WO2003060116A1 - Procede de detection d'acides nucleiques et systeme associe - Google Patents

Procede de detection d'acides nucleiques et systeme associe Download PDF

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WO2003060116A1
WO2003060116A1 PCT/JP2003/000060 JP0300060W WO03060116A1 WO 2003060116 A1 WO2003060116 A1 WO 2003060116A1 JP 0300060 W JP0300060 W JP 0300060W WO 03060116 A1 WO03060116 A1 WO 03060116A1
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WO
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nucleic acid
acid amplification
salt
biological sample
amplification method
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PCT/JP2003/000060
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Sachiyo Tada
Tomokazu Yoshida
Keiichiro Shohmi
Masahiro Nishida
Kazuki Nakabayashi
Koichi Yamagata
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Sysmex Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating a biological sample containing a nucleic acid in the field of diagnosing a tumor or cancer, infecting a virus, a pacteria, or the like, and detecting various genetic diseases using a nucleic acid amplification means.
  • the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid that enables direct, simple and rapid gene detection without extracting from a biological sample. Background art
  • the target MA fragment is multiplied by several hundred thousand times by repeating dissociation of the DNA strand into single strands, binding of primers across specific regions in the DNA strand, and DNA synthesis reaction by DNA polymerase.
  • This is a method that can also be amplified.
  • the PCR method is an invention of Maris et al. And is described in JP-A-61-274697.
  • the PCR method can be used as a sensitive method for analyzing nucleic acids in various samples, In particular, it can be used for the analysis of nucleic acids in samples derived from animal body fluids. Therefore, the PCR method is used for diagnosis of infectious diseases, genetic diseases and cancer. Furthermore, the PCR method is also suitable for testing DNA typing during transplantation and paternity testing. In these cases, peripheral blood is often selected for testing.
  • PCR method One disadvantage of the PCR method is that dyes, proteins, saccharides, or unknown contaminants inhibit the reaction.
  • DNA polymerases including Taq DNA polymerase derived from Thermus aquat icus, a typical thermostable DNA polymerase, have strong PCR even when a small amount of contaminants derived from body fluids are mixed in the PCR reaction solution. It is widely known that it is inhibited.
  • RNA of tumor is extracted, and d) NA is synthesized by reverse transcriptase (RT) using oligo (dT) or random hexamer as a primer, and a part of this is amplified by PCR. It is a method of detecting.
  • RT-PCR method targets mRNA that is susceptible to degradation, it is necessary to process it immediately after collecting the sample. Also, since it is an extremely sensitive detection method, it is important to avoid contamination with other samples.
  • the LAMP method is a gene amplification method using two or more sets of primers including a special primer that forms a hairpin structure at the end of an amplification product as the strand displacement reaction proceeds.
  • the amplification product is composed of a large number of repetitive structures, and the unit of the repetitive structure is a complementary region in the same strand in which the base sequences of the two nucleic acids constituting the region to be amplified sandwiched between primers are reversed.
  • the amplification product of the LAMP method can be detected by a known double-stranded DNA detection method, and a detection method utilizing its unique structure has been reported (JP-A-2001-242169, W000 / 28082 International Publication).
  • RNA double-stranded DNA having a T7 promoter is synthesized.
  • T7 polymerase synthesis of DNA using RNA or DNA as type III
  • the T7 promoter is activated, the downstream gene is expressed, and a large amount of RNA is synthesized as a by-product.
  • the above amplification cycle proceeds at a constant temperature.
  • a nucleic acid detection system using a nucleic acid amplification means generally comprises a process of processing a collected biological sample, a process of nucleic acid extraction, a process of dispensing a measurement reagent, a process of nucleic acid amplification, and a process of determining a wide product. It is. Prior to nucleic acid amplification by PCR or the like, a pretreatment step for extracting nucleic acids is required prior to nucleic acid amplification by PCR or the like.
  • gene inclusions are separated by enzymes, surfactants, chaotropic agents, etc., followed by the phenolic method (Biochimica et Biophysica Acta, 72: 619—629, 1963), and the Leic Acid Research, 7: 1513-1523, 1979), or a method of extracting a nucleic acid from a degradation product of a gene inclusion body using phenol.
  • Non-Patent Document 1 Patent Document 1
  • nucleic acid-binding silica particles and chaotropic ions capable of releasing nucleic acids in the sample with the sample, binding the nucleic acids in the sample to the nucleic acid-binding silica particles, and separating the solid and liquid phases. After removing contaminants from the sample, the nucleic acids bound to the nucleic acid-binding particles are eluted.
  • Patent Document 2 As a method for removing a nucleic acid amplification interfering substance, a method of treating a biological material containing a nucleic acid with an acid has been reported (Patent Document 2). However, although it is described here that the sample is treated with an acid at any stage of extracting nucleic acid from a biological material sample, it is described that the sample is not isolated and purified of nucleic acid components in the sample. As a result, it was still difficult to rapidly perform nucleic acid amplification.
  • Patent Document 3 As a method for reducing the inhibition of the nucleic acid amplification reaction, a method has been reported in which a sample is contacted with an anionic solid phase so that the nucleic acid amplification inhibitor binds to the anionic solid phase (Patent Document 3). However, even here, there is no description about performing without isolating and purifying the nucleic acid component in the sample. It was still difficult to perform the nucleic acid amplification method quickly.
  • Non-Patent Document 1 J. Clinical Microbiology, 28-3: p. 495-503, 1990 (Patent Document 1) Patent No. 2680462
  • Patent Document 2 International Publication W001 / 00813
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-173,065 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to reduce the time required for measurement when detecting a nucleic acid using a nucleic acid amplification method, and to improve the efficiency of a system for testing genes and the like as a whole.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, if the pretreatment process of a biological sample is improved, the time required for the entire inspection system can be reduced, and the measurement sensitivity increases. This led to the completion of the present invention. That is, the present invention
  • a direct nucleic acid amplification method which comprises introducing a means for inhibiting the activity of decomposing a nucleic acid and amplifying the nucleic acid without isolating and purifying the nucleic acid component from a biological sample.
  • nucleic acid amplification method according to the above 1, wherein the means for inhibiting the activity of decomposing nucleic acids is a means for inhibiting the activity of decomposing RNA.
  • nucleic acid amplification method according to the above 1 or 2, wherein the means for inhibiting the decomposition activity is introduced at an acidic pH.
  • nucleic acid amplification method according to any one of the above items 1 to 4, wherein after the step of homogenizing the collected biological sample, the nucleic acid is amplified without isolating and purifying the nucleic acid component, 6.
  • Direct nucleic acid amplification characterized by treating a biological sample with a reaction inhibitor of nucleic acid amplification reaction and Z or a salt that interacts with a nucleic acid component, and amplifying the nucleic acid without isolating and purifying the nucleic acid component.
  • the salt is an alkali metal salt of trihaloacetic acid
  • the type of salt should be NaCl, KC1, Nal, KI, TMAC1 (tetramethylammonium chloride), TEAC1 (tetraethylammonium chloride), KSCN, CsSCN or CsCl.
  • nucleic acid amplification method according to any one of the above items 6 to 12, wherein a means for inhibiting nucleic acid decomposition activity is introduced, and the biological sample is treated with a salt that interacts with a reaction inhibitor of the nucleic acid amplification reaction.
  • nucleic acid amplification method according to the above item 13, wherein the means for inhibiting nucleic acid degrading activity is a means for inhibiting RNA degrading activity.
  • Acidic pH is pH 2.
  • the method of nucleic acid amplification according to the above 1 5 a. 5 to P H5, 1 7. Collected a biological sample without single Hanaresei made of nucleic acid components after a step of homogenizing
  • nucleic acid amplification method according to the above item 19, wherein the nucleic acid component degrading enzyme inhibitor is an RNase inhibitor.
  • nucleic acid amplification method according to any one of 1 to 20 above, wherein the nucleic acid amplification method is any of a LAMP method, an RT-LAMP method, a PCR method, and an RT-PCR method.
  • Nucleic acid test kit used for nucleic acid detection system, 28. Biological sample treatment solution with pH to keep nucleic acid components stable
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing the stability of the extracted RNA (Example 1).
  • Fig. 2 shows the chlorinated realm-HCl (pH 3.0) + 0.1 ° /.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing a time course of gene product amplification of CK19 mRNA by the RT-LAMP method for a sample prepared with Nonidet P-40 buffer (Example 3).
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing a time course of gene product amplification of CK19 mRNA by the RT-LAMP method for a sample prepared with a daricin_HCl (pH 2.2) buffer (Example 3).
  • FIG. 4 is a graph comparing the rise time of amplification of the gene product of CK19 mRNA with and without the addition of cesium trifluoroacetate (Example 4).
  • FIG. 5 and FIG. 6 are diagrams comparing the gene product amplification of ⁇ -actin mRNA with and without the addition of an RNase inhibitor (Example 5).
  • FIG. 7 is a diagram comparing the number of cycles of the amplification start-up of the gene product of CK19 mRNA depending on the pH of the buffer solution (Example 7).
  • nucleic acid amplification method The nucleic acid amplification method, biological sample treatment method, nucleic acid detection reagent, and the like of the present invention will be described below.
  • the direct nucleic acid amplification method in the present invention refers to a nucleic acid amplification method capable of amplifying a nucleic acid contained in a biological sample obtained by homogenizing a biological sample collected from a living body as a test sample using a blender or the like.
  • a nucleic acid amplification method capable of directly amplifying a nucleic acid without extracting a target nucleic acid component from a homogenized biological sample.
  • the biological sample in the present invention refers to a sample obtained from a living body for amplification of a target nucleic acid, and specifically, a tissue, whole blood, serum, plasma, urine, saliva, body fluid, secretion collected from the living body. Includes biological materials derived from humans or animals, such as objects, and non-animal biological materials such as plants and microorganisms. (Processing of biological samples)
  • Introducing a means to inhibit the activity of decomposing nucleic acids means introducing a substance that decomposes nucleic acids contained in a biological sample, for example, substances or conditions that inhibit the activity of a degrading enzyme during the treatment of the biological sample.
  • the nucleic acid refers to DNA or RNA.
  • RNA particularly mRNA is preferably used for confirming protein expression.
  • '' RNA is easily degraded by RNases contained in biological components, and is particularly unstable.
  • the means for inhibiting the activity of decomposing nucleic acids specifically means, for example, means for inhibiting the activity of a DNA degrading enzyme or an RNA degrading enzyme.
  • a method such as addition of a nucleic acid degrading enzyme inhibitor is generally considered.
  • any means may be used as long as it can inhibit the activity of decomposing nucleic acids.
  • a means for inhibiting the activity of the nuclease a means for inhibiting the enzyme activity by denaturing the enzyme protein can be applied.
  • Means for denaturing the enzyme protein include addition of a protein denaturant, heat treatment, and denaturation treatment accompanying a change in pH. In the present invention, it is necessary to denature the enzyme protein and to secure the target nucleic acid component in a stable state.
  • the stability of the nucleic acid contained in the biological sample differs depending on the pH of the biological sample treatment solution.
  • the treatment solution is not preferable near the neutrality where the enzyme activity of the nuclease, etc. contained in the sample is the highest. It is not preferable that the pH is lower than 2 because it is cut into short fragments by chemical decomposition of the product.
  • One of the features of the present invention is that a biological sample is treated under neutral or lower pH conditions, and conditions under which the target nucleic acid is stable are found. Specifically, by treating a biological sample with a solution having a pH of 2.5 to 5, preferably pH 3 to 4, and more preferably near pH 3, the target nucleic acid component can be stabilized. Can be secured.
  • the acidic pH solution specifically includes a solution containing daricin-HC1 and rhodium chloride-HC1.
  • the treatment of the biological sample can be performed by adding a salt that interacts with a reaction inhibitor of the nucleic acid amplification reaction.
  • the reaction inhibition of the nucleic acid amplification reaction includes, for example, suppression of reverse transcription activity from mRNA, suppression of DNA replication, and the like when amplifying DNA by using mRNA as type II. It is conceivable that such suppression of the amplification reaction is caused by, for example, binding of a nucleic acid such as a target DNA or RNA to a protein contained in the sample.
  • nucleic acid components such as RNA are remains charged (one), because proteins tend to charged (+), the nucleic acid component and proteins ionic bonds and hydrophobic bonds Combine with
  • a substance capable of ionic or hydrophobic binding to the protein may be added to the treatment solution before the nucleic acid component binds to the protein.
  • a substance can be referred to as a reaction inhibitor and a salt that interacts with the nucleic acid component.
  • the salt that interacts with the reaction inhibitor and Z or the nucleic acid component include a salt capable of generating a chaotropic ion, a so-called chaotropic salt, and a metal salt of trihaloacetic acid.
  • Chaotropic ions are a collective term for monovalent anions having a large ionic radius. When this ion is added to water, the water solubility of hydrophobic molecules increases, and has the effect of weakening hydrophobic bonds.
  • the nucleic acid amplification reaction can be carried out efficiently by weakening these ions from binding or hydrophobically binding the target nucleic acid component to the reaction inhibitor and preventing the target nucleic acid component from being adsorbed to the reaction inhibitor. It will be done.
  • chaotropic ions SCN-, ⁇ , C10 4 - , NO 3 one, Br-, Cl-, CH 3 C0 2 -, F- , and the like.
  • Possible salts include NaCl, KC1, LiCl, RbCl, Nal, KI, TMAC1, TEAC1, KSCN, CsSCN, CsCl and the like, preferably NaCl, KC1, Nal, Kee, TMAC1, TEAC1, KSCN, CsSCN and CsCl.
  • the addition of the salt can be performed before or after the introduction of the means for inhibiting the nucleic acid decomposition activity, and can be performed simultaneously, but it is most efficiently and most preferably performed simultaneously.
  • the efficiency of the nucleic acid amplification reaction can be increased by the same effect as the chaotropic salt with respect to the metal salt of trihaloacetic acid.
  • the metal salts of trihaloacetic acid are sodium trifluoroacetate, potassium trifluoroacetate, cesium trifluoroacetate, lithium trifluoroacetate, sodium trichloroacetate, potassium trichloroacetate, cesium trichloroacetate, trichloroacetate. Examples thereof include lithium acetate, rubidium acetate in trichloride, and furanium acetate in trichloro, and preferred is cesium trifluoroacetate.
  • the addition of the salt can be performed before or after the introduction of the above-mentioned means for inhibiting the nucleic acid degrading activity, and can be performed simultaneously.
  • the concentration of the salt to be added is from lmM to 2000 mM, preferably from 50 raM to 500 mM, more preferably from 100 mM to 300 mM.
  • the biological sample treated with a salt that interacts with a reaction inhibitor in a nucleic acid amplification reaction can be treated with an ayuonic solid, that is, a negatively charged solid.
  • anionic solids use cation exchange resins, for example, ionic compounds such as lipoxymethyl, phospho- or sulfopropyl-derivatized ion-exchange matrix or any other negatively charged surface, for example, negatively charged silica substances.
  • the biological sample can be treated with an ayuonic solid such as a cation exchange resin by a known method, and specifically, a column chromatography method and a patch method can be applied. For example, mixing a sample and anionic particles, centrifuging, The ayuonic particles can be separated from the target nucleic acid component together with the above-mentioned reaction inhibitor by stationary, magnetic separation or similar means.
  • a surfactant known per se may be used in combination.
  • the surfactant include a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • a nonionic surfactant is used.
  • Nonionic surfactants include higher alcohols, alkylphenols, ethylene glycol such as fatty acids, partial esters of polyhydric alcohols, higher fatty acid glycerol esters, fatty acid esters of sorbitol, and polypropylene glycol as hydrophobic groups. However, there are those obtained by addition polymerization of ethylene glycol at both ends as a hydrophilic group.
  • the biological sample is pulverized and homogenized using a homogenizer, a Z, a blender, or the like, and then subjected to the above-described means for inhibiting the nucleolytic activity and / or a salt that interacts with a reaction inhibitor of the nucleic acid amplification reaction.
  • the sample to be measured can be prepared by treating and / or treating with a solid having a ionic property.
  • the measurement sample thus obtained can be used as it is in the measurement method of the present invention, and this is a main feature of the direct nucleic acid amplification method of the present invention.
  • the homogenized biological sample can be subjected to treatment such as filtration or centrifugation, if necessary, to remove cell debris.
  • PCR method RT-PCR method, LAMP method, RT-LAMP method, TMA (Transcription Mediated Amplification) method (Japanese Patent Publication No. 4-500759), NASBA method, 3SR method, SDA (Strand Di splacement Amplification ;; ICAN (I sothermal and Chimeric primer one init iated Amplification of Nucleic acids) Apply to nucleic acid amplification and signal amplification, which is a kind of nucleic acid amplification such as RCA (Rolling Circle Amplification), INVADER, CPT (Cycling Probe Technology), and PALSAR.
  • Preferred are the PCR method, the RT-PCR method, the LAMP method, and the RT-LAMP method, and more preferably, the method is particularly effectively applied to the RT-PCR method and the RT-LAMP method for amplifying RNA.
  • the amplification product after completion of the reaction can be detected by a method known per se, and is not particularly limited.
  • a method known per se for example, agarose gel electrophoresis, real-time detection using a probe using a fluorescent label, detection of turbidity of by-products during DNA synthesis, etc.Confirmation of cleavage patterns by restriction enzymes, if necessary, direct sequence analysis
  • the method can be applied by selecting from a method for determining a base sequence and many other methods. When it is difficult to distinguish a specific band due to a large number of non-specific amplification bands, the specific band can be confirmed by a Southern blot method using a probe within a target amplification region. In the present invention, these known methods can be applied.
  • the target nucleic acid to which the above-mentioned means can be applied is not particularly limited, but is widely applied in a clinical laboratory for judging the presence or absence of a disease by amplifying a small amount of a nucleic acid component. For example, it is applied to confirmation of expression of a cancer or tumor-related marker, determination of presence or absence of a gene-related disease, virus or microorganism infection, and the like.
  • cancer or tumor-related markers include, for example, a cancer patient's cancer tissue and a cancer target that are equally expressed in the normal site of the organ where the cancer has occurred, In tissues, those whose expression is not recognized unless there is metastasis of cancer, those whose expression is strongly recognized in cancer tissues, and the like are mentioned. Cytokeratins, specifically cytokeratins 18, 18, 19, and 20 are examples of those that are equally expressed in the cancerous tissues of cancer patients and in the normal sites of cancer-causing organs. No. In addition, examples of those strongly expressed in cancer tissues include tumor markers such as CEA. Metastasis of cancer cells can be confirmed by confirming mRNA derived from each protein in the tissue to be diagnosed.
  • the amount of mRNA of the protein expressed equally in the cancer tissue, the normal site of the organ where the cancer occurred, or the tissue to be diagnosed May be used as an index.
  • Specific examples of this include / 3-actin and GAPDH raRNA.
  • the method of the present invention it is possible to rapidly diagnose cancer lymph node metastasis, intraperitoneal metastasis, and the like.
  • cancer lymph node metastasis intraperitoneal metastasis
  • Q0L quality of life
  • laparotomy, thoracotomy, or an incision is necessary depending on the site of lymph node metastasis.
  • prostate cancer removal of the lymph node is stopped if there is nodal metastasis, and a decision is made to continue or discontinue surgery, such as hormone therapy.
  • gastric cancer the extent of dissection varies depending on the presence or absence of cancer metastasis to the lymph nodes, and the surgical procedure fluctuates greatly.
  • cancer metastasis can be quickly diagnosed using the biological tissue collected during surgery, the lymph node dissection area can be determined even in short-time surgery, surgical procedures can be changed, and rescue therapy can be selected. And receive optimal treatment for the patient.
  • the detection of the present invention ⁇
  • the system can be applied as a rapid intraoperative diagnosis method for cancer metastasis.
  • Gene-related diseases include testing for hereditary diseases, e.g., predicting the risk of developing a hereditary disease that develops with age, specifically the risk of developing glaucoma, familial colorectal cancer, high blood pressure, diabetes, etc. Applied when determining.
  • the determination of the presence or absence of a virus or microorganism infection can be performed quickly by checking the presence or absence of a nucleic acid sequence of an infectious agent contained in a living tissue, for example, blood.
  • the present invention relates to various reagents necessary for performing a direct nucleic acid amplification method, specifically, a biological sample treatment solution, reverse transcriptase, dNTP serving as a substrate for complementary strand synthesis, and strand displacement type complementary strand synthesis.
  • DNA polymerase to be performed various oligonucleotides required as primers used for the present invention, buffers that provide favorable conditions for enzymatic reactions, and if necessary, detection of reaction products Reagents can be provided.
  • a biological sample treatment liquid and at least one other reagent among these reagents can be combined and provided as a kit.
  • the present invention covers not only the direct nucleic acid amplification method, but also a biological sample processing method, a nucleic acid detection reagent, a kit, and a whole nucleic acid detection system including the processing method.
  • the present invention extends to a device to which the present system is applied and a method for detecting cancer metastasis. Specifically, for example, during surgery of a cancer patient, the system can be applied to tissue collected from a living body, and during operation, cancer metastasis to another tissue can be confirmed. . (Example)
  • the conditions for keeping the RNA stable were examined.
  • RNA The aqueous solution of 513 g / ml of the RNA obtained by the extraction was examined for storage stability in the following various buffer injections. 2 ⁇ l of the above mouse RNA solution was added to 7 / il of various buffers, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, the stability of RNA was examined by agarose gel electrophoresis after adding buffer 1 / X 1 for electrophoresis.
  • the buffer at pH 3.0 stabilized the RNA and proved to be the most effective as a buffer for preparing RNA samples.
  • Lymph nodes were collected from breast cancer patients, and the presence or absence of cytokeratin (CK18 and CK19) mRNA was confirmed by RT-PCR for human crude RNA samples and purified RNA samples.
  • the human lymph node is suspended in a buffer of 50 mM chloride-hydrochloric acid-HCl (pH 3.0) + 0.1% Nonidet P-40, and the tissue of the human lymph node is homogenized using a homogenizer and a blender. milled, centrifuged homogenized tissue 4 ° C (12000r P m X 5 minutes) and the supernatant collected by is, was a crude RNA sample. Further, as in Example 1, RNA was extracted from the crude RNA sample using a commercially available extraction reagent (TRIZ0L: manufactured by Gibco BRL) to obtain a purified RNA sample.
  • TriZ0L commercially available extraction reagent
  • RT-PCR was performed using Applied Biosystems' RT-PCR master reagent.
  • Measurement kit TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems)
  • cDNA synthesis Synthesized using MultiScribe reverse transcriptase.
  • Reverse transcription primer The primer described in SEQ ID NO: 1 was used.
  • PCR primers The primers described in SEQ ID NOS: 1 and 2 were used so that the final concentration was 300 nM.
  • DNA polymerase Ampli Taq Gold DNA polymerase was used.
  • Reverse transcription primer The primer described in SEQ ID NO: 3 was used.
  • PCR primer The primer described in SEQ ID NO: 3 was used at a final concentration of 300 and the primer described in SEQ ID NO: 4 was used at a final concentration of 900 nM.
  • DNA polymerase Ampli Taq Gold DNA polymerase was used.
  • the amplification products of human CK18 and CK19 mRNA were detected by a fluorescence method using a TaqMan probe that specifically hybridizes to the target double-stranded DNA.
  • the TaqMan probe used was an oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 for CK18 and an oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 for CK19, labeled with FAM at the 5 'end and TAMRA at the 3' end, respectively.
  • PRISM7700 manufactured by Applied Biosystems the increase in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time.
  • Arsenide Torinpa node is collected from breast cancer patients, the clinically CKl 9 mRNA, a marker of breast cancer for the sample that cancer metastasis has been observed was detected by RT-LAMP method by HE staining.
  • RNA samples were suspended in the buffer, and the tissues were solubilized using a homogenizer and a blender. The homogenized tissue was centrifuged at 4 ° C (12000 rpm x 5 minutes), and the supernatant (lysate) was collected to prepare a crude RNA sample. Add 50 mM potassium chloride _HCl (pH 3.0) + 0.1% Noedet P-40 buffer or Used a 50 mM glycine-HCl (pH 2.2) buffer. Further, as in Examples 1 and 2, RNA was extracted from the crude RNA sample using a commercially available extraction reagent (TRIZOL: manufactured by Gibco BRL) to obtain a purified RNA sample.
  • TriZOL commercially available extraction reagent
  • Amplification of CK19 is performed by adding 2 ⁇ l of crude RNA solution or purified RNA solution to the following composition containing the six primers shown in the following sequence: 7 to 12 and heating at 65 ° C for 1 hour. Was.
  • AMV reverse transcriptase (Promega) 1. 25U Bst DNA polymerase (New England BioLabs) 16U ethidium diamide 0.125 mg / mL forward inner primer (19-FA-1101: SEQ ID NO: 7) 40 pmol reverse inner primer (19- RA-1101: Rooster system (1-8) 40 pmol forward outer primer (19-F3-1101: Distribution (I number 9) 5 pmol reverse outer primer (19-R3-1101: Column number 10 ) 5 pmol forward loop primer (19-LPF-1101: arrangement (I number 11) 20 pmol reverse loop primer (19-LPR-1101: arrangement lj number 1 2) 20 pmol (5) Detection of nucleic acid
  • the amplified product of human CK19 mRNA was detected by a fluorescence method using ethidium bromide that specifically binds to double-stranded DNA.
  • the change in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time using PRISM7700 manufactured by Pride Biosystems.
  • RT-LAMP method using potassium chloride-HC1 (pH 3.0) + Nudet P-40 as a preparation buffer and glycine-HC1 (pH 2.2) buffer 2 and 3 show the results of the nucleic acid amplification treatment performed by the method.
  • RNA when a buffer of pH 3.0 containing Nonidet P-40 is used as a preparative buffer, the RNA can be increased in the RT-LAMP method without purifying RNA.
  • the width was recognized, and as a result, the time required for RNA detection could be reduced. (Example 4)
  • Salts were added when lysing and solubilizing lymph node samples, and conditions for reducing the inhibition of amplification by contaminants when performing an amplification reaction using crude RNA samples were examined.
  • Mouse lymph nodes were disrupted using a blender in buffer and homogenized. Separately, the cultured cells (KATOIII) were solubilized in a buffer and homogenized. These homogenized solutions were mixed and used as a crude RNA sample. These homogenizations were performed at 1 ° / with or without lOOmM cesium trifluoroacetate. A 200 mM glycine_HCl (pH 3.0) buffer containing Nonidet P-40 was used.
  • Amplification of CK19 mRNA was performed by heating at 65 ° C. for 1 hour with the following composition containing the four types of primers represented by the following sequences: 7 to 10.
  • the KATOIII cell solubilized sample and mouse lymph node solubilized sample were mixed at an appropriate ratio, and one reaction solution contained a sample equivalent to 20 KATOIII cells. It was prepared so that the amount of coexisting protein became the set amount as one parameter.
  • dNTPs manufactured by GIBC0 companies
  • AMV reverse transcriptase (Promega) 1.25U
  • Detection was performed by fluorescence of ethidium bromide coexisting in the reaction system.
  • the change in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time using PRISM7700 manufactured by Pride Biosystems.
  • FIG. 4 shows the results obtained when a 200 mM glycine-HC1 (pH 3.0) buffer containing 1% Nord-Det P-40 but not containing glycine was used.
  • the horizontal axis shows the amount of contaminating proteins contained in one reaction solution, and the vertical axis shows the rise time of DNA amplification.
  • the cells were homogenized in a 200 mM glycine-HCl (pH 3.0) buffer containing Nonidet P-40 using a blender. This homogenized solution was used as such or as a crude RNA sample diluted 5 or 50-fold using the buffer used for homogenization.
  • Dithiothreitol 5 raM betaine (Sigma) 640 mM
  • AMV reverse transcriptase (Proraega) 1.25U
  • AD-LPF1 forward loop primer
  • AD-LPR1 Tori self system 'J number 1 8
  • Amplification products were detected by fluorescence of ethidium mouth mouth coexisting in the reaction system. Using Applied Biosystems PRISM7700, the change in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time.
  • FIGS. 5 and 6 show the results when the RNase inhibitor was added to the amplification reaction solution and when the RNase inhibitor was not added.
  • the horizontal axis shows the reaction time, and the vertical axis shows the fluorescence intensity. If the reaction solution contains an RNase inhibitor, the amplification reaction is not inhibited even for crude RNA samples prepared by homogenizing the human lymph node, samples diluted 5-fold, and samples diluted 50-fold. See what happens. On the other hand, if the RNase inhibitor is not contained in the reaction solution, the amplification reaction will be hindered, and if the undiluted crude RNA sample is used, the amplification will hardly occur. Understand.
  • Example 6 Add lOOmM cesium trifluoroacetate buffer to the buffer to homogenize and homogenize lymph node specimens, and add 25 U RNase inhibitor to the amplification reaction solution using actual lymph nodes from breast cancer patients. The effect of was confirmed.
  • Lymph nodes from breast cancer patients were homogenized using a blender in a 200 mM glycine-HCl (pH 3.0) buffer containing 1% nonidet P-40 with or without lOOmM cesium trifluoroacetate and homogenized.
  • the homogenized solution was diluted 5-fold with the buffer used for homogenization and used as a crude RNA sample to perform an amplification reaction using RT-LAMP.
  • RNA was extracted and purified from the crude RNA sample using a commercially available extraction reagent (TRIZ0L: Gibco BRL), as in Example 1.
  • RT-PCR was performed as a purified RNA sample.
  • RT-PCR was performed under the same conditions as in Example 1.
  • Amplification of CK19 mRNA was performed by heating at 65 ° C. for 1 hour with the following composition containing the six types of primers represented by the following sequences: 7 to 12.
  • an RNase inhibitor was added to the reaction solution to perform an amplification reaction.
  • dNTPs GIBC0
  • AMV reverse transcriptase (Promega) 1.25U
  • Bst DNA polymerase (New England BioLabs) 16U ethidium bromide 0.125 mg / mL forward inner primer (19-FA-1101: SEQ ID NO: 7) 40 pmol reverse inner primer (19 RA-1101: gfl column number 8) 40 pmol forward outer primer (19-F3-1101: rooster sequence number 9) 5 pmol reverse outer primer (19-R3-1101: SEQ ID NO: 10) 5 pmol forward loop primer (19HLPF-1101: sequence number 11) 20 pmol reverse loop primer (19-LPR-1101: SEQ ID NO: 12) 20 pmol RNase inhibitor
  • Amplification products were detected by fluorescence of ethidium mouth mouth coexisting in the reaction system.
  • the change in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time using PRISM7700 manufactured by Applied Biosystems.
  • Table 2 shows the results with and without cesium trifluoroacetate and RNase inhibitor added to the amplification reaction solution.
  • the left half of the table shows the results without cesium trifluoroacetate and RNase: In the right half, both cesium trifluoroacetate and RNase were used.
  • RT-PCR was performed using Applied Biosystems' RT-PCR master reagent.
  • Measurement kit TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems)
  • Reverse transcription primer The primer described in SEQ ID NO: 19 was used.
  • PCR primer The primer described in SEQ ID NO: 19 was used at a final concentration of 300 nM, and the primer described in SEQ ID NO: 20 was used at a final concentration of 900 nM.
  • DNA polymerase Ampli Taq Gold DNA polymerase was used.
  • the amplified product of human CK19 mRNA was detected by a fluorescence method using a TaqMan probe that specifically hybridized to the target double-stranded DNA.
  • the TaqMan probe used was CK19, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 21 labeled with FAM at the 5 'end and TAMRA at the 3 and 5 ends, respectively.
  • the increase in the fluorescence intensity in the reaction solution was measured in real time using PRISM7700 manufactured by Applied Biosystems.
  • the vertical axis shows the number of cycles of the amplification in the RT-PCR reaction, and the horizontal axis shows the amount of serum protein present in the reaction solution.
  • RNA samples prepared with neutral buffer will inhibit the amplification reaction and increase the number of cycles of amplification, but RNA prepared with acid buffer containing cesium trifluoroacetate Cycles small degree of inhibition by sample amplification by the RT-LAMP for preparing RNA samples using an acidic buffer containing Application Benefits Furuoro acetate cesium can be seen c of not increase substantially (pH 3) It was confirmed that the compound was not only effective in preventing the reaction inhibition in the above, but also effective in the RT-PCR reaction. Industrial applicability
  • RNA sample in the method for amplifying nucleic acids and detecting RNA, it is possible to measure even a crude RNA sample in the RT-PCR method and the RT-LAMP method, depending on the sample preparation conditions of the present invention. It was confirmed that measurement time was shortened using the nucleic acid amplification means.

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Description

明 細 書 核酸検出方法及びそのシステム 技術分野
本発明は、 核酸増幅手段を用いて、 腫瘍や癌の診断、 ウィルス、 パク テリァ等の感染、 ならびに各種遺伝子疾患の検出を行う分野において、 核酸を含有する生体試料の処理法に関し、 核酸成分を生体試料から抽出 することなく、 直接簡便かつ迅速に遺伝子の検出を可能とする核酸増幅 方法に関する。 背景技術
近年の遺伝子工学及ぴ分子生物学などの分野の進歩により、 感染症や 遺伝子疾患などについて、 DNA又は RNA レベルで診断することが可能に なった。特に、ポリメラーゼ'チエイン 'リアクション法（PCR法、 Science, 230： 1350- 1354, 1985 ) や NASBA 法 ( Nucleic Aci d Sequence Based Ampl ifi cat ion法、 Nature, 350, 91-92, 1991、 特許第 2648802号公報及 び特許第 2650159号公報記載） 及ぴ LAMP法 （Loop mediated i sothermal ampl i fi cat ion of DNA増幅法、 特開 2001- 242169号公報） などの核酸増 幅方法により、 検出が非常に困難であった生物検体中の極微量の核酸の 検出が可能となり、 遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなった。
PCR法は、 DNA鎖の 1本鎖への解離、 DNA鎖の中の特定の領域をはさん だプライマーの結合、 DNAポリメラーゼによる DNA合成反応を繰り返す ことによって、 目的の MA断片を数十万倍にも増幅できる方法である。 PCR法は、 マリス氏らの発明で、 特開昭 61-274697号公報に述べられて いる。 PCR 法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、 特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。 従って、 PCR 法は感染症や遺伝病や癌の診断等に利用される。 さらに、 PCR 法は移植 や親子鑑定の際の DNAタイビングの検査にも適した方法である。 これら の場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
PCR法の 1つの欠点は色素、 タンパク質、 糖類あるいは未知の夾雑物 が反応を阻害することである。 すなわち、 代表的な耐熱性 DNAポリメラ ーゼである Thermus aquat icus 由来の TaqDNAポリメラーゼをはじめ、 多くの DNAポリメラーゼは、 微量の体液由来の夾雑物が PCR反応液中に 混在しても、 PCRが強く阻害されることが広く知られている。
RT- PCR法は、 例えば腫瘍の RNAを抽出し、 オリゴ（dT)又はランダムへ キサマーをプライマーにして逆転写酵素（RT)により d)NAを合成し、この 一部を PCR法で増幅し、 検出する方法である。 この方法を用いた繊維芽 細胞腫の診断の例が報告されている （北海道医学雑誌、 p. 135- 141, Vol. 66 (2)， 1991)。 RT- PCR法は、 分解を受けやすい mRNAを対象としている ため、 検体採取後速やかに処理することが必要とされる。 また、 極めて 鋭敏な検出方法なので、 他検体とのコンタミネーションを防ぐ注意が大 切である。
LAMP法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を 形成する特殊なプライマーを含む 2組以上のプライマーによる遺伝子増 幅法である。 増幅産物は多数の繰り返し構造からなるが、 繰り返し構造 の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する 2本の核酸の塩基 配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。 LAMP法の増幅産 物は公知の 2本鎖 DNAの検出法により検出することができるが、 その独 特な構造をいかした検出方法等が報告されている （特開 2001-242169号 公報、 W000/28082号国際公開公報）。
また、 同じく遺伝子の増幅法である TMA法、 NASBA法、 3SR法において は、 2本のプライマーのうち一方に T 7プロモーター配列を有するプラ イマ一を用いることを特徴としている。 このためこれらプライマーを標 的 DNA又は RNAにハイブリダイズさせ、逆転写酵素反応（RNA又は DNAを 鐯型として DNA を合成）を行う と、 T7 プロモーターを有する二本鎖 DNA が合成される。 この反応系に T7ポリメラーゼを添加すると、 T7プロモ 一ターが活性化し、 その下流の遺伝子が発現し、 増副産物として大量の RNAが合成される。 TMA法、 NASBA法、 3SR法においては、 以上のような 増幅サイクルが一定温度で進行する。
核酸増幅手段を用いた核酸検出システムは、 採取した生体試料を処理 する工程、 核酸抽出の工程、 測定試薬分注工程、 核酸増幅工程及ぴ增幅 産物の判定の工程から構成されるのが一般的である。 PCR 法等による核 酸増幅に先立って、 核酸を抽出する前処理工程が必要となる。 その方法 としては、 酵素、 界面活性剤、 カオトロピック剤等により遺伝子包含体 を分角?し、 その後、 フエノーノレ法 ( Bi ochimica et Biophys i ca Acta, 72 : 619— 629, 1963)、 ァノレカリ法（Nuc le i c Acid Research, 7： 1513 - 1523, 1979)、 あるいはフエノール .クロ口ホルム等を用いて、 遺伝子包含体の 分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
最近では核酸抽出の過程において、 イオン交換樹脂、 ガラスフィルタ 一、 ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用され ている。
また核酸の抽出に核酸結合用担体を用いる系としては、 ガラス粒子と ョウイ匕ナトリ ゥムを用いる方法 (Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 76—2 : 615 - 619， 1979)、 ヒ ドロキシアパタイ トを用いる方法 （特開昭 63-263093 号公報） などが報告されている。 これらの方法は有害な有機溶媒などは それほど使用しないが、 そのかわり工程中に遠心分離操作を多く含むた め、 多数の試料を一度に処理することが困難で、 核酸を単離するのに長 時間かかるという問題を含んでいる。
このように、 従来の核酸単離方法は有機溶媒やアル力リなどの危険な 試薬を使用すること、 遠心分離操作を必要とし、 多数検体の処理が難し いことなどの難点があるが、 多数の検体を再現性よく処理し、 人的コス トを低減させる自動機械化において、 さらに大きな問題点が存在する。 核酸抽出の自動機械化を目指したものとして、 核酸結合性シリ力粒子 とカオトロピックイオンを用いた方法 （非特許文献 1、 特許文献 1 ) が ある。 これは、 核酸結合性シリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力を もつカオトロピックイオンを試料と混合し、 試料中の核酸を核酸結合性 シリカ粒子に結合させ、 固相と液相を分離して、 試料中の夾雑物質を除 去した後、 核酸結合性シリ力粒子に結合した核酸を溶離するというもの である。
核酸増幅妨害物質の除去方法として核酸を含有する生体材料を酸処理 する方法が報告されている （特許文献 2 )。 しかしながら、 ここでは生物 材料検体から核酸を抽出する任意の段階において当該検体を酸で処理し うることは記載するものの、 試料中の核酸成分の単離精製を行わずに行 うことについては記載されていないため、 依然として迅速に核酸増幅方 法を行うことは困難であった。
核酸増幅反応の阻害を減少する方法として、 核酸増幅阻害物がァニォ ン性固相と結合するように、 サンプルをァニオン性固相と接触させる方 法が報告されている （特許文献 3 )。 しかしながら、 ここでも試料中の核 酸成分の単離精製を行わずに行うことについては記載されていないため. 依然として迅速に核酸増幅方法を行うことは困難であった。
腫瘍や癌の診断、 ウィルス、 バクテリア等の感染、 ならびに各種遺伝 子疾患の検出の分野では、 以上説明したような核酸増幅方法が実用化さ れている （臨床検査法提要、 第 31版、 金原出版株式会社、 1998年 9月 20 13発行）。
しかしながら、 核酸增幅手段を用いた核酸検出において、 測定に要す る時間、 感度等の面で改良すべき点は多く残されている。
(非特許文献 1 ) J. Cl ini cal Mi crobiology, 28- 3： p. 495-503， 1990年 (特許文献 1 ) 特許第 2680462号公報
(特許文献 2 ) 国際公開 W001/00813号公報
(特許文献 3 ) 特開平 09-173065号公報 発明の開示
本発明の課題は核酸増幅方法を用いて核酸の検出を行う際に、 測定に 要する時間を短縮し、 遺伝子等の検査システムを総合的に効率化させる ことである。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 生 体試料の前処理工程を改善すれば、 検査システム全体と しての時間が短 縮でき、測定感度が上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、
1 . 核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、 生体試料から核酸成分の 単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅法、
2 . 核酸の分解活性を阻害する手段が、 RNA の分解活性を阻害する手段 である前項 1に記載の核酸增幅方法、
3 .分解活性を阻害する手段の導入が酸性 pHでなされる前項 1又は 2に 記載の核酸増幅方法、
4 . 酸性 pHが pH2. 5〜pH5である前項 3に記載の核酸増幅方法、
5 . 採取した生体試料を均質化する工程を経た後に、 核酸成分の単離精 製をしないで核酸を増幅する前項 1〜 4のいずれか 1に記載の核酸増幅 方法、 6 . 核酸増幅反応の反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互作用する塩を 用いて生体試料を処理し、 核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅す ることを特徴とする直接核酸増幅方法、
7 . 反応阻害物及びノ又は核酸成分と塩との相互作用が、 イオン結合及 び Z又は疎水結合による前項 6に記載の核酸増幅方法、
8 . 塩がカオトロピック塩である前項 6又は 7に記載の核酸増幅方法、 9 . 塩がトリハロ酢酸のアル力リ金属塩である前項 6又は 7に記載の核 酸増幅方法、
1 0 . 塩の種類が、 NaCl、 KC1、 Nal、 KI、 TMAC1 (テトラメチルァンモェ ゥムクロライ ド）、 TEAC1 (テ トラエチルアンモェゥムク口ライ ド）、 KSCN、 CsSCN, CsCl のいずれか少なく とも 1を含む前項 8に記載の核酸増幅方 法、
1 1 . 塩の種類が、 CF3C00Cs (トリフルォロ酢酸セシウム） を含む前項 9に記載の核酸増幅方法、
1 2 . 塩濃度が lmM〜2000mMである前項 6 ~ 1 1のいずれか 1に記載の 核酸増幅方法、
1 3 . 核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、 さらに核酸増幅反応の 反応阻害物と相互作用する塩を用いて生体試料を処理する前項 6 ~ 1 2 のいずれか 1に記載の核酸増幅方法、
1 4 . 核酸の分解活性を阻害する手段が、 RNA の分解活性を阻害する手 段である前項 1 3に記載の核酸増幅方法、
1 5 .分解活性を阻害する手段の導入が酸性 PHでなされる前項 1 2〜 1 4のいずれか 1に記載の核酸増幅方法、
1 6 . 酸性 pHが pH2. 5〜PH5である前項 1 5に記載の核酸増幅方法、 1 7 . 採取した生体試料を均質化する工程を経た後に核酸成分の単離精 製を行わずに行う前項 6〜 1 6のいずれか 1に記載の核酸増幅方法、 1 8 . 反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理し た生体試料をさらにァニオン性の固体を用いて処理する前項 6〜 1 7の いずれか 1に記載の核酸増幅方法、
1 9 . 反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理し た生体試料を、 核酸成分の分解酵素阻害剤共存下で増幅させる前項 6〜 1 8のいずれか 1に記載の核酸増幅方法、
2 0 . 核酸成分の分解酵素阻害剤が、 RNase インヒ ビターである前項 1 9に記載の核酸増幅方法、
2 1 . 核酸増幅方法が、 LAMP法、 RT- LAMP法、 PCR法又は RT- PCR法のい ずれかである前項 1〜 2 0のいずれか 1に記載の核酸増幅方法、
2 2 . 前項 1〜 2 0のいずれか 1に記載の核酸増幅方法に使用する生体 試料の処理方法、
2 3 . 前項 1〜 2 0のいずれか 1に記載の核酸増幅方法に使用する核酸 検出用試薬、
2 4 . 前項 1〜 2 0のいずれか 1に記載の核酸増幅方法を使用する核酸 検出システム、
2 5 . 前項 2 4に記載の核酸検出システムを使用する核酸の検査装置、 2 6 .前項 2 4に記載の核酸検出システムを使用する癌転移の検査方法、 2 7 . 前項 2 4に記載の核酸検出システムに使用する核酸検査キッ ト、 2 8 . 核酸成分を安定な状態に保つ pHを有する生体試料処理溶液、
2 9 . pH力 S 2. 5-5である前項 2 8に記載の生体試料処理溶液、
3 0 . さらに、 核酸増幅反応の反応阻害物及びノ又は核酸成分と相互作 用する塩を含む前項 2 8又は 2 9に記載の生体処理溶液、 からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、抽出した RNAの安定性を示した説明図である （実施例 1 )。 第 2図は、 塩化力リ ゥム- HCl (pH3. 0) + 0. 1°/。ノニデッ ト P- 40緩衝液で 調製した検体について、 RT- LAMP法による CK19mRNAの遺伝子産物増幅タ ィムコースを示した説明図である （実施例 3 )。
第 3図は、 ダリシン _HCl (pH2. 2)緩衝液で調製した検体について、 RT- LAMP法による CK19mRNAの遺伝子産物増幅タイムコースを示した説明 図である （実施例 3 )。
第 4図は、 トリフルォロ酢酸セシウム添加の有無による CK19mRNA の 遺伝子産物の増幅立ち上がり時間を比較した図である （実施例 4 )。 第 5図および第 6図は、 RNaseインヒ ビターの添加の有無による β -ァ クチン mRNAの遺伝子産物増幅を比較した図である （実施例 5 )。
第 7図は、 緩衝液の pHの違いによる CK19mRNAの遺伝子産物の増幅立 ち上がりサイクル数を比較した図である （実施例 7 )。 発明を実施するための最良の形態
本発明の核酸増幅方法、 生体試料の処理方法、 核酸検出用試薬等につ いて以下に説明する。
本発明における直接核酸増幅方法とは、 被検試料である生体から採取 した生体試料をプレンダ一等で均質化した後、 該生体試料中に含有する 核酸を増幅させることが可能な核酸増幅方法をいい、 均質化した生体試 料から目的とする核酸成分を抽出しないで直接核酸を増幅させることが 可能な核酸増幅方法をいう。
本発明における生体試料とは、 目的とする核酸の増幅のために生体か ら得られる試料をいい、具体的には生体から採取した組織、全血、血清、 血漿、 尿、 唾液、 体液、 分泌物などのヒ ト又は動物由来の生物材料、 そ の他、 植物、 微生物などの動物以外の生物材料を包含する。 (生体試料の処理）
核酸の分解活性を阻害する手段を導入するとは、 生体試料中に含有さ れる核酸を分解する原因物質、 例えば分解酵素の活性を阻害する物質や 条件等を、生体試料処理の際に導入することをいう。ここで核酸とは DNA 又は RNAをいい、 例えば蛋白質の発現確認のためには RNA、 特に mRNAが 好ましく適用される。' RNAは、 生体成分中に含有される RNA分解酵素に より分解されやすく、 特に不安定である。 本発明において核酸の分解活 性を阻害する手段とは、 具体的には例えば DNA分解酵素又は RNA分解酵 素の活性を阻害する手段をいう。 この場合において、 一般的には核酸分 解酵素阻害剤の添加等の方法が考えられるが、 本発明では核酸の分解活 性を阻害しうる手段であればどのような手段であっても良い。 例えば、 核酸分解酵素の活性を阻害する手段としては、 酵素蛋白質の変性により 酵素活性を阻害する手段を適用することができる。 酵素蛋白質を変性さ せうる手段と しては、 蛋白質変性剤の添加、 加熱処理、 pHの変化に伴う 変性処理などが挙げられる。 本発明では、 酵素蛋白質を変性させ、 かつ 目的とする核酸成分を安定な状態で確保することが必要である。
そこで、 目的とする核酸成分を安定な状態で保つ条件を検討したとこ ろ、生体試料処理液の pHにより生体試料に含有される核酸の安定性が異 なることがわかった。 処理溶液は、 試料に含まれる核酸分解酵素等の酵 素活性が最も高い中性付近では好ましくなく、 さらに酸性が強くなれば ( pHが低くなれば）、 核酸成分、 とくに RNAはリン酸ジエステル結合の 化学的な分解などにより短い断片に切断されるので pH2以下も好ましく ない。 本発明は、 中性又はそれより低い pHの条件で生体試料の処理を行 い、目的とする核酸が安定な条件を見出したことが一つの特徴点である。 具体的には、 生体試料を pH2. 5〜5、 好ましくは pH3〜4、 さらに好ましく は pH3付近の溶液で処理することで、 目的とする核酸成分を安定な状態 で確保することができる。
酸性 pH の溶液とは、 具体的にはダリシン- HC1、 塩化力リゥム- HC1 を 含む溶液が挙げられる。
上記生体試料の処理は、 核酸増幅反応の反応阻害物と相互に作用する 塩の添加により行うこともできる。 核酸増幅反応の反応阻害とは、 例え ば mRNAを铸型として DNAを増幅させる場合には、 mRNAからの逆転写活 性の抑制、 DNA の複製の抑制等が挙げられる。 このような増幅反応の抑 制は、 例えば目的とすべき DNA又は RNAなどの核酸が、 試料中に含まれ る蛋白質に結合する等により起こることが考えられる。
生体試料を酸性 PHで処理すると、 RNA等の核酸成分は （一） に荷電し たままであるが、 蛋白質は （+ ) に荷電する傾向にあるので、 核酸成分 と蛋白質がイオン結合や疎水結合によって結合する。 このような核酸成 分と蛋白質の結合を防止するために、核酸成分が蛋白質に結合する前に、 蛋白質とイオン結合あるいは疎水結合する物質を処理液に添加すればよ い。 このような物質を、 反応阻害物及びノ又は核酸成分と相互に作用す る塩ということができる。
反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互に作用する塩の具体例と して、 カオトロピックイオンを発生しうる塩、 いわゆるカオトロピック塩及び トリハロ酢酸のアル力リ金属塩等が挙げられる。 カオトロピックイオン とは、 イオン半径の大きな 1価の陰イオンの総称であり、 このイオンを 水に加えると疎水性分子の水溶性が増加して、 疎水性結合を弱める作用 を有する。 つまり、 これらのイオンが、 目的核酸成分が反応阻害物にィ オン結合あるいは疎水結合するのを弱め、 目的核酸成分が反応阻害物に 吸着されることを防ぐことにより、 核酸増幅反応が効率良く行われるこ ととなる。 カオトロピックイオンの具体例と して、 SCN-、 Γ、 C104—、 NO 3一、 Br―、 Cl—、 CH 3 C02—、 F—などが挙げられる。 このようなイオンを発生 しうる塩としては、 NaCl、 KC1、 LiCl、 RbCl、 Nal、 KI、 TMAC1、 TEAC1、 KSCN、 CsSCN、 CsCl等力 S挙げられ、好ましくは NaCl、 KC1、 Nal、 Kェ、 TMAC1、 TEAC1、 KSCN、 CsSCN、 CsClである。 上記塩の添加は、 上記の核酸分解活 性を阻害する手段の導入に前後して行うこともでき、 同時に行うことも できるが、 同時に添加するのが効率良く最も好ましい。
また、 トリハロ酢酸のアル力リ金属塩についてもカオトロピック塩と 同様な効果により核酸増幅反応の効率化を行うことができる。 トリハロ 酢酸のアル力リ金属塩の具体例としてトリフルォロ酢酸ナトリ ウム、 ト リフルォロ酢酸カリ ウム、 トリフルォロ酢酸セシウム、 トリフルォロ齚 酸リチウム、 トリクロ口酢酸ナトリウム、 トリクロ口酢酸カリ ウム、 ト リクロロ酢酸セシウム、 トリクロ口酢酸リチウム、 トリクロ口酢酸ルビ ジゥム、 トリクロ口酢酸フランシウム等が挙げられ、 好ましくはトリフ ルォロ酢酸セシウムである。 上記塩の添加は、 上記の核酸分解活性を阻 害する手段の導入に前後して行うこともでき、 同時に行うこともできる が、 同時に添加するのが効率良く最も好ましい。
添加する塩の濃度は、 lmM〜2000mM、好ましくは 50raM〜500mMより好ま しくは 100mM〜300mMである。
核酸増幅反応の反応阻害物と相互に作用する塩により処理した上記生 体試料は、 ァユオン性の固体、 すなわち陰性に荷電した固体で処理する ことができる。 ァニオン性の固体として、 カチオン交換樹脂、 例えば力 ルポキシメチル、 ホスホ又はスルホプロピル誘導体化イオン交換マ ト リ ックス又はその他のあらゆる陰性に荷電した表面を有する固体、 例えば 陰性に荷電したシリカ物質を使用することができる。 カチオン交換樹脂 等のァユオン性の固体で生体試料を処理する方法は公知の方法によるこ とができ、 具体的には、 カラムクロマトグラフィー法及びパッチ法を適 用することができる。 例えば試料とァニオン性の粒子を混合し、 遠心、 静置、 磁気分離又は同様の手段によってァユオン性の粒子を上記反応阻 害物とともに目的とする核酸成分から分離することができる。
さらに安定性の効果を高めるために、 自体公知の界面活性剤を併用し て用いても良い。 界面活性剤としては、 非イオン界面活性剤、 陽イオン 界面活性剤、 陰イオン界面活性剤、 両性界面活性剤などがあり、 好まし くは非イオン界面活性剤を使用する。 非イオン界面活性剤としては、 高 級アルコール、アルキルフエノール、脂肪酸などのエチレングリコーノレ、 多価アルコールの部分エステル、 高級脂肪酸グリセロールエステル、 ソ ルビ トールの脂肪酸エステル、 ポリ プロ ピレンダルコールを疎水性基と し両端にエチレングリコールを親水性基として付加重合させたものなど がある。 これらの界面活性剤は単独で又は 2種以上併用してもよい。 生体試料は、 ホモジナイザ一及び Z又はプレンダ一等を用いて粉砕し て均質化させた後、 上記の核酸分解活性を阻害する手段及び/又は核酸 増幅反応の反応阻害物と相互に作用する塩による処理、 及び/又はァュ オン性の固体で処理し、 測定試料を調製することができる。 このように して得た測定試料は、そのまま本発明の測定方法に使用することができ、 この点が本発明の直接核酸増幅方法ということを示す主な特徴点である。 均質化した生体試料は、 細胞破砕物を除去するために必要に応じて、 ろ 過、 遠心分離等の処理を施すこともできる。
(核酸の増幅工程）
本発明の核酸の増幅法は、公知のものが適用され、特に限定されない。 例えば、 PCR法、 RT - PCR法、 LAMP法、 RT - LAMP法、 TMA (Trans cription Mediated Ampl i ficat ion)法（特表平 4-500759 号公報）、 NASBA 法、 3SR 法、 SDA (Strand Di splacement Ampl ifi cation; ¾ ICAN (I sothermal and Chimeri c primer 一 init iated Ampl ification of Nucleic acids)法等の 核酸増幅法及ぴ RCA (Ro l ling Circ le Ampl ifi cat ion)法、 INVADER法、 CPT (Cycl ing Probe Technology)法、 PALSAR法等の核酸増幅法の一種である シグナル増幅法にも適用することができる。 好ましくは PCR法、 RT- PCR 法、 LAMP法、 RT- LAMP法であり、 より好ましくは RNAを増幅する RT- PCR 法、 RT-LAMP法において、 特に効果的に適用される。
(増幅産物の検出）
通常反応終了後の増幅産物は、 自体公知の方法によって検出すること ができ、 特に限定されない。 例えば、 ァガロースゲル電気泳動法、 蛍光 標識を使用したプローブにより検出するリアルタイム検出法、 DNA 合成 の際の副生成物の濁りによる検出等、 必要に応じて制限酵素による切断 パターンの確認や、 直接シークェンス解析で塩基配列を決定する方法、 その他多くの方法から選択して適用することができる。 また、 非特異的 な増幅バンドが多くて特異バン ドの判別が困難な場合は、 目的とする増 幅域内のプローブを用いたサザンブロッ ト法等により特異バンドを確認 することができる。 本発明においても、 これらの公知の方法を適用する ことができる。
(対象核酸）
上記の手段を適用しうる目的の核酸は特に限定されないが、 微量の核 酸成分を増幅させることにより、 疾患の有無を判断する臨床検査の場に おいて広く適用される。 例えば、 癌あるいは腫瘍関連マーカーの発現の 確認、 遺伝子関連の疾患、 ウィルス又は微生物の感染の有無の判断等に 適用される。
癌あるいは腫瘍関連マーカーとしては、 例えば癌患者の癌組織及び癌 の発生した臓器の正常部位において同等に発現しているが診断対象の組 織では癌の転移がない限りその発現が認められないもの、 あるいは癌組 織において発現が強く認められるもの等が挙げられる。 癌患者の癌組織 及び癌の発生した臓器の正常部位において同等に発現しているものの例 として、 サイ トケラチン類、 具体的にはサイ トケラチン 1 8、 サイ トケ ラチン 1 9、 サイ トケラチン 2 0等が挙げられる。 また、 癌組織におい て発現が強く認められるものの例として CEAなどの腫瘍マーカーが挙げ られる。診断対象の組織中の各蛋白質に由来する mRNAを確認することに より癌細胞の転移を確認することができる。
上記の特定患者に認められる癌組織由来の raRNAを確認するためには、 癌組織、 癌の発生した臓器の正常部位あるいは診断対象の組織のいずれ においても同等に発現している蛋白質の mRNA の量を指標とする場合が ある。 このような例として具体的には /3—ァクチン、 GAPDHの raRNAなど が挙げられる。
本発明の方法を適用することにより、 迅速に癌のリンパ節転移や腹腔 内転移等を診断することが可能となる。 例えば、 乳癌などは、 Q0L (生活 の質： Qual i ty of l i fe)の向上のため、 手術におけるリンパ節郭清範囲 は可能な限り小さくすることが望ましい。 また、 食道癌では、 リンパ節 転移の部位により開腹、 開胸、 類部切開の選択が必要になる。 前立腺癌 では、 リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、 ホルモン療法を行うな どの手術の続行あるいは中止の意思決定がなされる。さらに、胃癌では、 リンパ節への癌転移の有無により郭清範囲が異なり、 術式が大きく変動 し、 術後の治療方針の指針、 例えば抗癌剤の投与あるいは放射線療法の 選択の指針となる。 このような場合に、 術中に採取した生体組織を用い て癌転移を迅速に診断することができれば、 短い時間の手術においても リンパ節郭清範囲決定、 術式の変更、 捕助療法の選択などを行うことが でき、 患者にとって最適な治療を受けることが可能となる。 本発明の検 查システムを癌転移の術中迅速診断方法として適用することができる。 遺伝子関連の疾患としては、 遺伝性疾患の検査、 例えば加齢に伴い発 症する遺伝性疾患の発症リ スクの予測、 具体的には緑内障、 家族性大腸 癌、 高血圧、 糖尿病などの発症リ スクを判断する場合に適用される。 ま た、 ウィルス又は微生物の感染の有無の判断は、 生体組織、 例えば血液 などに含まれる感染原因物質の核酸配列の有無を迅速に検査することが できる。
(試薬、 検査キッ ト及び検査システム）
本発明は、 直接核酸増幅方法を行うために必要な各種の試薬類、 具体 的には、 生体試料処理液、 逆転写酵素、 相補鎖合成の基質となる dNTP、 鎖置換型の相補鎖合成を行う DNAポリメラーゼ、 本発明のために使用さ れるプライマーと して必要な各種のオリゴヌクレオチド、 酵素反応に好 適な条件を与える緩衝液、 さらに必要に応じて反応生成物の検出のため に必要な試薬類を提供することができる。 さらに、 これらの試薬のうち 生体試料処理液及び他の少なく とも 1つの試薬を組み合わせてキッ トと して提供することができる。
本発明は、 直接核酸増幅方法の他、 生体試料処理方法、 処理方法を含 む核酸検出用試薬、 キッ ト及び核酸検出システム全体に及ぶ。 また、 本 システムを適用する装置、 癌転移の検查方法にも及ぶ。 具体的には、 例 えば癌患者の手術中に、 生体から採取した組織について本システムを適 用することが可能であり、 手術の間に他の組織への癌転移の確認をする ことができる。 (実施例）
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこ れら実施例に限定されるものではない。 (実施例 1 )
RNAを安定に保つ条件について検討した。
1 ) 材料及ぴ方法
(1)試料の調製
マウスからリンパ節をとり、 ホモジナイザー及ぴプレンダ一を用いて 組織を粉砕し、 均質化した組織を 4°Cで遠心分離 （12000rpmX 5分） し て上清をとつた。 市販の抽出用試薬 （TRIZ0L： Gibco BRL 社製） を用い て上清から RNAを抽出した。
抽出して得た RNA 513 g/mlの水溶液について、 以下の各種緩衝液注 での保存安定性を調べた。 各種緩衝液 7 /i l に、 上記マウス RN A溶液 2 μ 1を加え、 室温で 10分間静置した。 その後、 電気泳動用緩衝液 1/X 1 を加えてァガロースゲル電気泳動により、 RNAの安定性を調べた。
(2)緩衝液
① 200mM塩化力リ ゥム- HC1 (pHl.0) +0.1%ノニデッ ト P-40 (非イオン 性界面活性剤： Calbiochem社製）
② 200mM塩化力 リ ゥム- HC1 (pH2.2) +0.1%ノ -デッ ト P-40
③ 200mM塩化力リ ゥム- HC1 (pH3.0) +0.1%ノニデッ ト P- 40
④ 200mMグリシン— HCl(pH3.0) +0.1%ノニデッ ト P - 40
⑤酢酸緩衝液 （PH5.2) +0.1%ノ -デッ ト P- 40
©50raMTris-HCl (pH7.4) + 0.1 %ノニデッ ト P— 40
⑦緩衝液を加えない場合（H20)
(3) RNAの検出 （ァガロース電気泳動）
ァガロースゲル電気泳動は、 1 %ァガロース、 TEA 緩衝液を用い、 1 レーンあたり 1 μ g となるように RNAを添加し、 通常の手法で行った。 2 ) )fc ^
その結果を図 1に示した。 pH3. 0より中性側の緩衝液中では、 RNAは分 解されず、安定であることが示された。 pH2. 2より酸性の緩衝液中では、 RNAは分解され、 RNAのバンドが認められなかった。
pH3. 0の緩衝液が RNAを安定化し、 RNA試料調製用緩衝液として最も効 果的であることがわかった。
(実施例 2 )
乳癌患者からリンパ節を採取し、 サイ トケラチン （CK18及び CK 19) の mRNAの有無を、 ヒ ト粗製 RNA試料及び精製 RNA試料について RT- PCR法 で確認した。
1 ) 材料及び方法
( 1)試料の調製
ヒ ト リ ンパ節を 50mM 塩化力リ ゥム- HCl (pH3. 0) + 0. 1 %ノニデッ ト P- 40の緩衝液に懸濁し、 ホモジナイザー及びプレンダーを用いて該ヒ ト リンパ節の組織を粉砕し、 均質化した組織を 4°Cで遠心分離 （12000rPm X 5分） して上清をと り、 粗製 RNA試料とした。 さらに、 実施例 1 と同 様に、 市販の抽出用試薬 （TRIZ0L： Gibco BRL 社製） を用いて粗製 RNA 試料から RNAを抽出し、 精製 RNA試料とした。
(2)使用したプライマー又はプローブの配列
①し K18 reverse primer：
5' -GATGGTTTGCATGGAGTTGCT-3' (配列番号 1 )
( Genbank acce ss ion No. 4557887 に基づく CK18 の配列の塩基位置 1215- 1195位）
② CK18 forward primer：
5' - GCCGCCTGCTGGAAGAT- 3， （配列番号 2 ) (Genbank accession No.4557887 に基づく CK18 の配列の塩基位置 1142-1158位）
③ CK19 reverse primer：
5' -TCCAGGGCGCGCAC-3' (配歹【J番号 3 )
(Genbank accession No.4504916 に基づく CK19 の配列の塩基位置
305-292位）
④ CK19 forward primer：
5' -AAGCTAACCATGCAGAACCTCAAC-3' (配列番号 4 )
(Genbank accession No.4504916 に基づく CK19 の配列の塩基位置 241-264 iiL)
⑤ TaqMan probe for CK18：
5' -CAAGGCATCACCAAGATTAAAGTCCTCGC-3' (配列番号 5 )
(Genbank accession No.4557887 に基づく CK18 の配列の塩基位置 1188-1160位)
©TaqMan probe for CK19：
5' -CGCCTGGCCTCCTACCTGGACA-3' (配列番号 6 )
(Genbank accession No.4504916 に基づく CK19 の配列の塩基位置
268-289位)
(3)RT - PCR法
RT-PCRは、 アプライ ドバイオシステムズ社の RT-PCRマスター試薬を 用いて行った。
測定キッ ト ： TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents (ァプ ライ ドバイオシステムズ社製）
cDNA合成 ： MultiScribe 逆転写酵素を用いて合成した。
① CK18の増幅
逆転写用プライマー ：配列番号 1に記載のプライマーを用いた。 PCR 用プライマー ：配列番号 1及び 2に記載のプライマーを各々最終 濃度 300nMとなるように用いた。
DNAポリメラーゼ ： Ampl i Taq Gold DNA ポリメラーゼを用いた。
② CK19 の増幅
逆転写用プライマー ：配列番号 3に記載のプライマーを用いた。
PCR 用プライマー ：配列番号 3に記載のプライマーを最終濃度 300 及び配列番号 4に記載のプライマーを最終濃度 900nMとなるように用い た。
DNAポリメラーゼ ： Ampl i Taq Gold DNA ポリメラーゼを用いた。
③ PCR処理
48°Cで 30分間逆転写反応後、 95°Cで 10分間保持した。
その後、 95°C： 15秒間、 60°C： 1分間の PCR操作を 40サイクル行った。 (4)核酸の検出
ヒ ト CK18及ぴ CK19mRNAの増幅産物を標的 2本鎖 DNAに特異的にハイ ブリダィズする TaqMan プローブによる蛍光法により検出した。 TaqMan プローブは、 CK18には配列番号 5、 CK19には配列番号 6 のオリ ゴヌタ レ ォチドで、 各々 5'末端に FAM、 3'末端に TAMRAをラベルしたものを用い た。 アプライ ドバイオシステムズ社製 PRISM7700を用いて、 反応液中の 蛍光強度の増加をリアルタイムで測定した。
(表 1 ) 表 1 RT— PCRの測定
(精製 RNA試料および粗製 RNA試料の湖定値）
精製 RNA試料 粗製 RNA試料
Sample
copies/ng total RNA copies/ng total RNA
CK1 B 2000 300
CK19 9000 1900
2 ) ロ ^z
以上の結果、 臨床的な結果 （HE染色組織診） と RT-PCRによる測定結 果が一致し、 CK18及ぴ CK19の niRNAについて各々増幅が認められた。 ま た、 粗製 RNA試料についても mRNAから 300及び 1900コピーの核酸の増 幅が認められた （表 1 )。
このことから、試料調製用液としてノニデッ ト P-40を含む pH3. 0の緩 衝液を使用すると、 RNAを抽出することなく RT - PCR法において増幅が認 められ、 結果と して RNA検出に要する時間が短縮可能となった。
(実施例 3 )
乳癌患者からヒ トリンパ節を採取し、 HE染色により臨床的に癌転移が 認められている検体について乳癌のマーカーである CKl9mRNAを RT-LAMP 法で検出した。
1 ) 材料及ぴ方法
( 1)試料の調製
ヒ トリンパ節を緩衝液に懸濁し、 ホモジナイザー及びプレンダーを用 いて組織を可溶化した。 均質化した組織を 4°Cで遠心分離 （12000rpm X 5 分） して上清 （ライセート） をとり、 粗製 RNA試料とした。 組織の懸濁 に 50m M塩化カリ ゥム _HCl (pH3. 0) + 0. 1 %ノエデッ ト P- 40の緩衝液又 は 50mMグリシン- HCl(pH2.2)緩衝液を用いた。 さらに実施例 1及び 2と 同様に、 市販の抽出用試薬 （TRIZOL： Gibco BRL社製） を用いて粗製 RNA 試料から RNAを抽出し、 精製 RNA試料とした。
(2) RT-LAMP法による増幅
CK19の増幅は、 次の配列： 7〜 1 2に示す 6種のプライマーを含む以 下の組成に粗製 RNA溶液あるいは精製 RNA溶液 2μ 1を添加し、 65°Cで 1時間加温して行った。
マ一
① 19- FA-1101：
ΰ -ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-ύ' (酉己列畨号 Ί )
② 19 - RA- 1101：
5' -aggtcagtgtggaggt gcgcatgtcactcaggatc-3 (酉己グ'' J备 8 )
③ 19- F3-1101 ：
5' -acctggagatgcagatcg-3 Θ己列畨号 9 )
④ 19 - R3 1101：
5 -caggcttcagcatccttc-3' (配列番号 1 0 )
⑤ 19 - LPF - 1101：
5' -tgatttcctcctcatggttc-3' (酉己歹 U番号 1 1 )
©19-LPR-1101：
5' -tccgggcaccgatctc-3' (配列番号 1 2 )
(4)反応液組成
dNTPs (GIBCO社製） 0.4 mM MgS04 2 mM ジチォスレイ ト一ノレ 5 mM ベタイン （Sigma社製） 640 mM The進 po l緩衝液（New England BioLabs社製）
AMV 逆転写酵素 （Promega社製） 1. 25U Bst DNA ポリメラーゼ （New England BioLab s) 16U ェチジゥムブ口マイ ド 0. 125 mg/mL forward inner primer ( 19 - FA - 1101：配列番号 7 ) 40 pmol reverse inner primer ( 19- RA - 1101：酉 歹 (1番 8 ) 40 pmol forward outer primer ( 19 - F3- 1101：配歹 (I番号 9 ) 5 pmol reverse outer primer ( 19 - R3 - 1101： 列番号 1 0 ) 5 pmol forward loop primer ( 19-LPF-1101：配歹 (I番号 1 1 ) 20 pmol reverse loop primer ( 19-LPR- 1101：配歹 lj番号 1 2 ) 20 pmol (5)核酸の検出
ヒ ト CK19mRNAの增幅産物を 2本鎖 DNAに特異的に結合するェチジゥム プロマイ ドによる蛍光法により検出した。 反応液中の蛍光強度の変化は プライ ドバイオシステムズ社製 PRISM7700を用いてリアルタイムに測定 した。
)
調製用緩衝液として、 塩化カリ ウム- HC1 (pH3. 0) +ノュデッ ト P - 40 を使用した場合の結果及びグリシン- HC1 (pH2. 2)緩衝液を使用した場合 の、 各 RT- LAMP法により核酸増幅処理を行った結果を図 2及び図 3に示 した。
ダリシン- HC1 (PH2. 2)緩衝液の場合は、精製した RNA試料では増幅が認 められたが、 粗製 RNA試料の場合には増幅されなかった。 一方、 塩化力 リ ゥム- HCl (pH3. 0) +ノニデッ ト P-40緩衝液の場合は、 精製 RNA試料及 び粗製 RNA試料のいずれにおいても増幅が認められた。
このことから、 調製用緩衝液として、 ノニデッ ト P - 40 を含む pH3. 0 の緩衝液を使用すると、 RNAを精製することなく RT- LAMP法において増 幅が認められ、 結果として RNA検出に要する時間が短縮可能となった。 (実施例 4)
リンパ節検体を破砕して可溶化する際に塩類を添加し、 粗製 RNA試料 を用いて増幅反応を行う際の夾雑物による増幅の阻害を低減する条件に ついて検討した。
1 ) 材料および方法
(1)試料の調製
マウスリンパ節を緩衝液中でプレンダーを用いて破碎し、均質化した。 また、 これとは別に培養細胞（KATOIII)を緩衝液中で可溶化し、均質化し た。 均質化したこれらの溶液を混合し、 粗製 RNA試料として用いた。 こ れらの均質化には、 lOOmM のトリフルォロ酢酸セシウムを含むあるいは 含まない 1°/。ノニデッ ト P-40含有 200mMグリシン _HCl(pH3.0)緩衝液を用 いた。
(2)RT-LAMPによる増幅
CK19mRNAの増幅は、 次の配列： 7〜 1 0に示す 4種のプライマーを含 む以下の組成にて、 65°Cで 1時間加温して行った。 各反応液には、 上記 KATOIII 細胞培養細胞可溶化試料およびマウスリンパ節可溶化試料を適 当な比率で混合し、一反応液に KATOIII細胞 20個に相当する試料が入り、 また、 夾雑物量のパラメータ一として共存タンパク量が設定した量にな るように調製した。
マ一
① 19- FA- 1101： (配列番号 7)
② 19- RA- 1101： (配列番号 8 )
③ 19-F3- 1101： (配列番号 9 )
④ 19- R3- 1101： (配列番号 1 0 ) ⑤ 19-LPF- 1101： (配列番号 1 1 )
⑥ 19- LPR- 1101： (配列番号 1 2)
(4)反応液組成
dNTPs (GIBC0社製） 0.4 mM MgS04 2 mM ジチオス レィ トーノレ 5 mM ベタイン （Sigma社製） 640 mM
Thermopol緩衝液 (New England BioLabs社製)
AMV 逆転写酵素 （Promega社製） 1.25U
Bst DNA ポリメラーゼ （New England BioLabs) 16U ェチジゥムブ口マイ ド 0.125 mg/mL for ar inner primer (19 - FA - 1101 ： ΰ列番 7 ) 40 pmol reverse inner primer (19-RA-1101：目己列番 8 ) 40 pmol forward outer primer (19- F3-1101：酉己列番号 9 ) 5 pmol reverse outer primer (19 - R3 - 1101：酉己歹 (I番号 1 0 ) 5 pmol forward loop primer 、丄 9-LPF-1101 ： 目 ii列番号 1 1 ) 20 pmol reverse loop primer (19 LPR - 1101：配歹 [J番号 1 2 ) 20 pmol (5)核酸の検出
反応系に共存させたェチジゥムブロマイ ドの蛍光により検出した。 ァ プライ ドバイオシステムズ社製 PRISM7700を用いて、 反応液中の蛍光強 度の変化をリアルタイムに測定した。
2) 結果
粗製 RNA試料を調製するための緩衝液として、 lOOmM トリフルォロ酢 酸セシウムおよび 1%ノ -デッ ト P-40 を含む 200mM グリ シン - HC 1 (PH3.0)緩衝液を使用した場合の結果およびトリフルォロ酢酸セシウム を含まず 1%ノ -デッ ト P-40を含む 200mMグリシン- HC1 (pH3. 0)緩衝液を 使用した場合の結果を図 4に示す。 横軸には、 一反応液中に含まれる夾 雑タンパク量を示し、 縦軸には DNA増幅の立ち上がり時間を示す。 粗製 RNA試料を調製するための緩衝液中に l OOmMのトリフルォロ酢酸セシゥ ムが存在する場合には、一反応液中の夾雑タンパク量が 8 z g近くにまで 増えても DNA増幅の立ち上がり時間はほとんど変化しない。これに対し、 トリフルォロ酢酸セシウムが存在しない場合は、 夾雑タンパクの量が增 えるにつれて明らかに DNA増幅の立ち上がり時間は遅延する。すなわち、 核酸増幅反応が夾雑タンパクにより阻害されていることを示す。 これら のことから粗製 RNA試料調製用緩衝液に lOOmM ト リ フルォロ酢酸セシゥ ムを含有させることで夾雑タンパクによる増幅反応の阻害を低減するこ とができ、 結果と して一反応液に添加できる粗製 RNA試料溶液を増やす ことができ、 感度の向上が可能となった。 (実施例 5 )
リンパ節検体から調製した粗製 RNA試料を用いて増幅反応を行う際に RNaseィンヒビターを添加することで RNaseによる標的 mRNAの分解を防 ぎ、 検出感度の向上を図ることを検討した。
1 ) 材料および方法
( 1)試料の調製
乳癌患者リンパ節を lOOmMのトリフルォロ酢酸セシウムを含むあるい は含まない 1°/。ノニデッ ト P- 40含有 200mMグリシン- HCl (pH3. 0)緩衝液中 でプレンダーを用いて破砕し、 均質化した。 均質化したこの溶液をその ままあるいは、均質化に用いた緩衝液を用いて 5倍、 あるいは 50倍に希 釈して粗製 RNA試料と して用いた。
(2) RT-LAMP法による増幅 -ァクチンの増幅は、次の配列番号 1 3〜 1 8に示す 6種のプライマ 一を含む以下の組成に上記粗製 RNA試料 2 1 を添加し、 65°Cで 1時間加 温して行った。
(3)プライマー
① AFA-4：
a -tgaaggtagtttcgtggatgcctgaggcactcttccagc-3 (酉己列 1 3ノ
② ARA - 4：
5' -tgaagtgtgacgtggacatccagggtacatggtggtgc-3 (酉己歹！^ ： 1 4 )
③ AF3 - 4：
5' -tggcaatgagcggttcc-3' (配列番号 ： 1 5 )
④ AR3-4：
5' -tcctt ctgcatcctgtcg-3' (配列番号 ： 1 6 )
©AD-LPF1 ：
5 -acaggactccatgccc-3 ( ti列番"^ : 1 7)
©AD-LPR1 ：
5 - "tgtacgccaacacagtgc - 3 (酉己歹 (J番 : 1 8 )
(4)反応液組成
dNTPs (GIBC0社製） 0.4 raM
MgS04 2 mM
ジチオス レィ トール 5 raM ベタイン （Sigma社製） 640 mM
Thermopol緩衝液（New England BioLabs社製）
AMV 逆転写酵素 （Proraega社製） 1.25U
Bst DNA ポリメラーゼ (New England BioLabs) 16U
ェチジゥムブロマイ ド 0.125 mg/mL forward inner primer (AFA-4： 酉己歹『J番号 1 3 ) 40 pmol reverse inner primer (ARA-4：配列番号 1 4 ) 40 praol
forward outer primer (AF3 - 4：配列番号 1 5 ) 5 pmol
revers e outer primer (AR3 - 4：酉己夕' (J番 1 6 ) 5 pmol
forward loop primer (AD-LPF1：配列番号 1 7 ) 20 pmo l
revers e loop primer (AD-LPR1：酉己歹' J番号 1 8 ) 20 pmo l
RNas eインヒ ビター
( STRATAGENE社製、 RNase Bl ock Ribonuc l ease I nhibi tor) 25 U (5)核酸の検出
増幅産物は反応系に共存させたェチジゥムブ口マイ ドの蛍光により検 出した。 アプライ ドバイオシステムズ社製 PRISM7700を用いて、 反応液 中の蛍光強度の変化をリアルタイムに測定した。
2 ) 結果
増幅反応液に RNaseインヒビターを添加した場合と添加していない場 合の結果を図 5及び図 6に示す。 横軸には、 反応時間を示し、 縦軸には 蛍光強度を示す。 反応液中に RNas eインヒ ビターを含む場合にはヒ トリ ンパ節を均質化して調製した粗製 RNA試料、 5倍希釈した試料、 50倍希 釈した試料についても阻害がかからず、増幅反応が起こることがわかる。 これに対して、 反応液中に RNas eインヒビターが含まれない場合には、 増幅反応に阻害がかかり、 特に希釈していない粗製 RNA試料を用いた場 合には、 增幅がほとんど起こらないことがわかる。 これらのことから反 応液中に 25Uの RNas eインヒ ビターを添加させることで粗製 RNA試料中 に含まれる夾雑物による増幅反応の阻害を低減することができ、 結果と して一反応液に添加できる粗製 RNA試料溶液を增やすことができ、 感度 の向上が可能となった。
(実施例 6 ) リンパ節検体を破碎し、 均質化する緩衝液中に lOOmM トリフルォロ酢 酸セシウムを含み、 増幅反応液中に 25Uの RNaseインヒビターを含む条 件で実際に乳癌患者リンパ節を用いてこれらを添加することの効果を確 認した。
1 ) 材料および方法
(1)試料の調製
乳癌患者リンパ節を lOOmMのトリフルォロ酢酸セシウムを含むあるい は含まない 1%ノニデッ ト P-40含有 200mMグリシン- HCl (pH3. 0)緩衝液中 でプレンダーを用いて破碎し、 均質化した。 均質化したこの溶液を均質 化に用いた緩衝液を用いて 5倍希釈し粗製 RNA試料として用い、 RT- LAMP による増幅反応を行った。 また、 粗製 RNA 試料中に含まれる CK19mRNA のコピー数を測定するために粗製 RNA試料から実施例 1 と同様に、 市販 の抽出用試薬 （TRIZ0L : Gibco BRL社製） を用いて RNA を抽出精製し、 精製 RNA試料として RT-PCRを行った。 RT-PCRは実施例 1 と同様の条件 にて行った。
(2) RT- LAMPによる増幅
CK19mRNAの増幅は、 次の配列： 7 〜 1 2に示す 6種のプライマーを含 む以下の組成にて、 65°Cで 1時間加温して行った。 トリフルォロ酢酸セ シゥム共存下で均質化した粗製 RNA 試料を用いる場合には反応液中に RNaseインヒビターを添加して増幅反応を行った。
(3)プライマー
① 19- FA- 1101： (配列番号 7 )
② 19- RA- 1101： (配列番号 8 )
③ 19- F3- 1101： (配列番号 9 )
④ 19-R3- 1 101 ： (配列番号 1 0 )
⑤ 19- LPF- 1101： (配列番号 1 1 ) ⑥ 19- LPR - 1101： (配列番号 1 2 )
(4)反応液組成
dNTPs (GIBC0社製） 0.4 mM MgS04 2 mM ジチォスレイ トール 5 raM ベタイン （Sigma社製） 640 mM
Thermopol緩衝液 (New England BioLabs社製）
AMV 逆転写酵素 （Promega社製） 1.25U
Bst DNA ポリメラーゼ （New England BioLabs) 16U ェチジゥムブロマイ ド 0.125 mg/mL forward inner primer (19- FA- 1101 ：配列番号 7 ) 40 pmol reverse inner primer (19 RA - 1101 ： gfl列番号 8 ) 40 pmol forward outer primer (19 - F3-1101 ：酉己列番号 9 ) 5 pmol reverse outer primer (19- R3 - 1101 ：配列番号 1 0) 5 pmol forward loop primer (19HLPF - 1101 ：配列番号 1 1 ) 20 pmol reverse loop primer (19 - LPR- 1101：配列番号 1 2 ) 20 pmol RNaseインヒ ビター
(STRATAGENE社製、 RNase Block Ribonuclease Inhibitor) 25 U (5)核酸の検出
増幅産物は反応系に共存させたェチジゥムブ口マイ ドの蛍光により検 出した。 .アプライ ドバイオシステムズ社製 PRISM7700を用いて、 反応液 中の蛍光強度の変化をリアルタイムに測定した。
2) 結果
増幅反応液にトリフルォロ酢酸セシウムおよび RNaseインヒ ビターを 添加した場合と添加していない場合の結果を表 2に示す。 表の左半分に はトリフルォロ酢酸セシウムおよび RNaseを含まない場合の結果を示す: 右半分にはトリフルォロ酢酸セシウムおよび RNas eの両者を用いた場合 ェ CO yj
φ CO
の結果を示す。 両者を持ちない場合には 4検体について RT- LAMPにより CK19 m RNA を検出することができなかったが、 両者を用いた場合には 4 検体中 3検体について CK19m RNAを増幅して検出することができた。 こ のことから実際のヒ トリンパ節検体について破碎■可溶化する際にトリ フルォロ酢酸を共存させ、 反応液中に RNas eインヒビターを添加するこ とが検出感度の向上に有効であることが確認できた。
(表 2 ) 丄
Ϊ
ψ CO
表 2 RT-PGRと RT-LAMPによる CK19mRNA量の測定 試料 No. タンノ Sク質 CK1 9 mRNA 試料 No. タンパク質 CK1 9 mRNA
(mg/mL) (コピー数 / ϋ ϋ (mg/mL) (コピー致/ ϋϋ
PGR LAMP PGR LAMP
0.76 70 ND 0.44 60 ND
3.0 380 ND 8.2 ぐ 400 300
6.8 1 ,880 ND 7.9 90 650
126 3.8 620 ND 150 5.5 70 く 500
(HE-/IHC+) (HE-)
(実施例 7 )
血清検体を直接用いた RT- PCR を用いてトリフルォロ酢酸セシウムの効 果を確認した。 1 ) 材料及び方法
(1)試料の調製
ヒ ト血？青こ pH8. 0の 200mM Tris_HCl緩衝夜あるレヽ fま lOOmM ト リ フノレ才ロ 酢酸セシウムを含む 200mM グリシン - HC1緩衝液（PH3. 0)を加え、 さらに ΚΑΤ0Ι Π細胞由来の精製 RNA試料を添加し RNA試料として用いた。試料中の タンパク量は 0から 33 g/ μ 1となるように調整した。 また、 CK19 mRNA は全ての RNA試料中 5000コピー/ / 1となるように調整した。
(2)使用したプライマーおよびプローブの配列
① CK19 reverse primer：
5' -cttggcccctcagcgtact-3' (酉己列番号 1 9 )
(Genbank acces sion No. 4504916 に基づく CK19の配列の塩基位置 685-667位)
② CK19 forward primer：
5 -cagatcgaaggcctgaagga-3' (酉己歹 U番 2 0；
( Genbank access ion No. 4504916 に基づく CK19 の配列の塩基位置
607-626位）
③ TaqMan probe for CK19：
5 -gcctacctgaagaagaaccat gaggaggaa-3 、目己列番号 2 1
( Genbank access ion No. 4504916 に基づく CK19 の配列の塩基位置 634-663位）
(3) RT_PCR法
RT-PCRは、 アプライ ドバイオシステムズ社の RT-PCRマスタ一試薬を 用いて行った。
測定キッ ト ： TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents (ァプ ライ ドバイオシステムズ社製）
cDNA合成 ： Mult iScribe 逆転写酵素を用いて合成した。 ① CK19の増幅
逆転写用プライマー ：配列番号 1 9に記載のプライマーを用いた。 PCR用プライマー：配列番号 1 9に記載のプライマーを最終濃度 300nM 及び配列番号 2 0に記載のプライマーを最終濃度 900nMとなるように用 いた。
DNAポリメラーゼ ： Ampl i Taq Gold DNA ポリメラーゼを用いた。
③ PCR処理
48°Cで 30分間逆転写反応後、 95°Cで 10分間保持した。
その後、 95°C： 15秒間、 60°C： 1分間の PCR操作を 40サイクル行った。 (4)核酸の検出
ヒ ト CK19mRNAの増幅産物を標的 2本鎖 DNAに特異的にハイブリダイズ する TaqManプローブによる蛍光法により検出した。 TaqManプローブは、 CK19には配列番号 2 1のオリゴヌクレオチドで、 各々 5'末端に FAM、 3， 末端に TAMRAをラベルしたものを用いた。 アプライ ドバイオシステムズ 社製 PRISM7700を用いて、 反応液中の蛍光強度の増加をリアルタイムで 測定した。
2 ) 結果
血清成分を含む RNA 試料を ト リ フルォロ酢酸セシウム含有緩衝液 (pH3)で調製した場合の結果、 及び中性緩衝液（PH8)で調製した場合の RT-PCRの結果を図 7に示す。 図中の四角のプロッ トはトリフルォロ酢酸 セシウムを含む酸性緩衝液（pH3)を用いた場合、ひし形のプロッ トは中性 緩衝液（PH8)を用いた場合の結果を示す。 また、 縦軸には RT-PCR反応に おける増幅の立ち上がりサイクル数、 横軸には反応液中に存在する血清 タンパク量を示す。 血清タンパクが含まれる場合、 中性緩衝液で調製し た RNA試料では増幅反応の阻害が起こり増幅の立ち上がりサイクル数が 増えるが、 トリフルォロ酢酸セシウムを含む酸性緩衝液で調製した RNA 試料では阻害の程度が小さくサイクル数はあまり増えないことがわかる c これらのことから ト リ フルォロ酢酸セシウムを含有する酸性緩衝液 (pH3)を用いて RNA試料を調製することは RT-LAMPによる増幅における反 応阻害の防止に有効であるだけにとどまらず、 RT- PCR反応にも有効であ ることが確認できた。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 核酸を増幅して RNA を検出する方法において、 本発明の検体の調製条件により、 RT-PCR法及ぴ RT- LAMP法において、 粗 製 RNA試料でも測定可能であることが確認され、 核酸増幅手段を用いた 測定時間の短縮化が達成できた。

Claims

求 の 範 囲
1 . 核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、生体試料から核酸成分の 単離精製をしないで核酸を増幅することを特徴とする直接核酸増幅法。
2 . 核酸の分解活性を阻害する手段が、 RNAの分解活性を阻害する手段 青
である請求の範囲第 1項に記載の核酸増幅方法。
3 . 分解活性を阻害する手段の導入が酸性 PHでなされる請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の核酸増幅方法。
4 . 酸性 PHが PH2. 5〜PH5である請求の範囲第 3項に記載の核酸増幅方 法。
5 . 採取した生体試料を均質化する工程を経た後に、核酸成分の単離精 製をしないで核酸を増幅する請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1に 記載の核酸増幅方法。
6 . 核酸増幅反応の反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互作用する塩 を用いて生体試料を処理し、 核酸成分の単離精製をしないで核酸を増幅 することを特徴とする直接核酸増幅方法。
7 . 反応阻害物及び Z又は核酸成分と塩との相互作用が、 イオン結合及 び Z又は疎水結合による請求の範囲第 6項に記載の核酸増幅方法。
8 . 塩がカオト口ピック塩である請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の 核酸増幅方法。
9 . 塩がトリハロ酢酸のアル力リ金属塩である請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の核酸増幅方法。
1 0 . 塩の種類が、 NaCl、 KC1、 Nal、 KI、 TMAC1 (テトラメチルアンモ ニゥムクロライ ド）、 TEAC1 (テトラエチルアンモ-ゥムク口ライ ド）、 KSCN、 CsSCN、 CsCl のいずれか少なく とも 1を含む請求の範囲第 8項に記載の 核酸増幅方法。
1 1 . 塩の種類が、 CF 3 C00Cs (トリフルォロ酢酸セシウム） を含む請 求の範囲第 9項に記載の核酸増幅方法。
1 2 . 塩濃度が lmM〜2000mM である請求の範囲第 6項〜第 1 1項のい ずれか 1に記載の核酸増幅方法。
1 3 . 核酸の分解活性を阻害する手段を導入し、さらに核酸増幅反応の 反応阻害物と相互作用する塩を用いて生体試料を処理する請求の範囲第 6項〜第 1 2項のいずれか 1に記載の核酸増幅方法。
1 4 . 核酸の分解活性を阻害する手段が、 RNAの分解活性を阻害する手 段である請求の範囲第 1 3項に記載の核酸増幅方法。
1 5 . 分解活性を阻害する手段の導入が酸性 PHでなされる請求項の範 囲第 1 2項〜第 1 4項のいずれか 1に記載の核酸増幅方法。 1 6 - 酸性 pHが pH2. 5〜pH5である請求の範囲第 1 5項に記載の核酸増 幅方法。
1 7 . 採取した生体試料を均質化する工程を経た後に核酸成分の単離 精製を行わずに行う請求の範囲第 6項〜第 1 6項のいずれか 1に記載の 核酸増幅方法。
1 8 . 反応阻害物及ぴ 又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理 した生体試料をさらにァニオン性の固体を用いて処理する請求の範囲第 6項〜第 1 7項のいずれか 1に記載の核酸増幅方法。
1 9 . 反応阻害物及び Z又は核酸成分と相互作用する塩を用いて処理 した生体試料を、 核酸成分の分解酵素阻害剤共存下で増幅させる請求の 範囲第 6項〜第 1 8項のいずれか 1に記載の核酸増幅方法。
2 0 . 核酸成分の分解酵素阻害剤が、 RNaseインヒ ビターである請求項 の範囲第 1 9項に記載の核酸増幅方法。
2 1 . 核酸増幅方法が、 LAMP法、 RT-LAMP法、 PCR法又は RT- PCR法の いずれかである請求の範囲第 1項〜第 2 0項のいずれか 1に記載の核酸 増幅方法。
2 2 . 請求の範囲第 1項〜第 2 0項のいずれか 1に記載の核酸増幅方 法に使用する生体試料の処理方法。
2 3 . 請求の範囲第 1項〜第 2 0項のいずれか 1に記載の核酸増幅方 法に使用する核酸検出用試薬。
2 4 . 請求の範囲第 1項〜第 2 0項のいずれか 1に記載の核酸増幅方 法を使用する核酸検出システム。
2 5 . 請求の範囲第 2 4項に記載の核酸検出システムを使用する核酸 の検査装置。
2 6 . 請求の範囲第 2 4項に記載の核酸検出システムを使用する癌転 移の検査方法。
2 7 . 請求の範囲第 2 4項に記載の核酸検出システムに使用する核酸 検查キッ ト。 2 8 . 核酸成分を安定な状態に保つ pHを有する生体試料処理溶液。
2 9 . pHが 2. 5- 5である請求の範囲第 2 8項に記載の生体試料処理溶液。
3 0 . さらに、 核酸増幅反応の反応阻害物及び Ζ又は核酸成分と相互作 用する塩を含む請求の範囲第 2 8項又は第 2 9項に記載の生体処理溶液 c
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