CN105164259B - 核酸的分离 - Google Patents
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Abstract
描述了改进的用于处理和分析样品的组合物和方法。尤其是，该组合物和方法从生物样品中释放核酸，使得在微流体系统中直接下游处理核酸。这些组合物、方法和试剂盒可用于诊断、分期、或另外表征各种生物疾病。
Description
技术领域
本发明涉及改进的用于处理和分析样品的组合物和方法。尤其是，本发明涉及用于从生物样品中释放核酸使得直接下游处理核酸的组合物、方法和试剂盒。这些组合物、方法和试剂盒可用于诊断、分期(staging)、或另外表征各种疾病。
背景技术
微流体系统(microfluidic systems)和结合的微流体-微流体系统对于诊断引人注目并提供了资源有限的设置，因为它们使用包括将样品预处理、样品/试剂操作、分离、反应、和检测整合成单一平台的整体分析方案。目前用于裂解细胞的方法基于机械裂解、热裂解、化学裂解或电裂解。一旦将细胞或样品裂解，或核酸从样品中释放，微流体传感系统要求将核酸在传递给传感器之前纯化或浓缩。较宽范围的核酸提取方法是可用的，每种方法采用不同的化学类型并对特殊样品类型进行优化。因为它们复杂的特性，所以大部分现有的提取方法对于结合在微流体平台中不是适合的或者在提取步骤过程中导致核酸的显著损失。
从个体取得各种生物样品以评价疾病诊断或预后的指示。新鲜组织样本、固定和包埋样品和细针抽吸活组织检查(FNA)是用于获得分子以及临床信息的有价值的材料资源，因为它们经常来自收集的人类样本用于组织学活组织检查的检测来检测疾病。用固定剂处理组织，所述固定剂制备样品用于许多(免疫)组织化学程序，经受许多核酸和氨基酸之间的交联修饰(Chaw Y.F.M.et al.Biochemistry 1980,19:5525-5531；Metz B.etal.J.Biol.Chem 2004.279:6235-6243)。然后将固定的组织装入包埋材料(如琼脂、明胶或蜡)块中，其变硬并将其切成小至1-2个细胞层厚的切片用于组织学研究。与来自其他样品资源的核酸提取相比，来自固定和包埋样品切片的核酸提取需要去除包埋材料的额外步骤。
使用福尔马林固定剂和石蜡包埋(paraffin embedding)(FFPE)来固定和保存组织样品是最常用的。许多溶解石蜡并从FFPE样品中释放核酸 的常规方案是可用的(Gilbert M.T.P.et al.,PLoS One 2007,2(6):e537)。传统去石蜡方法以使用有机溶剂，通常是二甲苯的液化步骤开始，接着是核酸提取步骤(Goezl et al.,Biochemical andBiophysical Research Communication 1985,Vol.130 No.1,p118-126)。二甲苯具有易燃、挥发、有毒和与塑料不相容的主要缺点，使得其较少适合用于自动化系统。
来自组织切片样品的核酸制备通常需要蛋白酶步骤，最常见是与热稳定的蛋白酶一起在表面活性剂存在下孵育，以释放核酸并降解能干扰下游核酸分析的抑制剂。所释放的核酸的量时常是微小的，因为在切片中存在非常少的真实组织，并且，在FFPE组织切片的情况中，核酸经常降解掉。结果，在常规方法中，在自动化系统中最经常需要将核酸在递送至下游传感器之前进行浓缩。
已经开发用于去石蜡的非毒性溶液并且在实验室规模水平(例如，来自Trimgen的WAXFREETM试剂盒、来自Amplification Technologies的ExpressArt FFPE Clear RNAready试剂盒、来自Mo Bio Laboratories的BiOsticTM FFPE组织分离试剂盒以及来自Epicentre的QuickExtractTM FFPE DNA提取试剂盒)可用于改进在FFPE样品上适用的核酸回收方法。
在WO2012/075133中描述了一种这样的改进，并且这样的改进提供了用于从包埋在疏水基质如石蜡或石蜡共混物中的样品中原位核酸分离的方法。乳化的裂解物在热稳定蛋白酶，和选自亚烷基二醇、聚亚烷基丙三醇、或具有76至2900Da的平均分子量的嵌段共聚物、或盐的添加剂存在的情况下就此产生。不同添加剂用于乳化样品，包括PEG200、PEG400、PEG1000、Brij30、Brij35P、Brij56和Brij 76。在温和离液剂(如脲或甲酰胺)存在下并加热而获得乳化的裂解液。该方法评估了在去石蜡步骤中物理分离石蜡和使用有机溶剂如二甲苯的需要。然而，后续从乳化裂解物残余中提取核酸要求进一步的下游应用如例如通过聚合酶链反应定量核酸，而这样的方法可能与微流体系统不相容。
将核酸提取方案整合到微流体平台中需要很大的努力以优化产率并将核酸损失最小化。此外，在样品制备操作中提取也是消耗时间的步骤。另外，提取在洗脱核酸中引入一定大小的偏差|(损失较小的片段)，这在从含有降解的核酸的FFPE样品中分离核酸时尤其是成问题的。因此，统一适用于在允许自动化微流体系统处理和直接下游分析(directdownstream analysis)的条件下从宽范围的生物样品包括FFPE样品获得核酸的方法与现有方法相比将提供巨大优势。尤其是，在允许自动化微流体 系统处理和直接下游分析、没有损失一些核酸片段和引入长度和纯度偏差的风险的条件下的FFPE样品，与现有方法相比将提供巨大优势。
因此需要改进样品制备方法，允许自动化高通量处理和检测各种生物样品中的核酸。
发明内容
本发明提供了在与下游应用如扩增过程相交接(交界，interface)的环境中从生物样品中释放的核酸。本文所描述的组合物和方法消除了在下游核酸分析之前分离核酸提取步骤的需要。样品制备方法和组合物能够自动地处理并且特别适用于在微流体核酸诊断系统中实施。本发明克服了常规技术中的缺点，并可实现通过常规方法不能预期的其他优点。
尤其是，本发明提供了在微流体系统中在与下游应用如扩增过程相交接的环境中从生物样品中释放的核酸。本文所描述的组合物和方法消除了分离核酸提取步骤的需要，并消除核酸提取步骤的需要，减少潜在偏差，并消除在下游核酸分析之前稀释释放的核酸的需要。
总的来说，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中进行直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物。
尤其是，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中进行直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
-在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，以及
-在微流体系统内在未稀释或最低程度稀释的裂解物中直接分析核酸。
更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
-在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，以及
-在微流体系统内在未稀释或最低程度稀释的裂解物中直接分析核酸。
尤其是，本发明的一个方面提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
-在微流体系统内分析包含在裂解物中的核酸。
更具体地，本发明的一个方面提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
-在微流体系统内在裂解物中直接分析核酸。
本发明的方法包括发明方法和一起工作用于增强核酸检测敏感度和准确度的组合物的组合。
因此本发明还有的一个方面提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
优选地，在所有方面，在微流体系统中在裂解物中直接分析核酸。
本发明的另一个方面提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
-在微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
在具体的实施方式中，本发明的方法适用于新鲜组织样品和/或新鲜冷冻组织样品和/或固定组织样品和/或包埋组织样品。在具体的实施方式中，生物样品是活组织检查样品(biopsy sample)、固定样品(fixed sample)、蜡包埋样品(wax-embedded sample)和/或FFPE样品。
在具体的实施方式中，用于本发明的方法的组合物具有液化性质(liquefyingproperty)。在优选的实施方式中，该方法适用于从包含生物样品的蜡中液化或溶解蜡。
在具体的实施方式中，用于本发明的方法的组合物具有的性质类似于目前所描述组合物的必要性质。
因此，在本发明的另一个方面，提供了用于从生物样品中释放核酸能够在微流体系统中直接核酸分析的组合物，所述组合物包含与下游核酸分析系统相容的表面活性剂。优选地，提供用于从生物样品中释放核酸以形成裂解物的组合物，能够在微流体系统中在该裂解物中直接核酸分析，所述组合物包含与下游核酸分析系统相容的表面活性剂。优选地，组合物当与样品接触时提供裂解物，所述裂解物以其未稀释形式与下游核酸分析系统相容。优选地，裂解物以其未稀释形式或轻微稀释形式与下游核酸分析系统相容。在优选的实施方式中，组合物具有乳化性质并包含与下游核酸分析系统相容的非离子型表面活性剂。优选地，非离子型表面活性剂具有式R-O-(CH2CH2O)nH，其中n>7，n≥8，或n＝8；R包含12≤C≤38，R是烷基链，R是CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)8，或者R是(CH2)11(CH3)。优选地，离子表面活性剂是C13(异-十三烷基)脂肪醇PEG醚或油醇PEG醚。最优选地，表面活性剂是对应于(Z)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂四十二烷-33-烯-1-醇 ((Z)-3,6,9,12,15,18,21,24-Octaoxadotetracont-33-en-1-ol)(CAS编号27040-03-5)。
在一些实施方式中，组合物包括至少非离子型表面活性剂、热稳定的蛋白酶和pH缓冲剂，并且尤其用于在加热下与包含蜡的样品接触产生乳化的裂解物，其乳化的裂解物以其未稀释形式与微流体系统相容并且能够被微流体系统直接处理用于核酸分析。优选地，以其未稀释形式或轻微稀释形式的乳化的裂解物与微流体系统相容并且能够被微流体系统直接处理用于核酸分析。
本发明的又一个方面提供了一种能够直接被微流体分析仪处理的用于从样品中获得核酸的试剂盒，所述试剂盒包括至少本发明的组合物。
通过本文所提供的权利要求和详细说明，本发明的这些以及进一步的特征将变得更加显而易见。
附图说明
图1：图描述了利用两种不同方法从FFPE组织样品中获得的液化裂解物的PCR相容性。X轴代表扩增循环数量；Y轴代表相对荧光单位(RFU)(103)。显示了代表包含清洁剂的液化组合物(灰色)和商业液化缓冲剂(黑色)的扩增曲线；十字标记曲线代表几乎未稀释的样品，圆圈标记的曲线代表4倍稀释的样品。较小稀释的样品代表80/20的裂解物/PCR扩增混合物的比率。
图2：图说明了商业缓冲剂与微流体qPCR系统的不相容性。圆圈标记在PCR室中在通过微流体路径泵送商业缓冲剂后气泡的形成。
图3：Cq图说明了在不同DNA提取/液化方法以后在来自带有不同量的黑色素的FFPE黑素瘤样品的DNA上进行的实施试验。X轴代表FFPE样品；Y轴代表所获得的Cq值；直柱代表：使用商业溶液的DNA液化(黑色)、基于柱的NDA提取(深灰色)、和来自本发明的DNA液化(浅灰色)。较低值表示较低的qPCR阈值并因此提高DNA分析的灵敏度。
图4：视觉表示实施例5中所用的含高黑色素的样品FFPE1、FFPE2和FFPE3。
图5：图说明了结合温度升高的样品液化(A)和结合温度升高连同HIFU处理的样品液化(B)。
图6a和6b：从来自2个代表性FFPE样品(FFPE1和FFPE2)的单个连续10μm部分的液化物质(X)和二氧化硅提取的RNA(□)所获得的qRT-PCR曲线。
具体实施方式
用于从生物组织样品提取核酸的技术通常使用两个分开的步骤：a/消化组织，接着b/纯化核酸。用于从含蜡样品中提取核酸的技术通常使用三个分开的步骤：a/去蜡；接着b/消化组织；和c/纯化核酸。总体上，这些方法常常十分耗费时间和/或不能直接可转移到全面整合的诊断系统中，最通常因为核酸提取需要合用试剂(例如乙醇)和子步骤如样品离心，或与塑料(二甲苯)或流体(例如由于在通道这形成泡沫)不相容。本文提供的方法和组合物现在允许直接分析来自生物样品的核酸，包括含蜡的样品，不需要提前从样品中纯化核酸。
本发明在此提供了用于从各种生物样品，包括含蜡的样品中释放核酸的方法。发现组合物用于从样品中释放核酸能够在微流体系统中直接核酸分析的方法中、和用于在微流体系统中分析从样品中释放的核酸的方法中。在特别的应用中，该方法包括以下步骤：将生物样品与组合物在条件下接触以提供允许从该样品中释放核酸的裂解物，该裂解物与设计用于下游核酸分析的微流体系统相容。裂解物是液体样品并可以是简单裂解物，或可替换地是与酶如蛋白酶一起孵育的产物。在该应用中，除非另外说明，否则所使用的“裂解物”表示“裂解物”、“液体样品”或“消化物(消化液，digest)”。裂解物已准备好用于直接核酸分析，不需要从裂解物中所释放的核酸的进一步纯化。能够在裂解物中直接分析核酸。
直接核酸分析是指分析在裂解物中释放的核酸，不需要从裂解步骤中所用的清洁剂、蛋白、盐类和试剂中纯化核酸。该方法统一适用于在允许自动化微流体系统处理和直接下游分析、没有损失一些核酸片段和引入长度和纯度偏差的风险的条件下从宽范围的生物样品中获得核酸。例如，不需要乙醇沉淀、苯酚-氯仿提取或微柱纯化。预期当不使用纯化步骤时遗传信息是有代表性的。核酸分析，尤其是核酸扩增，在一些情况下可能需要裂解物的轻微稀释形式，原因例如稀释扩增酶的蛋白抑制剂、稀释使酶不稳定的物质...。核酸分析，尤其是核酸扩增，可能需要或可能不需要加入用于实施核酸扩增的物质，并因此可能导致初始裂解物的轻微稀释。用于进一步下游处理样品所需的物质可以以干燥形式提供并可以直接溶解在裂解物中。
轻微稀释形式是指全然在未稀释至2倍稀释范围内用核酸裂解物扩增物质稀释核酸裂解物。
因此，本发明提供了用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中直接核酸分析的方法，包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
-在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
具体地，本发明提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
-在微流体系统内分析包含在裂解物中的核酸。
尤其是，本发明提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
-在微流体系统内在裂解物中直接分析核酸。
因此，本发明提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，以及
-在微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
更具体地，本发明提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-在微流体系统中，将样品与组合物在条件下接触以提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，以及
-在所述微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，以及
-在裂解物中直接分析核酸。
本文所用的“核酸”(以及等价术语“多核苷酸”)是指在核苷酸亚单位之间包含磷酸二酯键的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。核酸包括，但不限于，基因DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA、片段核酸、从亚细胞器如线粒体获得的核酸，以及从可能出现在样品上或样品中的微生物或病毒获得的核酸。核酸可以是双链或者单链、环状或线性的。优选地，从生物样品中释放核酸。核酸由DNA和RNA组成，RNA优选为总的RNA。“样品或生物样品”意在包括各种包含核酸和/或细胞物质的生物资源。核酸和/或细胞物质来自待测试细胞以测定是否存在一种或多种特殊标记物。所包括的样品是下述样品：来自细胞培养物、真核微生物或诊断样品如体液、体液沉淀物、洗胃样本、细针抽取物、活组织检查样品、组织样品、癌细胞、来自病人的细胞、来自组织的细胞或来自待测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养的细胞、或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿、乳糜、粪便、射精、痰、乳头吸液、唾液、棉签样本、冲洗或灌洗液和/或擦拭样本。
在一些实施方式中，样品是新鲜样品、新鲜冷冻样品、细针抽取物、已处理用于保存并由于固定处理可能含有交联反应位点的样品、蜡接触或蜡包埋样品、或以FFPE切片形式的FFPE样品。新鲜冷冻样品是在冷冻-能凝固介质如OCT-化合物中硬化和包埋的样品。本文所用细针抽取物包括但不限于离心后被蜡包埋的细胞，进行或不进行在先固定处理。
“蜡”是指在组织化学领域中用于包埋用于组织化学或其他分析的生物样品所使用的组合物，通常由高级烃类的复合混合物组成，经常包括酯类或高级脂肪酸和高级二醇类，并且可以矿物、天然的或合成来源。
石蜡是组织化学领域中最常用的蜡的实例。术语“石蜡”与“烷烃”同义使用，是指具有通式CnH2n+2的烃类。如本文所用的，术语“石蜡”包括固体石蜡(石蜡，paraffin wax)和石蜡共混物型包埋介质。“固体石蜡(paraffin wax)”是指落在20≤n≤40范围内的烷烃类的混合物。石蜡共混物包括可增强石蜡在包埋操作中的性能的其他物质。
化学固定保存组织免于降解并帮助保持细胞的结构和亚细胞成分。包埋的生物样品通常以福尔马林固定石蜡包埋的样品(FFPE样品)形式保存或储存。“FFPE”是指通过暴露于中性缓冲的福尔马林(通常是在磷酸盐 缓冲盐水中的4％的甲醛)，随后完全浸入疏水基质如石蜡或石蜡共混物中处理使得石蜡或石蜡共混物渗透组织或细胞的组织或细胞。
作为在示例性部分中示出的非限制性实例，本发明的方法成功地在黑素瘤样品上实施。因此，在本发明的一些实施例中，样品是来自询问生物状态如健康状态、疾病或感染的个体的生物样品。可替换地，样品是来自诊断生物状态但询问预后或治疗性措施如治疗选择或治疗结果的个体。在具体的实施方式中，生物状态是疾病并包括瘤形成疾病，尤其是肿瘤或癌症。
生物状态、疾病、感染或对治疗措施的应答可以使用标记物(marker)来评估。
“标记物”、“测试标记物”、“生物标记物”或“生物学标记物”是客观测定评估过的特征，并是指对特殊生物状态特定的细胞成分。标记物可以是核酸或蛋白成分或其部分。优选地，其是核酸、DNA或RNA。
在一个实施方式中，标记物旨在包括但不限于与疾病或感染相关的易位、微卫星(microsatellite)、等位基因、突变、单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、剪接变异体、转位子(transposon)、微RNA的表达分布等。在一些实施方式中，使用DNA来确认SNP、插入、缺失或易位。在其他实施方式中，使用RNA来确认表达水平。表达水平能最终与SNP或其他基因变异相联系。示例性部分显示本发明的方法成功地用于检测BRAF基因的存在。存在特定分析以检测该基因的突变体的存在(例如基于Hamfjord et al.,Diagn Mol Pathol 2011；20:158-165)。因此，在一些实施方式中，标记物是适用于诊断或预后癌症或疾病、预测癌症或疾病治疗结果、选择适合治疗的患者、选择将使用的治疗方案、或选择治疗方案改变的标记物。在一些实施方式中，标记物包括与疾病相关的核酸修饰，优选突变、SNP、插入、缺失或易位。
在本发明的方法中，样品与组合物接触以提供释放核酸的裂解物，所述组合物优化用于微流体分析仪中。该组合物能通过微流体系统运送。在所提供方法的一些实施方式中，这种接触步骤因此可在微流体系统自身中实施或可替换地可以需要研究者在微流体系统分析之前手动移液(manual pipetting)。因此，在一些实施方式中，微流体系统可接受样品并在分析之前利用本发明的方法处理样品。在一些实施方式中，该系统将接受和分析预先准备好的裂解液。
“接触”是指将样品和组合物放在一起、暴露、孵育、或混合。
本发明的方法包括发明的物理的(热、HiFu…)和生物化学的(酶类、盐类、还原剂…)方法和组合物的组合一起作用以增强核酸测定的灵敏度和准确度。如在示例性部分所显示的，使组合物经受加热和HIFU与经受加热结合搅拌或震荡相比产生提高的乳化能力。尤其是，将温度加热至约60℃(例如60℃±1℃；60℃±2℃、60℃±3℃、60℃±4℃、60℃±5℃)产生提高的乳化效果。在优选的实施方式中，将温度从室温逐步升高至60℃，接着进行HIFU处理。优选地，HIFU功率不超过2.25W。
“释放”是指释出、获得和/或反转交联。为了从样品中释放核酸，可能需要来自组合物的蛋白酶活性和pH缓冲。释放可能需要来自组合物的在研究样品中存在的除了核酸以外的组分的潜在沉淀活性，以及固定剂的去除/溶解。释放可能需要如加热或高强度聚焦超声(HIFU)的条件。从FFPE样品中获得的核酸通常含有核苷酸至核苷酸和核苷酸至蛋白的交联、碱基修饰以及其他影响核酸完整性的化学修饰。
在一个实施方式中，从样品中释放的裂解液和/或组分将在利用微流体系统的微加工诊断分析仪中进行处理。“微流体系统”是指处理运行、精确控制和操作流体的系统，该流体几何上被限制为小的、通常亚毫米的级别。以微级别移动、混合、分离或另外处理小体积的流体需要小尺寸和低能量消耗。微流体系统包括如微型气动系统，即用于处理芯片外流体的微系统的结构(压力源、液体泵、微型阀等)和用于在芯片上处理微升、纳升和皮升体积的微流体结构(微流体通道等)。微流体系统目标在于在一个系统上整合试验操作如检测，以及样品预处理和样品制备。用于进行微流体分析的装置和方法可包括基于DNA微阵列或蛋白微阵列的生物芯片，和/或用于进行热循环(例如PCR、LCR等)的装置和/或用于测序的装置。在本发明的一些实施方式中，微流体系统将结合微加工分析系统，需要在系统外操作样品和液化缓冲剂。在优选的实施方式中，微流体系统将整合步骤用于提供本发明的方法中所描述的裂解物，并且是完成从样品进入(sample-in)到结果出来(result-out)的试验的完全整合的系统。在核酸分析方面，因此微流体系统可以是同时进行核酸制备和释放以及包括目标扩增和检测的标记物分析的整合的微系统。具体地，本发明的方法包括以下步骤：在微流体系统内将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送，并在微流体系统内在裂解物中直接分析核酸。因此，根据本发明方法产生的裂解物应当由此能通过微流体系统直接运送。
在EP1896180、EP1904234和EP2419705中已经描述了适合的微系统并相应包括在描述本发明的一些实施方式中。优选地，使用包括一个或多个反应室和一个或多个流体室的基于盒的系统(基于柱体的系统，cartridge-based system)。一些流体室可以保持用于从样品中产生裂解物的流体。其他室可以保持流体如清洗流体和扩增溶液。使用反应室以进行不同的检测步骤如清洗、裂解和扩增。
在描述本发明的优选的实施方式中，所有需要用于进行试验的试剂是预先设置于微流体装置内，使得该装置是用于进行核酸分析的自包含的可任意使用的设备(self-contained disposable apparatus)。适合的装置包括基于DNA微阵列或蛋白微阵列的生物芯片，和/或用于进行热循环(例如PCR、LCR等)的装置和/或用于测序的装置。优选地，微流体系统将包括用于进行热循环，优选聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的装置。PCR方法是本领域所熟知的，并依赖于热循环，由重复加热和冷却用于核酸融化和核酸酶复制的反应的循环组成。这样的扩增反应通常采用目标核酸和启动核酸合成所需要的反应组分如热稳定DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、核苷酸和寡核苷酸(例如引物、探针、阻断剂…)。在优选的应用中，微系统将使用以干燥后形式(dried-down form)存在于微流体装置中的试剂实施热循环。将按照本发明所描述的处理样品以形成裂解物，并由裂解物将预先设置于微流体装置中的试剂在测试时重新组成。因此，裂解物允许在裂解物中直接进行下游核酸分析。典型地，使用微气动控制仪来管理需要用于完成试验的裂解物和试剂。试验可包括终点或实时检测，两种方法在本领域中是熟知的。
在示例性部分中所用的与PCR相关的术语：
“Cq”是指定量循环，当荧光增加超过阈值时的部分循环次数。也称为Ct(阈值循环)。
“阈值”是指用于确定Cq的任意水平的荧光并且应被设置在扩增曲线(amplification plot)的基线以上和指数增长期内。
“基线”是指有很少或没有荧光变化的PCR起始循环。
“扩增曲线”是指荧光信号相对循环次数的曲线。
“RFU或相对荧光单位”是在采用荧光检测的试验中所用的测量单位。
本发明的一个方面还提供了用于从生物样品中释放核酸能够在微流体系统中直接核酸分析的组合物，所述组合物包含与下游核酸分析系统相 容的表面活性剂。优选地，当组合物与样品接触时提供裂解物，所述裂解物以其未稀释形式允许在裂解物中直接进行下游核酸分析，并且所述裂解物与下游核酸分析系统相容。重要地，裂解物能通过微流体系统直接运送。在一些实施方式中，组合物具有乳化活性并包括至少表面活性剂，优选非离子型表面活性剂。优选地，裂解物是以其未稀释形式或以轻微稀释的形式。
“乳液”是两种或更多种通常不能混溶(不可混合(nonmixable)或不可共混的(unblendable))的液体的混合物。乳化剂(也称为乳剂)是通过增加其动力学稳定性来稳定乳液的物质。将一类乳化剂称为“表面活性物质”或表面活性剂。
本文所用的“表面活性剂”是指降低液体表面张力、两种液体之间的界面张力、或液体和固体之间的界面张力的化合物。这些表面活性剂通常包括疏水部分和亲水部分。表面活性剂除了其他以外可用作乳化剂。表面活性剂可分为阴离子型、非离子型、两性离子型或阳离子型，这取决于它们是否包含一个或多个带电基团。
非离子型表面活性剂包含非带电极性基团并不带电。非离子型表面活性剂的实例为：BigCHAP(即，N,N-双[3-(D-葡萄糖酰胺基)丙基]胆酰胺)；双(聚乙二醇双咪唑基羰基])(bis(polyethylene glycol bispmidazoyl carbonyl]))；聚氧乙烯醇类，如Brij(R)30(聚氧乙烯(4)月桂基醚)、Brij(R)35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)、Brij(R)35P、Brij(R)52(聚氧乙烯2鲸蜡基醚)、Brij(R)56(聚氧乙烯10鲸蜡基醚)、Brij(R)58(聚氧乙烯20鲸蜡基醚)、Brij(R)72(聚氧乙烯2硬脂基醚)、Brij(R)76(聚氧乙烯10硬脂基醚)、Brij(R)78(聚氧乙烯20硬脂基醚)、Brij(R)78P、Brij(R)92(聚氧乙烯2油基醚)；Brij(R)92V(聚氧乙烯2油基醚)、Brij(R)96V、Brij(R)97(聚氧乙烯10油基醚)、Brij(R)98(聚氧乙烯(20)油基醚)、Brij(R)58P和Brij(R)700(聚氧乙烯(I OO)硬脂基醚)；氢化蓖麻油(Cremophor)(R)EL(即，聚氧乙烯甘油氢化油酸酯(polyoxyethylenglycerolthhcinoleat 35)；聚氧乙烯35蓖麻油(polyoxyl 35castor oil))；十乙二醇单十二烷基醚；十乙二醇单十六烷基醚；十乙二醇单十三烷基醚；N-癸酰基-N-甲基葡糖胺；正癸基[α]-D-吡喃葡萄糖苷；癸基[β]-D-麦芽糖苷；洋地黄皂苷；正十二酰基-N-甲基葡萄糖酰胺；正十二烷基[α]-D-麦芽糖苷；正十二烷基[β]-D-麦芽糖苷；七乙二醇单癸基醚；七乙二醇单十二烷基醚；七乙二醇单十四烷基醚；正十六烷基[β]-D-麦芽糖苷；六乙二醇单十二烷基醚；六乙二醇单十六烷基醚；六乙二醇单十八烷 基醚；六乙二醇单十四烷基醚；Igepal(R)CA-630(即，壬基苯基-聚乙二醇、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇、辛基苯基-聚乙二醇)；甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-[α]-D-吡喃葡萄糖苷；九乙二醇单十二烷基醚；N-壬酰基-N-甲基葡糖胺；八乙二醇单癸基醚；八乙二醇单十二烷基醚；八乙二醇单十六烷基醚；八乙二醇单十八烷基醚；八乙二醇单十四烷基醚；辛基-[β]-D-吡喃葡萄糖苷；戊乙二醇单癸基醚；戊乙二醇单十二烷基醚；戊乙二醇单十六烷基醚；戊乙二醇单己基醚；戊乙二醇单十八烷基醚；戊乙二醇单辛基醚；聚乙二醇二缩水甘油基醚；聚乙二醇醚W-1；聚氧乙烯10十三烷基醚；聚氧乙烯100硬脂酸酯(或盐)；聚氧乙烯20异十六烷基醚；聚氧乙烯20油基醚；聚氧乙烯40硬脂酸酯(或盐)；聚氧乙烯50硬脂酸酯(或盐)；聚氧乙烯8硬脂酸酯(或盐)；聚氧乙烯双(咪唑基羰基)；聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯(或盐)；来自皂树树皮的皂苷；脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，如Span(R)20(脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、Span(R)40(脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Span(R)60(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、Span(R)65(脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Span(R)80(脱水山梨糖醇单油酸酯)、和Span(R)85(脱水山梨糖醇三油酸酯)；聚乙二醇的各种烷基醚类如Tergitol(R)型15-S-12、Tergitol(R)型15-S-30、Tergitol(R)型15-S-5、Tergitol(R)型15-S-7、Tergitol(R)型15-S-9、Tergitol(R)型NP-10(壬基苯酚乙氧基化物)、Tergitol(R)型NP-4、Tergitol(R)型NP-40、Tergitol(R)型NP-7、Tergitol(R)型NP-9(壬基苯酚聚乙二醇醚)、Tergitol(R)MIN FOAM1x、Tergitol(R)MIN FOAM 2x、Tergitol(R)型TMN-10(聚乙二醇三甲基壬基醚)、Tergitol(R)型TMN-6(聚乙二醇三甲基壬基醚)、Triton(R)770、Triton(R)CF-10(卞基-聚乙二醇叔-辛基苯基醚)、Triton(R)CF-21、Triton(R)CF-32、Triton(R)DF-12、Triton(R)DF-16、Triton(R)GR-5M、Triton(R)N-42、Triton(R)N-57、Triton(R)N-60、Triton(R)N-101(即，聚乙二醇壬基苯基醚；聚氧乙烯支化的壬基苯基醚)、Triton(R)QS-15、Triton(R)QS-44、Triton(R)RW-75(即，聚乙二醇260单(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八烷醇)、Triton(R)SP-135、Triton(R)SP-190、Triton(R)W-30、Triton(R)X-15、Triton(R)X-45(即，聚乙二醇4-叔辛基苯基醚；4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、Triton(R)X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；聚乙二醇叔辛基苯基醚；4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、Triton(R)X-102、Triton(R)X-1 14(聚乙二醇叔-辛基苯基醚；(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、Triton(R)X-165、Triton(R)X-305、Triton(R)X-405(即，聚氧乙烯(40)异辛基环己基醚；聚乙二醇叔辛基苯基醚)、Triton(R)X-705-70、Triton(R)X-151、Triton(R)X-200、Triton(R)X-207、Triton(R)X-301、 Triton(R)XL-80N和Triton(R)XQS-20；十四烷基-[β]-D-麦芽糖苷；四乙二醇单癸基醚；四乙二醇单十二烷基醚；四乙二醇单十四烷基醚；三乙二醇单癸基醚；三乙二醇单十二烷基醚；三乙二醇单十六烷基醚；三乙二醇单辛基醚；三乙二醇单十四烷基醚；聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，如 20(聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、21(聚氧乙烯(4)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、60(聚乙二醇脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、61(聚氧乙烯(4)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、65(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、80(聚乙二醇脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、81(聚氧乙烯(5)脱水山梨糖醇单油酸酯)，和85(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯)；四丁酚醛(tyloxapol)；正十一烷基[β]-D-吡喃葡萄糖苷、MEGA-8(辛酰基-N-甲基葡萄糖酰胺)；MEGA-9(壬酰基-N-甲基葡萄糖酰胺)；MEGA-10(癸酰基-N-甲基葡萄糖酰胺)；甲基庚基氨基甲酰基吡喃葡萄糖苷；辛基-吡喃葡萄糖苷；辛基-硫代吡喃葡萄糖苷；辛基-[β]-硫代吡喃葡萄糖苷；以及它们的各种组合。
如在示例性部分所示出的，用包含非离子型表面活性剂如具有式R-O-(CH2CH2O)nH的聚二醇醚(聚乙二醇醚)(其中氧乙烯的数目超过7(n>7))的组合物处理样品，产生已热循环好的裂解物，而不需要单独的核酸分离步骤。
在优选的实施方式中，非离子型表面活性剂是具有式R-O-(CH2CH2O)nH的Cx脂肪醇PEG醚，
其中n>7；n≥8；或n＝8；和/或
R包含12≤C≤38；优选R包含C13；
优选R包含C38；最优选R是CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)8(油烯基或顺式-9-十八烯基)；或最优选R是(CH2)11(CH3)2。
因此，在一些实施方式中，n是7、8、9、10、11、12或更多；和/或R包括C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38。非离子型表面活性剂可以是线性或具有支化结构。非离子型表面活性剂在环境温度下可以是液体形式或固体。
在优选的实施方式中，非离子型表面活性剂是C13脂肪醇PEG醚；异-十三烷基脂肪醇PEG醚；或具有8个氧乙烯残基的油烯基脂肪醇PEG醚。
最优选地，非离子型表面活性剂是X-080，其中R是(CH2)11(CH3)2并且n是8。
最优选地，非离子型表面活性剂是其中R是CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)8并且n是8。
X-080是由商品化的化学产品，而其化学文摘社编号(Chemical Abstract Service number)(CAS编号)是9043-30-5。 对应于(Z)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂四十二烷-33-烯-1-醇(CAS编号27040-03-5)。
如在示例性部分所示出的，液化组合物包括非离子型表面活性剂以约0.10至约0.40％之间、约0.15至约0.35％之间、约0.20至约0.30％之间、约0.25％、或0.25％存在。因为的储存液通常在DMSO(50％w/v)中制备，所以优选的组合物中的一种另外含有DMSO。DMSO因此以相对于存在量的量存在组合物中。在非离子型表面活性剂以约0.35％，或0.25％存在的情况中，则DMSO以约0.35％，或0.25％存在。
常规液化方法将有机溶剂加入其液化组合物中或使用有机溶剂用于允许这种下游应用。如上文提到的，这在用于从蜡包埋的样品中分离组分如核酸(例如用于溶解石蜡的二甲苯)的方法中是尤其真实的。本发明的方法具有不需要有机溶剂的优势，并且目前的加入非离子型表面活性剂的方法允许自动去除包埋的蜡并释放组分而不使用有机溶剂。这是尤其有益的，因为其使得释放的核酸处于与需要酶活性的缩减规模应用如缩减规模扩增处理连接的条件和环境中。因此，在一些实施方式中，液化组合物不含有有机溶剂。在优选的实施方式中，将蜡包埋切片浸入液化缓冲剂中进行液化。典型地，总样品面积是所包含的石蜡并在约20cm2至约1mm2之间变化。20cm2的总样品面积可以例如产生5个4cm2片。典型地，蜡包埋的切片的量在约50μm至约3μm之间、约40μm至约3μm之间、约30μm至约3μm之间、约20μm至约3μm之间、约15μm至约5μm之间、约13μm至约5μm之间、约12μm至约5μm之间、约11μm至约5μm之间、约10μm至约5μm之间、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、或5μm之间变化。典型地，切片在体积在约10ml至约50μL、约5ml至约250μL、 约1ml至约500μL的范围内变化的液化组合物中液化。优选地，切片在约1ml、900μL、800μL、700μL或600μL的液化组合物中液化。更优选地，切片在约1ml、900μL、800μL、700μL、600μL、500μL、400μL、300μL或200μL的液化组合物中液化。
在一些实施方式中，组合物进一步包含蛋白水解酶(蛋白酶)。蛋白酶也称为朊酶，是蛋白水解酶类，并且涉及消化蛋白。在优选的实施方式中，蛋白酶是热稳定蛋白酶，其可以被加热以调节温度而不损失效力，如蛋白酶K。工程的或天然存在的热稳定蛋白酶的其他实例在本领域中是熟知的。蛋白酶在组合物中的浓度为在约0.1μg/ml至约5000μg/ml之间、约1μg/ml至约4000μg/ml之间、约10μg/ml至约3000μg/ml之间、约100μg/ml至约2000μg/ml之间。优选地，其在约500μg/ml至约1500μg/ml之间、约600μg/ml至约1400μg/ml之间、约800μg/ml至约1200μg/ml之间、约900μg/ml至约1100μg/ml之间、约950μg/ml至约1050μg/ml之间，或是约0.1、1、2、3、4、5、10、15、20、30、50、75、100、125、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500μg/ml或其中的任何范围。在优选的实施方式中，在组合物中蛋白酶的浓度为约1000μg/ml，或1000μg/ml。核酸的扩增在蛋白酶失活以后进行。因此，直接核酸分析可以包括蛋白酶失活步骤。
提高测试结果的一种方式为增加从所给样品获得的信号。增加的信号能够尤其通过增加目标的可达到性来获得。实施某种条件如例如温度加热、HIFU、暴露时间、混合和缓冲可以提高乳化裂解物和目标分子释放的质量。
在一些实施方式中，用于从样品中释放核酸的液化组合物需要加热。在具体的实施方式中，适合产生乳化裂解物的条件需要在适合从生物样品中释放核酸的温度下孵育液化组合物。影响溶解时间的因素包括温度、样本部分的厚度和蜡组成。本发明的方法中的孵育持续适于从样品中以足够用于目的分析的量和浓度释放需要的核酸的时间和温度。在一些实施方式中，孵育是在从室温(20℃)至更高温度变化的温度下进行的。在一些实施方式中，孵育在范围在约35℃至约99℃、约45℃至约95℃、约52℃至约90℃、约60℃至约80℃、约55℃至约65℃范围的温度下进行。优选地，孵育处于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃的温度。起始温度后可以接着是用于使酶(如蛋白水解酶)失活的更高温度。典型的失活温度在约90℃至约99℃、约92℃至约97℃变化。优选地，失活温度是约95℃。
典型地，蜡包埋的样本与本发明的液化组合物接触持续足以溶解所有或部分蜡包埋的样本的时间。孵育时间在约2min至约20min变化获得良好的结果。对于所描述的实例，通过将一个10μm FFPE切片浸入1ml液化组合物中，接着在60℃加热20min和在95℃加热10min进行液化。如在示例性部分中所示出的，在乳化裂解物中释放的DNA适于直接微流体分析而不需要二甲苯或乙醇提取石蜡和/或核酸。
用于混合和加热样品和液化组合物的常规方法在本领域中是熟知的。对于在微加工分析仪中较小体积的应用和处理，施加高强度聚焦超声(HIFU，或有时也缩写为FUS)用于样品的加热和微成穴可以是有益的。在一些实施方式中，施加HIFU用于加热或在加热步骤以后施加HIFU。在优选的实施方式中，HIFU功率在约2瓦至约15瓦、约6瓦至约9瓦的范围内。优选地，HIFU功率在2瓦至10瓦之间或其中的任何范围。最优选地，HIFU功率是4瓦，或其任何更低的值。优选地，HIFU功率是2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75或4瓦并施加5至20分钟。
在一些实施方式中，组合物具有范围在约pH6至约pH10之间、约pH7至约pH9之间的缓冲能力。典型地，本发明的组合物包含10mM Tris pH8。
在本发明的方法中用组合物处理样品将产生裂解物。
在本发明的一些实施方式中，需要包含非离子型表面活性剂的裂解物，不论是否是乳化的裂解物，与下游核酸分析相容。因此，进一步处理可需要包含非离子型表面活性剂的组合物(如液化组合物、乳化裂解物)的足够的稀释。足够的稀释因子范围在约5倍至约2倍、4倍至约4倍至约2倍，或其中任何范围。优选地，将组合物稀释约3倍。在优选的实施方式中，由将组合物与样品接触而产生的裂解物以未稀释的形式使用用于进一步的下游处理和核酸分析。在另外优选的实施方式中，将组合物稀释约2倍。
最常见的扩增失败的原因是扩增抑制，其中测试样品的一种或多种不需要的组分在核酸纯化期间没有被充分消除。包含在各种组织中的色素细胞中的黑色素在标准DNA和RNA操作中与核酸共纯化，并且其存在对PCR、RT-PCR或其他下游核酸分析方法具有抑制作用。该问题可以通过由例如柱色谱、过滤、核酸沉淀、加入BSA从核酸中分离黑色素，或通过使用较少受抑制剂影响的聚合酶而避免。正如在本发明的实施例部分所显示的，该问题通过提供充足的包含防止由黑色素引起的扩增抑制的非离子型表面活性剂的液化组合物而解决。因此，在一些实施方式中，液化组 合物需要防止由黑色素引起的扩增抑制的非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂可进一步防止由抑制剂如，但不限于，例如血红蛋白(hemoblobin)、亚铁血红素、肌红蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、焦油、或胶原引起的扩增抑制。
因此，可以直接处理裂解物用于核酸分析，不需要存在于裂解物中的所释放核酸的纯化。然而，虽然没有一定需要，但部分或全部裂解物可以经受用于核酸提取或分离的操作。这可以在一些分析设置中显示优势。适用于核酸提取的方法在本领域中是熟知的。
将要理解的是，如要求保护的，前述一般描述和详细描述都仅仅是示例性的和说明性的而并不限制本发明。在本申请中，除非另外特别说明，否则使用单数包括复数。在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”是指“和/或”。使用术语“包括”、“包含”或“含有”是非限制性的。
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实施例
实施例1.用于从FFPE样品中释放核酸的液化方法。
将人FFPE样品与液化组合物接触以提供其中释放核酸的乳化裂解物。该组合物包含使石蜡乳化的添加剂，使得在石蜡存在的情况下发生组织样品的消化。该组合物是包含非离子清洁剂的液化缓冲剂。该液化组合物由10mM Tris pH 8、0.25％和1mg/ml蛋白酶K组成。因为 的存储溶液在DMSO中制备，所以该组合物另外包含0.25％DMSO。用施加在55℃和65℃之间变化的加热条件和在2min和20min之间变化的孵育时间获得了良好液化结果。对于所描述的实施例，通过将一个10μm FFPE切片浸入1ml液化组合物中，接着在60℃加热20min和在95℃加热10min来进行液化。如在进一步的实施例中所示出的，在乳化裂解物中释放的DNA适用于直接微流体分析而不需要二甲苯或乙醇提取石蜡。
实施例2.液化和基于柱的提取之间DNA产率的比较
比较了通过基于柱的提取方法和所描述的液化操作所获得的10μm FFPE切片的DNA产率。利用Qiagen QIAamp DNA FFPE组织试剂盒根据生产商的使用说明实施基于柱的DNA提取。洗脱后，将所提取的DNA 的体积调整至1ml以允许与液化DNA进行比较。利用QubitdsDNA BR测试试剂盒在Qubit荧光计2.0上根据生产商的使用说明测定DNA浓度。ΔCq(Liq–Extr)代表液化的和柱提取的DNA之间的Cq差值；Cq值基于Hamfjord等人(Diagn MolPathol 2011；20:158–165)通过实施用于野生型BRAF基因的基于的qPCR反应来获得。结果示出在表1中。
表1：DNA产率和ΔCq(Liq–Extr)
如在表1中所示的，除了样品2以外，对于所有样品来说，利用液化方法的DNA产率较高，在样品2中按照提取方法的DNA产率与按照本发明的液化方法的DNA产率相比较高。另外，如在表1的最右列示出的，通过液化和基于柱的提取所获得的DNA之间的Cq值差值表明在液化条件下能够扩增目标DNA的更多拷贝数。与DNA定量结果一致，只有样品2显示负的ΔCq值，对应于在该液化切片中较少的可扩增的DNA。
实施例3.利用商业液化方法的DNA的qPCR功能性。
比较了在本发明的乳化裂解物中和在商业可获得的液化组合物QuickExtractTMFFPE DNA提取溶液(Epicentre，Madison，Wisconsin)中所释放的DNA的qPCR功能性。如在前面的实施例中所描述的，进行10μm FFPE切片的液化和随后的qPCR分析。调整商业液化组合物(Epicentre QuickExtractTM FFPE DNA提取溶液)的体积以允许与本发明的液化组合物进行1:1比较。将产生的液化裂解物用作用于qPCR的原料(input material)；基于Hamfjord等人(Diagn Mol Pathol 2011；20:158–165)在25μl反应体积中利用用于野生型BRAF基因的基于的检测反应来进行反应。
图1示出了从FFPE样品在含有清洁剂的乳化裂解物(灰色)中所释放的DNA和从FFEP样品在商业液化组合物(黑色)中所释放的DNA的扩增结果。十字标记曲线代表几乎未稀释的乳化裂解物样品(20μL/5μL，模板/PCR混合物)的扩增，圆圈标记的曲线代表4倍稀释的乳化裂解物样品的扩增。在80％的模板条件下，商业液化组合物完全抑制PCR，而需要因此进一步4倍稀释以允许qPCR分析。相比之下，含有清洁剂 的本发明的液化组合物与直接下游PCR分析相容，允许在PCR中使用更多模板DNA(更高的拷贝数)并由此提高PCR分析的灵敏度。
实施例4.液化组合物在微流体系统中的功能性
探索了几种液化组合物在微流体系统处理中的功能性。
利用4种不同缓冲剂(有/没有清洁剂和有/没有蛋白酶K)进行3种不同FFPE样品的液化，每种条件使用单个连续10μm FFPE切片。如在EP1896180、EP1904234和EP2419705中所描述的，在微流体系统中进行样品的液化和PCR处理。将样品液化在1ml的液化组合物中并利用前面提及的条件进行加热。利用前面提及的扩增条件将产生的液化混合物以未稀释用作qPCR的原料。通过用于野生型BRAF基因的qPCR对所测试的液化混合物评估扩增的DNA。
表2总结了对于含有清洁剂的组合物相对于省去清洁剂的参照组合物所获得的ΔCq值。在微流体盒中的微流体通道的情况中，将清洁剂如 加入到液化组合物中将Cq值降低3.8的平均值，表明与没有清洁剂的参照组合物相比提高了DNA的释放。加入蛋白酶K进一步将Cq值提高1.5的平均值。因此，通过将清洁剂加入到液化组合物中提高了DNA从3种FFPE样品中的释放。
表2
还测试了商业可获得的液化缓冲剂QuickExtractTM FFPE DNA提取溶液(Epicentre，Madison，Wisconsin)在微流体系统中的功能性。将商业液化缓冲剂通过微流体盒的微流体通道泵入到5个PCR室中重现性地导致气泡的形成(图2，圆形PCR室)。应当避免这样的气泡，因为在填充PCR室后它们削弱qPCR分析。相比之下，当含有的液化缓冲剂运送至PCR室时没有观察到气泡，表明的物理-化学性能与盒的微流体相容。
实施例5.液化组合物在PCR抑制剂存在的情况下的功能性
比较了包含变化量的熟知的PCR抑制剂黑色素的样品在DNA提取或液化后的性能。每个样品的1个FFPE切片或i)在800μL的含有的液化组合物中液化或ii)在商业液化组合物(Epicentre QuickExtractTMFFPE DNA提取溶液)中液化或iii)根据生产商的使用说明使用基于柱的提取方法(Qiagen QIAamp DNAFFPE组织试剂盒)处理并在200μL H2O或TE中洗脱。按照前面所描述的进行液化并将产生的混合物以未稀释用作PCR的原料。按照所描述的进行qPCR反应。图3表明DNA释放程序对5种含有变化量的熟知的PCR抑制剂黑色素的不同FFPE样品的qPCR性能的影响。样品1-4含有高含量的黑色素(例如，对于样品4来说>95％)，而样品5不含有黑色素。不管是否存在黑色素，本发明的液化组合物与商业液化组合物相比产生优良的DNA的PCR扩增。对于包含高黑色素的样品，本发明的液化组合物与基于柱的DNA提取相比通常产生与下游处理更好相容性。这例如从在图3中描绘的对于FFPE4在不同方法后的Cq值所显而易见。当没有黑色素存在时观察到相似的性能。因此样品中可能存在没有立刻显现的或知道的其他实时PCR抑制剂，对此，要求保护的组合物提供提高的性能。图4是在实验中所用的3种含有高黑色素的样品的可视表示。
实施例6在工作台上裂解和在Idylla盒的裂解室中裂解的液化缓冲剂的乳化能力。
对于两种条件，将从同一FFPE块连续切除的一个10μm切片浸入到1ml的液化缓冲剂中。在工作台方案中，将切片在1.5ml管(Eppendorf)中利用加热块(Eppendorf)加热至60℃持续15min同时震荡(800rpm)。在盒(cartridge)中，利用帕尔贴(peltier)(加热)和压电(高强度聚焦超声或HIFU)功能化的组合将温度在约5分钟内逐步升高(室温、45℃、50℃、54℃和58℃)。在最后的步骤中，在决不超过2.25W的HIFU功率下将温度升高至60℃并保持10min。在两者处理后，将0.5ml运送至高光学透明的圆底管中(5ml BD法尔康(falcon))，冷却至室温并在最大功率下涡旋。虽然两个实质上相同的切片在相同的缓冲剂和体积中液化，但与工作台加热和震荡相比通过HIFU处理获得优良的石蜡乳化。HIFU处理重现性地产生更不透明的液化和在涡旋后在管壁上较少的石蜡沉淀(箭头)。
实施例7.从液化物质和二氧化硅提取的RNA获得的qRT-PCR曲线。
上述的图示出了从来自2个代表性FFPE样品(FFPE1和FFPE2)的单个连续10μm部分的液化物质和二氧化硅提取的RNA所获得的qRT-PCR曲线。通过根据上面所描述的液化方法处理FFPE部分在液化条件下获得RNA模板物质。简要地，FFPE部分与液化组合物接触并利用加热块(Eppendorf)在1.5ml管(Eppendorf)中加热至60℃持续15min，接着加热至95℃持续10min同时震荡(800rpm)。通过使用Qiagen QIAamp RNA FFPE组织试剂盒根据生产商的使用说明处理FFPE部分在二氧化硅提取条件中获得RNA模板物质。随后，在25μL qRT-PCR反应中利用用于管家基因B2M的RNA-特定分析来分析由每种方法所获得的5μL模板。
图6a和6b证明了通过使用用于从FFPE部分释放RNA的液化或者二氧化硅提取方法获得相似的阈值循环(Ct)。
因此，在乳化裂解物中释放的RNA适用于直接微流体分析。
考虑到本文所公开的本发明的说明和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。旨在认为这些说明和实施例仅是示例性的，本发明的真实范围和精神将由所附的权利要求所指出。
Claims (11)
1.一种用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
-将所述生物样品与组合物接触用于将所述样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
-在所述微流体系统内在所述裂解物中直接分析所述核酸，
其中所述组合物是包括至少非离子型表面活性剂的液化组合物，其中所述非离子型表面活性剂是-8。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸的分析需要热循环。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸的分析需要PCR。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是固定样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是蜡包埋样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是FFPE样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
8.用于从生物样品释放核酸的组合物的应用，所述组合物：
-当与所述样品的至少部分接触时将所述样品的至少部分转化成裂解物；
-包含至少非离子型表面活性剂，
其中所述非离子型表面活性剂是-8。
9.根据权利要求8所述的组合物的应用，所述组合物具有液化性质。
10.根据权利要求8或9所述的组合物的应用，所述裂解物能通过微流体系统直接运送。
11.根据权利要求8或9所述的组合物的应用，所述裂解物能通过微流体系统直接运送用于所述裂解物中的直接核酸分析。
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