DE10013225A1 - Nukleinsäure-Isolierung aus Stuhlproben und anderen biologischen Materialien, die reich an Inhibitoren sind - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung, Reinigung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben, insbesondere Stuhlproben, die Verunreinigungen und Inhibitoren bzw. Störsubstanzen enthalten können. Weiterhin wird ein für die Durchführung des Verfahrens geeigneter Reagenzienkit beschrieben. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben, wobei man der Nukleinsäuren enthaltenden Probe einen Puffer zusetzt, der einen pH-Wert von 2 bis 7 hat, eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und eine phenolneutralisierende Substanz enthält. Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind auf vereinfachte Weise saubere und amplifizierbare Nukleinsäuren aus fäkalen Proben erhältlich, die zum diagnostischen Nachweis von Infektionen, insbesondere bakteriellen oder Virusinfektionen, oder von Mutationen, insbesondere von tumorspezifischen DNA-Mutationen verwendet werden können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung, Reinigung oder/und Isolie­ rung von Nukleinsäuren aus Materialproben, insbesondere Stuhlproben, die Ver­ unreinigungen und Inhibitoren bzw. Störsubstanzen enthalten können. Weiterhin wird ein für die Durchführung des Verfahrens geeigneter Reagenzienkit beschrie­ ben.

Zahlreiche Beispiele aus verschiedenen Forschungsbereichen belegen die Be­ deutung der Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien, die mit Substanzen verunreinigt sind, welche Nukleinsäuren während der Lagerung schä­ digen und eine enzymatische Manipulation der Nukleinsäuren, z. B. Verdau mit Restriktionsenzymen oder Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hemmen. Daher ist es für die Brauchbarkeit der in den biologischen Materialien enthaltenen Nukleinsäuren für weitere Analysen wichtig, daß diese Substanzen nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind oder gänzlich aus der Probe entfernt werden.

Eine besondere Bedeutung besitzt die Analyse von Nukleinsäuren aus fäkalen Proben. Eine wichtige medizinische Anwendung ist der Nachweis tumorspezifi­ scher Veränderungen nukleärer Human-DNA aus Stuhl, die als Parameter bei der Frühdiagnose von Tumoren des Verdauungstraktes dienen können. Ebenso ge­ winnt der Nachweis bakterieller und viraler Infektionserreger aus Stuhlproben durch auf Nukleinsäuren basierende Testverfahren zunehmend an Bedeutung.

Für die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Stuhlproben ist die Anwendung einer Kombination verschiedener Reinigungsschritte wie Protease-Behandlung, Phe­ nol/Chloroform-Extraktion, Bindung von Nukleinsäuren an Silika in Anwesenheit chaotroper Salze, Gelfiltration, Anionenaustauschchromatographie sowie Einsatz kationischer Detergentien bekannt. Die mit diesen Verfahren aus Stuhlproben iso­ lierten Nukleinsäuren sind jedoch im allgemeinen instabil und verhalten sich oft­ mals problematisch in nachfolgenden enzymatischen Reaktionen wie z. B. PCR.

Ursache hierfür sind Substanzen, die zusammen mit der Nukleinsäure isoliert werden und diese schädigen sowie enzymatische Reaktionen inhibieren. Im Stuhl enthaltene Inhibitorklassen sind - soweit bekannt - Hämoglobin und dessen Meta­ boliten, Gallensäuren und Gallensäurenderivate sowie Polysaccharide. Im Stand der Technik finden sich verschiedene Lösungsvorschläge für dieses Problem, die jedoch keine befriedigenden Ergebnisse liefern (Deuter et al., Nucleic Acids Res. 1995, 23: 3800-3801; van Zwet et al., J. Clin. Microbiol. 1994, 32: 1346-1348; Wilde et al., J. Clin Microbiol. 1990, 28: 1300-1307; Hopwood et al., Int. J. Legal Med. 1996, 108: 237-243; Sidransky et al, Science 1992, 256: 103-105; Rama­ murthy et al., J. Clin. Micorbiol. 1993, 31: 3068-3070; Monteiro et al., J. Clin. Microbiol. 1997, 35: 995-998; Uwatoko et al., Vet. Microbiol. 1996, 52: 73-79; Tuchili et al., J. Vet. Med. Sci. 1996, 58: 881-884; Pantosti et al., J. Clin. Microbiol. 1997, 35: 2482-2486, US 4,935,342; WO 93/20235). In der Regel wird die Probe in alkalischem Milieu aufgearbeitet.

Sivolap et al., Chem. Absir. 1992, 117: 206001u beschreiben den Zusatz phenol­ neutralisierender Substanzen bei der Isolierung von DNA aus Pflanzenmaterial. Chung et al., Chem. Abstr. 1997, 127: 146699x beschreiben die Extraktion von DNA aus Pflanzenmaterial mit einem basischen Puffer.

In WO 97/07239 wird ein Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolie­ rung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien, insbesondere Fäkalien, be­ schrieben, bei dem man einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe aus biologi­ schen Materialien eine Adsorptionsmatrix zur Bindung von Verunreinigungen zu­ setzt. Vorzugsweise verwendet man eine Adsorptionsmatrix auf Kohlenhydratba­ sis, z. B. Stärke, Zellulose, Glycogen, oder/und andere biogene oder nicht biogene Kohlenhydrate oder Mischungen davon, wobei Mehle aus Getreide, Erbsen, Mais, Kartoffeln oder Bestandteile daraus oder Mischungen bevorzugt sind. Mit dem in der WO 97/07239 offenbarten Verfahren werden in manchen Fällen jedoch die Nukleinsäuren schädigenden Substanzen nicht vollständig entfernt.

Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens offenbart die DE 199 00 628.5. Dort wird ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien beschrieben, bei dem man der Nukleinsäuren enthaltenden Probe außer der Ad­ sorptionsmatrix zur Bindung von Verunreinigung einen definierten Puffer zusetzt, wobei der Puffer dadurch gekennzeichnet ist, daß er einen sauren bis neutralen pH-Wert sowie einen hohen Salzgehalt hat und eine phenolneutralisierende Sub­ stanz enthält. Dieses Verfahren liefert zwar Nukleinsäuren in befriedigender Rein­ heit, hat aber den Nachteil, daß die beschriebene Adsorptionsmatrix stark quillt und die Homogenisierung erschwert. Dies ist insbesondere nach Einwirkung von Hitze der Fall, die zur Lyse von Bakterien, Viren und anderen Pathogenen vorteil­ haft ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung eines ver­ besserten Verfahrens zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, das die beschriebenen Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren überwindet.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus inhibitorischen Proben verbessert werden kann, indem ein definierter Puffer verwendet wird, ohne daß der Probe eine wie in der WO 97/07239 oder DE 199 00 628.5 beschriebene Adsorptionsmatrix zur Bindung von Verunreinigungen zu­ gesetzt werden muß.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben, wobei man der Nu­ kleinsäuren enthaltenden Probe einen Puffer zusetzt, der

• a) einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
• b) eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und
• c) eine phenolneutralisierende Substanz enthält,

wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß der Probe, dem Gemisch aus Probe und Puffer oder einem daraus abgeleiteten Homogenat, Lysat oder Extrakt keine Adsorptionsmatrix auf der Basis von Kohlenhydraten zugesetzt wird.

Solche Adsorptionsmatrices zur Bindung von Verunreinigungen werden in den Patentanmeldungen WO 97/07239 und DE 199 00 628.5 beschrieben, auf die vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Der Puffer hat dabei vorzugsweise eine Salzkonzentration von 100 mM bis maxi­ mal zur Löslichkeitsgrenze des verwendeten Salzes. Bevorzugte Bereiche sind 100 mM bis 2,5 M, besonders bevorzugt 250 bis 2,5 M, besonders bevorzugt 300 mM bis 1,5 M, besonders bevorzugt 300 mM bis 700 mM. Ein besonders bevor­ zugter Bereich ist 400 mM bis 600 mM. Vorzugsweise wird als Salz ein Alkalihalo­ genid, z. B. NaGt oder KCl oder Gemische davon verwendet.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform wird LiCl als Salz benutzt. Als Konzentration kann 100 mM bis zur Löslichkeitsgrenze eingesetzt werden. Bei der Verwendung von LiCl ist eine Konzentration von 0,5 M bis zur Löslichkeitsgrenze, besonders vorteilhaft von 0,5 bis 2,5 M bevorzugt.

In einer weiteren Ausgestaltungsform enthält der erfindungsgemäße Puffer min - destens 0,1% (GewNol) eines Detergenz, bevorzugt mindestens 0,5%. Als De­ tergens kommt vorzugsweise ein ionisches Detergenz zur Anwendung, insbeson­ dere Natrium-dodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 bis 5% (Gew/Vol), besonders bevorzugt 0,5 bis 5% (Gew/Vol), ganz besonders bevor­ zugt 1 bis 2% (Gew/Vol).

In einer weiteren Ausgestaltungsform kann der erfindungsgemäße Puffer 1 bis 200 mM, vorzugsweise 10 mM oder mehr als 10 mM, besonders bevorzugt min­ destens 20 mM eines Chelatbildners enthalten. Ein besonders bevorzugter Be­ reich ist 25 bis 75 mM. Bevorzugt ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder ein Salz davon, bevorzugt das Dinatriumsalz.

Der erfindungsgemäße Puffer weist bevorzugt einen pH-Wert von mehr als 3, aber weniger als 7, bevorzugt von 4 bis 6,5, besonders bevorzugt von 5 bis 6 auf. Als günstig hat sich dabei die Verwendung von Acetatpuffern, z. B. Essigsäure/Na- Acetat (NaAc) erwiesen. Es können jedoch auch andere Puffer, z. B. Phosphat- oder Citratpuffer, eingesetzt werden.

Der erfindungsgemäße Puffer enthält bevorzugt mindestens eine phenolneutrali­ sierende Substanz. Bevorzugte Beispiele für Substanzen, die Phenole neutralisie­ ren können, sind Polyvinylpyrrolidon (Poly(1-vinyl-2-pyrrolidon), PVP, CAS 9003- 39-8; zu beziehen z. B. über Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA) in unterschiedlichen Polymerisationsgraden, z. B. PVP-10 (PVP mit einem durch­ schnittlichen Molekulargewicht von 10.000), Reduktionsmittel, z. B. Thiolreagen­ zien wie β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, oder Borate. Bevorzugt ist ein Puffer, der mindestens 0,5% Polyvinylpyrrolidon als phenolneutralisierende Sub­ stanz enthält. Bevorzugte Konzentrationsbereiche sind 1-30% (Gew/Vol), bevor­ zugt 2-15%, besonders bevorzugt 4-10% PVP.

Der erfindungsgemäße Puffer ist vorzugsweise ein Lysepuffer, d. h. er hat bevor­ zugt eine Zusammensetzung, die eine Lyse von Zellen bewirkt, insbesondere eine Lyse der Zellen, die die Nukleinsäuren enthalten, die im gegebenen Fall von In­ teresse sind. Dem Fachmann sind die Bedingungen bekannt (z. B. Ionen- und/oder Detergenzkonzentrationen), bei denen die Lyse (d. h. Perforation, Zerstörung oder Auflösung der Zellmembranen und/oder Zellwände) der gewünschten Zellen wie Mikroorganismen, tierischen oder pflanzlichen Zellen eintritt.

Die Nukleinsäuren enthaltende Probe stammt bevorzugt aus Materialien, die Nu­ kleinsäure abbauende bzw. enzymatische Reaktionen hemmende Verunreinigun­ gen enthalten. Insbesondere hemmen solche Verunreinigungen die enzymatische Aktivität von Restriktionsenzymen und Enzymen, die für die Polymerase-Kettenke­ aktion (PCR) verwendet werden. Vorzugsweise stammt die Probe aus Fäkalien. Sie kann jedoch auch aus anderen Quellen stammen, beispielsweise tierischen oder pflanzlichen Geweben, Gewebe- oder Zellkulturen, Knochenmark, humanen und tierischen Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Sperma, Zere­ brospinalflüssigkeit, Sputum und Abstrichen, Pflanzen, Pflanzenteilen und -ex­ trakten, z. B. Säften, Pilzen, prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorga­ nismen wie Bakterien oder Hefen, fossilen oder mumifizierten Proben, Bodenpro­ ben, Klärschlamm, Abwässern und Lebensmitteln (insbesondere prozessierten, d. h. technisch aufbereiteten Lebensmitteln). Die Proben können wasserunlösliche Bestandteile enthalten.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren wie vorstehend beschrie­ ben, bei dem das Gemisch aus Probe und Puffer oder ein daraus abgeleitetes Homogenat, Lysat oder Extrakt bei mindestens 50°C inkubiert wird.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens wie vorstehend beschrieben zur Analyse, zum Nachweis oder zur Isolierung von Nu­ kleinsäuren aus Stuhlproben.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Reagenzienkit zur Reinigung, Stabili­ sierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien, ent­ haltend einen Puffer wie vorstehend beschrieben, insbesondere einen Puffer, der

• 1. einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
• 2. eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und eine phenolneutralisierende Substanz enthält.

Das erfindungsgemäße Reagenzienkit ist dadurch gekennzeichnet, daß es keine Adsorptionsmatrix auf Kohlenhydratbasis enthält, wie sie in den Patentanmeldun­ gen WO 97/07239 und DE 199 00 628.5 beschrieben ist.

Der Puffer kann dabei in fertiger Form, als Konzentrat oder Lyophilisat vorliegen.

Vorzugsweise enthält das Reagenzienkit zusätzliche Mittel zur Reinigung von Nu­ kleinsäuren, die z. B. mineralische oder/und organische Träger sowiegegebenen­ falls Lösungen, Hilfsstoffe oder/und Zubehör umfassen. Solche Mittel sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. WO 95/01359) und kommerziell er­ hältlich. Mineralische Bestandteile von Trägern können beispielsweise poröse oder nicht-poröse Metalloxide oder Metallmischoxide, z. B. Aluminiumoxid, Titandi­ oxid, Eisenoxid oder Zirkoniumdioxid, Silicagele, Materialien auf Basis von Glä­ sern, z. B. modifizierte oder nicht-modifizierte Glaspartikel oder Glasmehl, Quarz, Zeolithe oder Mischungen von einer oder mehrerer der oben genannten Substan­ zen sein. Andererseits kann der Träger auch organische Bestandteile enthalten, die z. B. aus gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen modifizierten Latexparti­ keln, synthetischen Polymeren, wie etwa Polyethylen, Polypropylen, Polyvinyli­ denfluorid, insbesondere ultrahochmolekularem Polyethylen oder HD-Polyethylen, oder Mischungen von einer oder mehreren der zuvor genannten Substanzen aus­ gewählt werden.

Der Träger kann beispielsweise in Form von Partikeln mit einer mittleren Größe von 0,1 µm bis 100 µm vorliegen. Bei Verwendung eines porösen Trägers ist eine mittlere Porengröße von 2 µm bis 100 µm bevorzugt. Der Träger kann beispiels­ weise in Form loser Schüttungen von Partikeln, Filterschichten, z. B. aus Glas, Quarz oder Keramik, Membranen, z. B. Membranen, in denen ein Silicagel ange­ ordnet ist, Fasern oder Geweben aus mineralischen Trägern, wie etwa Quarz oder Glaswolle sowie in Form von Latices oder Frittenmaterialien aus synthetischen Polymeren vorliegen.

Außerdem kann das erfindungsgemäße Reagenzienkit auch Hilfsstoffe wie z. B. eine Protease wie Proteinase K, oder Enzyme und andere Mittel zur Manipulation von Nukleinsäuren enthalten, z. B. mindestens einen Amplifikationsprimer, und zur Amplifikation von Nukleinsäuren geeignete Enzyme, z. B. eine Nukleinsäurepoly­ merase oder/und mindestens eine Restriktionsendonuklease.

Die Primer zur Amplifikation von Nukleinsäuren stammen zweckmäßigerweise aus den zu analysierenden Genen, d. h. beispielsweise aus Onkogenen, Tumorsup­ pressorgenen oder/und Mikrosatellitenabschnitten, oder sie sind geeignet zur Amplifikation viraler oder bakterieller Nukleinsäuresequenzen. Zur Amplifikation von Nukleinsäuren geeignete Enzyme und Restriktionsendonukleasen sind be­ kannt und kommerziell erhältlich.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben mit den Schritten

• a) Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• b) Zusetzen eines Puffer, der
  einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
  eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und
  eine phenolneutralisierende Substanz enthält,

dadurch gekennzeichnet, daß der Probe, dem Gemisch aus Probe und Puffer oder einem daraus abgeleiteten Extrakt, Lysat oder Homogenat keine Adsorpti­ onsmatrix auf der Basis von Kohlenhydraten zugesetzt wird.

Bevorzugt handelt es sich dabei um eine Materialprobe, die Nukleinsäure abbau­ ende bzw. enzymatische Reaktionen hemmende Verunreinigungen enthält. Ins­ besondere hemmen solche Verunreinigungen die enzymatische Aktivität von Nu­ kleinsäure-interagierenden Enzymen, z. B. Nukleasen wie Restriktionsendonuklea­ sen, Reverse Transkriptasen, Nukleinsäure-Polymerasen, Ligasen etc., insbeson­ dere von Enzymen, die für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), LCR (Ligase chain reaction), NASBA (Nucleic Acid Base Specific Amplification) oder 3SR (Self sustained Sequence Replication) verwendet werden. Bevorzugte Ausführungs­ formen des Puffers sind dabei wie vorstehend beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein solches Verfahren mit den Schritten

• a) Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• b) Zusetzen eines Puffers, der einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat, eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und eine phenolneutralisierende Substanz enthält, und
• c) Homogenisierung des Gemisches aus Probe und Puffer.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein solches Verfahren mit den Schritten

• 1. Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• 2. Homogenisierung des Materials, und
• 3. Zusetzen eines Puffers, der einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7 hat, eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und eine phenolneutralisierende Substanz enthält.

Unter Homogenisierung soll eine mechanische, thermische, enzymatische oder chemische Zerkleinerung von Materialproben oder Probenbestandteilen, insbe­ sondere wasserunlöslicher Materialproben, verstanden werden. Zur Homogenisie­ rung können an sich bekannte Verfahren ausgeführt werden, z. B. unter Verwen­ dung eines üblichen Rüttelmischers für Mikrozentrifugationsgefäße (Vortex-Rütt­ ler), eines Ultraturrax oder Polytran, einer French Press, eines Potters, eines Mör­ sers, oder einer Kugelmühle.

In weiteren Schritten können unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation abge­ trennt, dem Extrakt eine Protease zugesetzt, oder/und der Extrakt auf 50°C er­ hitzt werden.

Die beschriebenen Schritte (Zugabe des erfindungsgemäßen Puffers, Homogeni­ sierung, Zentrifugation, Zugabe einer Protease, Erhitzen), soweit sie ausgeführt werden, können je nach Notwendigkeit in unterschiedlicher Reihenfolge erfolgen. So kann der gewonnenen, ggf. grob zerkleinerten Materialprobe zunächst der er­ findungsgemäße Puffer zugesetzt werden, woran sich ein Homogenisierungs­ schritt und dann ein Zentrifugationsschritt anschließen kann. Hat der Puffer lyti­ sche Eigenschaften, müssen dabei andere Zentrifugationsbedingungen angewen­ det werden, als wenn der Puffer nichtlysierend ist und die Zelllyse erst in einem späteren Verfahrensschritt erreicht wird, da im letzteren Fall darauf geachtet wer­ den muß, daß die Zellen, die die gewünschten Nukleinsäuren enthalten, nicht bei der Zentrifugation verloren gehen. Sollen dagegen beispielsweise Nukleinsäuren aus Viren isoliert werden, die in der Materialprobe extrazellulär vorliegen, kann es wünschenswert sein, einen nichtlytischen Puffer zu verwenden und nach der Zu­ gabe des Puffers und Homogenisierung in der Probe enthaltene Zellen zusam­ men mit anderen unlöslichen Bestandteilen durch Zentrifugation abzutrennen.

An den Aufschluß der Materialprobe in der oben beschriebenen Weise kann sich eine chromatographische Aufreinigung bzw. Isolierung der Nukleinsäuren in an sich bekannter Weise anschließen, z. B. über eine Silicagelmembran in einer Zen­ trifugationssäule in Gegenwart chaotroper Salze.

Ein Weg, die Erfindung auszuführen, besteht darin, eine Materialprobe mit dem erfindungsgemäßen Puffer zu versetzen und das Gemisch, sofern notwendig, zu homogenisieren. Zur Homogenisierung kann z. B. ein Vortex-Rüttler verwendet werden. Diese Schritte können bei Raumtemperatur oder, bevorzugt, verringerter Temperatur, z. B. ≦ 10°C, insbesondere ≦ 4°C erfolgen. Nach einer ggf. erfolgten Homogeniserung können unlösliche Bestandteile abgetrennt werden. Sind die Zellen zu diesem Zeitpunkt bereits lysiert, z. B. weil der erfindungsgemäße Puffer lytische Eigenschaften hat, können die unlöslichen Bestandteile z. B. durch Zen­ trifugation für 1 bis 5 min bei 10.000 bis 25.000 × g, vorzugsweise bei 20.000 × g abgetrennt werden.

Es kann notwendig sein, den so erhaltenen Extrakt bzw. das so erhaltene Lysat unter Bedingungen zu inkubieren, die für eine Freisetzung der Nukleinsäuren aus dem Probenmaterial förderlich sind. Solche Inkubationsbedingungen werden ins­ besondere dann verwendet, wenn Nukleinsäuren aus "schwer" aufschließbaren Materialien, z. B. Bakterien oder Parasiten oder Viren nachgewiesen werden sol­ len. In diesem Fall kann durch chemische, thermische und/oder enzymatische Behandlung die Freisetzung der Nukleinsäuren verbessert werden, wodurch eine höhere Ausbeute an Nukleinsäuren aus dem Probenmaterial sowohl hinsichtlich Gesamt-DNA als auch spezifisch hinsichtlich der nachzuweisenden DNA erhalten wird. Vorzugsweise wird hierbei eine Temperaturerhöhung, z. B. auf ≧ 50°C, ins­ besondere auf ≧ 70°C vorgenommen.

Wenn andererseits Nukleinsäuren aus leicht aufschließbaren Materialien, z. B. empfindlichen Zellen wie etwa Humanzellen bestimmt werden sollen, kann es vorteilhaft sein, den Prozeß der Extraktion und des Zellaufschlusses bei verrin­ gerter Temperatur, z. B. ≦ 10°C, insbesondere ≦ 4°C auszuführen, um auf diese Weise die unerwünschte Freisetzung anderer Nukleinsäuren in der Probe zu ver­ meiden oder einzuschränken.

Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Puffer führt zu einer sehr guten Stabilität der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren und bei einer anschließen­ den Isolierung der Nukleinsäuren zu einer besseren Reproduzierbarkeit, ohne die zusätzlichen Schritte der Zugabe, Inkubation und anschließender Abtrennung ei­ ner Adsorptionsmatrix zur Bindung von Verunreinigungen vornehmen zu müssen. Dies gilt insbesondere, wenn sich an die Isolierung eine enzymatische Manipula­ tion der Nukleinsäuren mit Nukleinsäure-interagierenden Enzymen anschließt, z. B. Nukleasen wie Restriktionsendonukleasen, Reverse Transkriptasen, Nuklein­ säure-Polymerasen, Ligasen etc. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wenn anschließend eine Amplifikation und/oder Restriktionsspaltung, z. B. Amplifikation durch PCR, LCR (Ligase chain reaction), NASBA (Nucleic Acid Base Specific Amplification) oder 3SR (Self sustained Sequence Replication) durchgeführt wird.

Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Analyse, der Nachweis oder die Isolierung von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, aus Stuhl­ proben. Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind auf vereinfachte Weise saubere und amplifizierbare Nukleinsäuren aus fäkalen Proben erhältlich, die zum diagnostischen Nachweis von Infektionen, insbesondere bakteriellen oder Virus­ infektionen, oder von Mutationen, insbesondere von tumorspezifischen DNA-Mu­ tationen verwendet werden können.

Die vorliegende Erfindung soll durch die nachfolgenden Abbildungen und Bei­ spiele erläutert werden.

Abbildungen

Abb. 1: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß Verfahren V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die Werte stellen Mittelwerte und mittlere Abweichung von den Gesamtausbeuten in µg dar. Die ersten beiden Nummern der Abszissenbeschriftung kodieren die jeweilige Stuhlprobe. Die Be­ zeichnung m. T. (mit Tablette) bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. T. (ohne Tablette) das Verfahren V3.

Abb. 2: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß Verfahren V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die ersten beiden Nummern der Abszissenbeschriftung kodieren die jeweilige Stuhlprobe. Die Bezeichnung m. T. bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. T. das Ver­ fahren V3. Zur Berechnung des Wertes delta Ct siehe Beispiel 2. Die PCR-Reak­ tion wurde in Anwesenheit von 10 ng BSA/µl ausgeführt (BSA = Rinderserumal­ bumin).

Abb. 3: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß Verfahren V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die Werte stellen Mittelwerte von den Gesamtausbeuten in µg dar. Die ersten beiden Nummern der Abszissenbe­ schriftung kodieren die jeweilige Stuhlprobe. Die Bezeichnung m. T. bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. T. das Verfahren V3.

Abb. 4: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß Verfahren V1, V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die er­ sten beiden Nummern der Abszissenbeschriftung kodieren die jeweilige Stuhl­ probe. Die Bezeichnung m. T. bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. T. das Verfahren V3. Zur Berechnung des Wertes delta Ct siehe Beispiel 2. Die PCR-Reaktion wurde in Anwesenheit von 10 ng BSA/µl ausgeführt (BSA = Rin­ derserumalbumin).

Abb. 5: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß Verfahren V1, V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die Werte stellen Mittelwerte von den Gesamtausbeuten in µg dar. Die ersten beiden Nummern der Abszissenbe­ schriftung kodieren die jeweilige Stuhlprobe. Die Bezeichnung m. T. bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. T. das Verfahren V3, und m. P. das Verfahren V1.

Abb. 6: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß Verfahren V1, V2 und V3 aus Beispiel 2 aus verschiedenen Stuhlproben. Die er­ sten beiden Nummern der Abszissenbeschriftung kodieren die jeweilige Stuhl­ probe. Die Bezeichnung m. T. bezeichnet das Verfahren V2 aus Beispiel 2, o. a. das Verfahren V3, und m. P. das Verfahren V1. Zur Berechnung des Wertes delta Ct siehe Beispiel 2. Die PCR-Reaktion wurde in Anwesenheit von 100 ng BSA/µl ausgeführt (BSA = Rinderserumalbumin).

Abb. 7: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit von der PVP-Konzentration des Puffers P1. Wert in µg Gesamt­ ausbeute. PVP-Konzentration in % (Gew/Vol). Stuhlprobe 27. Doppelbestimmung.

Abb. 8: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit von der PVP-Konzentration des Puffers P1. Stuhlprobe 27. 1 ng/µl BSA.

Abb. 9: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit von der PVP-Konzentration des Puffers P1. Wert in µg Gesamt­ ausbeute. PVP-Konzentration in % (Gew/Vol). Stuhlprobe 61. Doppelbestimmung.

Abb. 10: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit von der PVP-Konzentration des Puffers P1. Stuhlprobe 61. 1 ng/µl BSA.

Abb. 11: Ausbeuten der DNA-Isolierung gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers P1. Wert in µg Gesamtausbeute. Stuhlprobe 51. Doppelbestimmung.

Abb. 12: Inhibition der PCR-Reaktion durch DNA-Präparationen gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3 in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers P1. Stuhlprobe 51. 1 ng/µl BSA.

Beispiele Beispiel 1: DNA-Isolierung aus Stuhlproben

Menschliche Stuhlproben wurden gesammelt, eingefroren und bei -20°C aufbe­ wahrt. 200 mg Stuhl wurden in einem 2 ml-Mikrozentrifugengefäß abgewogen und auf Eis gekühlt. Dann wurde die Stuhlprobe in 1600 µl Puffer P1 (100 mM NaAc pH 5,5, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 2% (Gew/Vol) PVP-10, 1,4% (Gew/Vol) SDS) aufgenommen und die Mischung durch Vortexbehandlung für 1 min homo­ genisiert. Das Lysat wurde für 3 min zur Präzipitation von Stuhlpartikeln und ande­ ren Verunreinigungen bei 20.000 × g (14.000 rpm in der verwendeten Zentrifuge Eppendorf 5417C; Rotor FA 45-30-11) zentrifugiert. 1250 µl des Überstandes wurden in ein neues 2 ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und durch Invertieren gemischt. 600 µl dieses Lysats wurden in ein neues 2 ml-Mikrozentrifugationsge­ fäß überführt und mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Reinigungskit (QIAamp® DNA Mini Kit, Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) nach den Herstel­ lerangaben weiter aufgereinigt. Diese Reinigungsschritte schlossen die Zugabe von Proteinase-K, eine Inkubation von 10 min bei 70°C sowie die chromatogra­ phische Reinigung der Nukleinsäuren über eine Silicagelmembran in einer Zen­ trifugationssäule in Gegenwart chaotroper Salze ein. Das dabei erhaltene DNA- Eluat hatte ein Volumen von 200 µl.

Beispiel 2 DNA-Isolierung aus Stuhlproben mit und ohne Verwendung einer Kohlenhydratmatrix

Menschliche Stuhlproben wurden gesammelt, eingefroren und bei -20°C aufbe­ wahrt. DNA wurde aus insgesamt 16 verschiedenen Stuhlproben nach verschie­ denen Verfahren isoliert sowie anschließend mit Hilfe einer PCR-Methode ("Real­ time quantitative PCR"; SFV-TaqMan®-Reaktion; SFV = Semliki Forest Virus; Wang et Brown, Anal. Biochem. 1999, 269: 198-201; de Kok et al., Clin. Chem. 1998, 44: 2201-2204) quantitativ auf Inhibitoren untersucht.

V1-V3 : 1600 mg Stuhl wurden in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gekühlt. Dann wurde die Stuhlprobe in 12,8 ml Puffer P1 (100 mM NaAc pH 5,5, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 2% (Gew/Vol) PVP-10, 1,4% (Gew/Vol) SDS) aufgenommen und die Mischung durch Vortexbehandlung für 1 min homogeni­ siert. Zur Pelletierung nicht löslicher Bestandteile im Stuhl erfolgte eine Zentrifu­ gation für 3 min bei 5000 rpm (entspricht 5338 g in der verwendeten Zentrifuge Sigma 4K15, Rotor 1156). Der Überstand wurde in ein neues 50 ml Zentrifugen­ röhrchen überführt und erneut für 3 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird nachfolgend in ein weiteres 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und durch Invertieren gemischt. Das so erhaltene Lysat wird in Aliquots von 1400 µl in 2 ml- Mikrozentrifugengefäßen aufgeteilt für die folgenden drei Verfahren verwendet:

V1: 500 mg einer aus Kartoffelmehl und Zellulose bestehenden, pulverförmigen Adsorptionsmatrix (im Mischungsverhältnis 3 : 1 [Gew/Gew]) wurden dem Lysat zugefügt und durch Vortexbehandlung für 1 min resuspendiert.

V2: 500 mg einer aus Kartoffelmehl und Zellulose bestehenden, tablettenförmi­ gen Adsorptionsmatrix (im Mischungsverhältnis 3 : 1 [Gew/Gew]; plus Mg-Stearat als Tablettierungshilfsstoff) wurden dem Lysat zugefügt und durch Vortexbehand­ lung für 1 min resuspendiert.

V3: Dem Lysat wurde keine Adsorptionsmatrix zugefügt.

Die weitere Prozessierung in allen drei Verfahren war identisch. Die Suspension (V1 und V2) bzw. das unbehandelte Lysat (V3) wurden für 3 min zur Präzipitation von Stuhlpartikeln, der Adsorptionsmatrix und anderen Verunreinigungen bei 20.000 × g (14.000 rpm in der verwendeten Zentrifuge, siehe Beispiel 1) zentrifu­ giert. Der Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugationsgefäß überführt und für weitere 3 min zentrifugiert. 600 µl des Überstands der zweiten Zentrifugation wurden in ein neues 2 ml-Mikrozentrifugationsgefäß überführt und mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Reinigungskit (QIAamp® DNA Mini Kit, Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) nach den Herstellerangaben weiter aufgereinigt. Diese Reinigungsschritte schlossen die Zugabe von Proteinase-K, eine Inkuba­ tion von 10 min bei 70°C sowie die chromatographische Reinigung der Nuklein­ säuren über eine Silicagelmembran in einer Zentrifugationssäule in Gegenwart chaotroper Salze ein. Das dabei erhaltene DNA-Eluat hatte ein Volumen von 200 µl.

Die DNA-Eluate aus den Verfahren V1, V2, und V3 wurden mit Hilfe einer SFV- TaqMan-Reaktion (TaqMan®, Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA, USA) quantitativ auf Inhibitoren untersucht (PCR über 50 Cyclen). Dazu wurden einem PCR-Mastermix pro Ansatz 1000 Kopien des Plasmids pSFV1 (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA) zugefügt, welches stuhlfremde Se­ quenzen des Semliki Forest Virus trägt. Das Amplikon ist im nsP1-Leseraster des Plasmids lokalisiert. Der Mastermix enthält desweiteren 1x TaqMan BufferA (Perkin Elmer), 3 mM MgCl₂ (Perkin Eimer), 200 µM dATP, dCTP, dGTP, 400 µM dUTP (Perkin Elmer), je 300 µM Primer, 100 µM Probe, 1-10 ng/µl BSA (New England Biolabs BSA007), 0,025 U/µl Amplitaq Gold (Perkin Elmer) und 0,01 U/µl UNG (Perkin Elmer). Im Gesamtvolumen von 25 µl waren außerdem 5 µl DNA- Eluat aus Stuhl enthalten. Waren inhibitorische Substanzen im Stuhl enthalten, wurde die Amplifikation des SFV-Amplikons verzögert (steigende Ct-Werte) und im Extremfall vollständig inhibiert (Ct = 50). Als Positivkontrolle wurde anstelle der DNA-Eluate 5 µl des in allen Verfahren verwendeten Elutionspuffers P2 (10 mM Tris/HCl pH 9.0, 0,5 mM EDTA) verwendet (Ct-Werte von ca. 30). Jede DNA-Iso­ lierung erfolgte in Doppelwerten. Von jedem Eluat wurden 3 TaqMan-Reaktionen angesetzt. Aus den so erhaltenen 6 Ct-Werten wurden Mittelwerte berechnet (MW-Ct). Das Maß der Inhibition wurde als Differenz aus MW-Ct_Eluat minus MW- Ct_P2 ( = ΔCt, delta Ct) berechnet. Nicht inhibitorische Eluate weisen demnach ΔCt- Werte von 0 (in der Praxis ± 1), vollständig inhibitorische DNA-Eluate hingegen ΔCt-Werte von 16 bis 20 auf.

Überraschenderweise zeigte sich, daß es für die Abtrennung inihibitorischer Ver­ unreinigungen entbehrlich ist, bei der Probenaufarbeitung eine Adsorptionsmatrix zuzufügen (Verfahren V1, V2), wenn man den erfindungsgemäßen Puffer benutzt (Verfahren V3). Die Ergebnisse für Gesamtausbeute und Inhibitorgehalt zeigen die Abb. 1 bis 6.

Beispiel 3 DNA-Isolierung aus Stuhlproben in Abhängigkeit verschiedener Parameter des Puffers

DNA wurde aus Stuhlproben gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 isoliert. Dabei wurde im Puffer P1 in einer Serie von Experimenten die Konzentration an Poly­ vinylpyrrolidon variiert (0 bis 30%), in einer zweiten Serie von Experimenten der pH-Wert des Puffers (pH 3 bis 11,2). Die Ergebnisse für Gesamtausbeute und Inhibitorgehalt zeigen die Abb. 7 bis 12.

Claims (16)

1. Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben, wobei man der Nukleinsäuren enthaltenden Probe einen Puffer zusetzt, der

• a) einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
• b) eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und
• c) eine phenolneutralisierende Substanz enthält,

dadurch gekennzeichnet, daß der Probe, dem Gemisch aus Probe und Puffer oder einem daraus abgeleiteten Homogenat, Lysat oder Extrakt keine Adsorp­ tionsmatrix auf der Basis von Kohlenhydraten zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer eine Salzkonzentration von mindestens 250 mM, vorzugsweise mindestens 300 mM hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das im Puf­ fer enthaltene Salz LiCl, NaCl oder/und KCl ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das im Puffer enthaltene Salz LiCl ist und in einer Konzentration von 0,5 bis zur Löslichkeitsgrenze, bevorzugt 0,5 bis 2,5 M vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer zusätzlich mindestens 0,1% (Gew/Vol) eines Detergenz enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer zusätzlich mindestens 10 mM, vorzugsweise mindestens 20 mM ei­ nes Chelatbildners enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer einen pH-Wert von mehr als 3, aber weniger als 7, bevorzugt von 4 bis 6,5, besonders bevorzugt von 5 bis 6 hat.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer mindestens 0.5% (Gew/Vol) Polyvinylpyrrolidon als phenolneutrali­ sierende Substanz enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Polyvinylpyrrolidon im Puffer 1-30% (Gew/Vol), bevorzugt 2-15%, be­ sonders bevorzugt 4-10% beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren enthaltende Probe aus Fäkalien, tierischen oder pflanzlichen Geweben, Gewebe- oder Zellkulturen, Knochenmark, humanen und tierischen Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Sperma, Zerebrospinalflüs­ sigkeit, Sputum und Abstrichen, Pflanzen, Pflanzenteilen und -extrakten, z. B. Säften, Pilzen, prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen, fossilen oder mumifizierten Proben, Bodenproben, Klär­ schlamm, Abwässern oder Lebensmitteln stammt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das Gemisch aus Probe und Puffer oder ein daraus abgeleitetes Homogenat oder Extrakt bei mindestens 50°C inkubiert wird.

12. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Analy­ se, zum Nachweis oder zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Stuhlproben.

13. Reagenzienkit zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nuklein­ säuren aus biologischen Materialien, enthaltend einen zur Aufnahme einer Nu­ kleinsäure enthaltenden Probe geeigneten Puffer wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, nicht aber eine Adsorptionsmatrix auf Kohlenhydratbasis.

14. Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder/und Isolierung von Nukleinsäuren aus Materialproben mit den Schritten

• a) Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• b) Zusetzen eines Puffers, der
  einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
  eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und
  eine phenolneutralisierende Substanz enthält,
  dadurch gekennzeichnet, daß der Probe, dem Gemisch aus Probe und Puffer oder einem daraus abgeleiteten Extrakt, Lysat oder Homogenat keine Adsorp­ tionsmatrix auf der Basis von Kohlenhydraten zugesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14 mit den Schritten

• a) Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• b) Zusetzen eines Puffers, der
  einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weniger als 7, hat,
  eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und
  eine phenolneutralisierende Substanz enthält, und
• c) Homogenisierung des Gemisches aus Probe und Puffer.

16. Verfahren nach Anspruch 14 mit den Schritten

• a) Gewinnung einer Probe aus Nukleinsäuren enthaltendem Material,
• b) Homogenisierung des Materials, und
• c) Zusetzen eines Puffers, der einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise weni­ ger als 7 hat, eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM hat, oder/und eine phenolneutralisierende Substanz enthält.