EP2299985A1 - Diagnostisches reagens, enthaltend biopartikel, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als interner standard in nukleinsäurepräparations- und nukleinsäurenachweis-verfahren - Google Patents

Diagnostisches reagens, enthaltend biopartikel, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als interner standard in nukleinsäurepräparations- und nukleinsäurenachweis-verfahren

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EP2299985A1
EP2299985A1 EP09753787A EP09753787A EP2299985A1 EP 2299985 A1 EP2299985 A1 EP 2299985A1 EP 09753787 A EP09753787 A EP 09753787A EP 09753787 A EP09753787 A EP 09753787A EP 2299985 A1 EP2299985 A1 EP 2299985A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
diagnostic reagent
preparation
pcr
bioparticles
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Pending
Application number
EP09753787A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Himmelreich
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Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
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Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
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    • A61K9/2068—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals

Definitions

  • An example of simply feline cells are white blood cells These can be comparatively gently lysed, for example by the enzyme proteinase K in the presence of a detergent (eg sodium dodecyl sulfate or Triton X-1 00) At each Zell ⁇ uf gleich nucleic acids are sheared and fragmented by Doppelstr ⁇ ngbruche in Erbm ⁇ te ⁇ l, However, the fragmentation of genetic information is not so extensive that thereby the desired analyzes were at risk.
  • a detergent eg sodium dodecyl sulfate or Triton X-1 00
  • cells that are difficult to break up are to be lysed, this is done, for example, by adding heat. Then, cells that are difficult to break up are treated for 1 0 minutes at 95 ° C. Typically, many bacteria are lysed with the aid of heat.
  • LoC lab-on-a-ch ⁇ p
  • LoC ie disposable consumables as a laboratory on a chip in the size of a credit card
  • molecular biological determinations For example, the determination of pathogens of an infection, food control, veterinary diagnostics, analysis of biological warfare agents, environmental analysis
  • LoC Only a small amount of personnel and no special training or training is required to operate LoC become a large-scale operator
  • Em LoC combines microfluidic functions for sample extraction and enrichment of the analyte, for signal amplification (amphfication) and detection in one chip.
  • the operation of the LoC and the control unit is very simple and the analysis is extremely fast compared to conventional
  • Fungi, parasites, eukaryotic cells or plant cells or also called spores Fungi, parasites, eukaryotic cells or plant cells or also called spores. It is described as particularly advantageous that both the nucleic acid preparation and the amplification can be checked by direct addition of the cells to the test sample. Genetically modified cells (i.e., those into which the control DNA sequence has been engineered by genetic engineering) or natural cells, such as those of the invention, can be used. For example, spores of B. globigii can be used as control cells. Solid preparations are not disclosed, but suspensions containing the genetically modified spores by introducing the control DNA.
  • the object of the invention is to provide a suitable internal standard for the problems described To provide nuclear acidification and nuclear acid detection methods
  • the dyes are added to the mixture for the preparation of the reagent according to the invention either as solids or in the form
  • gentian violet solution in water
  • fuchsine solution in ethanol
  • eosin solution in water
  • methylene blue solution in 95% ethanol
  • malachite green solution may be added
  • solutions are commercially available, for example from Fluka or Sigma-Ald ⁇ ch
  • the reagent may also contain anti-foaming agents. These are suitably selected from the known anti-foaming agents
  • the reagent according to the invention may also contain particles of a hard material such as glass, silicon carbide or zirconium carbide. Magnetic silica particles or anion exchange resin particles are also suitable. The diameter of these particles is preferably from 1 00 to 800 nm Reagent very difficult to lyse microorganisms, especially certain bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium phlei, yeast fungi; or spores of Bacillus anthracls.
  • glass particles with different diameters are used:
  • the preparation of the reagent can be carried out by the ingredients, some of which are also in liquid form, for. B, mixed with a spatula or any mixers and optionally with distilled water until a viscous to viscous homogeneous mass is formed.
  • the microorganisms to be incorporated are added to the other constituents in the form of a bacterial culture fluid or a suspension of microorganisms such as, for example, phage supernatant.
  • the order of addition only matters if the reagent is to additionally contain hard particles too long stirring In this case, the bacteria can already be lysed by grinding effects, so the suspension of microorganisms in this case is added as the very last ingredient and also very carefully mixed with the other ingredients. Otherwise, the order of addition and mixing of the individual components is irrelevant
  • the resulting viscous mass is z B in a syringe überschreibt and with a blunt cannula (z B as small balls (diameter z B 1 -2 mm)) on a suitable film such as parafilm or polyethylene film or Teflonfohe applied in portions and then at
  • microfluidic preparation and detection methods where they can be added to the sample to be prepared by placing them on the microfluidic device.
  • the reagent according to the invention in the microfluidic device such that it can be used the task of the sample to be prepared is suspended in this and then further prepared together with it, ie as part of a LoC or a detection Cart ⁇ dge
  • buffer G GITC (guanidinium thiocyanate) / Nonidet® (nonylphenyl ethylene glycol)
  • GITC guanidinium thiocyanate
  • Nonidet® nonylphenyl ethylene glycol
  • the temperature and time for incubation is suitably selected Since some lysis procedures using enzymes, the selected temperature is also Depending on the activity of the enzymes zymolase, lyticase and lysozyme are usually used in the temperature range of 20 0 C - 37 0 C Incubation with proteases, such as proteinase K or subtilisin, is usually at 50 - 60 0 C The duration The incubation is generally 5 to 20 minutes, preferably about 10 minutes. The incubation may be carried out in one
  • Thermomixer done by Schuttein, z B at about 1 400 rpm, or on a Vortex® device (maximum power level)), optionally with the addition of glass beads, the inventive preparation itself already particles of a hard material and / or enzymes to support may contain the lysis
  • nucleic acids liberated by the lysis are isolated by any purification method known in the art.
  • a suitable solvent can be added to the resulting mixture, for example ethanol.
  • the nucleic acids contained in the lysate are generally purified by adsorption
  • filter elements which are formed, for example, from silica gel and which on the one hand are porous or mat-like in order to allow a liquid to pass through the filter element. and, on the other hand, have a surface to which the biomolecules bind in a specific or nonspecific process.
  • biomolecules on filter elements are simply retained by the effect of large exclusion.
  • a vessel which is open and closed at the top, At the bottom of the vessel is a membrane as a filter element, Below the membrane is an opening in the form of a nozzle, which with, for example, a hose connected is. Liquid can be sucked out of the vessel via this hose
  • wash buffers are added from above into the vessel and aspirated down out of the vessel or centrifuged.
  • the wash buffer maintains this binding while simultaneously washing unwanted cell constituents out of the membrane
  • Membrane acting as a filter A membrane serving as a filter has a certain dead volume of, for example, 40 ⁇ l. It can therefore not be prevented that a corresponding amount of ethanol always remains in the filter. On the one hand, ethanol contributes undesirably to binding. On the other hand, ethanol can also falsify the result of a later analysis.
  • ethanol is first removed, for example, by centrifuging the vessel. The ethanol escapes from the membrane and can be removed downwards. Thereafter, the membrane is sufficiently free of ethanol. By means of vacuum and heat supply, ethanol can alternatively be removed from the membrane. To remove the nucleic acid from the membrane is eluted. This is done regularly with water or a weak saline wass ⁇ gen pH-stabilized solution Following the elution, the nucleic acid can be removed through the membrane from the vessel downwards.
  • Ethanol usually centrifuging again after each washing step to remove the washing buffers.
  • the buffer TE 10 mM Tris / Cl pH 8.0; 1 mM EDTA
  • the primers can be prepared synthetically by methods known to those skilled in the art or are commercially available from the companies Operon or MWG Biotech
  • the tablet was prepared in exactly the same way as tablet C with the exception that 1 ml of page supernatant solution was replaced by 1 ml bidistilled water. After drying, 4 .mu.l of phage supernatant solution (obtained as described above) were pipetted onto each dried tablet and dried again overnight in a fume hood.
  • the results are shown in FIG. 2.
  • the histogram shows the amount of C glutamicum DNA (in pg) detected by the PCR per reaction at a sample quantity of 4.
  • the Ct values in each case were in the RT-PCR Determined by fluorescence spectroscopy.
  • the respective initial concentration of DNA in the respective eluent was determined.
  • the values of the 4 different approaches and representations are within one standard deviation.
  • the amount of C, glutamicum is approximately the same in all samples and approaches. This shows that the inventive
  • Preparations of C, glutamicum were prepared according to the tablet formulation B (Example I b). In three independent determinations, in each case 1 preparation was mixed with 200 ⁇ l whole blood. Following the protocol of Example 2, the nucleic acids were prepared, and in each case with 2 ul eluate a quantitative duplex RT-PCR with the specific for C.
  • the cell numbers used were a) 5 ⁇ 10 5 b) 1 ⁇ 10 6 c) 5 ⁇ 10 4 d) 1 ⁇ 10 4 e) 5 ⁇ 10 3 f) 1 ⁇ 10 3
  • 1 tablet C was mixed with 1 40 .mu.l of plasma and 560 .mu.l of buffer AVL for 2 minutes at 1400 rpm in the Thermomixer until the tablet was dissolved. Then lysed for 10 minutes under normal conditions with the addition of 560 .mu.l of ethanol on a Vortex® device Das Mixture was placed on a QIAamp column twice for binding and centrifuged at 6000 xg for 1 minute.
  • FIG. The figure shows the development of the fluorescence signal as a function of the number of the PCR cycle, 24 individual samples are shown simultaneously, the mean value of the 24 quantitative PCRs is 1.7.8 and the coefficient of variation CV.sub.2, 1%.
  • the example shows that the preparations according to the invention are outstandingly suitable in a reproducible manner for use as internal standard in RNA preparation and subsequent RNA amplification methods.

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Abstract

Offenbart werden ein diagnostisches Reagenz in Form einer bei Normalbedingungen formstabilen Zusammensetzung, enthaltend mindestens Biopartikel, ausgewählt aus der aus Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Sporen, Parasiten, Pflanzenzellen, tierischen oder menschlichen Zellen, Gameten, Plasmiden und Viroiden bestehenden Gruppe, sowie übliche pharmazeutische Hilfsstoffe, ein Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung als interner Standard in Nukleinsäurepräparations-und Nukleinsäurenachweis -Verfahren, ein Verfahren zum Nachweis der Biopartikel sowie ein Kit-of-parts, enthaltend dieses diagnostische Reagenz.

Description

DIAGNOSTISCHES REAGENS, ENTHALTEND BIOPARTIKEL, VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG UND SEINE VERWENDUNG ALS INTERNER STANDARD IN NUKLEINSÄUREPRÄPARATIONS- UND NUKLEINSÄURENACHWEIS-VERFAHREN
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betriff! ein diagnostisches Reagenz in Form einer bei Normalbedingungen formstabilen Zusammensetzung, die mindestens eine Art Biopartikel, ausgewählt aus der aus Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Sporen, Parasiten, Pflanzenteilen, tierischen oder menschlichen Zellen, Gameten, Plasmiden und Viroiden bestehenden Gruppe sowie übliche pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als interner Standard in Nukleinsaurepraparations- und Nuklemsaurenachweis-Verfahren, insbesondere in mikrofluidischen Vorrichtungen Weiter betrifft die Erfindung ein Kιt-of-parts, enthaltend das diagnostische Reagenz, sowie ein Verfahren zum Nachweis der genannten Biopartikel unter Verwendung des diagnostischen Reagenz
Hintergrund der Erfindung
Es ist zunehmend von großer Bedeutung, Biopartikel wie Bakterien, Viren, Pilze, Protozoen oder ahnliche in Proben unterschiedlicher Herkunft nachzuweisen So ist es beispielweise für die Auswahl eines geeigneten Behandlungsverfahrens oder Therapeutikums für an Infektionen erkrankte Patienten sehr bedeutsam, zu bestimmen, welcher Krankheitserreger vorliegt Bisher wurden z B bei Verdacht auf bakterielle Infektionen zu diesem Zweck häufig Proben wie z B Blut-oder Urinproben inkubiert und nach einigen Tagen anhand langwieriger Tests mit verschiedenen Antibiotika bestimmt, welche Erreger vorliegen und welche Therapeutika ggf geeignet zur Behandlung waren Häufig wird dadurch wertvolle Zeit verloren Auch ist es zunehmend wichtig, Biopartikel in Proben wie Lebensmitteln, Trinkwasser o a zur Qualitätskontrolle nachzuweisen Auch die Anschlage mit dem Anthrax (Milzbrand)-Erreger Bacillus anthracis in den USA haben verdeutlicht, dass sehr schnelle und zuverlässige Analyseverfahren für Mikroorganismen dringend notwendig sind
Es bestehen daher schon seit längerer Zeit Bestrebungen, schnellere Diagnoseverfahren zu entwickeln, die schon nach einigen Minuten oder Stunden die Bestimmung von Erregern ermöglichen
Eine Möglichkeit dafür besteht darin, die Nukleinsäuren der in einer Probe enthaltenen Erreger freizusetzen, diese anschließend spezifisch zu amplifizieren und dann nachzuweisen Hierzu sind folgende Schritte erforderlich
• Mateπalentnahme (z B Blut, Sputum, Urin, Faeces, Liquor, sowie Abstrichproben aus Mundhohle, Nasenraum, Genitaltrakt) • Lyse(Aufschlιeßen der Zellen)
• Nukleinsaure-Praparation
• Nukleinsaure-Amphfikation
• Dθtektion der amphfizierten Nukleinsäuren
Unter Aufschheßen/Lyse von Zellen wird das Aufbrechen von Zellen verstanden, wobei Nukleinsäuren aus Zellen freigesetzt werden Des weiteren werden Proteine aus dem Zellinneren freigesetzt
Zellen sind unterschiedlich schwierig aufzuschließen Kultivierte Zellkulturen können in der Regel einfach mit vergleichsweise die Erbinformation schonenden Mitteln lysierϊ werden Sporen sind dagegen vergleichsweise schwierig aufzuschließen Die für die Lyse von solchen Zellen benotigten Mittel brechen nicht nur die Zellen auf, sondern fragmentieren auch Erbinformationen in großem Ausmaß
Ein Beispiel für einfach aufzuschließende Zellen sind weiße Blutkörperchen Diese können vergleichsweise schonend lysiert werden, beispielsweise durch das Enzym Proteinase K in Anwesenheit eines Detergenz (z B Natrium Dodecylsulfat oder Triton X- 1 00) Bei jedem Zellαufschluss werden Nukleinsäuren geschert und durch Doppelstrαngbruche im Erbmαteπαl fragmentiert, Allerdings erfolgt die Fragmentierung der Erbinformation nicht derart umfangreich, dass dadurch die gewünschten Analysen gefährdet waren.
Je großer das Ausmaß an Fragmentierung der Nukleinsäuren ist, umso problematischer ist es, die gewünschten Analysen durchzufuhren. Es ist also ein Ziel bei dem Aufschluss von Zellen, Doppelstrangbruche auf ein vertragliches Maß zu reduzieren ,
Sollen schwer aufzuschließende Zellen lysiert werden, so geschieht dies beispielsweise durch Zufuhr von Hitze, Dann werden schwer aufzuschließende Zellen beispielsweise 1 0 Minuten lang bei 95°C behandelt, Typischerweise werden viele Bakterien mit Hilfe von Hitze lysiert,
Ein weiteres Verfahren ist die Lyse mittels Ultraschall, welches im Fall von schwierig aufzuschließenden Zellen angewendet wird, Ultraschall fragmentiert Erbinformationen allerdings besonders umfangreich, Daher wird Ultraschall üblicherweise nur dann eingesetzt, wenn andere Verfahren versagen Mit Hilfe von Ultraschall werden beispielsweise Sporen lysiert, die besonders widerstandsfähig sind ,
Ein drittes Verfahren für die Lyse von schwierig aufzuschließenden Zellen stellt das Mahlen mittels Glaskugeln dar, Mit Hilfe von Glaskugeln werden Bakterien und Pilze aufgeschlossen . Der Aufschluss mittels Glaskugeln (in Fachkreisen auch als "Bead Beating" bekannt) verlauft vergleichsweise schonend im Vergleich zu Ultraschall und Hitze, In samtlichen drei Fallen werden jedoch die Erbinformationen unterschiedlich stark fragmentiert,
Soll mit Glaskugeln aufgeschlossen werden, so wird in der Regel eine Ruttel- oder Schuttelapparatur so zum Beispiel ein sogenannter Vortex®-Ruttler verwendet, Ein oder mehrere aus Kunststoff bestehende Rohrchen werden mit einer wassπgen Losung, die einen Lysepuffer umfasst, dem Zellmaterial und Glαskugelchen gefüllt, verschlossen und in die Ruttel- oder Schuttelαppαrαtur gestellt und mittels der Apparatur beispielsweise für fünf Minuten geschüttelt, Ein solches Verfahren wird auch als „Vortexen mit Glasbeads" oder als "Bead Beating" bezeichnet.
Ist der Zellaufschluss abgeschlossen, so werden das oder die Rohrchen entnommen, die Rohrchen bei Bedarf zentrifugiert, um Glaspartikel von der Flüssigkeit zu trennen, und der flussige Inhalt wiid in ein weiteres Rohrchen gegeben. Hier wird das lysierte Zellmaterial mit weiteren Pufferlosungen behandelt, um die Nukleinsäure zu isolieren .
Eine Lyse mittels Glaskugelchen wird beispielsweise in der Druckschrift DE 1 0 2004 032 888 B4 beschrieben.
Nach der Lyse können die freigesetzten Nukleinsäuren bevorzugt aus dem erhaltenen Gemisch isoliert werden, z. B. durch Festphasenextraktion an geeigneten Tragern wie z. B. Silika, Glasfasermembranen oder durch Absorption an Magnetpartikeloberflachen . Anschließend wird mit geeigneten Losungsmitteln, insbesondere mit Waschpufferlosungen, gewaschen, und dann werden die Nukleinsäuren mit geeigneten Elutionspuffern eluiert. Diese Techniken sind Fachleuten gut bekannt, und geeignete Adsorptionsmaterialien, Waschpuffer und Elutionspuffer können leicht durch Testen ausgewählt werden.
Die Amplifikation von Nukleinsäuren wird üblicherweise durch PCR
(Polymerase Chain Reaction) durchgeführt. Andere Amplifizierungsverfahren sind z. B. Ligase Chain Reaction (LCR), gap-filling LCR (Gap-LCR), Nukleinsauresequeπz-basierte Amplifizierung (NASBA) und Transkriptions- vermittelte Amplifizierung (TMA), Diese Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die PCR ist eine enzymatische Methode zur Synthese spezifischer Nukleinsauresequenzen unter Verwendung von zwei Oligonukleotid-Primern (Sonden), die mit entgegengesetzten Strängen hybridisieren und einen interessierenden Abschnitt einer Tαrget-Nukleinsαure flankieren Eine Serie von wiederholten Reaktionsschritten, welche Templat-Denatuπerung, Primer- Annealmg und Verlängerung der hybridisierten Pπmer durch die DNA- Polymerase umfassen, resultiert in exponentieller Akkumulation des spezifischen Target-Fragments, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer definiert sind Das PCR-Verfahren verwendet wiederholte Zyklen der DNA- Synthese zur Reph kation der Target-Nukleinsaure In der grundlegenden Ausfuhrungsform umfasst die PCR folgende Schritte
Zugabe spezifischer Primer zu einer Probe, von der vermutet wird, dass sie die Target-Nukleinsaure enthalt Die Pπmer sind so gewählt, dass sie an komplementäre DNA-Strange binden, die in entgegengesetzten Strängen der DNA vorliegen Die Target- Nukleinsaure ist innerhalb der Pπmerbindungsstellen lokalisiert und ist ein Marker des nachzuweisenden Mikroorganismus - Zugabe der vier Desoxynukleosid-Triphosphate, Magnesiumsulfat- haltiger Puffer, Poiymerase-Enzyme und von verschiedenen Additiven und Cosolventien, Mischen mit der Probe und den Primern
Denaturieren der Probe durch Erwarmen, Trennung der DNA in zwei komplementäre Strange
- Abkühlung, dadurch Bindung (Hybridisierung) der Primer an die jeweiligen Bindungsstellen an den komplementären DNA-Strangen Pπmer-Extension auf dem DNA-Templat durch DNA-Polymerase
Diese drei Schritte Denaturierung, Hybridisierung und Extension werden 40 bis 50 Mal wiederholt und resultieren in einer exponentiellen Amplifikation der Targetsequenzen
Zum Nachweis der Amphfizierungsprodukte werden geeignete Sonden zugesetzt, die z B mit Markern wie Fluoreszenzmarkern (Fluorophoren) markiert sind Es handelt sich um Ohgonukleotide, die komplementär zur Target-DNA sind Diese Sonden hybridisieren mit der Target-DNA und ermöglichen dann spater deren Nachweis, z B durch Fluoreszenzspektroskopie Die PCR-Techπik ist z B. umfassend in PCR Technology. Pπnciples and Applications for DNA Amplification Erlich, Hrsg . ( 1 992); PCR Protocols1 A Guide to Methods and Applications, Innis et al ., Hersg ( 1 990), R. K Saiki et al , Science 230 : 1 350 ( 1 985) und US 4,683, 202 beschrieben, deren Offenbarung vollinhaltlich hier aufgenommen wird.
Die klassische PCR-Reaktion ist eine Endpunkt-PCR Dadurch ist es möglich, die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Target-DNA nachzuweisen, die Methode gibt aber keine Auskunft über die Anfangskonzentration der Target- DNA.
In neuerer Zeit wurde die Real-Time PCR (RT-PCR; Echtzeit-Polymerase-Chain- Reaktion; auch quantitative PCR (qPCR) genannt) entwickelt. Diese ermöglicht das gleichzeitige Verfolgen von mehreren Nukleinsaure-
Amphfikationsreaktionen durch PCR, wobei die akkumulierten Daten zur quantitativen Bestimmung der Ausgangskonzentration einer Target- Nuklemsauresequenz verwendet werden , Daher wird diese PCR-Raktion auch als Multiplex-PCR bezeichnet. Offenbart ist die Real-Time PCR z.B. in EP-A-O 51 2 34, EP-A-O 640 828, EP-A-O 51 9 338 (F . Hoffmann- La Roche AG) . Es werden hierfür kommerziell Systeme angeboten, z. B. TaqMan® (Roche Molecular Systems, Inc . , Branchburg Township, New Jersey) . Das Verfahren ermöglicht die schnelle und präzise Quantifizierung der Ausgangskopienzahl über einen sehr weiten Konzentrationsbereich. Es ist geeignet für viele Anwendungen wie Genexpressionsstudien, Sequenz- und Mutationsanalysen, Überprüfung von Virustitern, den Nachweis pathogener oder genetisch modifizierter Organismen . Em Kit für Real-Time PCR mit sequenzspezifischen Sonden ist z. B. erhältlich von Eppendorf AG, Hamburg (RealMasterMix Probe®) oder von artus GmbH, Hamburg (RealArt® PCR Kits) .
Bei der TaqMan® PCR sind die Ohgonukleotidsonden so ausgelegt, dass sie an der Target-Nuclemsauresequenz stromaufwärts vom Extensionpπmer binden . Jede Oligonukleohdsonde ist am 5'-Ende mit einem Reportermolekul wie einem Fluorophor und am 3'-Ende mit einem Reportermolekul-Quencher markiert Die markierten Sonden werden gemeinsam mit den Primern und der Probe zur PCR-Reaktionsmischung gegeben Nach der Denaturierung wird die Reaktionsmischung abgekühlt, wobei die markierten Sonden bevorzugt an die Primer binden Als nächstes wird bis auf die optimale Temperatur zur Primerbindung und Extension abgekühlt Im Verlauf der Polymerisation, wenn die DNA-Polymerase enilang dem Target- Nuklemsauresi rang vom 3'-Ende zum 5'-Ende fortschreitet, wobei Nukleotide an den wachsenden Primer angefugt werden, Iπfft der Pπrner auf die 5'- Enden der zuvor an den l arget-Nukleinsaurestrang gebundenen markierten Sonden Wenn die DNA-Polymerase auf diese markierten Sonden trifft, übt sie ihre 5'-3'-Endonucleaseaktιvιtat aus und baut die markierten Sonden ab Fluorophore und Quencher werden dabei n die Reaktionsmischung freigesetzt Der TaqMan® Assay ist so ausgelegt, dass er Reportermolekule nicht nachweist, die innerhalb einer vorherbestimmten Nahe des Quenchermolekuls vorliegen Daher wird in der PCR-Mischung zu Beginn kein Fluoreszenz aufgrund des Reportermolekuls nachgewiesen, weil die Fluoreszenz des Reportermolekuls vom in räumlicher Nahe befindlichen Quenchermolekul gequencht wird Wahrend der PCR werden die 5'- fluoreszenzmarkierten Sonden freigesetzt und dabei von den 3'- Fluoreszenzquenchern getrennt Nach der Freisetzung wird der Fluoreszenzmarker nicht mehr gequencht und kann daher durch Fluoreszenzspektrometπe oder durch andere geeignete Mittel nachgewiesen werden In der Reaktionsmischung vorhandene ungebundene Sonden stören nicht, da sie gequencht bleiben Unspezifisch an Nuklemsauresequenzen, die nichts mit der Target-Nukleinsaure zu tun haben, gebundene markierte Sonden stören ebenfalls nicht, da sie gebunden und daher gequencht bleiben Daher ist jedes freie Reportermolekul, das in der Reaktionsmischung nachgewiesen wird, direkt proportional zu der Menge der ursprünglich spezifisch gebundenen markierten Sonde, und daher der Target- Nukleinsäure Zum Nachweis unterschiedlicher Target-Nukleinsauren in einer Probe werden Sonden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Reportermolekulen verwendet, die in unterschiedlichen Wellenlangenbereichen fluoreszieren und daher den gleichzeitigen Nachweis verschiedener Target-DNAs ermöglichen Als Fluoreszenz-Reporter sind z B 6-FAM, VIC, Bodipy-TMR, JOE und HEX bekannt und geeignet, als Quencher TAMRA, MBG, Black Hole Quencher 1 (BHQl ), Black Hole Quencher 2 (BHQ2), Black Hole Quencher 3 (BHQ3), BodyPi 564/570 und Cy5 oder ahnliche Der Fachmann wählt die Reporter und Quencher geeignet aus, bevorzugt so, dass eine gegenseitige Überlagerung der Fluoreszenzemissionen („Bleed through") vermieden wird Z B ist die Kombination 6-FAM/BHQ1 besonders geeignet
Neben Fluoreszenzmaiketn können auch radioaktive Marker, chemilumineszente Marker, paramagnetische Marker, Enzyme und Enzymsubstrate als Marker verwendet werden
Im Anschluss an die Amphfikation erfolgt die Detektion der Nukleinsäuren durch Fluoreszenzspektrometπe, wie vorstehend beschrieben, oder bei Verwendung anderer Marker durch entsprechende andere Deteklionsverfahren
Die genannten Nukleinsaurepraparations- und -amphfikations- sowie detektionsverfahren können im Labormaßstab, d h im Mikro- oder Millilitermaßstab durchgeführt werden Alternativ wurden in jüngerer Zeit mikrofluidische Verfahren entwickelt
Unter Mikrofluidik wird die Handhabung und das Arbeiten mit kleinen Flussigkeitsmengen verstanden, die ein um Zehnerpotenzen geringeres Volumen aufweisen als normale Flussigkeitstropfen
Vorrichtungen zur Durchfuhrung mikrofluidischer Verfahren, die eine Probe bis zum gewünschten Messergebnis verarbeiten, werden auch als Lab-on-a-chιp (LoC) bezeichnet, also Einweg-Verbrauchsmaterial als Labor auf einem Chip in der Große etwa einer Kreditkarte, mit dem molekularbiologische Bestimmungen vorgenommen werden, z B die Bestimmung von Erregern einer Infektion, Nahrungsmittelkontrolle, Vetermardiagnostik, Analyse biologischer Kampfstoffe, Umweltanalytik Für die Analyse ist nur geringer Personalaufwand und keine spezielle Ausbildung oder Einarbeitung zur Bedienung erforderlich LoC werden in ein Betreiberinstrument von der Große eines Videorecorders eingelegt, das dann das Ergebnis ausgibt Em LoC vereinigt mikrofluidische Funktionen zur Probenextraktion und Anreicherung des Analyten, zur Signalverstarkung (Amphfikation) und Detektion in einem Chip Die Bedienung des LoC und der Bedieneinheit ist sehr einfach, und die Analyse erfolgt extrem schnell verglichen mit konventionellen
Analyseverfahren (30-60 Minuten Gesamtprozesszeit gegenüber mindestens 6 Stunden)
Em großes Problem bei den Nuklemsaurepraparations- und -amplifikationsschπtten sowohl im Labormaßstabe als auch mit mikrofluidischen Vorrichtungen ist es, eine zuverlässige Kontrolle des Verfahrens einzubauen, um insbesondere falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden Falsch-negativ bedeutet, dass die Target-Nukleinsaure zwar in der Probe vorliegt, weil z B ein bestimmter Erreger vorhanden ist, aber durch Fehler im Test nicht nachgewiesen wird Dabei können sowohl die Lyse der Zellen, die Isolierung der Nukleinsäuren als auch die Amphfikation fehleranfallig sein Insbesondere die PCR ist empfindlich gegen nachteilige Wirkungen von Inhibitoren, von denen viele häufig in biologischen Proben vorliegen, wie z B Harn und seine metabolischen Produkte, saure Polysaccharide, Detergentien und chaotrope Salze Aber auch die Lyse der Zellen verlauft nicht immer zuverlässig, besonders bei schwer zu lysierenden Zellen, wie vorstehend beschrieben
Es wurde daher bereits vorgeschlagen (WO 02/052041 , WO 2005/04762), der PCR interne Konlrollsubstanzen zuzugeben, die so angelegt sind, dass die korrekte Durchfuhrung der Amphfikation bestätigt wird Der inferne Standard kann der Probe vor dem ersten Bearbeitungsschritt zugesetzt werden, z B bereits vor der Reinigung oder der Lyse, oder auch vor der PCR I a wird ein synthetisches Ohgonukleotid-Konstrukt hergestellt, dass von der Target- Region des Testdetektionssystems verschieden ist (internes Kontroll-Target) Die geeignete Auswahl der internen Kontrolle ist sehr komplex und schwierig Im Stand der Technik als interne Kontrollstandards bekannt sind gereinigte Nukleinsäuren, Protein-komplexierte Nucleinsauren („armored RNA" der Fa, Ambion), z. B mit Capsid, oder inaktive Virusstandards.
Problematisch bei den gereinigten Nukleinsäuren ist ihre geringe Stabilität, Insbesondere RNA wird in Blut oder anderen biologischen Probematerialien innerhalb kürzester Zeit abgebaut, Zudem ermöglicht die Verwendung von Nukleinsäuren keine Kontrolle, ob die Lyse, also der Probenaufschluss inklusive Nukleinsaurefreisetzung korrekt verlaufen ist, sondern nur die Kontrolle der Amphfikation.
Die „armored RNA" ist zwar deutlich stabiler als „nackte" Nukleinsäuren, ist aber deutlich leichter zu lysieren als intakte Zellen und daher nicht mit diesen vergleichbar und als Kontrolle der Lyse nicht gut geeignet,
Die inaktiven Virusstandards sind im Grunde Vaccine und enthalten Chemikalien, insbesondere Formaldehyd, die die Oberflachenstruktur der Viren durch chemische Kreuzvernetzung gegenüber aktiven Formen verandern . Daher ist das Lyseverhalten nicht vergleichbar mit dem von lebenden Viren, und die inaktiven Virusstandards sind als Kontrolle für die Lyse nicht unbedingt geeignet,
WO 03/02959 betrifft durch Gefriertrocknen erhaltene Produkte, die bestimmte definierte Mengen Biopartikel enthalten , Die Anmeldung deckt nach Angabe des Anmelders in der letzten Eingabe im EP-Verfahren vom 22, 8 , 2006 das Produkt BioBall® ab, das gefriergetrocknete Kugelchen darstellt, die für die quantitative mikrobiologische Qualitätskontrolle eingesetzt werden , Sie werden bisher in der Lebensmittel-, Pharma-, Wasser- und Abwasserindustrie eingesetzt, können aber auch für Kosmetik, „personal care", klinische Labors and Forschungs- und akademische Institutionen verwendet werden Weitere Bestandteile der Kugelchen oder Anwendung als interne Kontrollen bei Nuklemsaurepraparationen ist nicht offenbart, BioBalls® sind mit verschiedenen Bakterien verfugbar, z B, Enterokokken , E. coli, Salmonellen , Es wird u .a . ein Set von im wesentlichen festen Produkten offenbart, die eine definierte Anzahl von 1 bis 1 000 Mikroorganismen enthalten, ausgewählt aus Viren, Bakterien, Hefen, Pilzen, Parasiten, Protozoen, Zellen und Mischungen daraus, wobei die festen Produkte ohne Verlust an Mikroorganismen zwischen Behaltern transferiert werden können, und die Mikroorganismen in einer Flüssigkeit freigesetzt werden können, und wobei die Abweichung der Zahl der Mikroorganismen zur definierten Anzahl höchstens 1 0 % betragt. Der Sinn dieser Produkte liegt darin, eine genau definierte sehr geringe Anzahl von Mikroorganismen für Vergleichsproben in der Qualitätskontrolle bereitzustellen ,
WO 2004/055205 offenbart die Verwendung von Zellen, viralen Partikeln, Organellen, Organellen, virale Partikel, Parasiten oder bakterielle Zellen umfassenden Zellen, die mindestens eine Nukleinsauresequenz umfassen, die als internes Kontroll-Target für Nukleinsaureassays dient, als interne Kontrolle. PCR ist als bevorzugt offenbart, Als Zellen sind Bakterien, Viren,
Pilze, Parasiten, eukaryontische Zellen oder Pflanzenzellen oder auch Sporen genannt. Es wird als besonders vorteilhaft beschrieben, dass sowohl die Nukleinsaurepraparation als auch die Amplifikation durch direkte Zugabe der Zellen zu der Testprobe überprüft werden kann . Es können genetisch veränderte Zellen (d . h. solche, in die die Kontroll-DNA-Sequenz durch gentechnische Methoden eingebaut wurde) oder natürliche Zellen wie z. B. Sporen von B. globigii als Kontrollzellen eingesetzt werden . Feste Präparate sind nicht offenbart, sondern Suspensionen, die die durch Einschleusen der Kontroll-DNA genetisch veränderten Sporen enthalten.
WO 02/1 8635 offenbart die Verwendung von nicht lebensfähigen Partikeln, die eine interne Nukleinsauresequenz umfassen, als interne Kontrolle für nukleinsaurebasierte Analysen . Die Partikel sind insbesondere Liposomen .
DE 21 40 747 offenbart ein Verfahren zum Mischen von festen biologischen Stoffen mit anderen festen Stoffen durch Gefriertrocknen in Gegenwart eines Zuckers, WO 99/06594 offenbart ein Verfahren zur Herstellung stabil eingekapselter Nukleinsäuren, die zur Überwachung aller Schritte von Nukleinsaurepraparationen verwendbar sind Die beschriebenen Zellen werden nach Einschleusen der Nukleinsäuren abgetötet, z B durch Stehenlassen bei Raumtemperatur oder mit chemischen Reagenzien
EP 1 1 79 585 und WO 99/33559 offenbaren eine integrierte Kartusche zur Analyse von klinischen oder Umwelt-Flüssigkeiten, insbesondere zum Nachweis von DNA Das System ist kommerziell von der Fa Cepheid unter der Bezeichnung GeneXpert® erhältlich Es gibt für verschiedene Assays unterschiedliche interne Konlrollen, z B für den Assay von MRSA (Methicillin- resistenter Staphylococcus aureus) Sporen von Bacillus globign, oder für virale RNA „armored RNA" der Fa Ambion
Die genannten internen Standards sind alle noch nicht zufriedenstellend
Zum einen können die meisten von ihnen nur für die Kontrolle der PCR, nicht aber für die der Lyse eingesetzt werden, da es sich nicht um intakte Mikroorganismen mit vergleichbarer Struktur wie die nachzuweisenden handelt Zum anderen handelt es sich z T um instabile, nicht bei Normalbedingungen lagerfähige Produkte Für eine einfache
Verfahrensfuhrung sind die z T bekannten Suspension oder Losungen zudem nachteilig, weil sie aufwendiger und ungenauer zu dosieren und zuzugeben sind als z B feste Präparate
Sowohl für Verfahren im Labormaßstabe als auch für mikrofluidische Verfahren besteht ein dringender Bedarf an zuverlässigen internen Standards, die die Kontrolle der korrekten Durchfuhrung sowohl der Lyse als auch der Amplifikation ermöglichen Für Labormaßstabverfahren ist dabei zu berücksichtigen, dass der interne Standard prinzipiell vor oder nach jedem Einzelschritt des Nachweisverfahrens zugegeben werden kann, oder dass auch verschiedenen Standards für jeden Schritt eingesetzt werden können Bei mikrofluidischen Verfahren dagegen muss der interne Standard zu Beginn des Verfahrens zugegeben werden und für die Kontrolle aller Schritte geeignet sein, da eine Zugabe aufgrund der Verfahrensdurchfuhrung in einem geschlossenen System in spateren Schritten nicht mehr möglich ist
Wie vorstehend ausgeführt, gibt es bisher noch keine zufriedenstellenden internen Standards, die es ermöglichen, samtliche Schritte eines
Nachweisverfahrens für Biopartikel durch Analyse von dessen Nukleinsäuren (d h Praparation/Lyse der Zellen, Extraktion, Amplifikation und Detektion) zuverlässig zu kontrollieren
Nahrungserganzungsmittel, die Bakterien oder deren Bestandteile enthalten, in Tableitenform sind bekannt
EP-A 1 002 539 beschreibt z B ein zu einer Tablette geformtes Nahrungsmittel, das immunmodulative Abbauprodukte von Bakterienzellen von Corynebactπum glutamicum, Starke und Zellulose enthalt
Weiter offenbart Derwent Pubhcation, AN2008-C55669 - XP002501 895 (JP-A 2008043206) Tabletten, die sich aus Hefezellwandfraktionen und Bifidobakteπum in lebender Form zusammensetzen, als Nahrungserganzungsmittel Die Aufgabe der Erfindung besteht im Hinblick auf die dargestellten Probleme darin, einen geeigneten internen Standard für Nuklemsaurepraparations- und Nuklemsaurenachweis-Verfahren bereitzustellen
Offenbarung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelost durch das diagnostische Reagenz gemäß Anspruch 1 , enthaltend mindestens eine Art Biopartikel, ausgewählt aus der aus Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Sporen, Parasiten, Pflanzenzellen, tierischen oder menschlichen Zellen, Gameten, Plasmiden und Viroiden bestehenden Gruppe sowie übliche pharmazeutische Hilfsstoffe Bevorzugte Ausfuhrungsformen sind in den Ansprüchen 2 bis 6 definiert Ebenfalls beansprucht wird ein Herstellungsverfahren für das erfindungsgemaße Reagenz sowie dessen Verwendung als interner Standard in Nukleinsαureprαpαrαtions- und Nukleinsαurenαchweis-Verfαhren bzw, zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, ein Verfahren zum Nachweis der genannten Biopartikel unter Verwendung des diagnostischen Reagenz sowie ein Kit-of-parts, enthaltend das diagnostische Reagenz.
Überraschenderweise ist es erfindungsgemaß erstmals gelungen, ein festes bei Normalbedingungen und Umgebungstemperatur gut lagerfähiges und stabiles Produkt zu erhalten, das Biopartikel urnfasst und als interner Standard für Nuklemsaurepraparations- und Nukleinsaurenachweis-Verfahren verwendet werden kann . Es ist auf sehr einfache Art und Weise erhältlich, wobei keine aufwendigen und teuren Verfahrensschritte wie Gefriertrocknung notwendig sind .
Beschreibung der Figuren
Figur 1 ist eine Photographie eines Ethidium-Bromid gefärbten Agarosegels, auf dem die Probeneluate aus Beispiel 2 elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Bild A zeigt die Nukleinsaurepraparation für Blut bzw, PBS mit der Tablette A, Bild B die Nukleinsaurepraparation für Blut bzw. PBS mit Tablette B.
Figur 2 ist eine in Beispiel 3 erhaltene Graphik, die das Ergebnis der Real Time PCR-Quantifizierung der genomischen DNA von Corynebacterium glutamicum zeigt. Das Histogramm zeigt die durch PCR nachgewiesene Menge (pg) pro Reaktion bei einer Stichprobenmenge von N = 4
Figur 3 ist eine in Beispiel 4 erhaltene Graphik, die die Treshold-Cycles (Ct) der quantitaNven PCR einzeln präparierter Blut-Proben zeigt, Für jede Probe wurde eine Corynebacterium g/ufam/cum-spezifische und eine Human-DNA- spezifische (ß-Aktin-Gen) PCR durchgeführt,
Figur 4 ist eine Graphik, die das Ergebnis der quantitativen PCR zum Nachweis von ß. subtilis~DHA aus Beispiel 5 mit unterschiedlichen Anzahlen von Bakterien zeigt, Figur 5 ist eine Graphik des sogenannten „Amphfication-Plot", die das Ergebnis der revers transkribierten quantitativen PCR mit einem erfindungsgemaßen Präparat in Beispiel 6 zeigt
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Unter Biopartikel werden erfindungsgemaß Mikroorganismen verstanden, insbesondere Bakterien, Viren, Pilze, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Sporen, Parasiten, Pflanzenzellen, tierische oder menschliche Zellen,
Gameten, Plasmide und Viroide Die Biopartikel enthalten Erbmateπal in Form von Nukleinsäuren Bevorzugt enthalt das erfindungsgemaße Präparat Bakterien, Viren, und/oder Bakteriophagen Üblicherweise enthalt das Präparat eine Art Mikroorganismus, es ist aber auch möglich, dass mehrere Arten gemeinsam vorliegen, z B zwei oder mehr Arten Bakterien Auch eine Kombination von einer Bakterienart und einer Virenart oder einer Bakterienart und einem Bakteriophagen ist z B möglich Weitere Kombinationen sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten Besonders geeignet sind erfindungsgemaß Bakterien und Viren, die bei der Trocknung unter Normalbedingungen ihre Zellwand und Morphologie bewahren Dies sind z B die Bakterien Corynebacteπum giutamicum, Mycobacterium phlei und Bacillus subtilis, die Bakteriophagen Lambda, T7, fr, qß, MS2 und M l 3 Das Bakterium E coli ist prinzipiell auch geeignet, wird aber wegen seiner zu großen Instabilität gegen die Lyse (zu leichte Lysierbarkeit) für das erfindungsgemaße Präparat weniger bevorzugt C giutamicum ist besonders geeignet, weil es gut verfugbar und schwer zu lysieren ist, d h besonders gut für die Kontrolle der korrekten Lyse verwendbar ist Der Phage fr ist gut geeignet, weil er ein RNA-Genom aufweist und nur durch reverse Transkription amplifizierbar ist Damit kann er vorteilhaft für die Kontrolle von Amplifikationen mit reverser Transkription eingesetzt werden
Unter Normalbedingungen bzw Umgebungstemperatur wird erfindungsgemaß Raumtemperatur und Normaldruck verstanden, d h eine Temperatur von ca 20-25 0C und ein Luftdruck von ca 1 bar Ferner wird darunter eine relative Luftfeuchtigkeil von 20 - 60% verstanden Umgebungsluft mit einer niedrigeren relativen Luftfeuchtigkeit kann erfindungsgemaß auch benutzt werden
Das erfmdungsgemaße Reagenz ist im wesentlichen fest Dies bedeutet, dass das Reagenz bei Normalbedingungen formstabil ist, d h nicht zerlauft, zerfallt oder zerfließt Es kann z B in Form von Pellets oder Tabletten vorliegen oder auch in Form von Anhäufungen des Gemisches aus Biopartikeln und Hilfsstoffen, die durch Aufstreichen einer gewissen Menge z B auf einer Folie oder Pipettieren in Vertiefungen und anschließendes Trocknen hergestellt werden In einer alternativen Ausfuhrung kann das Reagenz auf einem Stutzvhes, z B aus Glasfaser hergestellt werden Die daraus erhaltenen Stanzprodukte stellen das finale Reagenz dar
Insbesondere soll durch den Begriff „im wesentlichen fest" bzw „bei
Normalbedingungen formstabil" zum Ausdruck gebracht werden, dass es sich nicht um ein flussiges Reagenz handelt, in dem Biopartikel als Suspension in einem Losungsmittel vorliegen
Das Reagenz enthalt weiter übliche pharmazeutische Hilfsstoffe, die zur Herstellung einer festen Zubereitung geeignet sind Insbesondere werden Fließmittel, Bindemittel, Füllstoffe und/oder Sprengmittel eingesetzt Diese sind Fachleuten gut bekannt und werden geeignet ausgewählt
Als Füllstoffe geeignet sind z B Starken wie Mais-, Kartoffel- und
Weizensiarke, Lactose, Granulatum Simplex (Gemisch aus Kartoffelstarke und Lactose), mikrokristalline Cellulose (z B Avicel®), modifizierte Starken, modifizierte Cellulosen, Glucose, Mannitol, Sorbitol, und Levulose
Bindemittel sind für die Erhöhung der Festigkeit des festen Präparats bedeutsam Hierfür geeignet sind z B Polyethylenglykole
Als Fließreguherungsmittel ist z B Aerosil® (kolloidale Kieselsaure) geeignet Als Sprengrnittel sind übliche Sprengmittel wie z B Starke, z B Maisstarke oder Kartoffelstarke, Alginate, mikrokπstaline Cellulose (Avicel®), Holocellulose (gereinigte ligninfreie Cellulose), Natπumcarboxymethylcellulose, Polyacrylsaure (Carbopol®), Polyvinylpyrrohdon (Polyplasdone®, Kolhdon®, Crospovidone®), vernetzte Natπumcarboxymethylcellulose (Ac-Dι-Sol®), Natπumcarboxymethylstarke (Pπmojel®, Explotab®), Natπumcarboxymethylcellulose (Nymcel®) geeignet
Fheßregulierungsmittel, Füllstoffe und Sprengmittel werden geeignet ausgewählt Bevorzugt werden erfindungsgemaß Hydroxyethylstarke und/oder Carboxymethylcellulose verwendet, weil damit ausreichend feste und stabile Präparate erhalten werden Als Bindemittel kommt bevorzugt Polyethylenglykol 8000 zum Einsatz
Dem Reagenz können im Verlauf des Herstellungsverfahrens ein oder mehrere Puffer zugesetzt werden Es werden Puffer verwendet, die stabilisierende und lysierende Eigenschaften für Mikroorganismen haben Solche Puffer enthalten Detergentien (z B SDS (Natπumdodecylsulfat), Lauryl- Sarkosin, Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Tπton-X 1 00 (Polyethylenglykol-p-( l , 1 ,3,3-tetramethylbutyl)phenylether),
Chelatisierungsmittel (z B EDTA (Ethylenglykoltetraessigsaure) oder Salze davon wie Na-EDTA (Titπplex)), EGTA (N-(2-Hydroxyethyl)-ethylendιamιn), und/oder pH Puffersubstanzen wie Tπs, Hepes (4-(2-Hydroxyethyl)- l - piperazmethansulfonsaure), MOPS (3-(N-Morpholιno)propansulfonsaure), Citrat, Acetat, Ammoniumchlorid) Diese Bestandteile können im verwendeten Puffer einzeln oder als Gemisch vorliegen Der Puffer wird vom Fachmann ggf geeignet für die Mikroorganismen ausgewählt Z B können erfindungsgemaß TE (Trιs/Cl pH 8, im Gemisch mit EDTA), oder EDTA in Kombination mit Trιs/Cl, Tween 20 und Trιton-X 1 00, Puffer P ( 1 ,4 % SDS, 50 mM Titπplex, 500 mM NaCI, 2 % Polyvinylpyrrohdon, 1 00 mM Na-Acetat- Tπhydrat pH 5,4) oder Puffer L ( 1 55 mM NH4CI, 1 0 mM KHCO3) oder Puffer B (50 mM EDTA, 50 mM Tπs/Cl pH 8,0, 0 5 % Tween 20, 0,5 % Triton X- 1 00) als Puffer verwendet werden Die in den Puffern enthaltenen Losungsmittel, insbesondere Wasser, werden zum Abschluss der Herstellung der erfindungsgemαßen Reagenzien weitgehend vollständig durch Trocknen bei Normalbedingungen entfernt
Die Mengen der pharmazeutischen Hilfsstoffe werden geeignet ausgewählt Sie können ggf durch einfache Versuche bestimmt werden Typischerweise werden z B in einem Ansatz 3 g Bindemittel für 1 5 ml Bakteπenkulturflussigkeit oder Bakteπophagen-Uberstand eingesetzt Die Menge des Bindemittels wild ebenfalls geeignet ausgewählt oder durch Versuche bestimmt und betragt z B 0,5 ml 20%-ιge Losung von PEG 8000 für 1 ,5 ml Bakterienkultur bzw Bakteπophagen-Uberstand Die Menge der verwendeten Pufferlosung betragt z B 1 ml Pufferlosung für 1 ml Bakterienkultur oder Bakteπophagen-Uberstand
Die Ubernacht-Bakteπenkultur wird erfindungsgemaß wie folgt erhalten Die Bakieπenkulturen werden als Ubernachtkultur heran gezogen Hierzu werden 20 ml geeignetes Bakteπennahrmedium in einen sterilen 1 00 ml Erlenmeyer- Kolben pipettiert und mit 5-20 μl Bakteriensuspension angeimpft Der Kolben wird mit etwas Alufolie locker verschlossen und 1 0- 1 4 h in einem Schuttelinkubator bei geeigneter Temperatur und Schuttelleisiung inkubiert Nach der Kultivierung wird der Bakterien-Titer eines 1 1 0 verdünnten Aliquots mit Hilfe einer modifizierten Neubauer Zahlkammer durch Auszahlen unter dem Mikroskop bestimmt
Bakteπophagen-Uberstande werden durch Infektion von Wirtsbakterien hergestellt Hierzu werden 20 ml geeignetes Bakteπennahrmedium in einen sterilen 1 00 ml Erlenmeyer Kolben pipettiert und mit 5-20 μl Bakteriensuspension angeimpft Die Kultur wird 4 h in einem Schuttelinkubator bei geeigneter Temperatur und Schuttelleistung inkubiert Danach gibt man eine geeignete Menge an Bakteπophagenlosung hinzu und kultiviert für weitere 1 0- 1 2 h im Schuttelinkubator Der Fachmann benutzt in der Regel eine MOI (multiplicity of Infection) von 1 0, d h das Verhältnis von Bakterien zu Bakteriophagen ist 1 1 0 Nach der Kultivierung werden die Bakterien in der Zentrifuge für 1 0 min bei 8000 Upm sedimentiert und der Überstand wird in ein frisches Zentπfugenrohrchen überfuhrt und ein weiteres Mal zentπfugiert Der Überstand enthalt nun alle freien Bakteriophagen und kann als Aliquots eingefroren werden Die Bestimmung des Phagentiters (Pfu Plaque forming Units) erfolgt nach klassischen Methoden der Mirkobiologie durch Ausplattieren von Verdünnungen des Bakteπophagen-Uberstands und Indikatorbakterien auf Agarplatten Nach der Inkubation der Agarplatten kann die Anzahl an Pfu durch Auszahlen der „Plaques" im „Bakterienrasen v bestimmt werden
Die geeignete Anzahl an Bakterien und/oder Bakteriophagen, die bei der Herstellung des Reagenz zugefugt wird, wird der Fachmann an Hand der finalen Anwendung entscheiden Sie betragt z B 5 000 Die Mindestanzahl ist etwa 1 000, da bei diesem Wert die Nachweisgrenze hegt Bevorzugt betragt sie etwa 1 0 000 bis etwa 1 00 000 Das erfindungsgemaße Reagenz kann nach Bedarf geeignete Farbstoffe enthalten, um eine Farbcodierung bereitzustellen Dies bedeutet, dass erfindungsgemaße feste Reagenzien je nach dem darin enthaltenen Mikroorganismus unterschiedlich gefärbt vorliegen und so leicht vom Anwender voneinander unterschieden werden können Hierfür kommen Farbstoffe für histologische Färbungen in Frage, die Fachleuten gut bekannt sind und geeignet ausgewählt werden Z B können Fuchsin, Methylenblau, Eosin, Malachitgrün, Gentianviolett und deren Derivate eingesetzt werden Die Farbstoffe werden dem Gemisch zur Herstellung des erfindungsgemaßen Reagenz entweder als Feststoffe oder in Form einer Losung zugesetzt, z B Wasser und/oder Glyceπn und/oder üblichen Alkoholen Als Beispiele können Gentianviolett Losung (in Wasser), Fuchsinlosung (in Ethanol), Eosinlosung (in Wasser), Methylenblau-Losung (in 95% Ethanol) oder Malachitgrün Losung (in Wasser/Glyceπn unter Zusatz von Essigsaure) genannt werden Derartige Losungen sind kommerziell erhältlich, z B von der Fa Fluka oder der Fa Sigma-Aldπch
Nach Bedarf kann das Reagenz auch Antischaummittel enthalten Diese werden aus den bekannten Antischaummitteln geeignet ausgewählt Optional kann das erfindungsgemaße Reagenz auch Partikel aus einem harten Material wie Glas, Siliziumcarbid oder Zirkoniumcarbid enthalten , Geeignet hierfür sind auch magnetische Silikapartikel oder Anionaustauscherharz-Partikel , Der Durchmesser dieser Partikel betragt bevorzugt 1 00 bis 800 nm Dieser Zusatz kommt insbesondere in Betracht, wenn das Reagenz sehr schwer zu lysierende Mikroorganismen, insbesondere bestimmte Bakterien wie Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium phlei, Hefe-Pilze; oder Sporen von Bacillus anthracls enthalr. Diese Ausfuhrungsform kommt insbesondere in Frage, wenn die Lyse, die unter Zusatz des als interner Standard durchgeführt werden soll, mittels eines Vortex®-Gerats oder in einer Kugelmühle durchgeführt wird . Wie eingangs erwähnt, unterstutzen die harten Partikel die Lyse der Mikroorganismen bei diesen Verfahren durch mechanische Einwirkung , Die Menge der harten Partikel wird geeignet ausgewählt und betragt z. B . 1 0 bis 20 g , bevorzugt etwa 1 4 bis 1 7 g für 1 ,5 ml Bakterienkulturflussigkeit,
Je nach Anwendung kommen Glaspartikel mit unterschiedlichen Durchmessern zur Anwendung :
Das erfindungsgemaße Reagenz kann darüber hinaus optional ein oder mehrere Enzyme enthalten, Diese unterstutzen ebenfalls die Lyse, Es kommen hierfür Proteasen wie z. B. Proteinase K, Subtilisine; Lipasen und zellwandzersetzende Enzyme wie z.B. Lysozym, Lyticase oder Zymolase in Betracht, Das/die Enzyme und ihre Menge(n) werden geeignet ausgewählt.
Die Herstellung des Reagenz kann erfolgen, indem die Bestandteile, die zum Teil auch in flussiger Form vorliegen, z. B, mit einem Spatel oder auch beliebigen Mischern gemischt und ggf. mit dest, Wasser versetzt werden, bis eine zähe bis dickflüssige homogene Masse entstanden ist. Die einzuarbeitenden Mikroorganismen werden bei dieser Ausfuhrungsform in Form einer Bakterienkulturflussigkeit oder einer Suspension von Mikroorganismen wie z B , Phagenuberstand zu den übrigen Bestandteilen gegeben . Die Reihenfolge der Zugabe spielt nur eine Rolle, wenn das Reagenz zusätzlich noch harte Partikel enthalten soll , Allzu langes Ruhren kann die Bakterien in diesem Fall bereits durch Mahleffekte lysieren, daher wird die Suspension von Mikroorganismen in diesem Fall als allerletzte Zutat beigefugt und auch nur sehr vorsichtig mit den übrigen Bestandteilen vermischt Ansonsten spielt die Reihenfolge der Zugabe und Vermischung der einzelnen Bestandteile keine Rolle
Die erhaltene dickflüssige Masse wird z B in eine Spritze überfuhrt und mit einer stumpfen Kanüle (z B als kleine Kugelchen (Durchmesser z B 1 -2 mm)) auf eine geeignete Folie wie z B Parafilm oder Polyethylenfohe oder Teflonfohe portionsweise aufgetragen und anschließend bei
Normalbedingungen getrocknet Auch mit einer anderen geeigneten üblichen Portioniervorrichtung kann das Portionieren erfolgen Alternativ kann die dickflüssige Masse auch in geeignete Formen wie z B Tablettenblister gefüllt und dann bei Normalbedingungen getrocknet werden Weiterhin kann ein festes Präparat durch Auftragen der dickflüssigen Masse auf einem Stutzvlies, z B aus Glasfaser, Trocknen und Ausstanzen von beliebigen Formen erfolgen Üblicherweise erfolgt das Trocknen wahrend mehrerer Stunden, z B über Nacht, bevorzugt im Abzug Überraschenderweise ist weder Kuhlen noch Arbeiten unter Schutzgas erforderlich
In einer weiteren Ausfuhrungsform werden alle Bestandteile des festen Reagenz mit Ausnahme der Mikroorganismen wie vorstehend gemischt, portioniert und getrocknet Dann wird nachträglich eine Losung oder Suspension der Mikroorganismen auf die erhaltenen festen Produkte, z B mittels einer Pipette, aufgetragen, und anschließend wird nochmals unter den vorstehend genannten Bedingungen getrocknet Hierdurch erfolgt gewissermaßen ein Imprägnieren des festen Produkts mit den Mikroorganismen Überraschenderweise wird auch auf diese Art und Weise ein stabiles festes Mikroorganismen enthaltendes Reagenz erhalten Diese Vorgehensweise ist sowohl für Bakterien als auch für Phagen besonders geeignet Sie bietet den Vorteil, dass man die Mengen der auf jede Tablette aufgebrachten Mikroorganismen durch Titerbestimmung nach einem üblichen Verfahren und anschließende Grenzverdunnung genau festlegen kann Die erhaltenen erfmdungsgemaßen festen Reagenzien sind unter Normalbedingungen mehrere Wochen stabil Dies bedeutet, dass bei Resuspendieren des bei Normalbedingungen gelagerten Reagenz in Wasser oder wassπger Pufferlosung nach mehreren Wochen noch eine ausreichende Anzahl lebender Mikroorganismen vorliegt, um eine Verwendung als interner Standard in Nuklemsaurepraparations- und Nukleinsaurenachweisverfahren zu ermöglichen
Dies ist sehr überraschend, da man bisher davon ausging, dass derartig stabile Mikroorganismen-Präparate nur durch Lyophihsierung erhalten werden konnten und ausschließlich unter Zusatz von Zuckern wie z B Trehalose oder Mannitol stabil seien
Das erfmdungsgemaße feste Reagenz ist leicht herzustellen, ohne dass aufwendige und teure Verfahren wie Lyophihsierung erforderlich sind und dass Zusätze wie die genannten Zucker notwendig sind
Das Reagenz ist leicht zu handhaben, da der Anwender es einfach der zu analysierenden Probe, wie z B Blut, Liquor o a zugeben kann Dadurch werden gleichzeitig der Kontakt mit den im Reagenz enthaltenen Mikroorganismen und Verluste von Material sowie Kontamination von Geraten und Laborumgebung, die bei Verwendung von Suspensionen bzw Flüssigkeiten zwangsläufig auftreten, vermieden
Besonders einfach wird die Handhabung des erfmdungsgemaßen Reagenz, wenn es bereits in mikrofluidischen Vorrichtungen oder LoCs enthalten ist, so dass der Anwender gar nicht mehr direkt mit dem Reagenz in Berührung kommt und gar nicht erst die Möglichkeit besteht, dass der interne Standard vergessen wird Daher wird erfindungsgemaß auch ein Kιt-of-parts, z B eine mikrofluidische Vorrichtung, eine Nachweis-Cartπdge oder ein LoC bereitgestellt, das das erfmdungsgemaße diagnostische Reagenz enthalt Die erfmdungsgemαßen Reagenz werden als inferne Standards in Nuklemsaurepraparations- und Nukleinsaurenachweisverfahren eingesetzt D h , sie werden in üblichen Verfahren zur Nuklemsaurepraparation und zum Nukleinsaurenachweis vor oder beim ersten Reaktionsschritt oder auch erst nach der Praparation der Nachweismischung zugesetzt
Besonders bevorzugt kann ihr Einsatz in mikrofluidischen Praparations- und Nachweis-Verfahren erfolgen, wo sie der zu präparierenden Probe voi dein Aufgeben auf die rnikrofluidische Vorrichtung zugesetzt werden können Alternativ ιs1 es auch möglich, das erfmdungsgemaße Reagenz in der mikrofluidischen Vorrichtung so vorzusehen, dass es bei der Aufgabe der zu präparierenden Probe in dieser suspendiert und dann mit ihr zusammen weiter präpariert wird, d h als Bestandteil eines LoC oder einer Nachweis- Cartπdge
Das erfmdungsgemaße feste Reagenz kann für jedes übliche Aufschlussbzw Lyseverfahren wie vorstehend beschrieben als interner Standard verwendet werden Die Probe wird dazu gemeinsam mit dem erfindungsgemaßen Reagenz und einem geeigneten Lysepuffer gemischt Anschließend wird das Gemisch durch Warme, Ultraschall oder „bead beating" behandelt Der Lysepuffer ist z B Buffer AL (Fa QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) Weitere Lysepuffer sind Fachleuten bekannt und werden passend für den zu lysierenden Mikroorganismus ausgewählt, ebenso wie die geeigneten Lysebedmgungen Es können auch mehrere verschiedene Lysepuffer eingesetzt werden Z B kann als Lysepuffer PBS-Puffer
(phosphatgepufferte Kochsalzlosung) verwendet werden, der Proteinase K und Lysozym enthalt Gegebenfalls wird zunächst inkubiert und dann ggf ein weiterer Puffer zugegeben wie z B Puffer G (GITC (Guanidiniumthiocyanatj/Nonidet® (Nonylphenylethylenglykol)) und nochmals inkubiert Das geeignete Volumen des/der Puffer muss in
Abhängigkeit zum Probenmateπal bestimmt werden und betragt z B je nach Probenmateπal zwischen 50 μl und 1 ml Die Temperatur und Zeit zur Inkubation wird jeweils geeignet ausgewählt Da manche Lyseverfahren mittels Einsatz von Enzymen erfolgen, ist die gewählte Temperatur auch abhängig von der Aktivität der Enzyme Zymolase, Lyticase und Lysozym werden in der Regel im Temperaturbereich von 200C - 370C eingesetzt Die Inkubation mit Proteasen , z B Proteinase K oder Subtilisin, erfolgt in der Regel bei 50 - 60 0C Die Dauer der Inkubation betragt in der Regel 5 bis 20 Minuten, bevorzugt ca 1 0 Minuten Die Inkubation kann z B in einem
Thermomixer durch Schuttein erfolgen, z B bei ca 1 400 Upm, oder auch auf einem Vortex®-Gerat (maximale Leistungsstufe)), ggf unter Zusatz von Glasperlen, wobei das erfmdungsgemaße Präparat selbst bereits Partikel aus einem harten Material und/oder Enzyme zur Unterstützung der Lyse enthalten kann
Im Anschluss an die Lyse erfolgt die Isolierung der durch die Lyse freigesetzten Nukleinsäuren durch beliebige im Stand der Technik bekannte Reinigungsverfahren Hierfür kann der erhaltenen Mischung ein geeignetes Losungsmittel zugesetzt werden, z B Ethanol Die Reinigung der in dem Lysat enthaltenen Nukleinsäuren erfolgt im allgemeinen durch Adsorption
Bei den Reinigungsverfahren durch Adsorption nutzt man das selektive Binden der Bestandteile des Inhalts des Lysats an oder auf einem festen Stutz- oder Tragermateπal ("Binden"), das Beseitigen unerwünschter
Bestandteile vom festen Stutz- oder Tragermateπal ("Waschen"), und das Losens des gewünschten Bestandteils ("Elution")
Um ein gewünschtes Absorbieren und Desorbieren wahrend der Aufreinigung der Biomolekule zuzulassen, sind spezielle Filterelemente entwickelt worden, die z B aus Sιlιka-Gel gebildet sind, und die einerseits porös oder Matπx- artig sind, um eine Flüssigkeit durch das Filterelement hindurch gelangen zu lassen, und die andererseits eine Oberflache haben, an die die Biomolekule in einem spezifischen oder unspezifischen Prozess binden In anderen Reinigungsverfahren werden Biomolekule auf Filterelementen einfach durch den Effekt des Großenausschlusses zurückgehalten Wenn eine Flüssigkeit, die ein Biomolekul wie z B eine Nukleinsäure enthalt, durch das Filterelement hindurch tritt, bleiben in jedem Fall die Biornokekule oder ein Teil davon in dem Filterelement, wahrend der Rest durch das Filterelement hindurch gelangt. Des Weiteren wird, um das Biomolekul aus dem Filterelement zu gewinnen, eine Elutionsflussigkeit, z. B . Nuklease-freies Wasser, zum Desorbieren des Biomolekuls auf das Filtereiement gefuhrt. Auf diese Weise wird das gewünschte Biomolekul von dem Filtereiement gelost (eluiert), und in einem Gefäß aufgefangen , Solche Filterelemente werden häufig als Membranen ausgelegt, die entweder in einzelnen Gefäßen angeordnet sind, die eine Eingangsoffnung und eine Ausgangsoffnung haben, oder die in Multiwell-Platten angeordnet sind. Die Filterelemente werden entweder mit Zentrifugen ("spin format"), oder mit auf Vakuum- Technologie basierenden Apparaten prozessiert, Einzelne Gefäße mit einer Eingangsoffnung und einer Ausgangsoffnung, die eine Membran haben und die in einer Zentrifuge benutzt werden können, sind auch als Säulen, Zentifugensaul(ch)en, Filtergefaße, Chromatographiesaulen, „columns", „spin columns" oder „Single spin columns" bekannt.
Eine weitere Ausfuhrungsform der Adsorptivmedien zur Nukleinsäure- Isolierung stellen magnetische Silika-Partikel dar, Prinzipiell sind die in der Erfindung vorgestellten Kontroll-Reagenzien auch kompatibel mit diesen Methoden der Nukleinsaure-Isolierung ,
Die Firma QIAGEN GmbH aus Hilden, Deutschland, bietet ein breites Spektrum an Reinigungsprotokollen und an dafür benötigten Produkten für unterschiedliche Biomolekule aus einer Vielzahl biologischer Proben an, die auf dem Grundprinzip des "Bιnd-Wash-Elute"-Protokolls basieren, Im Handel ist beispielweise das Produkt "QIAGEN QIAprep Spin Miniprep Kit" erhaltlich, Zu diesem Zweck werden unterschiedliche Filtermaterialien und - Vorrichtungen verwendet, wie beispielsweise beschrieben in WO 03/040364 oder US 6, 277, 648,
Bekannt ist also, zur Prozessierung einer Probe ein Gefäß zu verwenden, welches oben offen und verschließbar ist, Am Grund des Gefäßes befindet sich eine Membran als Filterelement, Unterhalb der Membran befindet sich eine Öffnung in Form eines Stutzens, die mit beispielsweise einem Schlauch verbunden ist. Über diesen Schlauch kann Flüssigkeit aus dem Gefäß abgesaugt werden
Zur Prozessierung wird die biologische Probe oben in das Gefäß hineingegeben. Anschließend wird die jeweils vorgesehen Losung hineingegeben, also z. B . zunächst ein Lysepuffer, um die Probe aufzuschließen . Ist die Probe aufgeschlossen worden, so wird der Lysepuffer nach unten aus dem Gefäß herausgesaugt, Das Lysat enthalt chemisch/physikalische Bedingungen, die eine Bindung der Nukleinsäure an das Tragermaterial bewirken . Die aufgeschlossene Probe (Lysat) wird anschließend gewaschen und eluiert.
Nachdem die Nukleinsäure der aufgeschlossenen Probe an die Membran gebunden oder adsorbiert wurde, werden Waschpuffer von oben in das Gefäß gegeben und nach unten aus dem Gefäß abgesaugt oder zentrifugiert. Der Waschpuffer erhalt diese Bindung aufrecht, wahrend er gleichzeitig ungewunschte Zellbestandteile aus der Membran wascht,
Waschpuffer enthalten in der Regel Ethanol , Ethanol bewirkt eine Bindung von Nukleinsäure unter bestimmten Voraussetzungen an eine als
Filterelement wirkende Membran , Eine als Filter dienende Membran weist ein gewisses Totvolumen von beispielsweise 40 μl auf , Es kann daher nicht verhindert werden, dass stets eine entsprechende Menge an Ethanol im Filter verbleibt. Ethanol tragt einerseits unerwünscht zur Bindung bei . Andererseits kann Ethanol aber auch das Ergebnis einer spateren Analyse verfalschen. Um die Nukleinsäure aus dem Gefäß nach unten entnehmen zu können und fehlerhafte Analyseergebnisse zu vermeiden, wird zunächst Ethanol entfernt, beispielsweise, indem das Gefäß zentrifugiert wird. Das Ethanol entweicht so aus der Membran und kann nach unten entnommen werden , Im Anschluss daran ist die Membran hinreichend frei von Ethanol , Mittels Vakuum und Wärmezufuhr kann Ethanol aus der Membran alternativ entfernt werden, LJm die Nukleinsäure wieder von der Membran zu losen, wird eluiert. Dies geschieht regelmäßig mit Wasser oder einer schwach salzhaltigen wassπgen pH-stabilisierten Losung Im Anschluss an die Elution kann die Nukleinsäure durch die Membran hindurch aus dem Gefäß nach unten hin entnommen werden .
Alternativ kann auch Adsorption an Magnetpartikeln und anschließendes Waschen und Elution erfolgen .
Die geeigneten Adsorptionsmaterialien, die Waschpuffer und die
Elutionspuffer sind Fachleuten bekannt und werden erfindungsgemaß geeignet ausgewählt.
In vorteilhafter Weise kann das Adsorbieren/Waschen/Eluieren bei der Praparation von DNA z. B. gemäß dem „QIAamp DNA Micro Handbook"
(wwwl , qiagen.com/HB/QIAampDNAMicro) auf einer QIAamp MinElute Spin Column erfolgen, die von der Fa , Qiagen angeboten wird, Nach der Bindung wird zentrifugiert und anschließend mit einem oder ggf . mehreren geeigneten Puffern gewaschen, z. B, mit Buffer AWl (GuanidiniumHydrochlorid, Ethanol), Buffer AW2 (NaCI, Tris/Cl pH 7,5,
Ethanol), wobei üblicherweise nach jedem Waschschritt erneut zentrifugiert wird, um die Waschpuffer zu entfernen, Für die anschließende Elution der Nukleinsäuren kann z.B. der Puffer TE ( 1 0 mM Tris/Cl pH 8,0; 1 mM EDTA) eingesetzt werden , Üblicherweise wir nach der Elution ebenfalls zentrifugiert, um die Nukleinsäuren vollständig von der Membran zu entfernen,
Alternativ kann auch für die RNA-Praparation z. B . eine RNeasy Spin Column der Fa . QIAGEN verwendet und gemäß dem RNeasy Mini Handbook (wwwl .qiagen .com/HB/RNeasyMini) verfahren werden. In diesem Fall können z. B. die Waschpuffer Buffer RWl (Guanidiniumisocyanat, Ethanol) und RPE (Tris/Cl pH 7,5, Ethanol) und zur Elution RNAse-freies Wasser verwendet werden, wobei nach jedem Wasch-/Elutιonsschritt ebenfalls vorteilhafterweise eluiert wird . Bei Durchfuhrung des Prαpαrαtions- und Nαchweisverfαhrens in mikrofluidischen Vorrichtungen werden αis Wαschpuffer bevorzugt Buffer AWl oder Buffer RWl bzw. Buffer AW2 oder Buffer RPE benutzt, und als Elutionspuffer bevorzugt RNAse-freies Wasser verwendet. Das Zentπfugieren nach jedem Wasch- bzw. Elutionsschritt entfallt hierbei ,
Als Nukleinsaurenachweisverfahren ist ebenfalls jedes übliche Verfahren für die Anwendung des erfindungsgemaßen Reagenz geeignet. Bevorzugt wird das erfindungsgemaße Präparat in PCR-Nachweisverfahren eingesetzt, besonders bevorzugt in Duplex-Realtime PCR-Verfahren wie eingangs beschrieben. Für die Erläuterung der PCR wird auf die eingangs gegebene Erläuterung verweisen.
Die Wahl des im erfindungsgemaßen Reagenz vorliegenden Mikroorganismus bestimmt, welcher Typ Nukleinsäure in der zu analysierenden Probe nachgewiesen werden kann. Bei Verwendung von Bakterien können sowohl RNA als auch DNA nachgewiesen werden, bevorzugt ist DNA. RNA-Nachweise aus Bakterien sind zwar grundsatzlich möglich, aber nicht sinnvoll, da nicht nur die RNA spezifisch amplifiziert wird, sondern auch die DNA. Bei Verwendung von Bakteriophagen und Viren bestimmt die Art der
Nukleinsäure des Genoms im Viruspartikel, ob RNA oder DNA in der Probe nachgewiesen wird, Bei Verwendung von Protozoen oder Hefepilzen als Kontroll-Mikroorganismus kann nicht nur deren chromosomale DNA nachgewiesen werden, sondern auch eine selektive Amplifikation von RNA ist möglich, da dies Organismen über Mechanismen des mRNA-Sphcing verfugen
Für die Durchfuhrung der PCR sind alle gangigen Reagenzien und dafür verfugbare Kits einsetzbar. Die Primer, Desoxynukleotid-Triphosphat, Polymerase, die Additive, Cosolventien und Markierungs-Sonden sind, wie eingangs beschrieben, dem Fachmann bekannt und werden geeignet ausgewählt, Beispielsweise können für eine TaqMan®-Analyse entsprechende PCR-Reagenziensatze von QIAGEN, wie der QuantiTect Probe PCR Mastermix, der QuαntiTect Probe RT-PCR MαsterMix, bzw der QuαntTect RT Mix erfmduπgsgemαß verwendet werden
Als Pπmer können z. B „fr Forward" (CTTCTGATCCGCATAGTGACGAC) (SEQ ID NO 7), „fr Reverse" (AACGGTCATTCGCCTCCAGCAG) (SEQ I D NO: 8) und „fr Probe" (,6-FAM'-TAGGGGATGGTAACGACGAAGCA-,BHQl α') (SEQ ID NO 9) eingesetzi werden, in dieser Kombination besonders vorteilhaft, wenn als Mikioorganismus der Phage fr eingesetzt wird
Insbesondere bei Verwendung von Corynebacteπum glutamicum als
Mikroorganismus wird in vorteilhafter Weise die Kombination von CG Forward (AAGCTCCAGCCACCCAAACTAC) (SEQ ID NO: 1 ), CG Reverse (CTACCAACCACTAATGCGTCArC) (SEQ ID NO: 2) und CG Probe (,6-FAM'- ATCGCCTTCCAGACGCTCAACG-, BHQI a') (SEQ ID NO' 3) eingesetzt.
Wird Bacillus subtils als Kontroll-Mikroorganismus verwendet, so kann dieser mit folgender Primer-Kombination nachgewiesen werden: BS Forward (ACATCTTACCGCAACTACGACCAT) (SEQ ID NO 4), BS Reverse (TAGCATAGTCTTTGTCCCACCGTA) (SEQ ID NO:5) und BS Probe (,6-FAM'- GGAGGCGATCTATGTCTTGTCCA -,BHQI a') (SEQ ID NO 6) .
Die Primer können mit Fachleuten bekannten Verfahren synthetisch hergestellt werden oder sind kommerziell bei den Firmen Operon oder MWG Biotech erhältlich
Als Marker können alle Marker verwendet werden, die Fachleuten bekannt sind. Insbesondere werden zur Detektion der Kontroll-Mikroorganismen Fluoreszenzmarker verwendet, besonders vorteilhaft die Kombination von 6- FAM am 5' Ende des Ohgonukleotid und „Black Hole Quencher" (BHQ) am 3'- Ende Für die Detektion der in der Probe nachzuweisenden Mikroorganismen werden ebenfalls geeignete Marker z B „HEX" ausgewählt, die sich von den genannten unterscheiden Der Fachmann wird je nach Bedarf auch andere Fluorophore einsetzen . Als Lösungsmittel für die PCR Reagenzien und Primer wird üblicherweise Wasser verwendet.
Zur PCR werden weiterhin Templat-Aliquots in Form des Eluats zugegeben, die die zu amphfizierenden Nukleinsäuren enthalten,
Die Temperaturzyklen der PCR werden vom Fachmann je nach der zugiundehegenden Ausgangsnukleinsaure geeignet ausgewählt und können z. B. 1 5 Mm bei 95°C und 40 x [1 5 Sekunden bei 95°C, 1 Minute bei 6O0C] sein oder für eine RNA-basierende Amplifikation 30 Minuten bei 5O0C
(Reverse Transkription), 1 5 Minuten bei 95°C und 40 x [1 5 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 6O0C] betragen . Die Kontrolle der Temperatur und das Erwarmen und Abkühlen erfolgen auf übliche Weise,
Der Nachweis der Amplifizierungsprodukte kann je nach den verwendeten
Markern wie eingangs beschrieben auf unterschiedliche Weise erfolgen. Dies ist dem Fachmann bekannt. Bei Verwendung von Fluoreszenzmarkern erfolgt die Detektion fluoreszenzspektrometrisch. In üblichen PCR-Verfahren können bis zu 6 verschiedene Fluorophore gleichzeitig nachgewiesen werden (6- Kanal-Multiplexing), Es wird dann die Anzahl von PCR-Cyclen bestimmt, ab der ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenz des spezifischen Markers auftritt (Ct, threshold cycle) .
Beobachtet man bei diesem Nachweis sowohl Amplifizierungsprodukte der Nukleinsäuren aus dem Kontroll-Mikroorganismus als auch aus der zu analysierenden Probe, so kann man davon ausgehen, dass sowohl die Praparation als auch die Amplifikation für beide korrekt verlaufen sind und dass der Nachweis des zu analysierenden Mikroorganismus positiv ist,
Beobachtet man nur Amplifizierungsprodukte von Nukleinsäuren des nachzuweisenden Mikroorganismus, aber nicht des Kontroll-Mikroorganismus, oder aber gar keine Amplifizierungsprodukte, war die Praparation und/oder die Amplifikation nicht korrekt und muss wiederholt werden . Beobachtet man nui Amplifizierungsprodukte der Nukleinsäuren des Kontroll- Mikroorganismus, aber keine des nachzuweisenden Mikroorganismus, war die Praparation und Amplifikation korrekt, und das Testergebnis ist negativ
Erfinsungsgemaße Kιts-of-parts beinhalten das erfindunsgemaße diagnostische Reagenz sowie alle zur Durchfuhrung der gewünschten Nukleinsaurepraparations- und/oder -nachweisreaktionen notwendigen Lösungsmittel und Reagenzien wie Primer, die vorstehend genannt sind und vom Fachmann geeignet ausgewählt werden
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung naher
Die in den Beispielen verwendeten Mikrorganismen sind kommerziell bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, erhältlich Es handelt sich um Bacillus subtihs ATCC 23857, Corynebactenum glutamicum ATCC 1 3032 und E coli Phage fr ATCC 1 5767-B 1
Die Begriffe „Standardabweichung", „Mittelwert" und „Variationskoeffizient (CV)" werden im folgenden wie übliche verwendet und mit üblichen statistischen Methoden ermittelt Für diagnostische Proben sollte ein CV geringer sein als 8%
Beispiel 1 Herstellung von Tabletten
a) Tablette A {Corynebactenum glutamicum)
3 g Hydroxyethylstarke, 0,5 ml 20 % PEG-8000, 1 ,5 ml TE ( 1 0 mM Trιs-Cl pH 8,0, 1 mN EDTA), 1 5 ml Ubernacht-Kultur von Corynebactπum glutamicum (erhalten wie vorstehend beschrieben) in 2 YT-Medιum (yeast extract tryptone medium, Hefeextrakt-Trypton-Medium)) und weinige Krümel Fuchsin (Fa Fluka) werden in eine Emmal-Wageschale gegeben und mit einem Spatel zu einer homogenen Masse vermischt Die Masse wird mit dem Spatel in eine Spritze überfuhrt und über eine stumpfe Kanüle als kleine Kugelchen (Durchmesser 1 -2 mm) auf Parafilmfohe portioniert Anschließend werden die erhaltenen Tabletten über Nacht im Abzug getrocknet Man erhalt auf diese Weise je nach verwendeten Aliquots 50 bis 200 Tabletten
b) Tablette B {Corynebacteπum glutamicum)
1 g Hydroxyethylstarke, 500 μl 20 % PEG-8000, 500 μl Ubernacht-Kultur von Corynebacteπum glutamicum in 2YT-Medιum (erhalten wie vorstehend beschrieben), 1 kleine Spatelspitze Methylenblau, 750 μl Puffer P (1 ,4 % SDS, 50 mM Titπplex, 500 mM NaCI, 2 % Polyvinylpyrrohdon, 1 00 mM Na-Acetat- Tπhydrat pH 5,4) 500 μl Puffer L (1 55 mM NH4CI, 1 0 mM KHCO3, und 50 mg Carboxymethylcellulose werden wie bei Tablette A gemischt, auf Folie portioniert und über Nacht getrocknet
c) Tablette C (Phage fr)
3 g Hydroxyethylstarke, 1 50 mg Carboxymethylcellulose, 1 ml 20 % PEG- 8000, 1 ml Puffer B (50 mM EDTA, 50 mM Trιs/Cl pH 8,0, 0,5 % Tween 20, 0,5 % Triton X- 1 00), 1 ml bidest Wasser, 1 kleine Spatelspitze Eosin und 1 ml Phagenuberstand des Phagen fr (erhalten wie vorstehend beschrieben) werden wie bei Tablette A gemischt, portioniert und über Nacht getrocknet
d) Tablette D (Phage fr)
Die Tablette wurde genauso wie Tablette C hergestellt mit der Ausnahme, dass 1 ml Pagenuberstandslosung durch 1 ml bidest Wasser ersetzt wurde Nach dem Trocknen wurden je 4 μl Phagenuberstandslosung (erhalten wie vorstehend beschrieben) auf jede getrocknete Tablette pipettiert und erneut über Nacht im Abzug nachgetrocknet
e) Tablette E (Bakterien mit Glasperlen)
0, 75 g Hydroxyethylstarke, 1 50 mg Polyvmylalkohol 30 000-70 000, 1 50 mg Polyvinylpyrolhdon KI 5 MG- I 0 000 und 1 5,9 g Glasbeads 425-600 μm (Sigma-Aldπch G8772-500G) werden in einer Wageschale abgewogen Nach Zugabe von 1 , 5 ml Puffer B [50 mM EDTA, 50 mM TπsCI pH 8 0, 0 5 % Tween 20, 0 5 % Triton X- I 00], 1 ,5 ml 20% PEG 8000, 20 μ\ Malachitgrün- Losung (Fluka) sowie 90 μl Wacker Chemie-Antischaummittel auf Silikon Basis wird durch sorgfaltiges Ruhren eine homogene Suspension hergestellt Nun wird in diese Masse 1 ,5 ml Bakteπenkulturflussigkeit (erhalten wie vorstehend beschrieben) ganz vorsichtig eingerührt Ahquots dieser Masse werden dann auf einer geeigneten Grundlage getrocknet
f) Tablette F (Bakterien mit Glasperlen)
1 ,5 g Hydroxyethylstarke, 50mg CMC (Carboxymethylcellulose), und 8 g Glasbeads 1 00 μm (Sigma-Aldπch G4649-500G) werden in einer Wageschale abgewogen Nach Zugabe von 0,5 ml Puffer B [50 mM EDTA, 50 mM TπsCI pH 8 0, 0 5 % Tween 20, 0 5 % Triton X- 1 00], 0,5 ml 20% PEG 8000, 1 ,25 ml bidest Wasser und 1 Tropfen Gentianviolett-Losung (Fluka) wird durch sorgfaltiges Ruhren eine homogene Suspension erstellt Nun wird in diese Masse 0, 75 ml Bakteπenkulturflussigkeit (erhalten wie vorstehend beschrieben) ganz vorsichtig eingerührt Ahquots dieser Masse werden dann auf einer geeigneten Grundlage getrocknet
Beispiel 2 (Nukleinsaure-Praparation und -Amplifikgtion)
a) Lyse/Praparation
Je eine Tablette A wurde in ein 2 ml Rohrchen gegeben und mit 200 μl Blut (Beispiel 2a) bzw 200 μl PBS-Puffer (Beispiel 2b) versetzt Zu jedem Rohrchen wurden je 20 μl QIAGEN Proteinase K Losung und 40 μl Lysozym-Losung (je 20 mg/ml in Wasser) gegeben Die Inkubation erfolgte wahrend 1 0 Minuten bei 56 0C auf einem Eppendorf-Thermomixer bei 1 400 Upm Schuttelgeschwmdigkeit Anschließend wurden 200 μl Puffer G (3 M GITC (Guanidmiumthiocyanat), 20 % Nonidet® P40) zugegeben und erneut bei 56°C wahrend 1 0 Minuten auf einem Eppendorf-Thermomixer bei 1 400 Upm Schuttelgeschwmdigkeit inkubiert Dann wurden 200 μl Ethanol zugegeben und gut mit dem Rohrcheninhalt vermischt b) Reinigung
Folgende Schritte wurden anschließend mit jeder der beiden Proben gemäß dem „QIAmp DNA Micro Handbook" durchgeführt
Bindung Das gesamte Gemisch wurde auf auf QIAmp MinElute
Spin Cυlumn geben und 1 Minute bei 6000 x g zentπfugiert Waschen mit 500 μl Puffer AWl waschen, bei 6000 x g 1 Minute zentπfugieren,
500 μl Puffer AW2 zugeben, 3 Minuten bei maximaler g-Zahl zentπfugieren
Trocknen „Dry Spin" (Trocknungschritt der Spin Column Membran in der Zentrifuge in Abwesennheit von jeglichen Waschpuffer-Resten) für 1 Minute bei maximaler g-Zahl, um alles Losungsmittel zu entfernen
Elution mit 80 μl Puffer TE (1 0 mM Trιs/Cl pH 8,0, T mM EDTA) eluieren, 1 Minute bei 6000 x g zentπfugieren
Dasselbe Verfahren wurde für Tablette B durchgeführt
c) Mengenbestimmung durch UV Quantifizierung und Agarose- Gelelektrophorese
Die Mengenbestimmung der Nukleinsäuren erfolgte bei allen erhaltenen Eluaten (Tablette A und B, jeweils in Blut und PBS) mittels Messung der optischen Dichte bei 260 nm am Spektralphotometer Die optische Dichte wurde jeweils mit einer Wellenlange des Lichts von 260 nm ermittelt Die optische Dichte ist ein Maß für die Menge der im Eluat vorliegenden DNA 1 OD entspricht 50 mg/ml doppelstrangiger DNA Aus der optischen Dichte kann damit (bei Verwendung einer geeigneten Verdünnung) die Konzentration der im Eluat der Probe vorhandenen DNA berechnet werden
Nach der Praparation gemäß den vorbeschriebenen Protokollen wurden die Nukleinsäuren auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt Es wurde eine Losung von 0, 7% w/v Agarose bis zum Schmelzen der Agarosepartikel erhitzt, und nach der Homogenisierung ließ man sie in einer Gelform erstarren Das Gel enthielt Taschen, in die die Nukleinsaure-haltige Losung pipettiert und elektrophoretisch aufgetrennt wurde In diesem Fall wurden 1 5 μl des Eluats nach Nukleinsäure Praparation aufgetragen, wobei in Figur 1 der Bildausschnitt -A die Ergebnisse der Tablette A und -B die Ergebnisse der Tablette B darstellt
Nach der Auftrennung wurden die Nukleinsaurefragmente in einem Ethidiumbromid-haltigen Wasserbad angefärbt, auf einer UV-Leuchtplatte zum Leuchten gebracht und durch ein Fotodokumentationssystem abgelichtet Die genomische DNA ist als helle Bande im oberen Drittel der linken Seite (Blut) von Figur I A bzw der unteren Hälfte der linken Seite (Blut) der Fig 1 A zu sehen
Es ist deutlich erkennbar, dass nur in den Blut-Proben genomische DNA (aus den weißen Blutkörperchen) im Gel sichtbar ist, wahrend in den PBS-Proben laut Gel keine DNA vorliegt Dies zeigt, dass die in den erfindungsgemaßen Präparaten A und B eingesetzte Menge Corynebacteπum glutamicum zu gering ist, um in der Agarosegelelektrophorese nachgewiesen zu werden
Die Ergebnisse der Quantifizierung der Optischen Dichte der Eluate der in Beispiel 2 erhaltenen Mengen an Nukleinsäuren (vor der PCR) sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt Tabelle 1
In den Blut-Proben wurden jeweils ca 20-30 ng/μl DNA gefunden (aus weißen Blutkörperchen), wahrend in den PBS-Proben nur ca 5-6 ng/μl DNA vorlagen, die aus dem im Präparat eingesetzten C glutamicum stammten Wahrend also die Gelelektrophorese nicht empfindlich genug ist, um die geringen Mengen Kontroll-Mikroorgansimus nachzuweisen, reicht die Empfindlichkeit der photometrischen Bestimmung dafür aus
Beispiel 3 Quantitative PCR (spezifisch für C glutamicum)
Die für C glutamicum spezifische Real Time PCR wurde mit 1 0,0 μl QIAGEN QuantiTect Probe PCR Mastermix, 0, 1 μl CG Forward (SEQ ID NO 1 ) ( 1 00 μM), 0, 1 0 μl CG Reverse (SEQ ID NO 2) (l OOμM), 0,05 μl CG Probe (SEQ ID NO 3) ( 1 00 μM), 7, 75 μl bidest Wasser und 2,0 μl Templat-Ahquots der in Beispiel 2 mit Blut- bzw PBS-Proben jeweils mit Tablette A und B erhaltenen Eluate durchgeführt Die Temperaturzyklen waren 1 5 Minuten bei 95 0C und 40 x (1 5 Sekunden 95 0C, 1 Minute bei 60 0C) Die Amphfikation wurde jeweils mit Eluaten von 4 einzelnen Nukleinsaurepraparationen durchgeführt
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt Das Histogramm zeigt die durch die PCR nachgewesene Menge C glutamicum DNA (in pg) pro Reaktion bei einer Stichprobenmenge von 4 Es wurden jeweils die Ct-Werte in der RT-PCR fluoreszenzspektroskopisch ermittelt, Mit Hilfe einer Eichkurve wurde die jeweilige Anfαngskonzeπtrαtion der DNA im jeweiligen Eluαt ermittelt. Die Werte der 4 unterschiedlichen Ansätze und Prαpαrαtionen liegen innerhalb einer Standardabweichung Die Menge an C, glutamicum ist in allen Proben und Ansätzen etwa gleich . Dies zeigt, dass die erfindungsgemaßen
Präparate in reproduzierbarer Weise für die Kontrolle sowohl der Praparation von Nukleinsäuren als auch der PCR eingesetzt werden können,
Beispiel 4: Duplex-g PCR
Präparate von C, glutamicum wurden nach der Tabletten-Rezeptur B (Beispiel I b) hergestellt. In drei unabhängigen Bestimmungen wurde jeweils 1 Präparat mit 200 μl Vollblut versetzt. Nach dem Protokoll des Beispiels 2 wurden die Nukleinsäuren präpariert, und es wurde jeweils mit 2 μl Eluat eine quantitative Duplex-RT-PCR mit den für C. glutamicum spezifischen Primern CG Forward (SEQ ID NO: 1 ), CG Reverse (SEQ ID NO.2) und der Sonde CG Probe (SEQ ID NO: 3) und den für das humane ß-Aktιn-Gen spezifischen Primern bactl OO Forward GAAGGTCTCAAACATGATCTGG (SEQ ID NO: 1 0), bactl OO Reverse GGGACGACATGGAGAAAATC (SEQ ID NO: 1 1 ) und der Sonde bacti 00 Probe CCCCGTGCTGCTGACCGAG (SEQ ID NO: 1 2) mit den
Fluorophoren Hex und BHQ durchgeführt, Die Reaktionsbedingungen wurden gemäß dem Beispiel 3 gewählt, mit der Ausnahme, dass die Primer wurden gemäß der Target DNA wie vorstehend genannt ausgetauscht wurden
Die Treshold-Cycles (Ct) der quantitativen PCRs der einzeln präparierten
Blutproben wurden verglichen. Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Es zeigt sich, dass die Ct's sowohl für C. glutamicum als auch für ß-Aktιn etwa gleich sind . Dies bedeutet, dass das erfmdungsgemaße Präparat die Kontrolle der Reaktionsbedingungen in Praparation und Amplifikation zuverlässig ermöglicht und dabei die Praparation und Amplifikation des Targets Human-ß-Aktin-Gen nicht stört.
Beispiel 5 nachträgliche Behandlung von Tabletten mit unterschiedlichen Zellzahlen von S, subtilis Tabletten wurden wie bei Tablette C (s Beispiel I c) hergestellt mit der Ausnahme, dass 1 ml Phagenuberstand durch 1 ml bidest Wasser ersetzt wurde, und bei Normalbedingungen über Nacht getrocknet Anschließend wurden unterschiedliche Mengen ß subtilis in je 1 0 μl Kulturmedium auf die getrockneten Tabletten pipettiert Die Präparate wurden anschließend erneut über Nacht bei Normalbedingungen getrocknet
Die eingesetzten Zellzahlen waren a) 5 x 1 05 b) l X l O6 c) 5 x 1 04 d) 1 x 1 04 e) 5 x 1 03 f) 1 x 1 03
Die Nukleinsaure-Praparation erfolgte jeweils als Vierfachbestimmung mit je 200 μl Blut und je einer der Tabletten a) bis f) unter Zusatz von 20 μl Proteinase K (Fa Qiagen) Diese Mischung wurde jeweils 1 0 Minuten bei 56 0C im Thermomixer geschüttelt Nach Zugabe von je 200 μl Puffer G (3 M GITC, 20% NP-40) wurde erneut 1 0 Minuten bei 56 0C im Thermomixer geschüttelt Die Reinigung erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben durch eine QIAmp Spin Column
Die quantitative PCR wurde gemäß dem Beispiel 3 mit den für S subtilis spezifischen Primern BS Forward (SEQ ID NO 4), BS Reverse (SEQ ID NO 5) und der Sonde BS Probe (SEQ ID NO 6) sowie mit den für das humane Gen für H l 8s spezifischen Primern H l 8 Forward (SEQ ID NO 1 3), H l 8 Reverse (SEQ ID NO 1 4) und der Sonde H l 8 Probe (SEQ ID NO 1 5) und den Fluorophoren HEX und BHQ durchgeführt
Das Ergebnis ist in Figur 4 dargestellt Gezeigt sind gemittelten Cts der 4 Versuche mit den Tabletten a) bis f) in Abhängigkeit von den eingesetzten Zellzahlen (gefüllte Raute) Wie anhand der Regressionsgeraden und des angegebenen Bestimmtheitsmaßes zu erkennen ist, besteht ein linearer Zusammenhang zwischen eingesetzter Zellzahl und Ct Die oftenen Dreiecke zeigen die zugehörigen Ct-Werte des humanen H 1 8-Gens Werte auf gleicher Hohe gehören gemeinsam zur jeweiligen Probe Die Werte der H l 8 qPCRs haben alle einen Mittelwert von 21 , 2 und einen Variationskoeffizienten (CV) von 0,96%
Es zeigt sich, anhand der Regressionsgeraden in ihrem Bestirnmtheitsmaß (R2), sowie des geringen CV, dass die erfmdungsgemaßen Präparate auch durch nachtragliche Behandlung der Tabletten mit den Mikroorganismen hergestellt werden können und sehr gut als interner Standard für Nukleinsaurepraparations- und -amplifikationsverfahren geeignet sind Ein verlasshches Detektionshmit für die erfmdungsgemaßen Präparate liegt bei 1 000 Zellen pro Tablette
Beispiel 6 Reverse Transkription
Unter Zusatz von Tablette C (s Beispiel I c) wurde eine Plasmaprobe wie folgt unter Verwendung des „QIAamp Virus Kits" (Qiagen GmbH, Hilden Deutschland) präpariert und amphfiziert
1 Tablette C wurde mit 1 40 μl Plasma und 560 μl Puffer AVL 2 Minuten bei 1 400 Upm im Thermomixer gemischt, bis die Tablette gelost war Dann wurde 1 0 Minuten bei Normalbedingungen unter Zusatz von 560 μl Ethanol auf einem Vortex®-Gerat lysiert Das Gemisch wurde zum Binden 2 mal auf eine QIAamp-Saule gegeben und 1 Minute bei 6000 x g zentπfugiert Dann wurde zum Waschen mit 500 μl Puffer AWl 1 Minute bei 6000 x g zenfπfugiert und anschließend mit 500 μl Puffer AW2 3 Minuten bei maximaler g-Zahl zentπfugiert Nach 1 Minute Zentπfugieren bei maximaler g-Zahl wurde mit 80 μl Puffer TE eluiert und 1 Minute bei 6000 x g zentπfugierr
Die anschließend quantitative PCR wurde mit den E coli Phagen fr- spezifischen Primern und Sonden fr Forward (SEQ ID NO 7), fr Reverse (SEQ ID NO 8) und fr Probe (SEQ I D NO 9) mit 1 2, 50 μl QIAGEN QuantiTect Probe RT- PCR Mαstermix 2x, 0, 25 μl QuαntiTect RT Mix, 0, 1 0 μl fr Reverse (1 00 μM), 0, 1 0 μl fr Reverse (l OOμM), 0,05 μl fr Probe ( 1 00 μM), 1 0,00 μl bidest. Wasser und 2,00 μl Templat-Aliquots und 2,00 μl des vorstehend erhaltenen Eluats durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 30 Minuten bei 50 0C, 1 5 Minuten bei 95 0C und 40 x ( 1 5 Sekunden 95 0C, 1 Minute bei 60 0C) . Der Versuch wurde insgesamt 24 mal durchgeführt,
Das Ergebnis ist in Figur 5 dargestellt. Die Figur zeigt die Entwicklung des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Nummer des PCR-Zyklus, 24 einzelne Proben sind gleichzeitig dargestellt, Der Mittelwert der 24 quantitativen PCRs beträgt 1 7,8 und der Variationskoeffizient CV 2, 1 % .
Das Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Präparate hervorragend in reproduzierbarere Weise zur Verwendung als interner Standard in RNA- Präparations- und nachfolgenden RNA-Amplifikationsverfahren geeignet sind.
SEQUENCE LISTING
<110> QIAGEN GmbH
<120> Diagnostisches Reagenz, enthaltend Biopartikel, Verfahren zu seiner
Herstellung und seine Verwendung als interner Standard in
Nuklemsaurepraparations- und Nukleinsaurenachweis-Verfahren
<130> H 64071WO
<160> 15 <170> Patentin version 3.1
<210> 1
<211 > 23
<212> DNA
<213> kunstliche Sequenz <220>
<223> CG Forward Primer (Forward-Primer für PCR von C. glutamicum)
<400> 1 aagctccagc cacccaaaac tac 23
<210> 2 <211 > 23
<212> DNA
<213> kunstliche Sequenz
<220>
<223> CG Reverse Primer (Reverse-Pπmer für PCR von C glutamicum) <400> 2 ctaccaacca ctaatgcgtc gtc 23
<210> 3
<211 > 22
<212> DNA <213> kunstliche Sequenz
<220>
<223> CG Probe (Sonde für PCR von C. glutamicum)
<400> 3 atcgccttcc agacgctcaa cg 22 <210> 4
<211 > 24
<212> DNA
< 213 > künstliche Sequenz <220>
<223> BS Forwαrd Primer (Forwαrd-Pπmer für PCR von B subtilis)
<400> 4 αcαtctiαcc gcααctαcgα ccαt 24
<210> 5 <211 > 24
<212> DNA
<213> künstliche Sequenz
<220>
<223> BS Reverse Primer (Reverse-Pπmer für PCR von B, subtilis) <400> 5 tαgcαtαgtc tttgtcccαc cgtα 24
<210> 6
<211 > 23
<212> DNA <213> künstliche Sequenz
<220>
<223> BS Probe (Sonde für PCR von B, subtilis)
<400> 6 ggαggcgαtc tαtgtcttgt ccα 23 <210> 7
<211 > 23
<212> DNA
<213> künstliche Sequenz
<220> <223> fr Forwαrd Primer (Forwαrd-Pπmer für PCR von E. coli Phαge fr)
<400> 7 cttdgαtcc gcαtαgtgαc gαc 23
<210> 8
<211 > 22 <212> DNA
< 213 > kunstliche Sequenz
<220>
<223> fr Reverse Primer (Reverse-Primer für PCR von E, coli Phαge fr) <400> 8 ααcggtcαtt cgcctccαgc αg 22
<210> 9
<211 > 23
<212> DNA <213> kunstliche Sequenz
<220>
<223> fr Probe (Sonde für PCR von E. coli Phαge fr)
<400> 9 tαggggαtgg tααcgαcgαα gcα 23 <210> 10
<211 > 22
<212> DNA
<213> kunstliche Sequenz
<220> <223> bαct 100 Forwαrd Primer (Forwαrd-Pπmer für PCR von bαct 100)
<400> 10 gααggtctcα ααcαtgαtct gg 22
<210> 11
<211 > 20 <212> DNA
<213> künstliche Sequenz
<220>
<223> bαct 100 Reverse Pπmer (Reverse Primer für PCR von bαct 100)
<400> 11 gggαcgαcαt ggαgααααtc 20
<210> 12
<211 > 19
<212> DNA
<213> kunstliche Sequenz <220>
<223> bαct 100 Probe (Sonde für PCR von bαct 100)
<400> 12 ccccgtgctg ctgαccgαg 19 <210> 13
<211 > 22
<212> DNA
<213> künstliche Sequenz
<220> <223> Hl 8 Forwαrd Primer (Forwαrcl-Primer für PCR von Humαn-Hl 8-Gen)
<400> 13 gccgctαgαg gtgαααttct tg 22
<210> 14
<211 > 21 <212> DNA
<213> künstliche Sequenz
<220>
<223> Hl 8 Reverse Primer (Reverse-Pπmer für PCR von Humαn-Hl 8-Gen)
<400> 14 cαttcttggc αααtgctttc g 21
<210> 15
<211 > 21
<212> DNA
<213> künstliche Sequenz <220>
<223> Hl 8 Probe (Sonde für PCR von Humαn-Hl 8-Gen)
<400> 15 αccggcgcαα gαcggαccαg α 21

Claims

Patentansprüche
1 Diagnostisches Reagenz in Form einer bei Normalbedingungen formstabilen Zusammensetzung, enthaltend Biopartikel sowie übliche pharmazeutische Hilfsstoffe, wobei die Biopartikel ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Sporen, Parasiten, Pflanzenzellen, tierischen oder menschlichen Zellen, Gameten, Plasmiden und Viroiden besteht
2 Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1 als interner Standard für Nukleinsaurepraparations- und -nachweisverfahren
3 Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1 und/oder 2, darüber hinaus enthaltend Puffersubstanzen, Detergenzien, Chelatbildner und/oder Farbstoffe
4 Diagnostisches Reagenz nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei die pharmazeutischen Hilfsstoffe ausgewählt sind aus Fließmitteln, Bindemitteln, Sprengmitteln und/oder Füllstoffen
5 Diagnostisches Reagenz nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend Glaspartikel, Zirkoniumpartikel, magnetische Sihkapartikel, Anionaustauscherharz-Partikel und/oder
Si lzι u mcarbid partikel
6 Diagnostisches Reagenz nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend ein oder mehrere Enzyme
7 Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte a) Mischen der Bestandteile in den gewünschten Mengen b) Portionieren auf einem geeigneten Tragermateπal c) Trocknen
Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die folgenden Schritte a) Mischen der Bestandteile in den gewünschten Mengen m\\ Ausnahme der Biopartikel b) Portionieren auf einem geeigneten Tragermateπal c) Trocknen d) Auftragen der Biopartikel in Form einer Losung auf den getrockneten Portionen e) erneutes Trocknen
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Trocknen jeweils bei Normalbedingungen durchgeführt wird
Diagnostisches Reagenz, erhältlich nach dem Verfahren aus Anspruch 7, 8 oder 9
Verwendung des diagnostischen Reagenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 oder 1 0 als interner Standard bei Nuklemsaurepraparationen mit optional nachfolgendem Nukleinsaurenachweis
Verwendung nach Anspruch 1 1 zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren
Verwendung nach Anspruch 1 1 oder 1 2, wobei die
Nuklemsaurepraparationen in einer mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt werden
Verfahren zum Nachweis von Biopartikeln, ausgewählt aus der aus Bakterien, Viren, Pilzen, Protozoen, Bakteriophagen, Hefen, Pilzen, Sporen, Parasiten, Pflanzenzellen, tierischen oder menschlichen Zellen, Gameten, Plasmiden und Viroiden bestehenden Gruppe, umfassend folgende Schritte
• Entnahme von Probenmaterial
• Lyse der darin enthaltenen Zellen
• Praparation der freigesetzten Nukleinsäuren
• Nukleinsaure-Amplifikation durch PCR
• Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, dadurch charakterisiert, dass ein diagnostisches Reagenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 und 1 0 als interner Standard verwendet wird
Kιt-of-parts, umfassend für Nukleinsaurepraparations- und/oder -nachweisverfahren notwendige Reagenzien und Gefäße, dadurch gekennzeichnet, dass es das diagnostische Reagenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 oder 1 0 enthalt
Kit-of parts nach Anspruch 1 5, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung und für die Durchfuhrung der Nuklemsaurepraparation und des Nukleinsaurenachweises notwendige Reagenzien sowie das diagnostische Reagenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 oder 1 0
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