JP4632607B2 - 細胞と核酸標的の保存方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の技術分野は広範には、ハイブリダイゼーションおよび増幅などの一定の診断プロセスに核酸が敏感に反応できるようにする目的で核酸の完全性を保持することに関する。さらに詳細には、本発明はタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤に対する阻害効果を引き起こす組成物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸分子を使用する診断プロセスには、標的核酸の存在および／または量を測定するための核酸プローブハイブリダイゼーション、核酸増幅プロセスのための核酸プライマーハイブリダイゼーション、核酸伸長、ニッキングおよび／または切断を含む酵素活性が含まれる。連鎖置換増幅（SDA）法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）法、核酸配列に基づく増幅（NASBA）法、転写媒介増幅（TMA）法、その他などの核酸増幅プロセスが、関心の対象である、サンプル中のコピー数が少ない特定の核酸配列（複数）（標的配列）の複数のコピーを作り出すために使用される。
【０００３】
DNアーゼとタンパク質分解酵素を不活性化するための公知の方法は、サンプルを100℃にて15分間加熱することである（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., Maniatis, T. 『分子クローニング法：実験室マニュアル−コールドスプリングハーバーラボラトリー版 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 』、 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、ニューヨーク州Cold Spring Harbor市、1989年）。これら酵素タンパク質を変性させるために、チオシアン酸グアニジニウムまたはチオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬が、タンパク質分解酵素を不活性化するその他の方法では使用される（例えば、米国特許第4,843,15号を参照されたい）。
【０００４】
核酸を保存するための方法に関するさらに一般的な説明は、糞便サンプル中にある剥脱ヒト上皮細胞からDNAを抽出するための諸方法でヌクレアーゼ阻害剤としてEDTAおよびEGTAを使用することが開示されているExact Laboratoriesに対するPCT公開公報WO 00/50640に提示されている。また、京都医科学研究所株式会社は尿中の細胞を保存するための諸方法に関して、2つの日本国特許文献を有している。特開平04-118557号には、抗菌剤としてのEDTAに緩衝液として添加するクエン酸の使用が開示されており、また特開平05-249104号は、クエン酸とEDTAに加えるフッ素化合物としてフッ化ナトリウムの使用を開示している。Sierra Diagnostics社は、PCT公報WO 99 / 29904に、塩酸リチウム、グアニジン、サルチル酸ナトリウム、過塩酸ナトリウム、またはチオシアン酸ナトリウムなどのキレート剤促進成分の少なくとも1つとともにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（EGTA）、1,2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、またはそれらの塩類の使用を開示している。
【０００５】
しかし、これら諸方法の多くは時間を浪費するものであり、労働集約的および／またはそれらと関連した厄介な安全性の必要条件を有する。かなり厳しい処理ステップまたは条件を利用する諸方法に関するもう1つの問題は、いくつかの標的核酸配列の欠損である。非常に数の少ないオリジナルの標的から標的配列（単位複製配列）の複数コピーを作る核酸増幅の能力はあるけれども、サンプル中にそのオリジナルの標的が非常に数多くあれば、増幅効率および検出能力は改善される。抗酸菌Bacillusなど（AFB）塗沫陰性Mycobaterium tuberculosisサンプルなどのサンプルを検出することが特に困難な処理である場合には、より大きな検出能力がありことが、非常に重要である。
【０００６】
分子診断プロセスにかけられるサンプルに関するもう1つの一般的な問題は、長い時間にわたるサンプルの安定性である。サンプルが1つの場所で採取されるが、その後に、分子診断処理用の中央検査室などのもうひとつの場所に輸送される場合にはサンプルの安定性はさらに重要なものになる。
【０００７】
例えば、臨床上関連性を有する生物体は、室温にて約24時間以上放置された尿サンプル中、膣および子宮頸部塗布ではそれらの完全性は保持されない。したがって、中央検査室への輸送時および／または貯蔵時にそうしたサンプルの冷蔵が必要になった。尿サンプルや塗布物から通常試験される1つの分析物であって、また室温にて貯蔵されるサンプル中で悪名高くも不安定であるのはNeisseria gonorrhoeae（淋菌）である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
標的核酸の完全性を維持し、また、サンプルの安定性に関連している問題に取り組むため、またしたがって、標的核酸配列検出を改善し、その恩恵に浴するために、本発明は、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤に対して阻害効果を生じる成分にそのサンプルを曝すことによりサンプル中の細胞および核酸を保存する方法を提供する。本発明の方法において有用であるこうした成分には、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤のヌクレアーゼ活性に必要な微量な金属を結合させるクエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびEDTAなどのキレート剤が含まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記されているように、本発明は、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／またはヌクレアーゼ薬剤に対する阻害効果を生じる組成物にサンプルを曝すことにより、サンプル中の細胞と核酸を保存するための方法に関する。本方法では、サンプルは、核酸を含む細胞がサンプル中に安定して残るようにそのサンプル中の細胞の溶解前にこうした組成物に曝される。
【００１０】
本発明の本方法にかけられるサンプルのタイプには、痰サンプル、血液サンプル、尿サンプル、脳脊髄液（「CSF」）サンプル、膣および頸部スワブなどの実質的に全てのヒトと獣医関連の臨床的サンプルと、その他、水、空気、土壌サンプルなどの環境サンプルならびに食物サンプルが含まれる。本発明の本方法にかけられるサンプルは、増幅プロセスを開始するために直接プローブハイブリダイゼーションまたはプライマーハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションを含む診断プロセスにかけられる標的核酸配列を有する細胞を含んでいるかが疑われる。
【００１１】
こうしたサンプルで典型的にみつかるタンパク質分解薬剤には、レニンなどのエンドペプチターゼ、トリプシンおよびキモトリプシンなどのエキソペプチドおよびカテプシンを含むプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素が含まれる。サンプル中に存在することにより、タンパク質分解試薬は細胞壁の分解を生じ、したがって、診断用のいずれかの標的核酸を含む核酸を放出してしまう。こうして放出された核酸はその後、DNアーゼ、RNアーゼなどの分解酵素、およびヘムやヘマチンから誘導されたポルフィリン化合物、アプロチニン、ロイペプチンPMSFやペプスタチンなどの血清酵素、および尿素などの核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅プロセスを阻害する物質を含む診断プロセスに悪影響を及ぼすその他の薬剤の作用を受けることになる。核酸、特に標的核酸を、こうした薬剤に曝すことは、核酸について実施されるいずれかの診断プロセスに悪影響を及ぼす。したがって、細胞壁の未成熟溶解を阻害することにより核酸とこうした薬剤が接触することを防ぐことにより、診断プロセスがそのサンプルに対して実施される前に長期間にわたって安定したサンプルの維持につながる。
【００１２】
本発明の本方法には、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の阻害を生じる組成物にそのサンプルを曝露するステップが含まれる。この曝露は細胞のサンプルを含む反応混合物と、タンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の活性に必要とされる少なくとも1つのコファクターを結び付ける組成物を結果的に生じる。
【００１３】
多くのこうした組成物は本発明の本方法において有用である。こうした有用な組成物の実施例には、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびEDTAなどのキレート剤である。こうしたキレート剤はサンプル中のタンパク質分解薬剤のタンパク質分解活性に必要とされる微量な金属を結合する。したがって、タンパク質分解薬剤は、細胞壁を分解するように、効果的には作用することができず、あるいはまったく作用することができない。こうした核酸分子はそれらを分解する原因となる薬剤に曝露されないため、これによって、その細胞壁が完全に残ることが可能となり、また、その細胞内の核酸分子の完全性が維持される。
【００１４】
タンパク質分解薬剤阻害を引き起こす組成物は、いかなる形態または状態でも使用されうる。例えば、こうした組成物は液体として、または乾燥顆粒形態で固体として、圧縮錠剤、その組成物を含む溶解可能なカプセル、またはその組成物を含む袋などの透過可能なビーイクルとして、サンプルに曝しうる。また、その組成物は、いかなる形態でも、そのサンプルを保持しているコンティナーに添加することが可能であり、または、そのサンプルが添加されているコンティナーの中に組み込むことが可能である。
【００１５】
本発明の諸方法に有用であるこうした組成物の濃度は、約2.5 mM〜約350 mMの範囲であるが、好適には約5 mM〜約100 mMの範囲である。本発明の諸方法が効果的なものになる温度は約5℃〜約45℃の範囲である。
【００１６】
本発明の諸方法に有用であるその他の組成物は、例えば、タンパク質分解薬剤の阻害を引き起こす、こうした組成物の最適な特性に向けて通常のスクリーニング測定法を実施することにより、成功するという予測を妥当なものとして当業者であれば了解することができる。
【００１７】
本出願で説明されている実施例は、当業者であれば、特定の組成物が本発明の諸方法において有用である可能性があるかどうかを素早く測定することができる、平易で、単純な日常的なスクリーニング測定法を提供する。
【００１８】
その組成物とサンプルが互いに曝されるとき、タンパク質分解酵素やDNアーゼやRNアーゼなどの核酸分解酵素などのタンパク質分解薬剤には必要なコファクターであるマグネシウム、カルシウム、亜鉛およびマンガンなどの微量金属が、その組成物により結合される。こうした結合状態では、その微量金属はそのコファクター機能という点では有用なものとはならない。したがって、細胞壁上のタンパク質分解薬剤および核酸上の核酸分解酵素の分解作用は阻害される。
【００１９】
本発明の本方法に関しては、その組成物とサンプルの互いの効果的な曝露時間は一般的には最短時間であって、最長時間ではない。
【００２０】
微量金属の結合はその組成物とサンプルの相互曝露時とほぼ同時にはじまリ、またこうした結合は時間経過にわたり判別可能に減少することはない。一般的なルールとして、組成物とサンプルの相互曝露は、効果的なものにするには、本発明の本方法で約30分未満であってはならない。
【００２１】
任意には、こうした曝露に続いて、その組成物とサンプルは分離されるのが良い。こうした分離は、遠心分離、ろ過などのさまざまな手段により行われることが可能であり、または、透過性ビーイクルが使用される場合は、その後に、その透過性ビーイクルをサンプルから物理的に除去することができ、または、その処理されたサンプルを簡単にピペットより除去することができる。
【００２２】
さまざまなプロセスが、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために、サンプル中の標的核酸を調製するのに現在使用されている。例えば、放線菌の核酸配列を増幅するために処理される痰サンプルは、典型的には、NALC/NaOHプロセスにかけられる。同様に、臨床サンプルの他のタイプは、その他の周知の標準的なプロセスにかけられ、例えば、血液や尿などの大容量サンプルは遠心分離にかけられる。本発明の本方法はこうした標準的なプロセスの前、その一部として、またはその後に使用されうる。
【００２３】
細胞壁の完全性と核酸の完全性を保存する本発明の本方法の有用性に加えて、本方法はまた、室温にて輸送されるサンプルを安定化させる。本発明の本方法から結果的に得られるタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の阻害は、室温での貯蔵、および、伝統的なサンプル保存方法を使用して、現在有用なものよりも、さらに長い期間にわたって、そのサンプルの輸送が可能となる。例えば、欧州特許出願公報第0915171A2に開示されているものなどの混合床イオン交換樹脂を使用すると、4日間にわたり尿サンプルの室温での貯蔵が可能になるが、一方、以下の実施例に示すように本発明の本方法は14日間の長きにわたって、尿サンプルの室温での貯蔵を可能にする。
【００２４】
以下の実施例は、本出願で説明されている本発明の特定の実施態様を説明する。熟練した当業者であれば、さまざまな変化と変更が可能であり、記載されている本発明の範囲内で企図されていることは、明らかであろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
［実施例1］
尿中分解から N. gonorrhoeae （淋菌） DNA を保護
この実施例の目的は、本発明の方法がヒト尿中のN. gonorrhoeaeプラスミドDNAの分解を除外するのかどうかを測定することであった。
【００２６】
材料
BDプローブTecTM ET淋菌プライミング抗原刺激マイクロウェル（BD社製）
BDプローブTecTM ET淋菌増幅マイクロウェル（BD社製）
BDプローブTecTM ET淋菌プラスミドDNA（BD社製）
BDプローブTecTM ET装置と装置プレート
BDプローブTecTM ET分解加熱器
BDプローブTecTM ETプライミング抗原刺激および温暖化加熱器
BDプローブTecTM ETピペッタとピペットチップ
クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
陰性蓄尿
グリシンHCl（Sigma社製）
フェロソ酸化鉄（III）（Pea Ridge Iron Ore社製）
ジメチルスルホキシド「DMSO」（Sigma社製）
Bicine（Sigma社製）
グリセロール（Sigma社製）
水酸化カリウム「KOH」（Sigma社製）
【００２７】
手順
陰性蓄尿20mL容量を10、40、100mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、10、20、40 mM EDTA (最終濃度)、化学的添加物は加えずに作成された。さらに、陰性蓄尿20mL容量が30分間加熱された（加熱処理尿）。サンプルは室温にて60分間インキュベートされた。インキュベーションステップの後、サンプルは淋菌プラスミドDNA（2500 DNAコピー/ml）によりスパイクされた。サンプルは室温にて60分間インキュベートされた。インキュベートステップの後、各サンプル（8つの複製）から得た2 ml容量がDNAを変性するために、30分間114℃にて加熱された。
【００２８】
加熱変性DNAは、米国特許第5,973,138号に説明されているように、酸性環境で常磁性粒子によりサンプルから分離された。上述されているようにその8つの複製の1mlがフェロソ酸化鉄（III）に添加された。6MグリシンHCl 100μl容量が各サンプルに添加された。DNA-フェロソ酸化鉄（III）複合体が磁石上で分離され、また、イオン強度を減らし、また、非特異的結合材料を除去するために、1 mMグリシンHCl 900-μlにより2回洗浄された。DNAは、溶出緩衝液480μl容量により、フェロソ酸化鉄（III）から放出された（88.3 mM KOH、177.8 mMビシン、12.1% (v/v)グリセロールおよび11.0% (v/v) DMSO[最終濃度]）。
【００２９】
連鎖置換増幅（SDA）は製造業者の指示書に従って実施された（BDプローブTecTM ET クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）と淋菌(N. gonorrhoeae)増幅DNA測定パッケージ挿入断片L-000203[1999年11月]）。各サンプルの150μl容量がプライミング抗原刺激マイクロウェルの中に添加された。そのプライミング抗原刺激マイクロウェルは20分間室温にてインキュベートされ、その後にそのプレートは72.5℃にてインキュベートされた。増幅マイクロプレートは、54℃でインキュベートされた。10分後、各プライミング抗原刺激マイクロウェルから100μl容量が対応する増幅マイクロウェルの中に添加された。増幅マイクロウェルプレートは、BDプレートTec ET装置の中に置かれた。データはMOTA値として報告された（加速度ではなく容量）。
【００３０】
結果
その結果は、各処理サンプルから得た平均増幅MOTA値（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００３１】
【表１】
【００３２】
結論
本実施例のデータは、10、20、40 mM のクエン酸と10、40、100 mM のEDTAが、内在性ヌクレアーゼによりヒト尿中で分解されないように保護していたことを示している。データからはまた、加熱処理尿が、淋菌プラスミドDNAの分解を防いでいたことを示している。
【００３３】
［実施例2］
クエン酸ナトリウムによる尿中淋菌細胞安定性
本実施例の目的は、室温にて14日間の期間、ヒト尿中淋菌の完全な細胞の安定性を測定することであった。
【００３４】
材料
増幅試薬と装置は実施例1に記載されているものと同じものであった。
【００３５】
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
BSA./PBS (0.2%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸カリウム緩衝液［pH 7.6］、および150 mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌（N.gonorrhoeae）ATCC 19424
Dynac II遠心分離器（BD社製）
【００３６】
手順
陰性蓄尿80ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）を加えて、および加えずに作成された。サンプルは淋菌細胞（最終濃度2500細胞/ml）によりスパイクされた。各サンプルは室温にて14日間インキュベートされた。特定の時点で（0日目、6日目および14日目）、各サンプル（8つの複製）の2.0 ml容量が2000 x gで30分間室温にて遠心分離にかけられた。上清はデカンターに移され、細胞ペレットがBSA/PBSの20 ml容量とともに再懸濁され、その後、室温にて2000 x gで30分間遠心分離にかけられた。再度、その上清がデカンターに移され、細胞ペレットがCT/GC希釈液の2.0 mlと一緒に再懸濁された。各サンプルは、細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００３７】
結果
その結果は、14日間それぞれ処理されたサンプルから得た平均増幅MOTA値（8つの複製）として、以下の表に提示する。
【００３８】
【表２】
【００３９】
結論
本実施例のデータからは、ヒト尿への100 mMクエン酸ナトリウムの添加は、淋菌の完全な細胞の溶菌を阻害し、室温にて14日間の最短で14日間その安定性を維持した。対照的に、クエン酸ナトリウムを加えない尿中では細胞は安定ではなく、0日目に比べて減少したMOTA値によって示されているように、遠心分離にかける前に溶菌されてしまう傾向があった。
【００４０】
［実施例3］
他の化学添加剤を加えた尿中の淋菌細胞の安定性
本実施例の目的は、他の化学添加剤が、ヒト尿中の淋菌の完全な細胞の安定性を維持することができるかどうかを測定するであった。
【００４１】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
【００４２】
BSA/PBS (02%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸カリウム緩衝液［pH 7.6］および150mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
ショ糖（Sigma社製）
ポリビニルピロリドン「PVP」［平均分子量40,000］(Sigma社製)
塩化マグネシウム「MgCl2」
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
ギ酸ナトリウム（Sigma社製）
ホウ酸ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
エチレンビス（オキシレンニトリロ）四酢酸「EGTA」（Sigma社製）
Dynac II遠心分離器（BD社製）
【００４３】
手順
陰性尿の40ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、5、10、15%(v/v)ショ糖（最終濃度）、5、10、15% (v/v) PVP(最終濃度)、5、10、15 mM塩化マグネシウム（最終濃度）、10、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、10、100 mMギ酸ナトリウム（最終濃度）、10、100 mMホウ酸ナトリウム（最終濃度）、0.5、5 mM EDTA(最終濃度)、0.5、5 mM EGTA (最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは、2500細胞/mlの最終濃度で淋菌細胞によりスパイクされた。各サンプルは室温にて6日間インキュベートされた。特定の時点で（0日目と6日目）、サンプルは実施例2に説明されているように、2000 x gで遠心分離により処理された。各サンプルは細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００４４】
結果
データは、6日間の各処理サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
結論
本発明のデータは、0日目と6日目で100 mMクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム、100 mMホウ酸ナトリウム、5 mM EDTAにより淋菌細胞に関する平均増幅MOTA値は有意には異なっていなかったことを示している。これらデータは、淋菌の完全な細胞の安定性は、これら化学安定剤によりヒト尿中で維持されていたことを示している。さらに、その結果により、淋菌の完全な細胞の溶菌を防ぐために、クエン酸ナトリウムと同様なやり方でこれら化学安定剤が実施されたことが示されている。
【００４７】
［実施例4］
異なる温度での尿中淋菌細胞の安定性
本実施例の目的は、淋菌の完全な細胞が、実施例3に説明されているクエン酸ナトリウムとその他の化学安定剤により、6日間5、25、35、45℃にて維持することができるかどうかを測定することであった。
【００４８】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
BSA/PBS (02%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸緩衝液［pH 7.6］および150mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸「EDTA」（Sigma社製）
Dynac II遠心分離器
【００４９】
手順
陰性蓄尿の70ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、100 mMホウ酸ナトリウム（最終濃度）、5 mM EDTA(最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは、2500細胞/mlの最終濃度で淋菌細胞によりスパイクされた。各サンプルは室温にて6日間5、25、35、45℃にてインキュベートされた。特定の時点で（0日目と6日目）、サンプルは実施例2に説明されているように、2000 x gで遠心分離により処理された。各サンプルは細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００５０】
結果
データは、6日間5、25、35、45℃で｛インキュベートした｝各処理サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００５１】
【表４】
【００５２】
結論
本発明のデータは、0日目と6日目とで5、25、35、45℃にて｛インキュベートした｝100 mMクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム、100 mMホウ酸ナトリウム、5 mM EDTAでは淋菌細胞の平均増幅MOTA値は有意差は無かったことを示している。これらデータからは、これら化学安定剤によりヒト尿中の淋菌の完全な細胞の安定性が付与されていたこと、また最短で6日間細胞溶解を防いでいたことが示されている。対照的に、化学添加剤を加えなかった尿中では細胞は安定ではなく、0日目に比べて減少したMOTA値により示されているように、5、25、35、45℃の温度で｛インキュベートして｝6日間内に遠心分離にかける前に溶菌されてしまう傾向があった。
【００５３】
さらに、その結果により、淋菌の完全な細胞の溶菌を防ぐために、クエン酸ナトリウムと同様なやり方でこれら化学安定剤が実施されたことが示されている。
【００５４】
［実施例5］
尿中淋菌 DNA の安定性
本実施例の目的は、淋菌プラスミドDNAを、実施例3に説明されているように化学添加剤により、3日間室温にて維持することができるかどうかを測定することであった。
【００５５】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
【００５６】
BDプローブTecTM ET淋菌プラスミドDNA（BD社製）
クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩（Sigma社製）
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
ホウ酸ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
陰性蓄尿
フェロソ酸化鉄（III）（Pea Ridge Iron Ore社製）
ジメチルスルホキシド「DMSO」（Sigma社製）
Bicine（Sigma社製）
グリセロール（Sigma社製）
水酸化カリウム「KOH」（Sigma社製）
【００５７】
手順
陰性蓄尿の60ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、100mMホウ酸ナトリウム(最終濃度)、10と20 mM EDTA(最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは60分間室温にてインキュベートされた。インキュベートステップ後、サンプルは、5000 DNAコピー/mlの最終濃度で淋菌プラスミドDNAによりスパイクされた。サンプルは3日間室温にてインキュベートされた。特定の時点で（0日目と3日目）、各サンプル（8つの複製）から得た2 ml容量がDNAを変性するために、30分間114℃にて加熱された。加熱変性DNAは、実施例1で説明されているように、酸性環境で常磁性粒子によりサンプルから分離された。SDAは実施例1で説明されているように、分離DNA上で実施された。
【００５８】
結果
データは、3日間室温にてインキュベートした後、各サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として、以下の表に提示する。
【００５９】
【表５】
【００６０】
結論
本実施例のデータは、100 mM のクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム100 mM、ホウ酸ナトリウム100 mM、 EDTA 20 mM EDTAが、内在性ヌクレアーゼによりヒト尿中での分解しないように室温にて最短で3日間保護していたことを示している。尿中に化学添加剤が無い場合は、淋菌プラスミドDNAは急速に分解された。
【００６１】
本発明はいくつか特異な例を用いて説明されてきたが、当業者には明らかなものである変更例は本発明の範囲から離れることなく作成される。本発明のさまざまな特徴は以下の請求項の中で説明される。
【発明の属する技術分野】
本発明の技術分野は広範には、ハイブリダイゼーションおよび増幅などの一定の診断プロセスに核酸が敏感に反応できるようにする目的で核酸の完全性を保持することに関する。さらに詳細には、本発明はタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤に対する阻害効果を引き起こす組成物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸分子を使用する診断プロセスには、標的核酸の存在および／または量を測定するための核酸プローブハイブリダイゼーション、核酸増幅プロセスのための核酸プライマーハイブリダイゼーション、核酸伸長、ニッキングおよび／または切断を含む酵素活性が含まれる。連鎖置換増幅（SDA）法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、リガーゼ連鎖反応（LCR）法、核酸配列に基づく増幅（NASBA）法、転写媒介増幅（TMA）法、その他などの核酸増幅プロセスが、関心の対象である、サンプル中のコピー数が少ない特定の核酸配列（複数）（標的配列）の複数のコピーを作り出すために使用される。
【０００３】
DNアーゼとタンパク質分解酵素を不活性化するための公知の方法は、サンプルを100℃にて15分間加熱することである（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., Maniatis, T. 『分子クローニング法：実験室マニュアル−コールドスプリングハーバーラボラトリー版 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 』、 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、ニューヨーク州Cold Spring Harbor市、1989年）。これら酵素タンパク質を変性させるために、チオシアン酸グアニジニウムまたはチオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬が、タンパク質分解酵素を不活性化するその他の方法では使用される（例えば、米国特許第4,843,15号を参照されたい）。
【０００４】
核酸を保存するための方法に関するさらに一般的な説明は、糞便サンプル中にある剥脱ヒト上皮細胞からDNAを抽出するための諸方法でヌクレアーゼ阻害剤としてEDTAおよびEGTAを使用することが開示されているExact Laboratoriesに対するPCT公開公報WO 00/50640に提示されている。また、京都医科学研究所株式会社は尿中の細胞を保存するための諸方法に関して、2つの日本国特許文献を有している。特開平04-118557号には、抗菌剤としてのEDTAに緩衝液として添加するクエン酸の使用が開示されており、また特開平05-249104号は、クエン酸とEDTAに加えるフッ素化合物としてフッ化ナトリウムの使用を開示している。Sierra Diagnostics社は、PCT公報WO 99 / 29904に、塩酸リチウム、グアニジン、サルチル酸ナトリウム、過塩酸ナトリウム、またはチオシアン酸ナトリウムなどのキレート剤促進成分の少なくとも1つとともにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（EGTA）、1,2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、またはそれらの塩類の使用を開示している。
【０００５】
しかし、これら諸方法の多くは時間を浪費するものであり、労働集約的および／またはそれらと関連した厄介な安全性の必要条件を有する。かなり厳しい処理ステップまたは条件を利用する諸方法に関するもう1つの問題は、いくつかの標的核酸配列の欠損である。非常に数の少ないオリジナルの標的から標的配列（単位複製配列）の複数コピーを作る核酸増幅の能力はあるけれども、サンプル中にそのオリジナルの標的が非常に数多くあれば、増幅効率および検出能力は改善される。抗酸菌Bacillusなど（AFB）塗沫陰性Mycobaterium tuberculosisサンプルなどのサンプルを検出することが特に困難な処理である場合には、より大きな検出能力がありことが、非常に重要である。
【０００６】
分子診断プロセスにかけられるサンプルに関するもう1つの一般的な問題は、長い時間にわたるサンプルの安定性である。サンプルが1つの場所で採取されるが、その後に、分子診断処理用の中央検査室などのもうひとつの場所に輸送される場合にはサンプルの安定性はさらに重要なものになる。
【０００７】
例えば、臨床上関連性を有する生物体は、室温にて約24時間以上放置された尿サンプル中、膣および子宮頸部塗布ではそれらの完全性は保持されない。したがって、中央検査室への輸送時および／または貯蔵時にそうしたサンプルの冷蔵が必要になった。尿サンプルや塗布物から通常試験される1つの分析物であって、また室温にて貯蔵されるサンプル中で悪名高くも不安定であるのはNeisseria gonorrhoeae（淋菌）である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
標的核酸の完全性を維持し、また、サンプルの安定性に関連している問題に取り組むため、またしたがって、標的核酸配列検出を改善し、その恩恵に浴するために、本発明は、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤に対して阻害効果を生じる成分にそのサンプルを曝すことによりサンプル中の細胞および核酸を保存する方法を提供する。本発明の方法において有用であるこうした成分には、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤のヌクレアーゼ活性に必要な微量な金属を結合させるクエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびEDTAなどのキレート剤が含まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記されているように、本発明は、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／またはヌクレアーゼ薬剤に対する阻害効果を生じる組成物にサンプルを曝すことにより、サンプル中の細胞と核酸を保存するための方法に関する。本方法では、サンプルは、核酸を含む細胞がサンプル中に安定して残るようにそのサンプル中の細胞の溶解前にこうした組成物に曝される。
【００１０】
本発明の本方法にかけられるサンプルのタイプには、痰サンプル、血液サンプル、尿サンプル、脳脊髄液（「CSF」）サンプル、膣および頸部スワブなどの実質的に全てのヒトと獣医関連の臨床的サンプルと、その他、水、空気、土壌サンプルなどの環境サンプルならびに食物サンプルが含まれる。本発明の本方法にかけられるサンプルは、増幅プロセスを開始するために直接プローブハイブリダイゼーションまたはプライマーハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションを含む診断プロセスにかけられる標的核酸配列を有する細胞を含んでいるかが疑われる。
【００１１】
こうしたサンプルで典型的にみつかるタンパク質分解薬剤には、レニンなどのエンドペプチターゼ、トリプシンおよびキモトリプシンなどのエキソペプチドおよびカテプシンを含むプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素が含まれる。サンプル中に存在することにより、タンパク質分解試薬は細胞壁の分解を生じ、したがって、診断用のいずれかの標的核酸を含む核酸を放出してしまう。こうして放出された核酸はその後、DNアーゼ、RNアーゼなどの分解酵素、およびヘムやヘマチンから誘導されたポルフィリン化合物、アプロチニン、ロイペプチンPMSFやペプスタチンなどの血清酵素、および尿素などの核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅プロセスを阻害する物質を含む診断プロセスに悪影響を及ぼすその他の薬剤の作用を受けることになる。核酸、特に標的核酸を、こうした薬剤に曝すことは、核酸について実施されるいずれかの診断プロセスに悪影響を及ぼす。したがって、細胞壁の未成熟溶解を阻害することにより核酸とこうした薬剤が接触することを防ぐことにより、診断プロセスがそのサンプルに対して実施される前に長期間にわたって安定したサンプルの維持につながる。
【００１２】
本発明の本方法には、サンプル中のタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の阻害を生じる組成物にそのサンプルを曝露するステップが含まれる。この曝露は細胞のサンプルを含む反応混合物と、タンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の活性に必要とされる少なくとも1つのコファクターを結び付ける組成物を結果的に生じる。
【００１３】
多くのこうした組成物は本発明の本方法において有用である。こうした有用な組成物の実施例には、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびEDTAなどのキレート剤である。こうしたキレート剤はサンプル中のタンパク質分解薬剤のタンパク質分解活性に必要とされる微量な金属を結合する。したがって、タンパク質分解薬剤は、細胞壁を分解するように、効果的には作用することができず、あるいはまったく作用することができない。こうした核酸分子はそれらを分解する原因となる薬剤に曝露されないため、これによって、その細胞壁が完全に残ることが可能となり、また、その細胞内の核酸分子の完全性が維持される。
【００１４】
タンパク質分解薬剤阻害を引き起こす組成物は、いかなる形態または状態でも使用されうる。例えば、こうした組成物は液体として、または乾燥顆粒形態で固体として、圧縮錠剤、その組成物を含む溶解可能なカプセル、またはその組成物を含む袋などの透過可能なビーイクルとして、サンプルに曝しうる。また、その組成物は、いかなる形態でも、そのサンプルを保持しているコンティナーに添加することが可能であり、または、そのサンプルが添加されているコンティナーの中に組み込むことが可能である。
【００１５】
本発明の諸方法に有用であるこうした組成物の濃度は、約2.5 mM〜約350 mMの範囲であるが、好適には約5 mM〜約100 mMの範囲である。本発明の諸方法が効果的なものになる温度は約5℃〜約45℃の範囲である。
【００１６】
本発明の諸方法に有用であるその他の組成物は、例えば、タンパク質分解薬剤の阻害を引き起こす、こうした組成物の最適な特性に向けて通常のスクリーニング測定法を実施することにより、成功するという予測を妥当なものとして当業者であれば了解することができる。
【００１７】
本出願で説明されている実施例は、当業者であれば、特定の組成物が本発明の諸方法において有用である可能性があるかどうかを素早く測定することができる、平易で、単純な日常的なスクリーニング測定法を提供する。
【００１８】
その組成物とサンプルが互いに曝されるとき、タンパク質分解酵素やDNアーゼやRNアーゼなどの核酸分解酵素などのタンパク質分解薬剤には必要なコファクターであるマグネシウム、カルシウム、亜鉛およびマンガンなどの微量金属が、その組成物により結合される。こうした結合状態では、その微量金属はそのコファクター機能という点では有用なものとはならない。したがって、細胞壁上のタンパク質分解薬剤および核酸上の核酸分解酵素の分解作用は阻害される。
【００１９】
本発明の本方法に関しては、その組成物とサンプルの互いの効果的な曝露時間は一般的には最短時間であって、最長時間ではない。
【００２０】
微量金属の結合はその組成物とサンプルの相互曝露時とほぼ同時にはじまリ、またこうした結合は時間経過にわたり判別可能に減少することはない。一般的なルールとして、組成物とサンプルの相互曝露は、効果的なものにするには、本発明の本方法で約30分未満であってはならない。
【００２１】
任意には、こうした曝露に続いて、その組成物とサンプルは分離されるのが良い。こうした分離は、遠心分離、ろ過などのさまざまな手段により行われることが可能であり、または、透過性ビーイクルが使用される場合は、その後に、その透過性ビーイクルをサンプルから物理的に除去することができ、または、その処理されたサンプルを簡単にピペットより除去することができる。
【００２２】
さまざまなプロセスが、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために、サンプル中の標的核酸を調製するのに現在使用されている。例えば、放線菌の核酸配列を増幅するために処理される痰サンプルは、典型的には、NALC/NaOHプロセスにかけられる。同様に、臨床サンプルの他のタイプは、その他の周知の標準的なプロセスにかけられ、例えば、血液や尿などの大容量サンプルは遠心分離にかけられる。本発明の本方法はこうした標準的なプロセスの前、その一部として、またはその後に使用されうる。
【００２３】
細胞壁の完全性と核酸の完全性を保存する本発明の本方法の有用性に加えて、本方法はまた、室温にて輸送されるサンプルを安定化させる。本発明の本方法から結果的に得られるタンパク質分解薬剤および／または核酸分解薬剤の阻害は、室温での貯蔵、および、伝統的なサンプル保存方法を使用して、現在有用なものよりも、さらに長い期間にわたって、そのサンプルの輸送が可能となる。例えば、欧州特許出願公報第0915171A2に開示されているものなどの混合床イオン交換樹脂を使用すると、4日間にわたり尿サンプルの室温での貯蔵が可能になるが、一方、以下の実施例に示すように本発明の本方法は14日間の長きにわたって、尿サンプルの室温での貯蔵を可能にする。
【００２４】
以下の実施例は、本出願で説明されている本発明の特定の実施態様を説明する。熟練した当業者であれば、さまざまな変化と変更が可能であり、記載されている本発明の範囲内で企図されていることは、明らかであろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
［実施例1］
尿中分解から N. gonorrhoeae （淋菌） DNA を保護
この実施例の目的は、本発明の方法がヒト尿中のN. gonorrhoeaeプラスミドDNAの分解を除外するのかどうかを測定することであった。
【００２６】
材料
BDプローブTecTM ET淋菌プライミング抗原刺激マイクロウェル（BD社製）
BDプローブTecTM ET淋菌増幅マイクロウェル（BD社製）
BDプローブTecTM ET淋菌プラスミドDNA（BD社製）
BDプローブTecTM ET装置と装置プレート
BDプローブTecTM ET分解加熱器
BDプローブTecTM ETプライミング抗原刺激および温暖化加熱器
BDプローブTecTM ETピペッタとピペットチップ
クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
陰性蓄尿
グリシンHCl（Sigma社製）
フェロソ酸化鉄（III）（Pea Ridge Iron Ore社製）
ジメチルスルホキシド「DMSO」（Sigma社製）
Bicine（Sigma社製）
グリセロール（Sigma社製）
水酸化カリウム「KOH」（Sigma社製）
【００２７】
手順
陰性蓄尿20mL容量を10、40、100mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、10、20、40 mM EDTA (最終濃度)、化学的添加物は加えずに作成された。さらに、陰性蓄尿20mL容量が30分間加熱された（加熱処理尿）。サンプルは室温にて60分間インキュベートされた。インキュベーションステップの後、サンプルは淋菌プラスミドDNA（2500 DNAコピー/ml）によりスパイクされた。サンプルは室温にて60分間インキュベートされた。インキュベートステップの後、各サンプル（8つの複製）から得た2 ml容量がDNAを変性するために、30分間114℃にて加熱された。
【００２８】
加熱変性DNAは、米国特許第5,973,138号に説明されているように、酸性環境で常磁性粒子によりサンプルから分離された。上述されているようにその8つの複製の1mlがフェロソ酸化鉄（III）に添加された。6MグリシンHCl 100μl容量が各サンプルに添加された。DNA-フェロソ酸化鉄（III）複合体が磁石上で分離され、また、イオン強度を減らし、また、非特異的結合材料を除去するために、1 mMグリシンHCl 900-μlにより2回洗浄された。DNAは、溶出緩衝液480μl容量により、フェロソ酸化鉄（III）から放出された（88.3 mM KOH、177.8 mMビシン、12.1% (v/v)グリセロールおよび11.0% (v/v) DMSO[最終濃度]）。
【００２９】
連鎖置換増幅（SDA）は製造業者の指示書に従って実施された（BDプローブTecTM ET クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）と淋菌(N. gonorrhoeae)増幅DNA測定パッケージ挿入断片L-000203[1999年11月]）。各サンプルの150μl容量がプライミング抗原刺激マイクロウェルの中に添加された。そのプライミング抗原刺激マイクロウェルは20分間室温にてインキュベートされ、その後にそのプレートは72.5℃にてインキュベートされた。増幅マイクロプレートは、54℃でインキュベートされた。10分後、各プライミング抗原刺激マイクロウェルから100μl容量が対応する増幅マイクロウェルの中に添加された。増幅マイクロウェルプレートは、BDプレートTec ET装置の中に置かれた。データはMOTA値として報告された（加速度ではなく容量）。
【００３０】
結果
その結果は、各処理サンプルから得た平均増幅MOTA値（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００３１】
【表１】
結論
本実施例のデータは、10、20、40 mM のクエン酸と10、40、100 mM のEDTAが、内在性ヌクレアーゼによりヒト尿中で分解されないように保護していたことを示している。データからはまた、加熱処理尿が、淋菌プラスミドDNAの分解を防いでいたことを示している。
【００３３】
［実施例2］
クエン酸ナトリウムによる尿中淋菌細胞安定性
本実施例の目的は、室温にて14日間の期間、ヒト尿中淋菌の完全な細胞の安定性を測定することであった。
【００３４】
材料
増幅試薬と装置は実施例1に記載されているものと同じものであった。
【００３５】
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
BSA./PBS (0.2%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸カリウム緩衝液［pH 7.6］、および150 mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌（N.gonorrhoeae）ATCC 19424
Dynac II遠心分離器（BD社製）
【００３６】
手順
陰性蓄尿80ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）を加えて、および加えずに作成された。サンプルは淋菌細胞（最終濃度2500細胞/ml）によりスパイクされた。各サンプルは室温にて14日間インキュベートされた。特定の時点で（0日目、6日目および14日目）、各サンプル（8つの複製）の2.0 ml容量が2000 x gで30分間室温にて遠心分離にかけられた。上清はデカンターに移され、細胞ペレットがBSA/PBSの20 ml容量とともに再懸濁され、その後、室温にて2000 x gで30分間遠心分離にかけられた。再度、その上清がデカンターに移され、細胞ペレットがCT/GC希釈液の2.0 mlと一緒に再懸濁された。各サンプルは、細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００３７】
結果
その結果は、14日間それぞれ処理されたサンプルから得た平均増幅MOTA値（8つの複製）として、以下の表に提示する。
【００３８】
【表２】
結論
本実施例のデータからは、ヒト尿への100 mMクエン酸ナトリウムの添加は、淋菌の完全な細胞の溶菌を阻害し、室温にて14日間の最短で14日間その安定性を維持した。対照的に、クエン酸ナトリウムを加えない尿中では細胞は安定ではなく、0日目に比べて減少したMOTA値によって示されているように、遠心分離にかける前に溶菌されてしまう傾向があった。
【００４０】
［実施例3］
他の化学添加剤を加えた尿中の淋菌細胞の安定性
本実施例の目的は、他の化学添加剤が、ヒト尿中の淋菌の完全な細胞の安定性を維持することができるかどうかを測定するであった。
【００４１】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
【００４２】
BSA/PBS (02%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸カリウム緩衝液［pH 7.6］および150mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
ショ糖（Sigma社製）
ポリビニルピロリドン「PVP」［平均分子量40,000］(Sigma社製)
塩化マグネシウム「MgCl2」
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
ギ酸ナトリウム（Sigma社製）
ホウ酸ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
エチレンビス（オキシレンニトリロ）四酢酸「EGTA」（Sigma社製）
Dynac II遠心分離器（BD社製）
【００４３】
手順
陰性尿の40ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、5、10、15%(v/v)ショ糖（最終濃度）、5、10、15% (v/v) PVP(最終濃度)、5、10、15 mM塩化マグネシウム（最終濃度）、10、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、10、100 mMギ酸ナトリウム（最終濃度）、10、100 mMホウ酸ナトリウム（最終濃度）、0.5、5 mM EDTA(最終濃度)、0.5、5 mM EGTA (最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは、2500細胞/mlの最終濃度で淋菌細胞によりスパイクされた。各サンプルは室温にて6日間インキュベートされた。特定の時点で（0日目と6日目）、サンプルは実施例2に説明されているように、2000 x gで遠心分離により処理された。各サンプルは細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００４４】
結果
データは、6日間の各処理サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００４５】
【表３】
結論
本発明のデータは、0日目と6日目で100 mMクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム、100 mMホウ酸ナトリウム、5 mM EDTAにより淋菌細胞に関する平均増幅MOTA値は有意には異なっていなかったことを示している。これらデータは、淋菌の完全な細胞の安定性は、これら化学安定剤によりヒト尿中で維持されていたことを示している。さらに、その結果により、淋菌の完全な細胞の溶菌を防ぐために、クエン酸ナトリウムと同様なやり方でこれら化学安定剤が実施されたことが示されている。
【００４７】
［実施例4］
異なる温度での尿中淋菌細胞の安定性
本実施例の目的は、淋菌の完全な細胞が、実施例3に説明されているクエン酸ナトリウムとその他の化学安定剤により、6日間5、25、35、45℃にて維持することができるかどうかを測定することであった。
【００４８】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
BSA/PBS (02%ウシ血清アルブミン、10 mMリン酸緩衝液［pH 7.6］および150mM塩化ナトリウム)
陰性蓄尿
CT/GC希釈液（BD社製）
淋菌ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma社製）
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸「EDTA」（Sigma社製）
Dynac II遠心分離器
【００４９】
手順
陰性蓄尿の70ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、100 mMホウ酸ナトリウム（最終濃度）、5 mM EDTA(最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは、2500細胞/mlの最終濃度で淋菌細胞によりスパイクされた。各サンプルは室温にて6日間5、25、35、45℃にてインキュベートされた。特定の時点で（0日目と6日目）、サンプルは実施例2に説明されているように、2000 x gで遠心分離により処理された。各サンプルは細胞を溶かすために、30分間114℃にて加熱された。SDAは実施例1に説明されているように、細胞溶菌液上で実施された。
【００５０】
結果
データは、6日間5、25、35、45℃で｛インキュベートした｝各処理サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として以下の表に提示する。
【００５１】
【表４】
結論
本発明のデータは、0日目と6日目とで5、25、35、45℃にて｛インキュベートした｝100 mMクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム、100 mMホウ酸ナトリウム、5 mM EDTAでは淋菌細胞の平均増幅MOTA値は有意差は無かったことを示している。これらデータからは、これら化学安定剤によりヒト尿中の淋菌の完全な細胞の安定性が付与されていたこと、また最短で6日間細胞溶解を防いでいたことが示されている。対照的に、化学添加剤を加えなかった尿中では細胞は安定ではなく、0日目に比べて減少したMOTA値により示されているように、5、25、35、45℃の温度で｛インキュベートして｝6日間内に遠心分離にかける前に溶菌されてしまう傾向があった。
【００５３】
さらに、その結果により、淋菌の完全な細胞の溶菌を防ぐために、クエン酸ナトリウムと同様なやり方でこれら化学安定剤が実施されたことが示されている。
【００５４】
［実施例5］
尿中淋菌 DNA の安定性
本実施例の目的は、淋菌プラスミドDNAを、実施例3に説明されているように化学添加剤により、3日間室温にて維持することができるかどうかを測定することであった。
【００５５】
材料
増幅試薬と装置は実施例1で説明されているものと同じであった。
【００５６】
BDプローブTecTM ET淋菌プラスミドDNA（BD社製）
クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩（Sigma社製）
フッ化ナトリウム（Sigma社製）
ホウ酸ナトリウム（Sigma社製）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「EDTA」（Sigma社製）
陰性蓄尿
フェロソ酸化鉄（III）（Pea Ridge Iron Ore社製）
ジメチルスルホキシド「DMSO」（Sigma社製）
Bicine（Sigma社製）
グリセロール（Sigma社製）
水酸化カリウム「KOH」（Sigma社製）
【００５７】
手順
陰性蓄尿の60ml容量が、100 mMクエン酸ナトリウム（最終濃度）、100 mMフッ化ナトリウム（最終濃度）、100mMホウ酸ナトリウム(最終濃度)、10と20 mM EDTA(最終濃度)、化学添加剤無添加により作成された。サンプルは60分間室温にてインキュベートされた。インキュベートステップ後、サンプルは、5000 DNAコピー/mlの最終濃度で淋菌プラスミドDNAによりスパイクされた。サンプルは3日間室温にてインキュベートされた。特定の時点で（0日目と3日目）、各サンプル（8つの複製）から得た2 ml容量がDNAを変性するために、30分間114℃にて加熱された。加熱変性DNAは、実施例1で説明されているように、酸性環境で常磁性粒子によりサンプルから分離された。SDAは実施例1で説明されているように、分離DNA上で実施された。
【００５８】
結果
データは、3日間室温にてインキュベートした後、各サンプルから得た平均増幅MOTAスコア（8つの複製）として、以下の表に提示する。
【００５９】
【表５】
結論
本実施例のデータは、100 mM のクエン酸ナトリウム、100 mMフッ化ナトリウム100 mM、ホウ酸ナトリウム100 mM、 EDTA 20 mM EDTAが、内在性ヌクレアーゼによりヒト尿中での分解しないように室温にて最短で3日間保護していたことを示している。尿中に化学添加剤が無い場合は、淋菌プラスミドDNAは急速に分解された。
【００６１】
本発明はいくつか特異な例を用いて説明されてきたが、当業者には明らかなものである変更例は本発明の範囲から離れることなく作成される。本発明のさまざまな特徴は以下の請求項の中で説明される。
Claims (4)
- サンプル中でタンパク質分解薬剤の阻害を引き起こす組成物であって、前記タンパク質分解薬剤の活性に必要とされる少なくとも１つのコファクターを結合する組成物として、クエン酸ナトリウムと、ホウ酸ナトリウムと、フッ化ナトリウムと、ＥＤＴＡと、から成るグループから選択されるキレート化合物に、前記サンプルを曝露するステップから成る、サンプル中のN. gonorrhoeae細胞内に存在する核酸を細胞内に保存するための方法。
- 前記コファクターが微量金属である請求項１に記載の方法。
- N. gonorrhoeae細胞内に存在する核酸を細胞内に保存するための反応混合物であって、（ａ）N. gonorrhoeae細胞を含むサンプルと、（ｂ）タンパク質分解薬剤の活性に必要な少なくとも１つのコファクターを結合する組成物として、クエン酸ナトリウムと、ホウ酸ナトリウムと、フッ化ナトリウムと、ＥＤＴＡと、から成るグループから選択されるキレート化合物と、から成る反応混合物。
- 前記コファクターが微量金属である請求項３に記載の反応混合物。
Applications Claiming Priority (2)
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