CN1612932A - 核酸检测方法及其系统 - Google Patents

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Abstract

为了在利用核酸扩增方法进行核酸的检测时，使用直接核酸扩增方法，使测定花费的时间缩短，使基因等的检查系统综合有效，在对采集的生物样品的处理中，经过对采集的生物样品均一化工序或在该工序中导入抑制核酸分解活性的手段，不从生物样品中进行核酸成分的分离纯化。抑制该核酸的分解活性的手段的导入是在酸性pH下、具体来说是在pH2.5～pH5下进行的，通过使用与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分进行相互作用的盐进行处理，不进行核酸成分的分离纯化直接进行核酸扩增。

Description

核酸检测方法及其系统
技术领域
本发明涉及在利用核酸扩增手段，进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、以及各种基因疾病的检测领域中，含有核酸的生物样品的处理方法，不用从生物样品中提取核酸成分，可直接简便而且迅速地对基因进行检测的核酸扩增方法。
背景技术
随着近年来基因工程以及分子生物学等领域的进步，对于传染病和基因疾病等疾病可以在DNA或RNA水平进行诊断了。特别是利用聚合酶链式反应法(PCR法，Science，230：1350-1354，1985)或NASBA法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification法，Nature，350，91-92，1991、日本专利第2648802号公报以及日本专利第2650159号公报记载)以及LAMP法(Loop mediated isothermal amplificationof DNA扩增法、特开2001-242169号公报)等核酸扩增方法，作为检测非常困难的生物检体中极微量的核酸的检测成为可能，基因解析也一下子变得容易了。
PCR法是通过使DNA链解离成单链，并使夹住DNA链中特定区域的引物结合单链，利用DNA聚合酶反复进行DNA合成反应，将目的DNA片段扩增数十万倍的方法。PCR法是Mullis等人的发明，在特开昭61-274697号公报中报道了。PCR法可用作各种样品中核酸的高灵敏度分析法，特别是可用作来自动物体液的样品中核酸的分析法。因此、PCR法可用于传染病和遗传病以及癌的诊断等。另外，PCR法也是适用于移植或亲子鉴定时的DNA类型的检查方法。这些场合下，往往选择末梢血液作为检查对象。
PCR法一个缺点在于色素、蛋白质、糖类或未知杂质阻碍反应。就是说，人们都知道以代表性的耐热性DNA聚合酶-来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的TaqDNA聚合酶为首的很多DNA聚合酶，即使是微量的来自体液的杂质混在PCR反应液中也会强烈地阻碍PCR。
RT-PCR法是提取诸如肿瘤的RNA，以寡(dT)或随机六聚体作为引物，通过逆转录酶(RT)合成cDNA，通过PCR法扩增其一部分进行检测的方法。利用该方法对成纤维细胞瘤进行诊断的例子已有报道(北海道医学杂志、p.135-141，Vol.66(2)，1991)。RT-PCR法由于使用易分解的mRNA作为对象，所以需要在检体采集后进行迅速处理。另外，由于是极其灵敏的检测方法，特别要注意防止与其它检体的污染。
LAMP法是当进行链置换反应时，利用含有可在扩增产物的末端形成发卡结构的特殊引物2组以上引物的基因扩增法。扩增产物是由许多反复结构构成的，反复结构的单元是由构成夹在引物之间的被扩增领域的2条核酸的碱基序列成反向的同一链内的互补区域构成。LAMP法的扩增产物可以通过众所周知的双链DNA检测法进行检测，利用其独特构造的检测方法等也有报道(特开2001-242169号公报、WO00/28082号国际公开公报)。
另外，作为同样的基因扩增法的TMA法、NASBA法、3SR法，其特征是在两条引物中一条使用含有T7启动子序列的引物。这样一来，使这些引物与靶DNA或RNA杂交，进行逆转录酶反应(以RNA或DNA作为模板，合成DNA)，合成含有T7启动子的双链DNA。当向该反应系添加T7聚合酶时，T7启动子被活化，其下游的基因进行表达，合成大量的扩增产物RNA。在TMA法、NASBA法、3SR法中，以上那样的扩增循环在一定温度下进行。
利用核酸扩增手段的核酸检测系统一般由对采集的生物样品进行处理的工序、提取核酸的工序、分注测定试剂的工序、核酸扩增工序以及扩增产物的判定工序构成的。在利用PCR法等进行核酸扩增之前，需要提取核酸的前处理工序。作为该提取方法，一直使用通过酶、表面活性剂、离液(chaotropic)剂等分解基因包涵体，然后利用酚法(Biochimica et Biophysica Acta，72：619-629，1963)、碱法(NucleicAcid Research，7：1513-1523，1979)、或酚-氯仿等从基因包涵体的分解物中提取核酸的方法。
最近，在提取核酸的过程中使用离子交换树脂、玻璃滤器、玻璃珠或具有蛋白质凝集作用的试剂等。
另外，作为在核酸的提取中使用的结合核酸用载体的体系，报道了使用玻璃粒子和碘化钠的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76-2：615-619，1979)、使用羟磷灰石的方法(特开昭63-263093号公报)等。这些方法虽然不使用那么多有害的有机溶剂等，但由于在相关的工序中包括很多离心分离操作，存在着一次处理许多样品困难，分离核酸花费时间长等问题。
因此，以往的核酸分离方法要使用有机溶剂或碱等危险试剂，需要离心分离操作，存在着处理多个检体困难等难点，在要对多个检体进行再现性好的处理，使人力减少的自动机械化中还存在很大的问题。
作为以提取核酸的自动机械化为目标的方法有使用核酸结合性硅粒子和离液离子的方法(非专利文献1、专利文献1)。该方法是将核酸结合性硅粒子和具有使样品中核酸游离的能力的离液离子与样品混合，使样品中核酸结合于核酸结合性硅粒子，将固相与液相分离开，除去样品中杂质后，将结合于核酸结合性硅粒子的核酸洗脱下来的方法。
作为核酸扩增阻碍物质的除去方法，报道了对含有核酸的生物材料进行酸处理的方法(专利文献2)。然而，虽然有报道在从生物材料检体提取核酸的任意阶段可以对该检体进行酸处理，但由于对于样品中核酸成分不进行分离纯化的记载还没有，所以迅速地实施核酸扩增方法依然困难。
作为减少核酸扩增反应的阻碍的方法，报道了为了使核酸扩增阻碍物与阴离子性固相结合，使样品与阴离子性固相接触的方法(专利文献3)。但也是由于对于样品中核酸成分不进行分离纯化的记载还没有，所以迅速地实施核酸扩增方法依然困难。
肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等的感染、以及各种基因疾病的检测领域中，像以上说明的那样的核酸扩增方法已经逐渐实用化(临床检查法提要、第31版、金原出版株式会社、1998年9月20日发行)。
然而，在利用核酸扩增手段的核酸检测中，测定中花费的时间、灵敏度等方面还遗留许多应当改进的地方。
(非专利文献1)J.Clinical Microbiology，28-3：p.495-503，1990年
(专利文献1)专利第2680462号公报
(专利文献2)国际公开WO01/00813号公报
(专利文献3)特开平09-173065号公报
发明的内容
本发明的课题在于在利用核酸扩增方法进行核酸的检测时，要使测定需要的时间缩短，使基因等的检查系统综合的有效率。
本发明人等为了解决上述课题反复潜心研究，结果发现如果改善生物样品的前处理工序，可以缩短检查系统整体时间，提高测定灵敏度，从而完成本发明。
即本发明由以下内容组成。
1.以导入抑制核酸分解活性的手段，不从生物样品分离纯化核酸成分而对核酸进行扩增为特征的直接核酸扩增法，
2.上述1所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段，
3.上述1或2所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的导入是在酸性pH下进行的，
4.上述3所述核酸扩增方法，其中酸性pH为pH2.5～pH5，
5.上述1～4中任一项所述核酸扩增方法，是在对采集的生物样品经过均一化工序后，不进行核酸成分的分离纯化而进行核酸扩增的，
6.以使用与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐，对生物样品进行处理，不进行核酸成分分离纯化而对核酸进行扩增为特征的直接核酸扩增法，
7.上述6所述核酸扩增方法，其中反应阻碍物和/或核酸成分与盐的相互作用是通过离子键和/或疏水作用进行的，
8.上述6或7所述核酸扩增方法，其中盐是离液盐，
9.上述6或7所述核酸扩增方法，其中盐是三卤醋酸的碱金属盐，
10.上述8所述核酸扩增方法，其中盐的种类至少包括NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl(氯化四甲基铵)、TEACl(氯化四乙基铵)、KSCN、CsSCN、CsCl中的一种，
11.上述9所述的核酸扩增方法，其中盐的种类包括CF3COOCs(三氟醋酸铯)，
12.上述6～11中任一项所述核酸扩增方法，其中盐浓度为1mM～2000mM，
13.上述6～12中任一项所述核酸扩增方法，是导入抑制核酸分解活性的手段，然后使用与核酸扩增反应的反应阻碍物进行相互作用的盐对生物样品进行处理的，
14.上述13所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段，
15.上述12～14中任一项所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的导入是在酸性pH下进行的，
16.上述15所述核酸扩增方法，其中酸性pH为pH2.5～pH5，
17.上述6～16中任一项所述核酸扩增方法，是在对采集的生物样品经过均一化后工序后，不进行核酸成分的分离纯化而进行核酸扩增的，
18.上述6～17中任一项所述核酸扩增方法，是将使用与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐进行处理后的生物样品再用阴离子性固体进行处理的，
19.上述6～18中任一项所述核酸扩增方法，是使使用与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐进行处理后的生物样品在有核酸成分的分解酶抑制剂共存下扩增的，
20.上述19所述核酸扩增方法，其中核酸成分的分解酶抑制剂是RNase抑制剂，
21.上述1～20中任一项所述核酸扩增方法是LAMP法、RT-LAMP法、PCR法或RT-PCR法中的任一种，
22.上述1～20中任一项所述核酸扩增方法中使用的生物样品的处理方法，
23.上述1～20中任一项所述核酸扩增方法中使用的核酸检测用试剂，
24.使用上述1～20中任一项所述核酸扩增方法的核酸检测系统，
25.使用上述24所述核酸检测系统的核酸检查装置，
26.使用上述24所述核酸检测系统的癌转移的检查方法，
27.上述24所述核酸检测系统中使用的核酸检查试剂盒，
28.具有使核酸成分保持在稳定状态的pH的生物样品处理溶液，
29.上述28所述生物样品处理溶液，其中pH为2.5-5，
30.上述28或29所述生物样品处理溶液，还包含与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐。
附图的简单说明
图1是表示提取的RNA的稳定性的说明图(实施例1)。
图2是表示对于用氯化钾-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40缓冲液制备的检体利用RT-LAMP法进行CK19mRNA的基因产物扩增时间过程的说明图(实施例3)。
图3是表示对于用甘氨酸-HCl(pH2.2)缓冲液制备的检体利用RT-LAMP法进行的CK19mRNA的基因产物扩增时间过程的说明图(实施例3)。
图4是表示对有无三氟醋酸铯添加引起的CK19mRNA的基因产物扩增开始时间变化进行比较的图(实施例4)。
图5和图6是对有无RNase抑制剂添加引起的β-肌动蛋白mRNA的基因产物扩增进行比较的图(实施例5)。
图7是对由于缓冲液pH不同引起的CK19mRNA的基因产物的扩增开始循环数变化进行比较的图(实施例7)。
实施发明的最佳方式
以下就本发明的核酸扩增方法、生物样品的处理方法、核酸检测用试剂等进行说明。
本发明中所谓的直接核酸扩增方法指的是用匀浆机等将从作为被检测样品的由生物体采集的生物样品均一化后，可使该生物样品中含有的核酸扩增的核酸扩增方法，不从均一生物样品提取目的核酸成分，而是可以直接使核酸扩增的核酸扩增方法。
本发明中所谓的生物样品指的是用于目的核酸扩增的由生物体得到的样品，具体来说包括从生物体采集的组织、全血、血清、血浆、尿、唾液、体液、分泌物等来自人或动物的生物材料，以及来自植物、微生物等动物以外的生物材料。
(生物样品的处理)
所谓导入抑制核酸分解活性的手段指的是在对生物样品进行处理时导入抑制生物样品中所含的使核酸分解的原因物质，例如抑制分解酶活性的物质或条件等。这里所说的核酸指的是DNA或RNA，例如用于确认蛋白质表达的RNA、特别是mRNA特别适合。RNA容易被生物成分中所含的RNA分解酶分解，特别不稳定。本发明中所谓抑制核酸分解活性的手段具体来说指的是，例如抑制DNA分解酶或RNA分解酶活性的手段。在这种场合下，一般来说可以考虑添加核酸分解酶抑制剂等方法，在本发明中只要是能够抑制核酸分解活性的手段，可以使用任意手段。例如、作为抑制核酸分解酶活性的手段可以使用通过酶蛋白质变性抑制酶活性的手段。作为可使酶蛋白质变性的手段，如添加蛋白质变性剂、加热处理、随着pH变化的变性处理等。本发明中，需要使酶蛋白质变性，而且要确保目的核酸成分处于稳定的状态下。
在此，当对目的核酸成分保持在稳定状态下的条件进行研究时，可知由于生物样品处理液的pH不同，生物样品中所含的核酸的稳定性也不同。所以处理溶液最好不要处于样品中所含的核酸分解酶等酶活性最高的中性附近，另外酸性过强(pH过低)，核酸成分、特别是RNA由于磷酸二酯键因化学分解等会被切成短的片段，所以也不希望在pH2以下。本发明的一个特征是发现在中性或低于中性的pH条件下进行生物样品的处理，目的核酸稳定的条件。具体来说、通过用在pH2.5～5、最好是在pH3～4、最理想是在pH3附近的溶液对生物样品进行处理，可以确保目的核酸成分处于稳定的状态下。
所谓酸性pH溶液具体来说如含有甘氨酸-HCl、氯化钾-HCl的溶液。
上述生物样品处理也可以通过添加与核酸扩增反应的反应阻碍物相互作用的盐来进行。所谓核酸扩增反应的反应阻碍，例如在以mRNA为模板扩增DNA时，由mRNA的逆转录活性的抑制、DNA复制的抑制等。可以认为这样的扩增反应抑制是由例如应为目的的DNA或RNA等核酸与样品中含有的蛋白质结合等引起的。
如果在酸性pH下处理生物样品，由于RNA等核酸成分依然带(-)电荷，而蛋白质倾向带(+)电荷，核酸成分和蛋白质通过离子键或疏水作用进行结合。为了防止这样的核酸成分和蛋白质的结合，在核酸成分结合蛋白质之前，可以向处理液中添加与蛋白质通过离子键或疏水作用结合的物质。可以将这样的物质称之为与反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐。
作为与反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐的具体例子，如可以产生离液离子的盐，所谓离液盐以及三卤醋酸的碱金属盐等。所谓离液离子是离子半径大的1价阴离子的总称，如果将该离子加到水中，具有使疏水性分子的水溶性增加，疏水作用减弱的作用。就是说，通过这些离子使目的核酸成分与反应阻碍物的离子键或疏水作用减弱，防止目的核酸成分吸附于反应阻碍物，由此可以有效地进行核酸扩增反应。作为离液离子的具体离子，可举出SCN-、I-、ClO4 -、NO3 -、Br-、Cl-、CH3CO2 -、F-等。作为可产生这样离子的盐，如NaCl、KCl、LiCl、RbCl、NaI、KI、TMACl、TEACl、KSCN、CsSCN、CsCl等，其中NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl、TEACl、KSCN、CsSCN、CsCl最好。上述盐的添加可以在导入上述的抑制核酸分解活性的手段的前后进行，也可以同时进行，同时添加效率好，最优选。
另外，三卤醋酸的碱金属盐也具有与离液盐同样的效果，所以也可以有效地进行核酸扩增反应。作为三卤醋酸的碱金属盐的具体例子，如三氟醋酸钠、三氟醋酸钾、三氟醋酸铯、三氟醋酸锂、三氯醋酸钠、三氯醋酸钾、三氯醋酸铯、三氯醋酸锂、三氯醋酸铷、三氯醋酸钫等，三氟醋酸铯最好。上述盐的添加可以在导入上述的抑制核酸分解活性的手段的前后进行，也可以同时进行，同时添加效率好，最优选。
添加的盐的浓度为1mM～2000mM、优选是50mM～500mM，更优选的是100mM～300mM。
通过用与核酸扩增反应的反应阻碍物相互作用的盐处理的上述生物样品可以用阴离子性固体、即带负电荷的固体进行处理。作为阴离子性固体可以使用阳离子交换树脂、例如羧甲基、磷酸或磺丙基衍生化离子交换基质或其它的任何含有带负电荷表面的固体、例如带负电荷的硅物质。用阳离子交换树脂等阴离子性固体处理生物样品的方法可以通过众所周知的方法进行，具体来说、可以使用柱层析法以及批次法。例如将样品与阴离子性粒子混合、离心、静置、磁分离或通过同样手段将阴离子性粒子与上述反应阻碍物一起从目的核酸成分中分离。
为了进一步提高稳定性效果，可以并用本身是公知的表面活性剂。作为表面活性剂如非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂等，最好使用非离子表面活性剂。作为非离子表面活性剂如高级醇、烷基酚、乙二醇、多价醇的脂肪酸等的部分酯、高级脂肪酸甘油酯、山梨糖醇的脂肪酸酯、以聚丙二醇作为疏水性基团，两端加成作为亲水性基团的乙二醇的聚合产物等。这些表面活性剂可以单独或2种以上并用。
生物样品用匀浆器和/或捣碎机等粉碎，使其均一化后、通过上述的抑制核酸分解活性的手段和/或用与核酸扩增反应的反应阻碍物相互作用的盐进行处理、和/或用阴离子性固体处理、可以制备测定样品。这样得到的测定样品可以直接用于本发明的测定方法，这一点是表示本发明直接核酸扩增方法的主要特征点。均一化的生物样品为了除去细胞破碎物，根据需要，也可以实施过滤、离心分离等处理。
(核酸的扩增步骤)
本发明的核酸扩增法可以适用众所周知的的方法，没有特别限定。例如、可适用PCR法、RT-PCR法、LAMP法、RT-LAMP法、TMA(Transcription Mediated Amplification)法(特表平4-500759号公报)、NASBA法、3SR法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification ofNucleic acids)法等核酸扩增法以及作为RCA(Rolling CircleAmplification)法、INVADER法、CPT(Cycling Probe Technology)法、PALSAR法等核酸扩增法的一种的信号放大法。优选PCR法、RT-PCR法、LAMP法、RT-LAMP法、更优选是在扩增RNA的RT-PCR法、RT-LAMP法中特别有效。
(扩增产物的检测)
通常，反应结束后的扩增产物可以利用本身公知的方法进行检测，没有特别限定。例如、通过琼脂糖凝胶电泳法、通过使用荧光标记的探针进行检测的实时检测法、通过DNA合成时副产物的浊度进行检测等，根据需要，可通过限制酶的酶切图形进行确认，以及通过直接测序解析确定碱基序列的方法、也可以选择其它的很多方法。另外，当非特异性的扩增带多，特异带的判别困难时，可以通过使用目的扩增域内的探针的Southern印迹法等对特异带进行确认。本发明也适用于这些众所周知的方法。
(对象核酸)
可适用于上述手段的目的核酸没有特别限定，可广泛适用于通过使微量核酸成分扩增，在对疾病有无进行判断的临床检查。例如、可适用于癌或肿瘤相关标志的表达的确认、与基因有关的疾病、有无病毒或微生物感染的判断等。
作为癌或肿瘤相关标志、例如在癌患者癌组织以及发生了癌的脏器的正常部位同等出现，只要在诊断对象组织没有癌转移，就不能认定其表达的标志、或在癌组织中确认强烈表达的标志等。作为在癌患者癌组织以及癌发生的脏器的正常部位同等出现的标志的例子，如细胞角蛋白类、具体来说，如细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、细胞角蛋白20等。而作为在癌组织中确认强烈表达的标志的例子，如CEA等肿瘤标志。通过确认来自诊断对象组织中的各蛋白质的mRNA可以确认癌细胞的转移。
为了确认来自上述特定患者的确认癌组织的mRNA，有时将癌组织、癌发生的脏器的正常部位或诊断对象组织的任一个中都同等表达的蛋白质的mRNA量作为指标。作为这样的例子，具体来说可举出β-肌动蛋白、GAPDH的mRNA等。
通过运用本发明方法，可以迅速地对癌的淋巴节转移或腹腔内转移等进行诊断。例如、乳癌等，为了提高QOL(生活质量：Quality oflife)，希望手术中的淋巴节清扫范围尽可能小。而对于食道癌，由于淋巴节转移部位不同，需要选择开腹、开胸、颈部切开手术。对于前列腺癌，如果发生淋巴节转移，则应决定是否中止切除手术、进行激素疗法等决定手术继续进行或者中止的意向。而对于胃癌，由于有无向淋巴节癌转移，清扫范围不同，手术方式有很大变动，术后治疗方针的指针，例如抗癌剂的给药或放射线疗法成为选择的指针。这样场合下，如果可以利用术中采集的生物体组织对癌转移进行迅速诊断，在短时间手术中也可以决定淋巴节清扫范围、进行手术方式的变更、辅助疗法的选择等，可以使患者受到最适的治疗。本发明的检查系统适合用作癌转移的术中快速诊断方法。
可适用于作为与基因有关的疾病，遗传性疾病的检查、例如年龄老化发病的遗传性疾病的发病危险性的予测，具体来说，可以适用于对青光眼、家族性大肠癌、高血压、糖尿病等发病危险性进行判断的场合。另外，有无病毒或微生物感染的判断可以对生物体组织、例如血液等有无含有感染原因物质的核酸序列进行迅速检查。
(试剂、检查试剂盒以及检查系统)
本发明可以提供用于进行直接核酸扩增方法需要的各种试剂类、具体来说可以提供生物样品处理液、逆转录酶、互补链合成的底物dNTP、进行链置换型的互补链合成的DNA聚合酶、作为本发明使用的引物需要的各种寡核苷酸、赋予酶反应最适条件的缓冲液、以及根据需要用于反应产物的检测所必需的试剂类。另外，将这些试剂中的生物样品处理液以及其它的至少一种试剂组合后可作为试剂盒提供。
本发明除了涉及到直接核酸扩增方法之外，还涉及到生物样品处理方法、包括处理方法在内的核酸检测用试剂、试剂盒以及核酸检测系统整体。另外还涉及到适用于本系统的装置、癌转移的检查方法。具体来说、例如在癌患者的手术中从生物体采集的组织也可运用本系统，在手术期间可以对向其它组织的癌转移进行确认。
(实施例)
以下、通过实施例对本发明进行更具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)
就稳定保存RNA的条件进行研究。
1)材料和方法
(1)样品的制备
取出小鼠的淋巴节，用匀浆器和捣碎机，将组织粉碎，将均一化的组织于4℃下进行离心分离(12000rpm×5分)，取上清。使用市售的抽提用试剂(TRIZOL：Gibco BRL公司)从上清中提取RNA。
就提取的RNA 513μg/ml水溶液通过注入以下各种缓冲液研究保存稳定性。向各种缓冲液7μl中加入上述小鼠RNA溶液2μl，于室温下静置10分钟。然后加电泳用缓冲液1μl，通过琼脂糖凝胶电泳研究RNA的稳定性。
(2)缓冲液
①200mM氯化钾-HCl(pH1.0)+0.1％Nonidet P-40(非离子性表面活性剂：Calbiochem公司)
②200mM氯化钾-HCl(pH2.2)+0.1％Nonidet P-40
③200mM氯化钾-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40
④200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40
⑤醋酸缓冲液(pH5.2)+0.1％Nonidet P-40
⑥50mMTris-HCl(pH7.4)+0.1％Nonidet P-40
⑦不加缓冲液时(H2O)
(3)RNA的检测(琼脂糖电泳)
琼脂糖凝胶电泳使用1％琼脂糖、TEA缓冲液，每一个槽加RNA至1μg、按照通常的手法进行。
2)结果
结果如图1所示。在比pH3.0高的中性侧缓冲液中，RNA没有分解，稳定。在比pH2.2高的酸性缓冲液中，RNA分解、但没有看到RNA的带。
可知pH3.0缓冲液使RNA稳定，作为RNA样品制备用缓冲液最有效。
(实施例2)
采集乳癌患者的淋巴节，对人的粗提RNA样品和纯化RNA样品通过RT-PCR法确认细胞角蛋白(CK18和CK19)的mRNA的有无。
1)材料和方法
(1)样品的制备
将人淋巴节悬浮于50mM氯化钾-HCl(pH3.0)+0.1％NonidetP-40的缓冲液中，用匀浆器和搅拌器将该人淋巴节的组织粉碎，将匀浆的组织于4℃离心分离(12000rpm×5分)，取上清，作为粗提RNA样品。另外与实施例1同样，使用市售抽提用试剂(TRIZOL：GibcoBRL公司)从粗提RNA样品中提取RNA，作为精制RNA样品。
(2)使用的引物向或探针的序列
①CK18  反向引物：
5′-GATGGTTTGCATGGAGTTGCT-3′(序列1)
(源于Genbank访问码No.4557887的CK18序列的碱基位置1215-1195位)
②CK18  正向引物：
5′-GCCGCCTGCTGGAAGAT-3′  (序列2)
(源于Genbank访问码No.4557887的CK18序列的碱基位置1142-1158位)
③CK19  反向引物：
5′-TCCAGGGCGCGCAC-3′    (序列3)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置305-292位)
④CK19  正向引物：
5′-AAGCTAACCATGCAGAACCTCAAC-3′(序列4)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置241-264位)
⑤CK18的TaqMan探针：
5′-CAAGGCATCACCAAGATTAAAGTCCTCGC-3′(序列5)
(源于Genbank访问码No.4557887的CK18序列的碱基位置1188-1160位)
⑥CK19的TaqMan探针：
5′-CGCCTGGCCTCCTACCTGGACA-3′(序列6)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置268-289位)
(3)RT-PCR法
RT-PCR使用Applied Biosystem公司的RT-PCR Master试剂进行。
测定试剂盒：TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystem公司生产)
cDNA合成：使用MultiScribe逆转录酶合成。
①CK18的扩增
逆转录用引物：使用序列1记载的引物。
PCR用引物：使用终浓度为300nM的序列1和2记载的引物。
DNA聚合酶：使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
②CK19的扩增
逆转录用引物：使用序列3记载的引物。
PCR用引物：使用终浓度为300nM的序列3记载的引物以及终浓度为900nM的序列4记载的引物。
DNA聚合酶：使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
③PCR处理
于48℃下进行30分钟逆转录反应后、于95℃保持10分钟。
然后、进行95℃：15秒、60℃：1分钟的PCR操作40循环。
(4)核酸的检测
通过与目的双链DNA特异性杂交的TaqMan探针，利用荧光法检测人CK18和CK19mRNA的扩增产物。TaqMan探针对于CK18是序列5、对于CK19是序列6的寡核苷酸、在各个5′末端使用标记了FAM、3′末端标记了TAMRA的探针。使用Applied Biosystem公司生产的PRISM7700，对反应液中荧光强度的增加进行实时测定。
(表1)
表1 RT-PCR的测定
(精制RNA样品和粗提RNA样品的测定值)
样品         精制RNA样品         粗提RNA样品
           拷贝数/ng总RNA       拷贝数/ng总RNA
CK18           2000                  300
CK19           9000                  1900
2)结果
以上结果表明临床结果(HE染色组织诊断)与通过RT-PCR测定的结果一致，CK18以及CK19的mRNA都扩增了。另外即使对于粗制RNA样品也确认了来自mRNA的300和1900拷贝的核酸的扩增(表1)。
由此表明如果作为样品制备用液，使用含有Nonidet P-40的pH3.0缓冲液，不用提取RNA也可通过RT-PCR法进行扩增，结果可以缩短RNA检测所需要的时间。
(实施例3)
采集乳癌患者的人淋巴节，就通过HE染色临床确认癌转移的检体利用RT-LAMP法对作为乳癌标志的CK19mRNA进行了检测。
1)材料和方法
(1)样品的制备
将人淋巴节悬浮于缓冲液中，用匀浆器和搅拌器将组织可溶化。均一化的组织于4℃下离心分离(12000rpm×5分)，取上清(ライセ一ト)作为粗制RNA样品。对于组织悬浮液使用50mM氯化钾-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40的缓冲液或50mM甘氨酸-HCl(pH2.2)缓冲液。另外与实施例1和2同样，使用市售抽提用试剂(TRIZOL：Gibco BRL公司)，从粗制RNA样品提取RNA作为精制RNA样品。
(2)利用RT-LAMP法进行扩增
CK19的扩增是通过向含有以下序列：7～12所示6种引物的以下组成中添加粗制RNA溶液或精制RNA溶液2μl，于65℃下加温1小时进行的。
(3)引物
①19-FA-1101：
5′-ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3′(序列7)
②19-RA-1101：
5′-aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3′(序列8)
③19-F3-1101：
5′-acctggagatgcagatcg-3′(序列9)
④19-R3-1101：
5′-caggcttcagcatccttc-3′(序列10)
⑤19-LPF-1101：
5′-tgatttcctcctcatggttc-3′(序列11)
⑥19-LPR-1101：
5′-tccgggcaccgatctc-3′(序列12)
(4)反应液组成
dNTPs(GIBCO公司)                       0.4mM
MgSO4                                 2mM
二硫苏糖醇                             5mM
甜菜碱(Sigma公司)                      640mM
Thermopol缓冲液(New England BioLabs公司)
AMV逆转录酶(Promega公司)               1.25U
Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)     16U
溴乙锭                                 0.125mg/mL
正向内引物(19-FA-1101：序列7)          40pmol
反向内引物(19-RA-1101：序列8)          40pmol
正向外引物(19-F3-1101：序列9)          5pmol
反向外引物(19-R3-1101：序列10)         5pmol
正向回环引物(loop primer)(19-LPF-1101：序列11)20pmol
反向回环引物(19-LPR-1101：序列12)      20pmol
(5)核酸的检测
通过与双链DNA特异结合的溴乙锭，利用荧光法对人CK19mRNA的扩增产物进行检测。反应液中荧光强度变化用AppliedBiosystem公司生产PRISM7700进行实时测定。
2)结果
图2和图3给出了作为制备用缓冲液使用氯化钾-HCl(pH3.0)+Nonidet P-40时以及使用甘氨酸-HCl(pH2.2)缓冲液时通过各RT-LAMP法进行核酸扩增处理的结果。
使用甘氨酸-HCl(pH2.2)缓冲液时，确认在精制的RNA样品中有扩增，而对于粗制RNA样品没有看到扩增。另外使用氯化钾-HCl(pH3.0)+Nonidet P-40缓冲液时确认无论精制RNA样品还是粗制RNA样品都看到了扩增。
所以作为制备用缓冲液如果使用含有Nonidet P-40的pH3.0缓冲液，不纯化RNA通过RT-LAMP法也可确认扩增，结果可以缩短RNA检测需要的时间。
(实施例4)
将淋巴节检体破碎后可溶化时添加盐类，就减少使用粗制RNA样品进行扩增反应时杂质对扩增的阻碍的条件进行研究。
1)材料和方法
(1)样品的制备
用捣碎机将小鼠淋巴节于缓冲液中破碎、均一化。另外将培养细胞(KATOIII)于缓冲液中进行可溶化、均一化。将均一化的这些溶液混合、用作粗制RNA样品。对于这些样品的均一化使用含有或不含有100mM的三氟醋酸铯的含有1％Nonidet P-40 200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)缓冲液。
(2)通过RT-LAMP扩增
CK19mRNA的扩增利用含有如下序列：7～10所示4种引物的以下组成于65℃下加温1小时进行。对于各反应液以适当的比率将上述KATOIII细胞培养细胞可溶化样品和小鼠淋巴节可溶化样品进行混合，向一种反应液中加入相当于20个KATOIII细胞的样品，另外，作为杂质量的参数，共存蛋白质量调整到设定的量。
(3)引物
①19-FA-1101：(序列7)
②19-RA-1101：(序列8)
③19-F3-1101：(序列9)
④19-R3-1101：(序列10)
⑤19-LPF-1101：(序列11)
⑥19-LPR-1101：(序列12)
(4)反应液组成
dNTPs(GIBCO公司)                      0.4mM
MgSO4                                2mM
二硫苏糖醇                            5mM
甜菜碱(Sigma公司)                     640mM
Thermopol缓冲液(New England BioLabs公司)
AMV逆转录酶(Promega公司)              1.25U
Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)    16U
溴乙锭                                0.125mg/mL
正向内引物(19-FA-1101：序列7)         40pmol
反向内引物(19-RA-1101：序列8)         40pmol
正向外引物(19-F3-1101：序列9)         5pmol
反向外引物(19-R3-1101：序列10)        5pmol
正向回环引物(19-LPF-1101：序列11)     20pmol
反向回环引物(19-LPR-1101：序列12)     20pmol
(5)核酸的检测
通过共存于反应体系的溴乙锭的荧光进行检测。用AppliedBiosystem公司生产PRISM7700对反应液中的荧光强度变化进行实时测定。
2)结果
图4给出了作为用于制备粗制RNA样品的缓冲液使用含有100mM三氟醋酸铯和1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)缓冲液时的结果以及使用不含三氟醋酸铯的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)缓冲液时的结果。横轴表示一种反应液中含有的杂质蛋白质量，纵轴表示DNA扩增开始时间。对于用于制备粗制RNA样品的缓冲液中存在100mM的三氟醋酸铯时，一种反应液中的杂质蛋白质量即使增加到8μg附近，DNA扩增开始时间也几乎没有变化。与此相反，当没有三氟醋酸铯时，随着杂质蛋白质量增加，DNA扩增开始时间明显推迟了。这表明核酸扩增反应受到了杂质蛋白质的阻碍。由此表明通过使粗制RNA样品制备用缓冲液中含有100mM三氟醋酸铯，可以减少杂质蛋白质造成的扩增反应的阻碍，作为结果，可以向一种反应液增加可添加的粗制RNA样品溶液，可以提高灵敏度。
(实施例5)
使用由淋巴节检体制备的粗制RNA样品进行扩增反应时，对通过添加RNase抑制剂防止RNase对目标mRNA的分解，意图提高检测灵敏度进行研究。
1)材料和方法
(1)样品的制备
将乳癌患者淋巴节于含有或不含有100mM的三氟醋酸铯的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)缓冲液中用捣碎机破碎、均一化。将均一化该溶液直接或用均一化使用的缓冲液稀释5倍、或50倍后用作粗制RNA样品。
(2)通过RT-LAMP法进行扩增
β-肌动蛋白的扩增通过向含有如下序列13～18所示6种引物的以下组成中添加上述粗制RNA样品2μl，于65℃下加温1小时进行。
(3)引物
①AFA-4：
5’-tgaaggtagtttcgtggatgcctgaggcactcttccagc-3’(序列：13)
②ARA-4：
5’-tgaagtgtgacgtggacatccagggtacatggtggtgc-3’(序列：14)
③AF3-4：
5’-tggcaatgagcggttcc-3’(序列：15)
④AR3-4：
5’-tccttctgcatcctgtcg-3’(序列：16)
⑤AD-LPF1：
5’-acaggactccatgccc-3’(序列：17)
⑥AD-LPR1：
5’-tgtacgccaacacagtgc-3’(序列：18)
(4)反应液组成
dNTPs  (GIBCO公司)                        0.4mM
MgSO4                                    2mM
二硫苏糖醇                                5mM
甜菜碱(Sigma公司)                         640mM
Thermopol缓冲液(New England BioLabs公司)
AMV逆转录酶(Promega公司)                  1.25U
Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)        16U
溴乙锭                                    0.125mg/mL
正向内引物(AFA-4：序列13)                 40pmol
反向内引物(ARA-4：序列14)                 40pmol
正向外引物(AF3-4：序列15)                 5pmol
反向外引物(AR3-4：序列16)                 5pmol
正向回环引物(AD-LPF1：序列17)             20pmol
反向回环引物(AD-LPR1：序列18)             20pmol
RNase抑制剂
(STRATAGENE公司、RNase Block Ribonuclease Inhibitor)25U
(5)核酸的检测
通过共存于反应体系的溴乙锭的荧光进行检测。用AppliedBiosystem公司生产PRISM7700对反应液中的荧光强度变化进行实时测定。
2)结果
图5和6给出了扩增反应液中添加和不添加RNase抑制剂时的结果。横轴表示反应时间，纵轴表示荧光强度。反应液中含有RNase抑制剂时，人淋巴节均一化后制备的粗制RNA样品、5倍稀释的样品、50倍稀释的样品都没有阻碍，发生了扩增反应。与此相反，反应液中不含有RNase抑制剂时，扩增反应受到阻碍，特别是使用没有稀释的粗制RNA样品时，几乎没有扩增。由此表明通过向反应液中添加25U的RNase抑制剂，可以减少粗制RNA样品中含有的杂质对扩增反应的阻碍，作为结果，可以向一种反应液增加可添加的粗制RNA样品溶液，能够提高灵敏度。
(实施例6)
在将淋巴节检体破碎、均一化的缓冲液中含有100mM三氟醋酸铯，扩增反应液中含有25U的RNase抑制剂的条件下，实际上使用乳癌患者淋巴节，确认添加上述成分的效果。
1)材料和方法
(1)样品的制备
将乳癌患者淋巴节于含有或不含有100mM的三氟醋酸铯的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)缓冲液中用捣碎机破碎、均一化。用均一化用的缓冲液将均一化的该溶液稀释5倍，用作粗制RNA样品，通过RT-LAMP进行扩增反应。另外为了测定粗制RNA样品中含有的CK19mRNA拷贝数，与实施例1一样从粗制RNA样品用市售抽提用试剂(TRIZOL：Gibco BRL公司)提取RNA，作为精制RNA样品，进行RT-PCR。RT-PCR在与实施例1同样的条件下进行。
(2)通过RT-LAMP的扩增
CK19mRNA的扩增通过含有如下序列：7～12所示的6种引物的以下组成于65℃下加温1小时进行。在三氟醋酸铯共存下使用均一化的粗制RNA样品时，向反应液中添加RNase抑制剂后进行扩增反应。
(3)引物
①19-FA-1101：(序列7)
②19-RA-1101：(序列8)
③19-F3-1101：(序列9)
④19-R3-1101：(序列10)
⑤19-LPF-1101：(序列11)
⑥19-LPR-1101：(序列12)
(4)反应液组成
dNTPs(GIBCO公司)                      0.4mM
MgSO4                                2mM
二硫苏糖醇                            5mM
甜菜碱(Sigma公司)                     640mM
Thermopol缓冲液(New England BioLabs公司)
AMV逆转录酶(Promega公司)              1.25U
Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)    16U
溴乙锭                                0.125mg/mL
正向内引物(19-FA-1101：序列7)         40pmol
反向内引物(19-RA-1101：序列8)         40pmol
正向外引物(19-F3-1101：序列9)         5pmol
反向外引物(19-R3-1101：序列10)        5pmol
正向回环引物(19-LPF-1101：序列11)     20pmol
反向回环引物(19-LPR-1101：序列12)     20pmol
RNase抑制剂
(STRATAGENE公司、RNase Block Ribonuclease Inhibitor)25U
(5)核酸的检测
通过共存于反应体系的溴乙锭的荧光进行检测。用AppliedBiosystem公司生产PRISM7700对反应液中的荧光强度变化进行实时测定。
2)结果
表2给出了扩增反应液中添加和不添加三氟醋酸铯和RNase抑制剂时的结果。表的左半边表示不含有三氟醋酸铯和RNase时的结果。右半边表示使用三氟醋酸铯和RNase两者时的结果。没有两者时，4个检体不能通过RT-LAMP检测CK19mRNA，使用两者时，4个检体中的3个检体可以进行CK19mRNA扩增后进行检测。由此可以确认对于实际的人淋巴节检体在破碎可溶化时使三氟醋酸共存，反应液中添加RNase抑制剂可以有效提高检测灵敏度。
(表2)利用RT-PCR和RT-LAMP进行CK19mRNA的测定
  样品号    蛋白质(mg/ml)      CK19mRNA(拷贝数/μg)   样品号   蛋白质(mg/ml)        CK19mRNA(拷贝数/μg)
  PCR   LAMP     PCR     LAMP
    33(HE+)     0.76   70   ND   102(HE+)     0.44     60     ND
    41(HE+)     3.0   380   ND   118(HE+)     8.2   ＜400     300
    94(HE+)     6.8   1,880   ND   149(HE+)     7.9     90     650
    126(HE-/IHC+)     3.8   620   ND   150(HE-)     5.5     70   ＜500
(实施例7)
直接用血清检体通过RT-PCR确认三氟醋酸铯的效果。
1)材料及方法
(1)样品的制备
向人血清中加入含有pH8.0的200mM Tris-HCl缓冲液或含100mM三氟醋酸铯的200mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)，再添加来自KATOIII细胞的精制RNA样品，用作RNA样品。样品中的蛋白质量调整到0至33μg/μl。另外、CK19mRNA调整到为总RNA样品中5000拷贝/μl。
(2)使用的引物和探针序列
①CK19反向引物：
5′-cttggcccctcagcgtact-3′         (序列19)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置685-667位)
②CK19正向引物：
5′-cagatcgaaggcctgaagga-3′        (序列20)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置607-626位)
③CK19的TaqMan探针：
5′-gcctacctgaagaagaaccatgaggaggaa-3′    (序列21)
(源于Genbank访问码No.4504916的CK19序列的碱基位置634-663位)
(3)RT-PCR法
RT-PCR使用Applied Biosystem公司的RT-PCR Master试剂进行。
测定试剂盒：TaqMan One-step RT-PCR Master MixReagents(Applied Biosystem公司生产)
cDNA合成：使用MultiScribe逆转录酶合成。
①CK19的扩增
逆转录用引物：使用序列19记载的引物。
PCR用引物：使用终浓度为300nM的序列19记载的引物以及终浓度为900nM的配列编号20记载的引物。DNA聚合酶：使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
③PCR处理
于48℃下进行30分钟逆转录反应后，于95℃下保持10分钟。
然后进行40循环的95℃：15秒、60℃：1分钟的PCR操作。
(4)核酸的检测
通过与目的双链DNA特异性杂交的TaqMan探针，利用荧光法检测人CK19mRNA的扩增产物。TaqMan探针对于CK19是序列21的寡核苷酸、在各个5′末端使用标记了FAM、3′末端标记了TAMRA的探针。使用Applied Biosystem公司生产的PRISM7700，对反应液中荧光强度的增加进行实时测定。
2)结果
图7给出了用含有三氟醋酸铯的缓冲液(pH3)制备含有血清成分的RNA样品时的结果、以及用中性缓冲液(pH8)制备时的RT-PCR的结果。图中四角曲线表示使用含有三氟醋酸铯的酸性缓冲液(pH3)时的结果，而菱形曲线表示使用中性缓冲液(pH8)时的结果。纵轴表示RT-PCR反应中扩增开始循环数，横轴表示反应液中存在的血清蛋白质量。含有血清蛋白质时，在用中性缓冲液制备的RNA样品中发生扩增反应的阻碍，扩增开始循环数增加，但在用含有三氟醋酸铯的酸性缓冲液制备的RNA样品中阻碍的程度小，循环数没有怎么增加。由此可以确认用含有三氟醋酸铯的酸性缓冲液(pH3)制备RNA样品不仅可以有效地防止利用RT-LAMP的扩增中的反应阻碍，而且对于RT-PCR反应也是有效的。
工业实用性
就象以上说明的那样，在对核酸进行扩增之后检测RNA的方法中，利用本发明的检体制备条件，确认在RT-PCR法以及RT-LAMP法中，即使是粗制RNA样品也可进行测定，使用核酸扩增手段能够缩短测定时间。
序列表
序列表
<110>希森美康株式会社
<120>核酸检测方法及其系统
<130>GP02-1020/PCT
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK18基因设计的DNA
<400>1
gatggtttgc atggagttgc t                                              21
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK18基因设计的DNA
<400>2
gccgcctgct ggaagat                                                   17
<210>3
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>3
tccagggcgc gcac                                                      14
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>4
aagctaacca tgcagaacct caac                                           24
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK18基因设计的DNA
<400>5
caaggcatca ccaagattaa agtcctcgc                                      29
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>6
cgcctggcct cctacctgga ca                                             22
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>7
ttggcccctc agcgtacaag agctggccta cctg                                34
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>8
aggtcagtgt ggaggtggcg catgtcactc aggatc                              36
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>9
acctggagat gcagatcg                                                  18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据CK19基因设计的DNA
<400>10
caggcttcag catccttc                                                  18
<210>11
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<223>根据CK19基因设计的DNA
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gcctacctga agaagaacca tgaggaggaa                                                 30

Claims (30)

1.直接核酸扩增法，其特征是导入抑制核酸分解活性的手段，不从生物样品分离纯化核酸成分而对核酸进行扩增。
2.权利要求1所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段。
3.权利要求1或2所述核酸扩增方法，其中抑制分解活性的手段的导入是在酸性pH下进行的。
4.权利要求3所述核酸扩增方法，其中酸性pH为pH2.5～pH5。
5.权利要求1～4中任一项所述核酸扩增方法，是在对采集的生物样品经过均一化工序后，不进行核酸成分的分离纯化而进行。
6.直接核酸扩增法，其特征在于使用与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐，对生物样品进行处理，不进行核酸成分的分离纯化而对核酸进行扩增。
7.权利要求6所述核酸扩增方法，其中反应阻碍物和/或核酸成分与盐的相互作用是通过离子键和/或疏水作用进行的。
8.权利要求6或7所述核酸扩增方法，其中盐是离液盐。
9.权利要求6或7所述核酸扩增方法，其中盐是三卤醋酸的碱金属盐。
10.权利要求8所述核酸扩增方法，其中盐的种类包括NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl(氯化四甲基铵)、TEACl(氯化四乙基铵)、KSCN、CsSCN、CsCl中的至少一种。
11.权利要求9所述核酸扩增方法，其中盐的种类包括CF3COOCs(三氟醋酸铯)。
12.权利要求6～11中任一项所述核酸扩增方法，其中盐浓度为1mM～2000mM，
13.权利要求6～12中任一项所述核酸扩增方法，是导入抑制核酸分解活性的手段，而且使用与核酸扩增反应的反应阻碍物进行相互作用的盐对生物样品进行处理的核酸扩增方法。
14.权利要求13所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段。
15.权利要求12～14中任一项所述核酸扩增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的导入是在酸性pH下进行的。
16.权利要求15所述核酸扩增方法，其中酸性pH为pH2.5～pH5。
17.权利要求6～16中任一项所述核酸扩增方法，是在对采集的生物样品经过均一化工序后，不进行核酸成分的分离纯化而进行核酸扩增的。
18.权利要求6～17中任一项所述核酸扩增方法，是将使用与反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐进行处理后的生物样品再用阴离子性固体进行处理的。
19.权利要求6～18中任一项所述核酸扩增方法，是使使用与反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐进行处理后的生物样品在有核酸成分的分解酶抑制剂共存下扩增的。
20.权利要求19所述核酸扩增方法，其中核酸成分的分解酶抑制剂是RNase抑制剂。
21.权利要求1～20中任一项所述核酸扩增方法，是LAMP法、RT-LAMP法、PCR法或RT-PCR法中的任一种。
22.权利要求1～20中任一项所述核酸扩增方法中使用的生物样品的处理方法，
23.权利要求1～20中任一项所述核酸扩增方法中使用的核酸检测用试剂。
24.使用权利要求1～20中任一项所述核酸扩增方法的核酸检测系统。
25.使用权利要求24所述核酸检测系统的核酸检查装置。
26.使用权利要求24所述核酸检测系统的癌转移的检查方法。
27.权利要求24所述核酸检测系统中使用的核酸检查试剂盒。
28.具有使核酸成分保持在稳定状态的pH的生物样品处理溶液、
29.权利要求28所述生物样品处理溶液，其中pH为2.5～5。
30.权利要求28或29所述生物样品处理溶液，还包含与核酸扩增反应的反应阻碍物和/或核酸成分相互作用的盐。
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