JP4776133B2 - 阻害物質に富む糞便試料及び他の生物学的材料からの核酸の単離 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、不純物及び阻害物質又は望ましくない物質を含み得る材料からの試料、特に糞便試料からの核酸の固定、精製、及び／又は単離方法に関する。その方法の実施に適した試薬キットも説明する。
【０００２】
様々な分野の研究からの非常に多くの例により、保存中の核酸にダメージを与え、かつ核酸の酵素による処理、例えば、制限酵素による消化、又はポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）による増幅を阻害する物質に汚染された生物学的材料からの核酸の分析の重要性が確認されている。従って、生物学的材料中に含まれる核酸を、更なる分析のために使用できるようにするためには、これらの物質が、非常に低濃度でのみ存在し、又は試料から完全に除去されることが重要である。
【０００３】
糞便試料からの核酸の分析は、特に重要である。１つの主な医学的用途は、消化管の腫瘍の初期診断におけるパラメーターとして使用され得る、糞便からのヒトの核のＤＮＡにおける腫瘍に特異的な変化の検出である。同様に、核酸に基づく試験法による、糞便試料からのバクテリア及びウイルス伝染性物質の検出は、重要性を増してきている。
【０００４】
糞便試料からの核酸の精製のために、プロテアーゼ処理、フェノール／クロロホルム抽出、カオトロピック塩の存在下でのシリカへの核酸の結合、ゲル濾過、アニオン交換クロマトグラフィー、及びカチオン洗浄剤の使用のような、異なる精製段階の組み合わせを使用することが、広く知られている。しかし、これらの方法によって、糞便試料から単離された核酸は、一般に不安定であり、例えばＰＣＲのようなその後の酵素反応において、しばしば問題となる挙動を示す。この理由は、核酸と共に単離され、それにダメージを与え、酵素反応を阻害する物質である。糞便中に含まれる阻害物質の種類は−知られている限りでは−ヘモグロビン（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）及びその代謝産物、胆汁酸及び胆汁酸誘導体、並びに多糖類である。従来技術には、この問題に対する様々な解決法が提案されているが、いずれも満足な結果をもたらすものではない（ドーター（Ｄｅｕｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５、２３：３８００−３８０１；ファン・ツェット（ｖａｎ Ｚｗｅｔ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９４、３２：１３４６−１３４８；ウィルデ（Ｗｉｌｄｅ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０、２８：１３００−１３０７；ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ．１９９６、１０８：２３７−２４３；シドランスキー（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２、２５６：１０３−１０５；ランマムーティー（Ｒａｍｍａｍｕｒｔｈｙ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３、３１：３０６８−３０７０；モンテリオ（Ｍｏｎｔｅｒｉｏ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７、３５：９９５−９９８；ウワトコ（Ｕｗａｔｏｋｏ）ら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６、５２：７３−７９；Ｔｕｃｈｉｌｉら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９６、５８：８８１−８８４；パントスティ（Ｐａｎｔｏｓｔｉ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７、３５：２４８２−２４８６、ＵＳ ４，９３５，３４２；ＷＯ ９３／２０２３５）。一般に、試料はアルカリ培地において調製される。
【０００５】
シボラップ（Ｓｉｖｏｌａｐ）らは、Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１９９２、１１７：２０６００１ｕに、植物材料からＤＮＡを単離する場合に、フェノール中和物質を添加することを記載している。チャン（Ｃｈｕｎｇ）らは、Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１９９７、１２７：１４６６９９ｘに、塩基性バッファーを用いて、植物材料からＤＮＡを抽出することを記載している。
【０００６】
ＷＯ ９７／０７２３９には、何らかの不純物を結合させるために、核酸を含む生物学的材料の試料へ、吸着マトリックスを添加する、生物学的材料、特に糞便材料から、核酸を精製、固定、及び／又は単離する方法が記載されている。好ましくは、炭水化物に基づく吸着マトリックスが使用される。例えば、澱粉、セルロース、グリコーゲン、及び／又は他の生物から作られる（ｂｉｏｇｅｎｉｃ）若しくは生物から作られるものではない（ｎｏｎ−ｂｉｏｇｅｎｉｃ）炭水化物若しくはそれらの混合物に基づくものがあり、小麦、エンドウ、とうもろこし、じゃがいも製の穀粉、又はそれらの成分、又はそれらの混合物が好ましい。しかし、多くの場合、ＷＯ ９７／０７２３９に記載された方法を用いると、核酸にダメージを与える物質は、完全には除去されない。
【０００７】
この方法の更なる進展が、ＤＥ １９９ ００ ６３８．５に開示されている。ここには、酸性から中性のｐＨを有し、塩含有量が多く、かつフェノール中和物質を含有することを特徴とする特異的なバッファーを、不純物を結合させるための吸着マトリックスと共に、核酸を含む試料へ添加する、生物学的材料から、核酸を単離するための方法が説明されている。この方法は、十分に高純度な核酸が実際に得られるが、記載された吸着マトリックスが、大きく膨らみ、均質化を一層困難にするという欠点がある。このことは、バクテリア、ウイルス及び他の病原菌の溶解の助けとなる、熱を作用させた後に顕著である。
【０００８】
従って、本発明の１つの目的は、上記の従来技術から知られた方法の欠点を克服する、核酸を精製するための改良された方法を提供することである。
【０００９】
驚くべきことに、阻害された（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）試料からの核酸の精製は、不純物を結合させるために、ＷＯ ９７／０７２３９又はＤＥ １９９ ００ ６２８．５に記載されたような吸着マトリックスを試料へ添加する必要なく、特異的なバッファーを用いることにより改良され得ることがわかった。
【００１０】
本発明は、
（ａ）２−７、好ましくは７未満のｐＨを有し、
（ｂ）少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、及び／又は
（ｃ）フェノール中和物質を含むバッファーを、核酸を含む試料に添加する、材料の試料からの核酸の精製、固定、及び／又は単離方法に関する。この方法は、試料、試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた均質化若しくは溶解された材料、若しくは抽出物に、炭水化物に基づく吸着マトリックスが添加されないことを特徴とする。
【００１１】
不純物を結合させるための、この種の吸着マトリックスは、特許出願ＷＯ ９７／０７２３９及びＤＥ １９９ ００ ６２８．５に記載されている。これにより、これらの全内容が参照される。
【００１２】
バッファーは、１００ｍｍｏｌ／ｌから使用される塩の溶解度の限界までの塩濃度を有することが好ましい。好ましい範囲は、１００ｍｍｏｌ／ｌ〜２．５ｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは２５０〜２．５ｍｏｌ／ｌであり、特に３００ｍｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌであり、最も好ましくは３００ｍｍｏｌ／ｌ〜７００ｍｍｏｌ／ｌである。特に好ましい範囲は、４００ｍｍｏｌ／ｌ〜６００ｍｍｏｌ／ｌである。なお（Ｂｙ ｔｈｅ ｗｏｒｄ）、ここで、塩とは、無機塩、特に無機酸のアルカリ又はアルカリ土類金属塩を意味する。好ましくは、アルカリ金属ハロゲン化物、例えば、ＮａＣｌ若しくはＫＣｌ、又はそれらの混合物が塩として使用される。
【００１３】
別の好ましい態様では、ＬｉＣｌが塩として使用される。使用される濃度は、１００ｍｍｏｌ／ｌから溶解度の限界までとすることができる。ＬｉＣｌが使用される場合、０．５ｍｏｌ／ｌから溶解度の限界までの濃度が好ましく、最も好ましくは０．５〜２．５ｍｏｌ／ｌである。
【００１４】
別の態様では、本発明によるバッファーは、少なくとも０．１％（ｗｔ．／ｖｏｌ）、好ましくは少なくとも０．５％の洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含む。使用される洗浄剤は、０．１〜５％（ｗｔ．／ｖｏｌ）、より好ましくは０．５〜５％（ｗｔ．／ｖｏｌ）、最も好ましくは１〜２％（ｗｔ．／ｖｏｌ）の濃度の、好ましくはイオン性洗浄剤、特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００１５】
別の態様では、本発明によるバッファーは、１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌ以上、最も好ましくは、少なくとも２０ｍｍｏｌ／ｌのキレート剤を含む。特に好ましい範囲は、２５〜７５ｍｍｏｌ／ｌである。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその塩、特にニナトリウム塩が好ましい。
【００１６】
本発明によるバッファーは、３を越えるが７より低いｐＨ、好ましくは４〜６．５、より好ましくは４〜６のｐＨを有する。酢酸塩バッファー、例えば、酢酸／酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）を使用することが有利であることがわかった。しかし、リン酸塩又はクエン酸バッファーのような他のバッファーを使用することもできる。
【００１７】
本発明によるバッファーは、少なくとも１つのフェノール中和物質を含むことが好ましい。フェノールを中和し得る物質の好ましい例は、例えばＰＶＰ−１０（平均分子量１０，０００のＰＶＰ）のような、様々な重合度のポリビニルピロリドン（ポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）、ＰＶＰ、ＣＡＳ ９００３−３９−８；例えば、シグマ−アルドリッチ・ファイン・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ、ＵＳＡから入手可能）、還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール若しくはジチオスレイトールのようなチオール試薬、又はホウ酸塩である。フェノール中和物質として、少なくとも０．５％のポリビニルピロリドンを含むバッファーが好ましい。好ましい濃度範囲は、１−３０％（ｗｔ．／ｖｏｌ）、好ましくは２−１５％、最も好ましくは４−１０％のＰＶＰである。
【００１８】
本発明によるバッファーは、好ましくは溶解バッファーである。即ち、細胞の溶解、特に、ここで対象としている核酸を含む細胞の溶解を引き起こす組成を有することが好ましい。当業者であれば、微生物、動物又は植物の細胞のような所望の細胞の溶解（即ち、細胞膜及び／又は細胞壁の貫通（ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）若しくは溶解）が起こる条件（例えば、イオン及び／又は洗浄剤の濃度）を熟知しているであろう。
【００１９】
核酸を含む試料は、核酸を破壊するか、又は酵素反応を阻害する不純物を含む材料から得られることが好ましい。特に、この種の不純物は、制限酵素及びポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）のために使用される酵素の酵素活性を阻害する。好ましくは、試料は、糞便材料からなる。しかし、それは、他の供給源、例えば、動物若しくは植物組織、組織若しくは細胞培養液、骨髄、血液、血清、血漿、尿、精液、脳脊髄液、痰、及び塗抹標本のようなヒト及び動物の体液、植物、植物の一部及び抽出物、例えば樹液、真菌、バクテリア若しくは酵母菌のような原核微生物若しくは真核微生物、化石化若しくはミイラ化試料、土壌試料、浄化汚泥（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ ｓｌｕｄｇｅ）、汚水、及び食糧（特に、加工された、即ち、工業的に調製された食糧）から得ることもできる。試料は、水不溶性成分を含むこともできる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた均質化若しくは溶解された材料、若しくは抽出物を、少なくとも５０℃でインキュベートする、先に説明したような方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、糞便試料からの核酸を、分析、検出、又は単離するための、先に説明したような方法の使用に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、先に説明したようなバッファー、特に、
（ａ）２〜７、好ましくは７未満のｐＨを有し、
（ｂ）少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、及び／又はフェノール中和物質を含む
バッファーを含む、生物学的試料からの核酸を精製、固定、及び／又は単離するための試薬キットに関する。
【００２３】
本発明による試薬キットは、 特許出願ＷＯ ９７／０７２３９及びＤＥ １９９ ００ ６２８．５に記載されているような、炭水化物に基づく吸着マトリックスを含まないことを特徴とする。
【００２４】
バッファーは、最終形態（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｆｏｒｍ）において、濃縮物又は凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）として存在することができる。
【００２５】
好ましくは、試薬キットは、例えば、無機及び／又は有機担体、並びに任意に溶液、添加剤、及び／又は付属物を含む、核酸を精製するための更なる手段を含む。そのような物質は、従来技術から知られており（例えば、ＷＯ ９５／０１３５９参照）、市販されている。担体の無機成分は、例えば、多孔質若しくは非多孔質金属酸化物又は混合金属酸化物、例えば、酸化アルミニウム、二酸化チタン、酸化鉄、若しくは二酸化ジルコニウム、シリカゲル、ガラス系材料、例えば、変性又は非変性ガラス粒子若しくはガラス粉（ｇｒｏｕｎｄ ｇｌａｓｓ）、水晶、ゼオライト、又は上記物質の１つ以上の混合物であることができる。一方、担体は、例えば、官能基によって任意に変性されたラテックス粒子、ポリエチレン、ポリプロプレン、フッ化ポリビニリデン、特に、超高分子量ポリエチレン若しくはＨＤ−ポリエチレン、又は上記物質の１つ以上の混合物から選ばれ得る有機成分を含むこともできる。
【００２６】
担体は、例えば、０．１μｍ〜１００μｍの平均サイズの粒子の形態で使用することができる。多孔質担体を使用する場合は、平均細孔サイズは２μｍ〜１００μｍであることが好ましい。例えば、担体は、例えばガラス、水晶若しくはセラミックの、ばらの（ｌｏｏｓｅ）粒子、フィルター層、膜、例えばシリカゲルを含む膜、繊維、又は水晶若しくはグラスウールのような無機担体から織られた織物の形態、及び、合成ポリマーからのラテックス又は焼結材料の形態であることができる。
【００２７】
また、本発明による試薬キットは、例えば、プロテイナーゼＫのようなプロテアーゼ、又は酵素、並びに核酸の処理のための他の物質、例えば、少なくとも１つの増幅プライマー、及び核酸の増幅に適した酵素、例えば核酸ポリメラーゼ、並びに／又は少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼのような、添加剤を含むこともできる。
【００２８】
核酸の増幅のためのプライマーは、分析されるべき遺伝子、即ち、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、及び／又はミクロサテライト（ｍｉｃｒｏ−ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）から得られることが好ましく、また、例えば、それらは、ウイルス又はバクテリア核酸配列の増幅に適したものであることができる。核酸の増幅に適した酵素及び制限エンドヌクレアーゼが知られており、市販されている。
【００２９】
別の態様では、本発明は、
（ａ）核酸を含む試料を採取する段階、
（ｂ）２〜７、好ましくは７未満のｐＨ、少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、及び／又はフェノール中和物質を含むバッファーを添加する段階を含む材料の試料からの核酸の精製、固定、及び／又は単離方法であって、試料、試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた抽出物、溶解物若しくは均質化物（ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｅ）へ、炭水化物に基づく吸着マトリックスを添加しないことを特徴とする方法に関する。
【００３０】
好ましくは、試料は、核酸を破壊するか、又は酵素反応を阻害する不純物を含む材料の試料である。特に、そのような不純物は、核酸と相互作用する酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、逆転写酵素、核酸ポリメラーゼ、リガーゼ等のようなヌクレアーゼ、特に、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）、ＬＣＲ（リガーゼ・チェーン反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸塩基特異的増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、又は３ＳＲ（自己持続性配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））のために使用される酵素の酵素活性を阻害する。バッファーの好ましい態様は、前述の通りである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、
（ａ）核酸を含む試料を採取する段階、
（ｂ）２〜７、好ましくは７未満のｐＨ、少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、及び／又はフェノール中和物質を含むバッファーを添加する段階、並びに、
（ｃ）試料とバッファーとの混合物を均質化する段階を含む、この種の方法に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、
（ａ）核酸を含む試料を採取する段階、
（ｂ）材料を均質化する段階、並びに
（ｃ）２〜７、好ましくは７未満のｐＨ及び少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、かつ／又はフェノール中和物質を含むバッファーを添加する段階を含む、この種の方法に関する。
【００３３】
均質化とは、材料試料又は試料成分、特に材料の水不溶性試料の、機械的、熱的、酵素的、又は化学的破壊を意味する。それ自体既知の方法を用いて、例えば、超遠心分離（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）容器のための通常の振動ミキサー（ボルテックスシェーカー）、ウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａｔａｒａｘ）又はポリトラン（Ｐｏｌｙｔｒａｎ）、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）、ポッター（ｐｏｔｔｅｒ）、乳鉢又はボールミルを用いて、均質化を行うことができる。
【００３４】
更なる段階において、不溶性成分を、遠心分離によって分離することができ、プロテアーゼを抽出物へ添加することができ、及び／又は、抽出物を５０℃以上（≧５０℃）に加熱することができる。
【００３５】
記載した段階（本発明によるバッファーの添加、均質化、遠心分離、プロテアーゼの添加、加熱）を行う場合は、必要により、異なる順序で行うことができる。従って、本発明によるバッファーを、任意に粗く粉砕される試料へ、まず最初に添加することができ、その後、均質化を行うことができ、次いで遠心分離を行うことができる。バッファーが、溶解性（ｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する場合、使用される遠心分離条件は、バッファーが非溶解性であり、細胞溶解が、後半の段階でのみ達成される場合に使用されるものと異なるものでなければならない。なぜなら、後者の場合には、所望の核酸を含む細胞が、遠心分離中に失われないことを保証するために、注意を払わなければならないからである。一方、材料試料中で細胞外に存在する（ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｏｒｍ）ウイルスから、核酸が単離されるべきであるならば、非溶解性バッファーを使用することが望ましいことがあり、バッファーが添加され、均質化が行われた後には、他の不溶性成分と共に、試料中に含まれる細胞を遠心分離によって分離することが望ましいことがある。
【００３６】
上記のような材料試料の分解（ｂｒｅａｋ−ｕｐ）後に、既知の方法、例えば、カオトロピック塩の存在下での遠心分離カラム中のシリカゲル膜による、核酸のクロマトグラフィーによる精製又は単離を行うことができる。
【００３７】
本発明を実施する１つの方法は、材料試料を、本発明によるバッファーと混合し、必要により、混合物を均質化することである。例えば、ボルテックスシェーカーを用いて、均質化を行うことができる。これらの段階は、周囲の（ａｍｂｉｅｎｔ）温度において、又は好ましくは、例えば１０℃以下（≦１０℃）、特に４℃以下（≦４℃）の低温（ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）において、行うことができる。何らかの均質化が完了した後、不溶性物質を分離することができる。例えば、本発明によるバッファーが、溶解性を有するために、この段階で、細胞が既に溶解されている場合は、例えば、１０，０００〜２５，０００×ｇ、好ましくは２０，０００×ｇでの１〜５分間の遠心分離によって、不溶性成分を分離することができる。
【００３８】
試料材料から核酸を放出させるために必要とされる条件下で、得られた抽出物又は得られた溶菌液をインキュベートすることが必要なこともある。この種のインキュベーション条件は、特に、開く（ｏｐｅｎ ｕｐ）のが“困難”な材料、例えば、バクテリア又は寄生虫又はウイルス中で、核酸が検出されるべき場合に使用される。この場合、核酸の放出は、化学的、熱的、及び／又は酵素的処理によって改善することができ、それにより、試料材料から、全ＤＮＡの点でも、とりわけ、検出されるべきＤＮＡに関しても、高収率で核酸を得ることができる。
例えば、５０℃以上（≧５０℃）、特に７０℃以上（≧）へ、温度を上げることが好ましい。
【００３９】
一方、例えばヒトの細胞のような敏感な細胞のような容易に開くことができる材料からの核酸が決定されるべきである場合は、この方法における試料中の他の核酸の望ましくない放出を回避又は制限するために、抽出及び細胞開放（ｏｐｅｎｉｎｇ）の工程を、例えば１０℃以下（≦１０℃）、特に４℃以下（≦４℃）の低温で行うことが有利なこともある。
【００４０】
本発明によるバッファーによる処理により、試料中に含まれる核酸の非常に良好な溶解度が得られ、核酸がその後に単離される場合は、不純物を結合させるための吸着マトリックスの添加、インキュベーション、及びその後の除去という、更なる段階を行う必要なく、より良好な再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）が得られる。核酸と相互作用する酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、逆転写酵素、核酸ポリメラーゼ、リガーゼ等のヌクレアーゼによる核酸の酵素による処理が、単離後に行われる場合に、このことは特に当てはまる。増幅、及び／又は制限切断（ｃｌｅａｖｉｎｇ）、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ・チェーン反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸塩基特異的増幅）、又は３ＳＲ（自己持続性配列複製）による増幅が、本発明による方法の後に行われることが特に好ましい。
【００４１】
本発明の特に好ましい態様は、糞便試料からの核酸、特にＤＮＡの分析、検出又は単離である。本発明による方法を用いることにより、糞便試料から、清潔かつ増幅可能な核酸を、容易に得ることができ、その後、感染、特に、バクテリア若しくはウイルス感染、又は突然変異、特に腫瘍に特異的なＤＮＡの突然変異の診断的検出に用いることができる。
【００４２】
本発明を、以下の図面及び実施例によって説明する。
図面
図１：実施例２の方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量。示した値は、総収量（μｇ）からの平均値、及び平均偏差である。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードである。ｍ．Ｔ．（タブレット（ｔａｂｌｅｔ）あり）という略記は、実施例２からの方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．Ｔ．（タブレットなし）は、方法Ｖ３を表す。
【００４３】
図２：実施例２からの方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードを表す。ｍ．Ｔ．という略記は、実施例２からの方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．Ｔ．は、方法Ｖ３を表す。デルタ（ｄｅｌｔａ）Ｃｔの値の計算については、実施例２を参照。１μｌ当たり１０ｎｇのＢＳＡ（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）の存在下で、ＰＣＲ反応を行った。
【００４４】
図３：実施例２の方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量。値は、総収量（μｇ）の平均値である。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードを表す。ｍ．Ｔ．という略記は、実施例２の方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．Ｔ．は、方法Ｖ３を表す。
【００４５】
図４：実施例２からの方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードを表す。ｍ．Ｔ．という略記は、実施例２からの方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．Ｔ．は、方法Ｖ３を表す。デルタＣｔの値の計算については、実施例２を参照。１μｌ当たり１０ｎｇのＢＳＡ（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）の存在下で、ＰＣＲ反応を行った。
【００４６】
図５：実施例２の方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量。値は、総収量（μｇ）の平均値である。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードである。ｍ．Ｔ．という略記は、実施例２の方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．Ｔ．は、方法Ｖ３を表し、ｍ．Ｐ．は、方法Ｖ１を表す。
【００４７】
図６：実施例２からの方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。ｘ軸上の見出しの最初の２つの数字は、特定の糞便試料に対するコードである。ｍ．Ｔ．という略記は、実施例２からの方法Ｖ２を表し、一方、ｏ．ａ．は、方法Ｖ３を表し、ｍ．Ｐ．は、方法Ｖ１を表す。デルタＣｔの値の計算については、実施例２を参照。１μｌ当たり１０ｎｇのＢＳＡ（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）の存在下で、ＰＣＲ反応を行った。
【００４８】
図７：バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３における方法によるＤＮＡ単離の収量。総収量の値（μｇ）。ＰＶＰ濃度（％）（ｗｔ／ｖｏｌ）。糞便試料２７。測定を繰り返した。
【００４９】
図８：バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３の方法を使用したＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。糞便試料２７。ＢＳＡ １ｎｇ／μｌ。
【００５０】
図９：バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３における方法によるＤＮＡ単離の収量。総収量の値（μｇ）。ＰＶＰ濃度（％）（ｗｔ／ｖｏｌ）。糞便試料６１。測定を繰り返した。
【００５１】
図１０：バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。糞便試料６１。ＢＳＡ １ｎｇ／μｌ。
【００５２】
図１１：バッファーＰ１のｐＨの関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ単離の収量。総収量（μｇ）。糞便試料５１。測定を２回繰り返した。
【００５３】
図１２：バッファーＰ１のｐＨの関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害。糞便試料５１。ＢＳＡ １ｎｇ／μｌ。
【００５４】
【実施例】
実施例１：糞便試料からのＤＮＡの単離
ヒトの糞便試料を集め、−２０℃で凍結保存した。２００ｍｇの糞便を、２ｍｌの超遠心分離容器に計り取り、氷上で冷却した。その後、糞便試料を１６００μｌのバッファーＰ１（１００ ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＡｃ ｐＨ ５．５、５０ ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、５００ ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２％（ｗｔ／ｖｏｌ） ＰＶＰ−１０、１．４％（ｗｔ／ｖｏｌ） ＳＤＳ）に入れ、ボルテックス中で１分間、混合物を均質化した。溶菌液を３分間遠心分離して、２０，０００×ｇ（１４，０００ｒｐｍ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１７Ｃ遠心分離機を使用；ローターＦＡ ４５−３０−１１）で、糞便粒子及び他の不純物を沈殿させた。１２５０μｌの上清を、新たな２ｍｌ超遠心分離容器へ移し、逆さにして（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）混合した。この溶菌液６００μｌを、新たな２ｍｌ超遠心分離容器へ移し、市販のＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡミニキット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）によって製造者の説明書に従って、更に精製した。これら精製段階は、プロテイナーゼ−Ｋの添加、７０℃での１０分間にわたるインキュベーション、及びカオトロピック塩の存在下での遠心分離カラム中のシリカゲル膜上でのクロマトグラフィーによる核酸の精製を含んでいた。こうして得られたＤＮＡ溶出液の容量は、２００μｌであった。
【００５５】
実施例２：炭水化物を使用する、及び使用しない、糞便試料からのＤＮＡの単離
ヒトの糞便試料を集め、−２０℃で凍結保存した。様々な方法を用いて、合計１６個の異なる糞便試料から、ＤＮＡを単離し、その後、ＰＣＲ法を用いて、阻害物質を定量的に調べた（“実時間定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）”； ＳＦＶ ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応； ＳＦＶ＝セムリキ・フォレスト・ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）； ワン（Ｗａｎｇ）及びブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９９、２６９： １９８−２０１； デ・コッコ（ｄｅ Ｋｏｋ）ら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． １９９８、４４：２２０１−２２０４）。
【００５６】
Ｖ１−Ｖ３：１６００ｍｇの糞便を、５０ｍｌ遠心分離管に入れ、氷上で冷却した。その後、糞便試料を１２．８ｍｌのバッファーＰ１（１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＡｃ ｐＨ ５．５、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２％ （ｗｔ／ｖｏｌ） ＰＶＰ−１０、１．４％ （ｗｔ／ｖｏｌ） ＳＤＳ）に入れ、１分間のボルテックス処理により、混合物を均質化した。糞便中の全ての不溶性成分をペレット化するために、５００ｒｐｍ（使用したシグマ（Ｓｉｇｍａ）４Ｋ１５遠心分離機中５３３８ｇに相当、ローター１１５６）で３分間、混合物を遠心分離した。上清を新たな５０ｍｌ遠心分離管へ移し、５０００ｒｐｍで３分間、再度遠心分離した。その後、上清を別の５０ｍｌ遠心分離管へ移し、逆さにして混合した。こうして得られた溶菌液を、２０ｍｌ超遠心分離容器中で１４００μｌのアリコートに分け、以下の３つの方法に使用した。
【００５７】
じゃがいもの粉末及びセルロースからなる粉末化した吸着マトリックス５００ｍｇ（３：１[ｗｔ／ｗｔ]の比で混合）を、溶菌液へ添加し、１分間のボルテックス処理によって再度懸濁した。
【００５８】
Ｖ２：じゃがいもの粉末及びセルロースからなるタブレット状の吸着マトリックス５００ｍｇ（３：１[ｗｔ／ｗｔ]の比で混合；タブレット化するための添加剤としてステアリン酸マグネシウムを添加）を、溶菌液へ添加し、１分間のボルテックス処理によって再度懸濁した。
【００５９】
Ｖ３：吸着マトリックスを溶菌液へ添加しなかった。
【００６０】
更なる処理は、３つの方法全てで同じであった。懸濁液（Ｖ１及びＶ２）並びに未処理の溶菌液（Ｖ３）を、３分間遠心分離して、全ての糞便粒子、吸着マトリックス及び他の不純物を、２０，０００×ｇ（１４，０００ｒｐｍ、遠心分離機使用、実施例１参照）で沈殿させた。上清を、新たな超遠心分離容器へ移し、更に３分間遠心分離した。２回目の遠心分離からの上清６００μｌを、新たな２ｍｌ超遠心分離容器へ移し、市販のＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ（登録商標） ＤＮＡミニキット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を用いて、製造者の説明書に従って、更に精製した。これら精製段階は、プロテイナーゼＫの添加、７０℃での１０分間のインキュベーション、及びカオトロピック塩の存在下での遠心分離カラム中のシリカゲル膜による核酸のクロマトグラフィーによる精製を含んでいた。得られたＤＮＡ溶出液の容量は、２００μｌであった。
【００６１】
方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３からのＤＮＡ溶出液において、ＳＦＶ ＴａｑＭａｎ反応（ＴａｑＭａｎ（登録商標）、パーキン・エルマー・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、ＣＡ、ＵＳＡ） （５０サイクルにわたるＰＣＲ ）を用いて、阻害物質を定量的に調べた。この目的のために、プラスミドｐＳＦＶ１の１０００個の複製（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ、ＵＳＡ）をＰＣＲマスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）へ、バッチごとに添加した。このプラスミドは、糞便と異なり（ｆｏｒｅｉｇｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｏｏｌ）、セムリキ・フォレスト・ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）の配列を含んでいた。アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は、プラスミドの小さなｎｓＰ１リーディングフレームに位置している。マスターミックスは、１倍の（１ｘ）ＴａｑＭａｎバッファーＡ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））、３ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ₂（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））、プライマー３００μＭずつ、試料１００μＭ、１−１０ ｎｇ／μｌのＢＳＡ （ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） ＢＳＡ００７）、０．０２５Ｕ／μｌ アンプリタク・ゴールド（Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））及び０．０１Ｕ／μｌのＵＮＧ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を更に含む。また、総容量２５μｌには、糞便からのＤＮＡ溶出液５μｌが含まれていた。阻害される物質が糞便中に存在するならば、ＳＦＶアンプリコンの増幅の進行が妨げられ（Ｃｔ値の増加）、極端な場合には、完全に阻害された（Ｃｔ＝５０）。プラスの（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）コントロールとして、ＤＮＡ溶出液の代わりに、全ての方法で使用された溶出バッファーＰ２（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０、０．５ｍｍｏｌ／ＥＤＴＡ）を使用した（Ｃｔ値 約３０）。各ＤＮＡ単離を繰り返した。各溶出液に対して、３つのＴａｑＭａｎ反応を組み立てた。こうして得られた６つのＣｔ値から、平均値を算出した（ＭＷ−Ｃｔ）。ＭＷ−Ｃｔ溶出液マイナスＭｗ−Ｃｔ_p2（＝ΔＣｔ、デルタ（ｄｅｌｔａ）Ｃｔ）からの差として、阻害の程度を算出した。それ故、阻害されていない（ｎｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）溶出液のΔＣｔ値は０である（実際は、±１）のに対して、完全に阻害されたＤＮＡ溶出液のΔＣｔ値は、１６〜２０である。
【００６２】
驚くべきことに、本発明によるバッファーが使用されるならば（方法Ｖ３）、試料の調製において（方法Ｖ１、Ｖ２）、阻害された汚染物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）を除去するために吸着マトリックスを添加する必要がないことがわかった。全収量及び阻害物質含有量の結果を、図１〜６に示す。
【００６３】
実施例３：バッファーの様々なパラメーターの関数としての、糞便試料からのＤＮＡの単離
実施例１の方法により、糞便試料からＤＮＡを単離した。一連の実験において、バッファーＰ１中で、ポリビニルピロリドンの濃度を変化させ（０〜３０％）、２回目の一連の実験において、バッファーのｐＨを変化させた（ｐＨ３〜１１．２）。総収量及び阻害物質含有量の結果を、図７〜１２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例２の方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量を示す。
【図２】 実施例２からの方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。
【図３】 実施例２の方法Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量を示す。
【図４】 実施例２からの方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。
【図５】 実施例２の方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ単離の収量を示す。
【図６】 実施例２からの方法Ｖ１、Ｖ２及びＶ３による様々な糞便試料からのＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。
【図７】 バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３における方法によるＤＮＡ単離の収量を示す。
【図８】 バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３の方法を使用したＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。
【図９】 バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３における方法によるＤＮＡ単離の収量を示す。
【図１０】 バッファーＰ１のＰＶＰ濃度の関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。
【図１１】 バッファーＰ１のｐＨの関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ単離の収量を示す。
【図１２】 バッファーＰ１のｐＨの関数としての、実施例３の方法によるＤＮＡ調製によるＰＣＲ反応の阻害を示す。

Claims (16)

1. （ａ）２〜６．５のｐＨを有し、
   （ｂ）少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、かつ
   （ｃ）ポリビニルピロリドンを含む
   バッファーを、核酸を含む試料に添加する、材料試料からの核酸の精製、固定、及び／又は単離方法であって、
   炭水化物に基づく吸着マトリックスが、試料、試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた何らかの均質化物、溶菌液、若しくは抽出物に添加されないこと、および、クロロホルムを含む溶媒を用いた抽出段階を含まないことを特徴とする方法。
2. バッファーが、少なくとも２５０ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. バッファーに含まれる塩が、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、及び／又はＫＣｌであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. バッファーに含まれる塩がＬｉＣｌであり、０．５ｍｏｌ／ｌから溶解度の限界までの濃度で存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. バッファーが、少なくとも０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の洗浄剤を更に含むことを特徴とする請求項１〜４の１項に記載の方法。
6. バッファーが、少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌのキレート剤を更に含むことを特徴とする請求項１〜５の１項に記載の方法。
7. バッファーが、４〜６．５のｐＨを有することを特徴とする請求項１〜６の１項に記載の方法。
8. バッファーが、少なくとも０．５％ｗｔ／ｖｏｌのポリビニルピロリドンを含むことを特徴とする請求項１〜７の１項に記載の方法。
9. バッファー中のポリビニルピロリドンの濃度が１−３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 核酸を含む試料が、糞便材料、動物若しくは植物組織、組織若しくは細胞培養液、骨髄、ヒト及び動物の体液、植物、植物の一部及び抽出物、真菌、原核微生物若しくは真核微生物、化石化若しくはミイラ化試料、土壌試料、浄化汚泥、汚水、又は食糧由来であることを特徴とする請求項１〜９の１項に記載の方法。
11. 試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた均質化物若しくは抽出物が、少なくとも５０℃でインキュベートされる、請求項１〜１０の１項に記載の方法。
12. 糞便試料からの核酸の分析、検出、又は単離のための、請求項１〜１１の１項に記載の方法の使用。
13. 請求項１〜８の１項に規定されたような核酸を含む試料の吸収に適したバッファーを含むが、炭水化物に基づく吸着マトリックスを含まない生物学的試料から、核酸を精製、固定、及び／又は単離するための試薬キット。
14. （ａ）核酸を含む材料の試料を採取する段階、
    （ｂ）２〜６．５のｐＨを有し、少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、かつポリビニルピロリドンを含むバッファーを添加する段階
    を含む、材料試料から核酸を精製、固定、及び／又は単離するための方法であって、
    炭水化物に基づく吸着マトリックスが、試料、試料とバッファーとの混合物、又はそれらから得られた抽出物、溶菌液、若しくは均質化物に添加されないこと、および、クロロホルムを含む溶媒を用いた抽出段階を含まないことを特徴とする方法。
15. （ａ）核酸を含む材料の試料を得る段階、
    （ｂ）２〜６．５のｐＨを有し、少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、かつポリビニルピロリドンを含むバッファーを添加する段階、及び
    （ｃ）試料とバッファーとの混合物を均質化する段階
    を含む請求項１４に記載の方法。
16. （ａ）核酸を含む材料の試料を得る段階、
    （ｂ）材料を均質化する段階、及び
    （ｃ）２〜６．５のｐＨを有し、少なくとも１００ｍｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、かつポリビニルピロリドンを含むバッファーを添加する段階
    を含む請求項１４に記載の方法。

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