JP2008289456A - がん細胞の検出方法及び装置 - Google Patents
がん細胞の検出方法及び装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008289456A JP2008289456A JP2007153536A JP2007153536A JP2008289456A JP 2008289456 A JP2008289456 A JP 2008289456A JP 2007153536 A JP2007153536 A JP 2007153536A JP 2007153536 A JP2007153536 A JP 2007153536A JP 2008289456 A JP2008289456 A JP 2008289456A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- quantification
- detection
- mrna
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】リンパ節組織等の生体試料を緩衝液で処理し、組織中のRNAとペプチドを液中に移行させた後、サイトケラチン等の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたmRNAを定量する工程、前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び前記mRNAの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法。
【選択図】なし
Description
所定の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたmRNAを定量する第1定量工程、
この遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第2定量工程、及び
mRNAの定量結果とポリペプチドの定量結果とに基づいて生体試料中のがん細胞を検出する検出工程、を含む。
R1−R2−(CH2CH2O)n−H
(ここで、R1は炭素数10〜22のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基;R2は−O−又は−(C6H6)−O−;nは8〜120の整数)
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Brij35(ポリオキシエチレン(35)ラウリルエーテル)などが好適である。緩衝液中の界面活性剤の濃度は0.1〜6%(v/v)が好ましく、より好ましくは1〜5%(v/v)である。
図4は、タンパク質定量部101の全体構成を示した斜視図であり、図5及び6は、タンパク質定量部101によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
また、核酸定量部100及びタンパク質定量部101は同一の試料を用いるため、この試料を各定量部に搬送する搬送装置を備えていてもよい。
1.測定用試料の調製
乳がん患者から切除したリンパ節31個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により22個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、9個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節(陽性リンパ節)22個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節(陰性リンパ節)9個を用いて、下記のようにして測定用試料を調製した。
まず、各リンパ節(約50〜600mg/個)に、pH3.4の緩衝液(200mMグリシン−HCl、5% Brij35(ポリオキシエチレン(35)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び20% DMSO(和光純薬)を含む)200μLを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×g、室温で1分間遠心分離し、上清を50〜200μL採取してこれを検出用試料とした。
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの検出用試料を核酸増幅装置(GD−100、シスメックス製)にセットし、RT−LAMP反応によってCK19cDNAを増幅させた(測定用試薬として、GD−100には核酸増幅用試薬サイトケラチン試薬(シスメックス製)がセットされた)。反応液の濁度をリアルタイムに測定することによってCK19のmRNA(コピー数)を定量した。
CK19mRNAの定量に用いた検出用試料20μLに3×SDS処理バッファ(150mM Tris HCl(pH6.8)、300mM ジチオスレイトール、6% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.3% ブロモフェノールブルー、及び30% グリセロールを含む)10μLを添加して95℃5分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料15μLを用いてSDS−PAGEを行った。泳動後のゲルをPVDFメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ(20mM Tris(pH7.6)、137mM NaCl、0.1% Tween20、及び5% スキムミルクを含む)に浸漬して1時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをTBS−T(20mM Tris(pH7.6)、137mM NaCl、及び0.1% Tween20を含む)で2分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液(一次抗体:Cytokeratin 19 (A53-B/A2):sc-6278(サンタクルズ社製、Lot:#L2403)をTBS−Tで500分の1に希釈した溶液)に浸漬し、4℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをTBS−Tで5分間、4回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液(二次抗体:ECL anti-mouse IgG HRP linked F(ab')2 fragment(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)をTBS−Tで2000分の1に希釈した溶液)にメンブレンを浸漬し、30分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをTBS−Tで5分間、4回洗浄した後、ECL-Advance Western Blotting Detection Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)により酵素反応を行った。LumiAnalyst(ロシュ社製)で酵素反応後のメンブレン画像を取り込み、QuantityOne(バイオラッド社製)によってメンブレン画像の蛍光強度を算出した。上述のようにして測定された蛍光強度を、検量線にあてはめ、CK19タンパク質の量を算出した。検量線は、上記と同じゲルで測定用試料を収容したウェルとは別のウェルに濃度既知のCK19タンパク質を含む試料を収容し、上述の蛍光強度測定を行うことにより作成された。
測定されたmRNA定量値(コピー/μL)及びタンパク質定量値(ng/μL)を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図8に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図8に示されるように、mRNAの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。従って、これらの定量結果を用いることにより、測定に供される生体試料が陰性検体であるか、陽性検体であるかを判定することが可能である。
1.測定用試料の調製
大腸がん患者から切除したリンパ節63個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により35個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、28個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節(陽性リンパ節)35個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節(陰性リンパ節)28個を用いて、実施例1と同様に測定用試料を調製した。
上記検出用試料を用い、実施例1と同様にしてCK19mRNA及びCK19タンパク質を定量した。
測定されたmRNA定量値(コピー/μL)及びタンパク質定量値(ng/μL)を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図9に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図9に示されるように、大腸がんにおいても、mRNAの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
1.測定用試料の調製
胃がん患者から切除したリンパ節30個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により24個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、6個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節(陽性リンパ節)24個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節(陰性リンパ節)6個を用いて、実施例1と同様に測定用試料を調製した。
上記検出用試料を用い、実施例1と同様にしてCK19mRNA及びCK19タンパク質を定量した。
測定されたmRNA定量値(コピー/μL)及びタンパク質定量値(ng/μL)を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図10に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図10に示されるように、胃がんにおいても、mRNAの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
Claims (11)
- 生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたmRNAを定量する工程、
前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び
前記mRNAの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。 - 前記生体試料がリンパ節組織であり、
前記mRNAの定量及び前記ポリペプチドの定量が、前記生体試料から調製された検出用試料を用いて行われる、請求項1記載の方法。 - 前記mRNAの定量及び前記ポリペプチドの定量が、同じ検出用試料を用いて行われる請求項2記載の方法。
- 前記検出用試料が、前記リンパ節組織を緩衝液中で処理し前記組織中のRNA及びポリペプチドを液中に移行させることによって得られる溶液である、請求項2又は3記載の方法。
- 前記緩衝液が、pH2.5〜5.0である請求項4に記載の方法。
- 前記緩衝液が、ジメチルスルホキシド及び界面活性剤をさらに含む、請求項4又は5記載の方法。
- 前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである、請求項1〜6の何れかに記載の方法。
- 前記がんが乳がん、大腸がん、又は胃がんである、請求項1〜7の何れかに記載の方法。
- 生体試料と緩衝液とを混合することにより調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたmRNAを検出する工程、
前記検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを検出する工程、及び
前記mRNAの検出結果及び前記ポリペプチドの検出結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。 - 核酸及びポリペプチドを検出するための検出用試料を調製する方法であって、
ジメチルスルホキシド及び界面活性剤を含み、pHが2.5〜5.0である緩衝液を用いて生体試料を処理することにより、前記生体試料に含まれる核酸及びポリペプチドを溶液中に移行させて検出用試料を調製することを特徴とする、検出用試料調製方法。 - 生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたmRNAを定量する第1定量手段、
前記生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第2定量手段、及び
前記mRNAの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する判定手段、
を備えたがん細胞の検出装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007153536A JP2008289456A (ja) | 2006-06-16 | 2007-06-11 | がん細胞の検出方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006168131 | 2006-06-16 | ||
JP2007114584 | 2007-04-24 | ||
JP2007153536A JP2008289456A (ja) | 2006-06-16 | 2007-06-11 | がん細胞の検出方法及び装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008289456A true JP2008289456A (ja) | 2008-12-04 |
Family
ID=40164862
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007153536A Ceased JP2008289456A (ja) | 2006-06-16 | 2007-06-11 | がん細胞の検出方法及び装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008289456A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115327116A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-11-11 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | 一种肿瘤细胞智能检测仪 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05344886A (ja) * | 1992-01-28 | 1993-12-27 | Piotr Chomczynski | Rna、dnaおよび蛋白の同時単離法 |
US5637687A (en) * | 1993-08-31 | 1997-06-10 | Wiggins; James C. | Methods and compositions for isolating nucleic acids |
WO2003060116A1 (fr) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Sysmex Corporation | Procede de detection d'acides nucleiques et systeme associe |
JP2004279157A (ja) * | 2003-03-14 | 2004-10-07 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 癌病巣判定のためのキット並びに方法 |
WO2006034456A2 (en) * | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for detecting and treating tumors |
-
2007
- 2007-06-11 JP JP2007153536A patent/JP2008289456A/ja not_active Ceased
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05344886A (ja) * | 1992-01-28 | 1993-12-27 | Piotr Chomczynski | Rna、dnaおよび蛋白の同時単離法 |
US5637687A (en) * | 1993-08-31 | 1997-06-10 | Wiggins; James C. | Methods and compositions for isolating nucleic acids |
WO2003060116A1 (fr) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Sysmex Corporation | Procede de detection d'acides nucleiques et systeme associe |
JP2004279157A (ja) * | 2003-03-14 | 2004-10-07 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 癌病巣判定のためのキット並びに方法 |
WO2006034456A2 (en) * | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for detecting and treating tumors |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6012025572; British Journal of Cancer Vol.89, 2003, p.1750-1756 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115327116A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-11-11 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | 一种肿瘤细胞智能检测仪 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sholl et al. | ROS1 immunohistochemistry for detection of ROS1-rearranged lung adenocarcinomas | |
Oshima et al. | Immunohistochemically detected expression of 3 major genes (CDKN2A/p16, TP53, and SMAD4/DPC4) strongly predicts survival in patients with resectable pancreatic cancer | |
Shia et al. | Immunohistochemical staining for DNA mismatch repair proteins in intestinal tract carcinoma: how reliable are biopsy samples? | |
Agaimy et al. | SMARCB1 (INI1)-negative rhabdoid carcinomas of the gastrointestinal tract: clinicopathologic and molecular study of a highly aggressive variant with literature review | |
Dacic et al. | Prognostic significance of p16/cdkn2a loss in pleural malignant mesotheliomas | |
Shapiro et al. | Residual esophageal cancer after neoadjuvant chemoradiotherapy frequently involves the mucosa and submucosa | |
Hernandez et al. | CK20 and CK7 protein expression in colorectal cancer: demonstration of the utility of a population-based tissue microarray | |
Yamamoto et al. | OSNA-based novel molecular testing for lymph node metastases in colorectal cancer patients: results from a multicenter clinical performance study in Japan | |
Zembowicz et al. | Loss of expression of protein kinase A regulatory subunit 1α in pigmented epithelioid melanocytoma but not in melanoma or other melanocytic lesions | |
Gerber et al. | Targeted next-generation sequencing of cancer genes in poorly differentiated thyroid cancer | |
KR102412396B1 (ko) | 객담유래 세포의 dna 메틸화 표현형결정에 의한 조기 폐암 검출 | |
ES2691213T3 (es) | Tratamiento de cáncer | |
US20220392640A1 (en) | Systems and methods for predicting therapeutic sensitivity | |
Panarelli et al. | Commercial molecular panels are of limited utility in the classification of pancreatic cystic lesions | |
Laudanski et al. | Prognostic significance of p53 and bcl-2 abnormalities in operable non-small cell lung cancer | |
Zakowski et al. | Morphologic features of adenocarcinoma of the lung predictive of response to the epidermal growth factor receptor kinase inhibitors erlotinib and gefitinib | |
JP2008017832A (ja) | がんの転移の判定方法及び判定装置 | |
Kim et al. | Development of on-chip multi-imaging flow cytometry for identification of imaging biomarkers of clustered circulating tumor cells | |
Ke et al. | Diagnostic value and lymph node metastasis prediction of a custom‑made panel (thyroline) in thyroid cancer | |
US20110059452A1 (en) | Methods of screening for gastric cancer | |
Tarabichi et al. | Thyroid cancer under the scope of emerging technologies | |
JP5303132B2 (ja) | がん細胞の存否を判定する方法及び装置 | |
Suenaga et al. | The effect of pancreatic juice collection time on the detection of KRAS mutations | |
ES2387494T3 (es) | Método y aparato para determinar el tamaño de un foco metastásico | |
Mehta et al. | SMARCA4/BRG1 protein-deficient thoracic tumors dictate re-examination of small biopsy reporting in non-small cell lung cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100225 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20110812 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120522 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120721 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130205 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130405 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131203 |
|
A045 | Written measure of dismissal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20140422 |