mL注射器压缩60mL空气通过滤器。2mL L2缓冲液(缓冲液含:异硫氰酸胍,0.1M Tris-HCl(pH6.5),0.2M EDTA(pH8.0),Triton-X 100)加入到滤器上。使用L2缓冲液后,压入60mL空气,加入3mL 70%的乙醇,然后再压入60mL空气(重复2次)。然后将滤器干燥,用TE洗脱靶(Tris,1.0mM EDTA,最终pH7.0)。
对洗脱液的等份试样进行RT-PCR和PCR以分别检测病毒RNA和细菌DNA。RT-PCR在反应体积25μl中进行。一步RT-PCR反应(TaManOne-Step,Applied Biosystems)的制备使用MS2特异性引物和探针对,在ABI7700实时PCR机器(Applied Biosystems)中进行。每个25μl反应体系中含有2.5μl样品洗脱液。使用下面的RT-PCR条件:48℃30分钟,95℃10分钟,然后进行50个循环,每个循环95℃15秒,60℃1分钟。PCR同样地进行,但是使用Btk特异性引物。
在只含有MS2或含有MS2和Btk的样品中通过RT-PCR检测MS2的存在。在只含有MS2的样品中通过RT-PCR检测MS2的循环阈值是20.65(标准偏差0.33)。在含有MS2和Btk的样品中通过RT-PCR检测MS2的循环阈值是21.75(标准偏差2.04)。
在只含有Btk或含有Btk和MS2的样品中通过PCR检测Btk的存在。在只含有Btk的样品中通过PCR检测Btk的循环阈值是23.65(标准偏差0.23)。在含有Btk和MS2的样品中通过PCR检测Btk的循环阈值是23.81(标准偏差0.39)。
实施例19、RNA靶的分离和鉴定
尽管可商购的玻璃纤维滤器及其方法可用于分离DNA和RNA靶。这些方法耗费时间和试剂,因此限制了(1)它们在野外的使用、(2)它们对时间敏感应用的使用、(3)它们对费用敏感应用的使用。正如在本申请中详细描述的那样,亲和规程克服了本领域现有的其它分析方法的许多限制,并允许使用最少的试剂和时间对各种靶进行分离和进一步分析。
我们证实了亲和规程可以有效用于分离各种靶包括细菌细胞和细菌孢子,此外通过亲和规程从细菌细胞和孢子分离的DNA可以用例如PCR这样的方法进一步分析。我们现在显示了亲和规程可以有效地用于分离病毒靶,此外通过亲和规程从病毒靶分离的RNA可以用例如RT-PCR这样的方法进一步分析。
使用可商购的玻璃纤维滤器和制造商的说明书(如实施例18描述的那样)或者使用亲和磁性规程(胺衍生的磁珠,用于在含有100mg/ml小牛胸腺DNA的0.01N NaOH的缓冲液中捕获和洗脱靶)从水样中分离了MS2。在使用任何一种方法分离MS2后,洗脱液用RT-PCR处理以鉴定MS2 RNA。简单地说,我们使用任何一种方法成功地分离了MS2并通过RT-PCR进行了进一步分析。在使用玻璃纤维滤器分离MS2后通过RT-PCR检测MS2的循环阈值是29.83(标准偏差为0.19)。在使用亲和规程分离MS2后通过RT-PCR检测MS2的循环阈值是33.02(标准偏差为0.72)。尽管在使用玻璃纤维滤器分离后检测的灵敏度表现得稍高,使用亲和规程可以得到时间、花费和操作的容易性方面的改进。
进一步的实验表明使用玻璃纤维滤器和使用亲和规程分离后检测RNA的灵敏度的差别是由于对RT-PCR分析的抑制性效应,而不是由于使用亲和规程对靶的捕获或洗脱是无效的。简单地说,在RT-PCR分析之前,含有MS2的洗脱物在水或AP洗脱缓冲液中稀释,在MS2的RT-PCR分析之前保温0、30或60分钟。在将样品在水中保温0、30或60分钟后通过RT-PCR检测MS2的循环阈值分别是20.57、20.65和21.02(标准偏差NA)。在将样品在洗脱缓冲液中保温0、30或60分钟后通过RT-PCR检测MS2的循环阈值分别是24.15、24.05和24.14(标准偏差分别为0.03、0.93和0.04)。
附加的参考文献
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所有的文献、专利和专利申请在此以其全文引为参考,其程度等同于好象每个单独的文献、专利和专利申请被特别地、单独地以其全文引为参考。
等同物
本领域的专业技术人员仅使用常规的实验,就将能够识别或能够确定本文描述的发明的特定实施方案的许多等同物。
Claims (66)
1.一种从非均一样品中分离靶的方法,包括
(a)将该样品与基材接触一段足够使该基材与该靶结合形成基材-靶复合物的时间,其中基材与该靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性,
(b)从该样品中取出基材-靶复合物,从而从该非均一样品中分离该靶。
2.权利要求1的方法,其中足够形成该基材-靶复合物的时间少于15分钟。
3.权利要求1的方法,其中足够形成该基材-靶复合物的时间少于5分钟。
4.权利要求1的方法,其中该基材用一种或多种表面改性剂改性形成表面改性的基材,以及其中该表面改性基材与该靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性。
5.权利要求4的方法,其中该一种或多种表面改性剂选自图2、图3或图10任何一个中代表的试剂,以及其中该表面改性基材与该靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性。
6.权利要求1或5的方法,其中的基材是磁性或顺磁性基材。
7.权利要求1或6的方法,其中的一种或多种表面改性剂通过可剪切的接头连接到基材上。
8.权利要求1的方法,其中的靶是真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子或病毒粒子。
9.权利要求1的方法,其中的靶是DNA、RNA、蛋白、有机小分子或化学化合物。
10.权利要求1的方法,其中该非均一样品是生物样品。
11.权利要求1的方法,其中该非均一样品是干样品。
12.权利要求11的方法,其中在将该干样品与该基材接触前将液体加入到该干样品中。
13.权利要求1的方法,进一步包括:
(c)将该基材-靶复合物与洗脱缓冲液接触一段足够从该基材上洗脱该靶的时间,从而从该基材上分离出该靶。
14.权利要求13的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于15分钟。
15.权利要求14的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于5分钟。
16.权利要求15的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于1分钟。
17.权利要求14的方法,进一步含有:
(d)分析该分离的靶。
18.一种从非均一样品中分离靶的方法,包括
(a)将该样品与基材接触一段足够使该基材与该靶结合形成基材-靶复合物的时间,其中基材与该靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性,
(b)从该样品中中取出基材-靶复合物,从而从该非均一样品中分离该靶,
(c)将该基材-靶复合物与洗脱缓冲液接触一段足够从该基材上洗脱该靶的时间,从而从该基材上分离出该靶,
其中该靶包括DNA、RNA、蛋白、真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子、病毒、有机小分子或化学化合物,以及其中该分离方法包括从非均一样品中分离DNA、RNA、蛋白、真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子、病毒、有机小分子或化学化合物。
19.权利要求18的方法,进一步含有:
(d)分析该分离的靶。
20.权利要求19的方法,其中分析该分离的靶包括从该分离的靶中分析DNA或RNA。
21.权利要求18的方法,其中足够形成该基材-靶复合物的时间少于15分钟。
22.权利要求21的方法,其中足够形成该基材-靶复合物的时间少于5分钟。
23.权利要求18的方法,其中该基材用一种或多种表面改性剂改性形成表面改性的基材。
24.权利要求23的方法,其中该一种或多种表面改性剂选自图2、图3或图10任何一个中代表的试剂,以及其中该表面改性的基材与一种或多种靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性。
25.权利要求18或23的方法,其中的基材是磁性或顺磁性基材。
26.权利要求23或25的方法,其中的一种或多种表面改性剂通过可剪切的接头连接到基材上。
27.权利要求18的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于15分钟。
28.权利要求27的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于5分钟。
29.权利要求28的方法,其中足够从该基材上洗脱该靶的时间少于1分钟。
30.用一种或多种表面改性剂改性基材形成表面改性的基材,其中该一种或多种表面改性剂选自图2、图3或图10任何一个代表的试剂,以及其中该表面改性的基材与一种或多种靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性。
31.权利要求30的表面改性的基材,其中的基材是磁性或顺磁性基材。
32.权利要求30的表面改性的基材,其中的一种或多种表面改性剂通过可剪切的接头连接到基材上。
33.权利要求30的表面改性的基材,其中表面改性的基材结合DNA、RNA、蛋白、有机小分子或化学化合物。
34.权利要求30的表面改性的基材,其中表面改性的基材结合一个或多个种的真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子或病毒粒子。
35.权利要求34的表面改性的基材,其中表面改性的基材与一个种的真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子或病毒粒子结合的亲和性高于与另一种的真核细胞、古菌、细菌细胞或孢子或病毒粒子结合的亲和性。
36.权利要求34的表面改性的基材,其中表面改性的基材与至少一个种的细菌细胞结合的亲和性高于与至少一个种的细菌孢子结合的亲和性。
37.权利要求34的表面改性的基材,其中表面改性的基材与至少一个种的细菌孢子结合的亲和性高于与至少一个种的细菌细胞结合的亲和性。
38.权利要求30的基材,其中该基材是珠子,以及其中该珠子粒径为0.1-120μm。
39.权利要求30的基材,其中该基材直径为0.5-10mm。
40.权利要求30的基材,其中该基材是试管或培养瓶。
41.滤器,含有一层或多层,其中一层或多层中至少一层含有一种或多种基材,以及其中一种或多种基材用一种或多种表面改性剂改性,以形成权利要求30的表面改性的基材。
42.权利要求41的滤器,其中该滤器包括含有一种或多种基材的一层,其中该基材用多种表面改性剂改性。
43.权利要求41的滤器,其中该滤器含有多层。
44.权利要求30的表面改性的基材,其中该基材用两种或更多种表面改性剂改性。
45.柱体,含有权利要求30的表面改性的基材。
46.一种释放靶的方法,其中该靶被结合到基材上形成靶-基材复合物,包括将该靶-基材复合物与洗脱缓冲液接触一段时间,其中该段时间是洗脱时间,从而破坏该靶-基材复合物,并从该基材上释放出该靶。
47.权利要求46的方法,其中该洗脱缓冲液含有小牛胸腺DNA。
48.权利要求46的方法,其中该洗脱缓冲液具有大约11-13的pH。
49.权利要求48的方法,其中该洗脱缓冲液具有大约11.5-12.3的pH。
50.权利要求48的方法,其中该洗脱时间是1-10分钟。
51.权利要求50的方法,其中该洗脱时间是1-5分钟。
52.权利要求51的方法,其中该洗脱时间少于1分钟。
53.一种捕获靶的方法,包括将含有该靶的样品与一定量的基材接触一段时间,其中该段时间是足够捕获靶并形成靶-基材复合物的捕获时间,其中该捕获时间是1-10分钟。
54.权利要求53的方法,其中该捕获时间是1-5分钟。
55.权利要求54的方法,其中该捕获时间少于1分钟。
56.权利要求53的方法,其中该基材的量是大约1-5mg/mL样品。
57.权利要求56的方法,其中该基材的量是大约1mg/mL样品。
58.权利要求57的方法,其中该基材的量少于1mg/mL样品。
59.一种从非均一样品中分离靶的方法,包括
(a)将该样品与用一种或多种表面改性剂改性的基材接触一段足够使该表面改性的基材与该靶结合形成基材-靶复合物的时间以形成表面改性的基材,其中表面改性的基材与该靶结合的亲和性高于与非靶材料结合的亲和性,其中一种或多种表面改性剂通过可剪切的接头连接到该基材上,
(b)从该样品中中取出基材-靶复合物,从而从该非均一样品中分离该靶,
(c)诱导该可剪切的接头的剪切,从而从该基材上分离出该靶。
60.权利要求59的方法,进一步含有:
(d)分析该分离的靶。
61.权利要求60的方法,其中分析该分离的靶包括从该分离的靶中分析DNA或RNA。
62.权利要求59的方法,其中该可剪切的接头是对氟化物不稳定的烷基甲硅烷基接头。
63.权利要求59的方法,其中该可剪切的接头是酸不稳定的羰基接头。
64.权利要求59的方法,其中该可剪切的接头是碱不稳定的羰基接头。
65.权利要求59的方法,其中该可剪切的接头是亲和试剂不稳定的接头。
66.权利要求59的方法,其中该可剪切的接头是光不稳定的接头。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |