JP2022552115A - 抗菌剤を含有する溶液からの微生物捕捉 - Google Patents

抗菌剤を含有する溶液からの微生物捕捉 Download PDF

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Abstract

抗菌剤を含む試料から生存微生物を回収する方法は、試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体を形成し、次に、粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離することを含む。これらの方法を使用して、抗菌剤を含有する試料中の微生物の不存在又は存在を検出する。対応する組成物及びキットもまた提供される。【選択図】 図１

Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
本発明は、一般的に、抗菌剤を含有する試料から微生物を回収する分野に関する。したがって、本発明の方法は、精製されていない血液、血液培養物及び他の体液などの臨床試料中の微生物病原体の不存在及び存在の決定を可能にする。本発明はまた、本方法を行うのに有用な試薬を含むキットに関する。本発明の用途は、生存微生物の有無の決定、それらのグラム状態、種、及び抗菌剤感受性／耐性の決定を含む。本発明はまた、患者の抗菌処理の有効性をモニターするのに使用することができる。
［背景技術］
本発明者らは、微生物感染を有する疑いのある対象から採取された試料において、試料の大部分が実際には感染した対象からではないにもかかわらず、以前に想像したよりもはるかに高いレベルの有核血球（白血球）が存在することを認識している。このことは、感染についてスクリーニングされた患者から採取された血液試料において、血液細胞、特に白血球から潜在的な微生物を分離する改良された方法の必要性をもたらした。
既に抗菌剤を投与されている患者から血液試料を採取した場合、患者が明らかに感染している場合でさえも、その後の血液培養では微生物は増殖しないことが多い（Ｓｃｅｒｂｏら、Ｓｕｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ（Ｌａｒｃｈｍｔ）．２０１６年６月；１７巻（３号）：２９４～３０２頁；Ｓｉｎｈａら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１８年２月２８日；３１巻（２号）、ｅ０００８９－１７；Ｓｃｈｅｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ．２０１９年３月；２５巻（３号）：３２６～３３１頁）。
この課題に対処するために、血液培養供給元は、抗生物質吸収性レジン（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＢＡＣＴＥＣ ＰＬＵＳボトル及びｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル）を含有する血液培養ボトルを提供してきた。Ｆｌａｙｈａｒｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７年）、８１６～８２１頁）は、模擬条件下でのＢＡＣＴＥＣ ＰＬＵＳ及びＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルの試験を記載する。セフトリアキソンの存在下では、いずれの系も肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を回収することができなかった。
Ｃｈｕｎｇら（Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．（２０１９年）、３８巻（１２号）：２２２９～２２３３頁）はまた、模擬条件下でのＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル及びＢＡＣＴＥＣ Ｐｌｕｓボトルの試験を記載する。いずれの系も、特定の抗菌剤の存在下では検出率が低いからゼロを示した。例えば、セフェピムの存在下での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅａ）；セフォタキシミンの存在下での大腸菌；メロペネムの存在下での大腸菌、肺炎桿菌又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）。したがって、いずれのシステムも、抗菌剤を含有する試料から微生物を普遍的に回収することができない。
国際公開第２００９／００７７１９号において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、試料中の微生物の存在の有用な指標として記載されている。リガーゼは、核酸分子の連結を触媒する酵素である。連結反応は、関連するリガーゼに依存して、補助因子としてＡＴＰ又はＮＡＤ＋のいずれかを必要とする。
国際公開第２０１１／１３０５８４号は、試料を微生物ポリメラーゼの基質として作用する核酸基質に接触させ、無傷の微生物からのポリメラーゼ活性に適した条件下でインキュベートし、いずれもの得られた核酸生成物を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を用いて決定する、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼの検出に基づく生存微生物の検出方法を記載する。このようなアッセイは、「ＥＴＧＡアッセイ」と呼ばれており、ＥＴＧＡは、酵素的鋳型生成及び増幅（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を表す。粗試料中の生存微生物に対するＥＴＧＡアッセイの問題点は、宿主（例えば、ヒト）細胞及び死んだ微生物から生じる、微生物は別として、汚染されたポリメラーゼ活性の存在である。ＥＴＧＡアッセイは、微生物ポリメラーゼ活性を宿主又は死んだ微生物の活性と区別することができない。
国際公開第２０１０／１１９２７０号は、無傷の微生物は別として、ＤＮＡリガーゼ活性を除去する方法を記載する。国際公開第２０１１／０７０５０７号は、非イオン性界面活性剤及び緩衝液を用いた動物細胞の選択的溶解を記載する。国際公開第２０１７／１８２７７５号は、非微生物細胞を選択的に溶解し、溶解物を濾過し、及びフィルター内又はフィルター上に保持された微生物の不存在又は存在を検出することを含む、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法を記載する。
抗体などの特異的結合部分で被覆された磁性ビーズの使用は、標的種の捕捉について公知である。これらの生成物の特異性は、特定の微生物の単離を可能にするために高度に特異的である特定の目的で一般的に選択される抗体又は他の結合リガンドの特異性によって定義される。
国際公開第０３／１０２１８４号は、ポリアミン又はカチオン性界面活性剤などの凝集剤を用いて、細胞（例えば、細菌）を濃縮又は分離し、それらを凝結させる細胞との複合体を形成するための方法、組成物及びキットを記載する。凝結した細胞の分離は、磁性ビーズなどの、細胞と結合することができる固相を用いて達成させることができる。
国際公開第０１／５３５２５号は、試料から細胞（例えば、微生物）を単離する方法を記載し、該方法は、固体支持体上に固定化された炭水化物リガンドによって、細胞を固体支持体に結合することを含む。このような方法を行うためのキットは、ＤｉａＳｏｒｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（「Ｂｕｇｓ’ｎ Ｂｅａｄｓ（商標）」キット）によって販売されている。
微生物を単離するための他のキットには、ＡｐｏＨ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｅｐｓ６磁性ビーズが含まれる。ビーズは、β－２糖タンパク質としても公知であるアポリポタンパク質Ｈタンパク質（ＡｐｏＨ）に由来する合成分子であるＰｅｐｓ６で被覆される。
Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ（２０１６年）９巻：２１７～２２７頁）は、マンノース結合レクチンで被覆された磁性ビーズを用いて病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を捕捉することを記載する。ＰＡＭＰは、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔによれば、様々なタイプの生きた及び死んだ病原体によって放出される炭水化物細胞壁物質及び外膜小胞である。Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔは、病原体によるＰＡＭＰの放出は、抗生物質によって死滅された場合に増加すると記述している。Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔアッセイは、試料から生存微生物を回収することを目的としたものではない。
国際公開第２０１８／０４４９６６号、欧州特許第１１１８６７６号、中国特許第１０９９２９７６３号、中国特許第１０９７４１８９６号は、抗菌剤を含有しない試料からの微生物を捕捉するためのビーズの使用を記載する。
［発明の説明］
本発明は、微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から、微生物を被覆された粒子で捕捉して微生物複合体を形成させ、微生物複合体を抗菌剤から分離することにより、生存微生物を回収することに関する。本発明者らは、被覆された粒子が微生物に普遍的に結合することができ、したがって、試料中にどのタイプが存在するかを事前に知らずに、細菌及び真菌などの一連のタイプの微生物を回収することができることを発見した。本発明による汎微生物回収は、抗菌剤の増殖阻害効果を除去するのに有効である。これは、１つの代替手段であり、抗生物質吸収性レジンを含有する血液培養ボトルを使用することによって、本明細書において報告された比較実験において実証されるように、臨床現場で現在取り組まれている課題に対処するより効果的な方法を提供する。本明細書において実証されるように、回収された微生物は生存し続け、増殖を示すために急速に回復する。本発明者らは驚くべきことに、この回収が、標的様式で（特異的な）微生物に結合する抗体などの複雑な部分を欠く被覆された粒子によって達成され得ることを見出した。
抗菌剤から微生物をレスキューすることに加えて、本発明はまた、微生物を、血液細胞レムナント、ヘモグロビン及び白血球ＤＮＡなどの後の分析の阻害剤からレスキューすることを可能にし、これは、分子検出及び同定などの技術に重大な影響を与えることができる。血小板の除去は、抗菌剤感受性を測定するためのいくつかの技術においても有用であり得る。
本発明はまた、特に抗生物質吸収性レジンを含有する血液培養ボトル（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＢＡＣＴＥＣ ＰＬＵＳボトル及びｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからのＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ）と比較した場合に、有意な濃度の微生物（例えば、５ｍＬの血液試料中の微生物を数十μＬに濃縮することができる）をもたらす。これは、より高い濃度の微生物を必要とする下流の用途に有利である。回収された生存微生物を検出及び／又は特徴付けるために、分子試験を含む種々の試験を行うことができ、より濃縮された試料は、一般的に、このようなアッセイを行うために必要であるか、又はこのようなアッセイの文脈において有利である。本明細書において、ＥＧＴＡアッセイ、ＰＣＲ又は配列決定アッセイ、及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）、特に比較的低体積で行われるマルチウェルＡＳＴを含む、適切なアッセイについて検討する。適切に濃縮された試料を最初に提供することは処理時間を改善し、微生物の下流試験においてさらなる濃縮ステップが回避され得る。
方法
本発明は、微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から生存微生物を回収する方法であって、ａ）試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体を形成するステップと；及びｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離し、それによって試料から生存微生物を回収するステップとを含む方法を提供する。
用語「生存微生物」とは、死んでいない微生物を指し、開示の全ての態様に適用される。したがって、それらは、抗菌剤によって死滅していない微生物である。生存微生物は、適切な条件下（本明細書に記載されているように、抗菌剤を含有する試料から一旦回収される）で、抗菌剤への曝露及び／又は増殖から代謝的回復が可能であり得る。「増殖」とは、体積／サイズの増加と、増殖能力、特に増殖能力（合成、ＤＮＡ複製及び細胞分裂を介して）の両方を意味する。
試料から生存微生物を回収する際に、回収された生存微生物が曝露される抗菌剤の濃度は、実質的に低減し得る。試料から生存微生物を回収する際には、試料に対して生存微生物の濃度を増加させることができる。生存微生物の濃度の増加は、生存微生物の特徴付けなどの下流プロセスの助けとなる可能性がある。
「試料をインキュベートする」ステップとは、粒子－微生物複合体の形成を誘導する条件下で試料を被覆された粒子と接触させることを指す。一部の実施形態では、試料を被覆された粒子とともにインキュベートするステップは、所定の温度（例えば、３７℃）で、一定期間（例えば、３０分間）被覆された粒子を試料と接触させることを含む。インキュベーションは、振とう（例えば、５００～１０００ｒｐｍに設定されたプラットフォームシェーカー、軌道振とう機又は振とうインキュベーターによる）を伴う又は伴わないで行うことができる。インキュベーションは、固定剤の不存在下で行うことができる。固定剤は、架橋固定剤又は非架橋固定剤であり得る。架橋固定剤は、試料中の微生物間で化学結合を形成することによって機能する。非架橋固定剤は、試料中の微生物を化学的に変化させず、むしろそれらを単に沈殿させる。
本方法は、回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するステップをさらに含むことができる。生存微生物は、被覆された粒子に付着したまま（すなわち、複合体中で）インキュベート及び／又は培養され得る。
本発明の方法によれば、回収された生存微生物の培養は、生存微生物の数を増加させることを含み得る。本方法において、回収された生存微生物をインキュベートすることは、別個の相と考えることができ、したがって、生存微生物の数を増加させることを含まない場合がある。抗菌剤に曝露された微生物は、回復後の期間、増殖する立場でないことがある。したがって、回収された生存微生物をインキュベートすることは、生物が抗菌剤に曝露された後に代謝的回復を受けることを可能にすることを含み得る。いくつかの下流の特徴付け方法では、微生物が増殖する必要はないが、代謝的回復が重要である場合がある。したがって、いくつかの方法は、回収後の培養ステップを伴わない場合がある。しかしながら、代謝回復後、生存微生物は増殖期に入る可能性がある。したがって、本発明の方法は、インキュベーションと培養の両方を含み、増殖後の代謝的回収を可能にすることができる。
したがって、本発明は、微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養する方法であって、ａ）試料を被覆された粒子とインキュベートして粒子－微生物複合体を形成するステップと；ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離して、それによって試料から生存微生物を回収するステップと；及びｃ）回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するステップとを含む方法を提供する。
本発明の方法は、回収された生存微生物を検出及び／又は特徴付けるステップをさらに含むことができる。「検出する」とは、回収された試料中に実際に生存可能な微生物が存在するかどうかを、任意の適切な手段によって決定又は確認することを指す。「特徴付ける」は、微生物の不存在又は存在を検出すること以上のものであり、回収された生存微生物に関する追加情報を提供するものである。特徴付けは、試料が細菌及び／又は真菌を含有するかどうかを決定することを含み得る。これは、特に臨床試料、特に感染が疑われる対象（例えば、敗血症の可能性のある患者）から採取した臨床試料において重要である。特徴付けは、追加的に（すなわち、最初に、微生物（細菌又は真菌など）が存在するかどうかを決定し、存在する場合には、さらなる特徴付けステップを行うことができる）、又は代替的に、試料から回収された微生物の属又は種を同定することを含み得る。特徴付けは、微生物のグラム状態（すなわち、細菌がグラム陰性か又はグラム陽性かどうか）を決定することを含み得る。これらのタイプの特徴付けは、試料が採取された対象に対して、どのタイプの抗菌剤が最も適しているかを決定するために特に有用であり得る。特徴付けは、微生物の抗菌剤感受性及び／又は耐性を決定することを含み得る。これらのさらなるステップには、任意の適切な方法を採用することができ、このような方法の例が本明細書においてさらに検討される。
したがって、本発明は、抗菌剤を含み、微生物を含有することが疑われる試料中の生存微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体（微生物が試料中に存在する場合、複合体が形成できない場合）を形成するステップと；ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離して、それによって試料から生存微生物を回収するステップと；及びｃ）生存微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
同様に、本発明は、抗菌剤を含み、微生物を含有することが疑われる試料中の生存微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体（微生物が試料中に存在する場合、複合体が形成できない場合）を形成するステップと；ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離して、それによって試料から生存微生物を回収するステップと；ｃ）回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するステップと；並びにｄ）生存微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
本発明は、対象からの試料上で本明細書に記載された方法のいずれかを行うことを含む、対象における生存微生物感染の不存在又は存在を検出する方法を提供する。典型的には、対象は、抗菌剤で処理されている。次に、これが試料中の抗菌剤の供給源である。試料は、典型的には、本明細書において検討される臨床試料である。対象は、典型的には、ヒト対象であり、しばしば、感染（細菌感染又は真菌感染であり得る）に罹患することが疑われるヒト対象である。
これらの方法において、本方法は、感染の原因となる微生物を特徴付けることをさらに含むことができる。本明細書で検討するように（以下、検討が準用される）、任意の適切な特徴付けを採用することができる。
既に述べたように、本発明は、特に臨床試料に適用可能である。このような試料は、典型的には、非微生物細胞を含有する。実際、それらは、主に非微生物細胞を含有し得る（すなわち、試料中の非微生物細胞よりも少ない、典型的には有意に少ない、微生物細胞が存在する）。したがって、被覆された粒子が、抗菌剤と非微生物細胞の両方を含有する試料から微生物を除去することができるという本発明者の発見は、本発明において特に有利である。
したがって、本発明は、微生物細胞、非微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から生存微生物を回収する方法であって、ａ）被覆された粒子とともに試料をインキュベートして粒子－微生物複合体を形成するステップと；ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤及び非微生物細胞から分離し、それにより、試料から生存微生物を回収するステップとを含む方法を提供する。
これらの方法において、試料は、非微生物細胞を含み、ステップｂ）は、粒子－微生物複合体を抗菌剤及び非微生物細胞から分離する。非微生物細胞は、血液細胞を含み得る。血液細胞は、赤色血液細胞（赤血球）及び／又は白色血液細胞（白血球）を含み得る。疑義を避けるために、分離が行われる前に、非微生物細胞を溶解することができる。したがって、非微生物細胞からの粒子－微生物複合体の分離は、非微生物細胞溶解物からの粒子－微生物複合体の分離を包含する。しかしながら、分離はまた、非微生物細胞が無傷のままである場合に行うことができる。
抗菌剤への微生物の曝露は、微生物を死滅させるか、又は部生物の増殖を妨げることを意図する。これは、生存可能な微生物を回収する場合に課題となる。したがって、本方法は、抗菌剤への曝露後に試料中に残存する生存微生物を保存することを意図した条件に依存することができる。それらの微生物は、細胞死及び溶解に対してより感受性である可能性がある。したがって、試料中の微生物よりも非微生物細胞を優先的に溶解するのに有用であり得る特定の薬剤は、本発明の特定の実施形態においては適切でないことがある。このような薬剤には、界面活性剤、特に高濃度の界面活性剤が含まれる。したがって、本発明の方法（ステップｂ）は、界面活性剤の不存在下で行うことができる。
一部の実施形態では、ステップｂ）は、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムの存在下で行うことができる。本明細書に示されるように、この試薬は、非微生物細胞を含有する試料からの微生物の回収に有用である。
さらなる実施形態では、ステップｂ）は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬（例えば、界面活性剤）の存在下で、追加的に又は代替的に行うことができる。適切な試薬は、当該技術分野において公知であり、本明細書においてさらに検討される。
抗菌剤に曝露された微生物の溶解に対する感受性の増加に鑑み、一部の実施形態では、非微生物細胞の溶解は、試料中の非微生物からの微生物の分離を容易にするために行われない。被覆された粒子は優先的に微生物と結合するため、試料中の非微生物を溶解する絶対的必要条件はない。しかしながら、非微生物細胞（典型的には無傷の非微生物細胞）及び／又は細胞溶解物を粒子－微生物複合体から除去するために、１つ又は複数の洗浄ステップを行うことが有利であり得る。したがって、本発明の方法のステップｂ）は、分離された粒子－微生物複合体を洗浄することを含み得る。任意の適切な洗浄溶液を採用することができ、例を本明細書において検討する。一部の実施形態では、分離された粒子－微生物複合体は、界面活性剤を含有しない溶液で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ及び／又は塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、約７～９、例えば、７．５～８．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、金属ハロゲン化物塩などの塩を含有する。好ましい例は、塩化ナトリウムである。塩濃度は、約５０～１５０ｍＭであり得る。好ましくは、洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ又はＴｒｉｃｉｎｅを含む。
他の実施形態では、分離された粒子－微生物複合体は、界面活性剤を含有する溶液で洗浄され得る。この溶液は、微生物の溶解のリスクを低減するための弱い界面活性剤溶液であり得る。溶液は、微生物を実質的に溶解しない濃度の界面活性剤を含み得る。適切な例としては、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％が挙げられる。試薬は、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％のサポニンを含み得る。微生物は、微生物を実質的に溶解しない期間、界面活性剤溶液に曝露され得る。溶液は、試料中の非微生物の少なくとも一部を選択的に溶解することができる。
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、１つ又は複数の酵素を含み得る。１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含み得る。適切な酵素は、本明細書において検討される。
しかしながら、既に述べたように、抗菌剤に曝露された後に脆弱であり得る微生物を扱う場合、ステップａ）及びステップｂ）で行われる任意の洗浄が、界面活性剤の不存在下で行われることが好ましい。全方法は、一部の実施形態では、界面活性剤の不存在下で行うことができる。他の実施形態では、本方法は、回収された生存微生物を検出及び／又は特徴付ける以外は、界面活性剤の不存在下で行うことができる。この実施形態では、微生物細胞の内容物は、分析のために放出される必要があり得る。適切な溶解試薬は、界面活性剤を含むことができる。このような界面活性剤は、微生物の完全な溶解を確実にするために高濃度であり得る。
本方法において、ステップｂ）は、典型的には、試料の残りから粒子－微生物複合体の何らかの形態の物理的分離を伴う。これは、任意の適切な分離手段の使用を含み得る。例えば、分離は、磁場を用いて達成され得る。磁場の使用は、粒子が磁性粒子であり、粒子－微生物複合体を引きつける必要がある。或いは、遠心分離、又は濾過などの他の分離方法を採用し得る。ステップ（ｂ）は、吸引によって粒子－微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップを含むか又はさらに含むことができる。
疑義を避けるために、物理的分離ステップ又は複数のステップに洗浄ステップを続けることができる。したがって、本方法は、（ステップｂの一部として）分離された粒子－微生物複合体を洗浄して、粒子－微生物複合体から抗菌剤及び／又は非微生物細胞若しくは溶解物を除去することをさらに含み得る。
より一般的には、ステップｂ）は、粒子－微生物複合体から非微生物細胞を除去することをさらに含むことができる。
選択的溶解が採用される場合、試料から非微生物細胞を除去するために（及び生存微生物を保持するために）、それは、本方法の任意の適切な段階で行うことができる。したがって、試料を被覆された粒子とともにインキュベートする前に、最初の処理ステップとしてこれを行うことができる。したがって、一部の実施形態では、ステップａ）に先立って、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することができる。
試料中に存在する無傷の微生物を保持しつつ、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することは、浸透圧溶解又は界面活性剤の添加を含むことができる。界面活性剤は、微生物を実質的に溶解しない非微生物細胞（例えば、血液細胞）の溶解を引き起こす弱い界面活性剤であり得る。適切な例としては、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％が挙げられる。試薬は、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％のサポニンを含み得る。
本方法において、ステップａ）は、典型的には、水溶液中で行われる。ステップａ）は、緩衝液の存在下で行うことができる。緩衝液は、任意の適切な緩衝剤を含むことができ、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＴＡＰＳ（［Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎｅ（２－（ビス（２－ヒドロキシエチル））アミノ）酢酸）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（３－［Ｎ－Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３－［Ｎ－Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、カコジル酸塩（ジメチルアルシン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ（２－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール）、マレイン酸塩、リン酸塩、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピペラジン、ヒスチジン、エタノールアミン、イミダゾール、ホウ酸塩、炭酸塩のうちのいずれか１つが挙げられる。緩衝液は、ｐＨが７．４～８．５であり得る。好ましくは、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ又はＴｒｉｃｉｎｅを含む。本方法において、ステップａ）は、塩化ナトリウムの存在下で行うことができる。塩化ナトリウムは、５０～５００ｍＭの濃度で存在することができる。好ましくは、塩化ナトリウムは、約１５０ｍＭの濃度で存在することができる。
本方法において、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤、特に弱い界面活性剤であり得る。本方法において、界面活性剤は、非イオン性であり得る。本方法において、界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。したがって、典型的には、界面活性剤は、粒子が添加される溶液の一部を形成し、粒子自体の一部を形成しない。
既に導入されているように、本発明の方法は、回収された生存微生物の検出及び／又は特徴付けを伴うことができる。一部の実施形態では、微生物の不存在又は存在を検出することは、（ｉ）微生物の酵素活性を検出すること、（ｉｉ）微生物から核酸又はポリペプチドを検出すること、（ｉｉｉ）サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出すること、又は（ｉｖ）細胞培養後に微生物を検出することを含み得る。
本発明の全ての関連する態様による粒子－微生物複合体中の微生物の不存在又は存在の検出は、任意の所望の方法に従って行うことができる。本方法は、１つ又は複数の微生物の単純な不存在又は存在を検出することを伴うことができる。存在する場合、微生物の定量化を伴う場合がある。また、一部の実施形態では、微生物の性質の特徴付けを伴うこともできる。したがって、細菌及び／又は真菌の検出を行うことができる。グラム陽性菌対グラム陰性菌の識別も行うことができる。生物の菌種及び抗菌剤感受性及び／又は耐性の同定もまた行うことができる。
粒子－微生物複合体から微生物を除去（又は回収）した後に、検出及び／又は特徴付けが行われることがある。回収された微生物は、検出前に溶解され得る。回収は、無傷の微生物、又は微生物の溶解後の溶解物であり得る（本明細書においてさらに詳細に検討される）。
好ましくは、検出は、粒子－微生物複合体からの微生物の事前除去（又は回収）なしに行われる。この実施形態は、本発明を磁性ビーズ処理装置に適用する際に特に有用である（すなわち、粒子が磁性である場合、本発明の方法の特に有用な実施を表す）。
微生物に関連する核酸分子の検出は、当該技術分野において公知であり、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで行うことができる。それは、増幅（例えば、ＰＣＲ）又は配列決定（特に、次世代シークエンシング）などの任意の適切な方法によって行うことができる。このような方法は、微生物と、ヒト、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの非微生物との間の配列の相違を利用することができる。このような方法は、核酸成分を放出するために、微生物（例えば、粒子－微生物複合体の形態で存在する）を溶解することを伴うことができる。
微生物の直接検出はまた公知である。これは、例えば、フローサイトメトリーによるサイトメトリー分析を伴うことができる。例えば、粒子－微生物複合体から回収された微生物を可視化するため、又は微生物を粒子－微生物複合体中で可視化するために、顕微鏡の使用を伴うことができる。
微生物の数を拡大するために、細胞培養後に微生物検出を行うこともできる。したがって、粒子－微生物複合体内に最初に捕捉された微生物は、検出前に、一定期間培養することができる。培養法によって、元の試料中の微生物を直接検出することができる。或いは、微生物をより短い期間（培養時よりも）インキュベートして、検出前に（しかし、拡大させずに）抗菌剤への曝露から代謝的回復を可能にすることができる。
しかしながら、好ましい実施形態では、回収された微生物の不存在又は存在の検出は、微生物に関連する酵素活性の検出を含むことができる。適切な酵素活性は、典型的には、核酸修飾活性であり、本明細書においてより詳細に検討される。
したがって、本方法において、微生物を検出するステップは、（ｉ）微生物を粒子－微生物複合体に溶解するステップ；（ｉｉ）溶解物を、微生物の核酸修飾活性のための基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップ；及び（ｉｉｉ）微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子上の核酸修飾酵素の作用から生じる修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップを含むことができる。適切な基質は、本明細書においてさらに詳細に検討される。「基質」とは、微生物由来の酵素によって作用される核酸分子を意味する。典型的には、このような核酸分子はオリゴヌクレオチド基質である。それらは合成核酸分子である。
粒子－微生物複合体中の微生物の溶解は、核酸修飾酵素などの微生物内の核酸分子又は酵素の検出を可能にする。溶解は、溶解混合物の添加によって達成され得る。溶解混合物は、一般的に、本発明の方法において有用である。溶解混合物は、細胞内の核酸分子及び／又は核酸修飾活性などの酵素活性に悪影響を及ぼすことなく、微生物の効率的な溶解を確実にするために、成分の特定の混合物を含み得る。成分は、担体／血清タンパク質、例えば、ＢＳＡ、サーファクタント／界面活性剤、金属ハロゲン化物塩、緩衝液、キレート剤などから選択することができる。本発明の溶解混合物は、その基本形態において、以下の成分を含むことができる：
１．サーファクタント／界面活性剤
２．アルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの血清タンパク質
３．緩衝液
４．ｄＮＴＰなどのヌクレオチド
５．核酸分子（本発明のアッセイにおいて基質として作用する）。
適切な溶解混合物を以下に記載する：
Ｌ１：３６０ｍＬのＬＭ中２５２ｍＬ
１．４６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
０．１５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００
０．１５％のＴｗｅｅｎ ２０
Ｌ２：３６０ｍＬのＬＭ中３６ｍＬ
１００ｍＭ硫酸アンモニウム
２０ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物
１００ｍＭ塩化カリウム
２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］
Ｌ３：３６０ｍＬのＬＭ中３６ｍＬ
０．１μＭのＰＴＯ－ＡＳオリゴ
０．１μＭのＰＴＯ－Ｓ１オリゴ
２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．５］
１０ｍＭ塩化カリウム
１０μＭのＥＤＴＡ
１０ｍＭのｄＮＴＰ：３６０ｍＬのＬＭ中３．６ｍＬ
ＰＴＯ－ＩＰＣストック：３６０ｍＬのＬＭ中約１８０μＬ
Ｈ２Ｏ：３６０ｍＬのＬＭ中約３２．４ｍＬ
「ＰＴＯ－ＡＳオリゴ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。「ＰＴＯ－Ｓ１オリゴ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むセンスオリゴヌクレオチドを意味する。２つのオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズし、基質核酸分子を形成する。
「ＰＴＯ－ＩＰＣ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むＩＰＣ分子を意味する。
適切な基質及びＩＰＣ分子は、本明細書においてさらに詳細に検討される。
各成分の例示的な量及び濃度は列挙されているが、当業者であれば容易に理解できるように修飾することができる。
また、溶解には細胞の破壊が必要となる場合がある。例えば、細胞は、物理的及び／又は酵素的手段と組み合わせて溶解混合物を用いて破壊され得る。しかしながら、典型的には、細胞を溶解する方法は、物理的破壊の使用を避ける。一部の実施形態では、物理的破壊は、ディスラプターを使用する。ディスラプターは、細胞を溶解するためにガラスビーズなどのビーズを取り込むことができる。適切な装置は市販されており、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造されたディスラプターＧｅｎｉｅを含む。超音波処理は、例えば、超音波ホーンを適用することで利用することができる。酵素的破壊は、一部の実施形態では、リゾスタフィン、リゾチーム及び／又はリチカーゼから選択される１つ又は複数の薬剤の使用を必要とすることができる。
一度、試料中に存在する場合に、微生物が溶解されると、放出された核酸及び／又は酵素は、試料中に生存微生物が存在するかどうか（及び試料から回収されるかどうか）を示すために検出され得る。一部の実施形態では、溶解物は、（微生物の）核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートされる。次に、基質核酸分子上の核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在は、微生物の不存在又は存在を示すために決定される。核酸基質分子は、検出されるべき核酸修飾活性に従って設計される。当業者は、適切な基質核酸分子を設計することができる。最初の試料は、核酸修飾活性の非微生物源を含有し得るが、本発明の方法は、基質核酸分子に作用するこの汚染活性を防ぐ。
本発明の方法によれば、検出され得る典型的な核酸修飾活性は、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ活性を含む。核酸修飾酵素は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを含み得る。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。核酸修飾酵素は、リガーゼを含み得、任意選択で、核酸修飾酵素は、ＮＡＤ依存性リガーゼ（細菌の存在を示すため）及び／又はＡＴＰ依存性リガーゼ（真菌又は細菌の存在を示すため）である。ＮＡＤ依存性リガーゼは（ｅｕ）細菌にのみ見出され、このような活性を検出することにより、さらなるレベルの特異性が得られる可能性がある。これは、国際公開第２００９／００７７１９号及び国際公開第２０１０／１１９２７０号（関連開示は本明細書に組み込まれる）でさらに検討されている。生存率に関連する他の核酸修飾活性、例えば、ホスファターゼ、キナーゼ及び／又はヌクレアーゼ活性は、代替的に測定され得る。
既に検討されたように、本方法は、分離された粒子－微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去することを含み得る。洗浄ステップは、その後の分析のインヒビター、例えば、ＰＣＲ阻害剤を除去することができる。洗浄ステップは、典型的には、粒子－微生物複合体を解離しない条件下で行われる。
一部の実施形態では、基質核酸分子に対する核酸修飾活性の作用は、伸長された核酸分子を生成する。これは、鎖伸長（ポリメラーゼ活性）により、及び／又は２つの核酸分子の連結（リガーゼ活性）によるものであり得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ又はリガーゼのいずれかによって作用され得る基質が利用され、これは、いずれかの活性が試料中の微生物の存在を示すためである。一部の実施形態では、関連活性は、生成される新規の核酸分子に関して区別することができる。
基質は、微生物の核酸修飾活性のための鋳型であり得る。例えば、基質は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの鋳型であり得、任意選択でＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩである。
微生物の核酸修飾活性の基質として作用する適切な核酸分子は、国際公開第２０１１／１３０５８４号、国際公開第２０１０／１１９２７０号及び国際公開第２００９／００７７１９号（関連開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ホスファターゼ活性の場合、適切な核酸分子は、国際公開第２００６／１２３１５４号に開示され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
具体的な実施形態では、本発明の方法で使用される（基質）核酸分子は、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含み、修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップは、相補鎖中のウラシル残基を分解するために、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に添加することを含む。
特定の実施形態では、（基質）核酸分子は、ＤＮＡ分子、典型的にはＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むか又はそれである。特定の実施形態では、（基質）核酸分子は、ＤＮＡを含み、部分的に二本鎖である。
一部の実施形態では、（基質）核酸分子は、センスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖からなる核酸を含み、これらの２本の鎖が、重なり合って、二本鎖領域を形成し、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の一本鎖部分は、ポリメラーゼ活性の存在下で伸長産物を作製するためのプライマーとして作用する、二本鎖領域のセンスオリゴヌクレオチド鎖を有する鋳型として作用する。
特定の実施形態では、部分的に二本鎖（基質）核酸分子の第１鎖は、合成ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）を含み（又はそれからなり）、第２（相補性）鎖は、ウラシル残基、及び任意選択で、合成ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む（又はそれからなる）。好ましくは、二本鎖領域は、第１及び第２（相補性）鎖の３’末端領域を包含する。一部の実施形態では、第２（相補性）鎖は、第２鎖のＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長を遮断するその３’末端に塩基（例えば、ジデオキシシチジン）を含む。このような部分的二本鎖（基質）核酸分子は、例えば、Ｚｗｅｉｔｚｉｇら、２０１２年（参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０巻、１４号、ｅ１０９、１～１２頁）に記載されている。好ましくは、二本鎖領域は、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチドであり；任意選択で、二本鎖領域は５０ヌクレオチド以下である。第１鎖は、本明細書に記載されるように、試料中の微生物のポリメラーゼ活性による保護されていない（又は標準の）ｄＮＴＰを用いて、インキュベーションステップ中に伸長されて、保護されていない（又は標準の）ヌクレオチドを含む伸長された第１鎖を形成することができる。このステップは、第２鎖を鋳型（第１と第２鎖の間の相補性領域の上流）として使用することに依存する。インキュベーションステップの後、第２（相補性）鎖は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に添加することによって分解され得、伸長された第１鎖は、合成ヌクレオチド及び保護されていないヌクレオチドを含む一本鎖分子として残される。第２鎖の分解に続いて、（基質）核酸分子の伸長された第１鎖を増幅ステップで検出することができる。本発明者らは、上記される部分的二本鎖（基質）核酸分子の使用が、試料中の微生物の検出を改善することを見出した。
一部の実施形態では、基質核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように予め修飾され、すなわち、核酸分子は、アッセイに加えられる前に、それをヌクレアーゼ活性から保護するように修飾される。本発明者らは、ヌクレアーゼ活性から基質核酸分子を保護することが、本発明のアッセイとの関連で有利であることを決定した。より具体的には、本発明の方法への保護された核酸分子の取り込みは、検出の感度を改善する。核酸分子をヌクレアーゼ活性から保護するために、任意の適切な手段を採用することができる。非限定的な例としては、核酸分子へのメチル化の取り込み、３’末端及び／又は５’末端の保護などの末端修飾、並びに合成ヌクレオチドの取り込みが挙げられる。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド及び／又はロックされた核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、核酸分子中のヌクレオチドの少なくとも１つから全部までを置換する。
（基質）核酸分子は、（新規の検出可能な）核酸分子を生成するために、核酸修飾活性によって作用することができる任意の天然核酸及び天然若しくは合成類似体を含み得る。基質は、具体的な実施形態では、伸長及び／又は連結することができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼ及びリガーゼ活性の検出を可能にするために、核酸基質分子の組み合わせを採用することができる。
核酸基質は、試料中の核酸修飾活性（微生物によって提供される）に対して、過剰に、特に、大きなモル過剰で存在し得る。新規な伸長又は連結された核酸分子が検出されるため、試料中のこの分子の存在のみが、検出方法が効果的に働くために必須である。したがって、他の核酸分子が、検出対象の微生物由来、又は哺乳動物若しくは、例えば、試験対象の試料中に見出され得る他の供給源由来などの試料中に存在する場合、本発明の方法に有害ではない。
本発明者らは、以前に、内部陽性対照（ＩＰＣ）分子の使用を、それらの方法との関連で調査した。したがって、全ての態様によれば、本発明は、ＩＰＣ分子の包含に依存し得る。一部の実施態様では、ＩＰＣは、ＩＰＣが同一の条件に曝露されるように、基質核酸分子とともに含まれる。一部の実施態様では、ＩＰＣ分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように予め修飾され、すなわち、核酸分子は、アッセイに加えられる前に、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように修飾される。本発明者らは、ＩＰＣ分子をヌクレアーゼ活性から保護することが、本発明のアッセイとの関連で有利であると決定した。核酸分子をヌクレアーゼ活性から保護するために、任意の適切な手段を採用することができる。非限定的な例としては、核酸分子へのメチル化の取り込み、３’末端及び／又は５’末端の保護などの末端修飾、並びに合成ヌクレオチドの取り込みが挙げられる。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド及び／又はロックされた核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、ＩＰＣ分子中のヌクレオチドの少なくとも１つから全部までを置換する。好ましくは、基質及びＩＰＣ分子は、それらが本発明のアッセイにおいて同様に挙動するために有利であるのと同じ方法で修飾される。
一部の実施形態では、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子は、核酸分子とＩＰＣの両方を含む核酸増幅反応においてプライマー結合に対する競合が存在するように、基質核酸分子に対する同一のプライマー結合部位を含む。
本発明の全ての方法において、修飾された核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定することは、核酸増幅ステップを含み、それから本質的になり、又はそれからなり得る。これは、本発明の方法を最大限に高感度にするのに役立つ。このような増幅技術は、当該技術分野において周知であり、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１年）、３ＳＲ（Ｆａｈｙら、１９９１年）、ローリングサークル複製、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５巻：７７７～７８４頁、１９９９年）、米国特許第６，２６１，８４６号に記載されるＤＮＡオリゴマー自己集合プロセス（参照により本明細書に組み込まれる）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、任意プライミングＰＣＲ（国際公開第９０／０６９９５号）、コンセンサス配列プライミングＰＣＲ（米国特許第４，４３７，９７５号）、インバーダー技術、鎖置換技術、及びニック置換増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号）などの方法が含まれる。上記のリストは、網羅的であることを意図したものではない。適切な核酸生成物が特異的に増幅されれば、任意の核酸増幅技術を使用することができる。
同様に、配列決定に基づく方法論は、一部の実施形態では、クローン的に増幅された配列の合成によるシークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ピロシークエンシング、４５４シークエンシング（Ｒｏｃｈｅ）、ナノ細孔シークエンシング（例えば Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、イオントレント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及び単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの、次世代シークエンシングプラットフォームの範囲のいずれかを含むために採用され得る。新規な核酸分子が生成されるという事実は、配列決定アプローチが、修飾された核酸分子の存在又はその他を確認することができ、また、その分子の定量化を提供することができることを意味する。
増幅は、検出されるべき修飾核酸分子の配列に特異的な増幅プライマーの使用によって達成される。核酸分子に対する特異性を提供するために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位を選択することができる。当業者は、核酸分子はまた、試料中の修飾活性によって生成される新規核酸分子の検出に必要なプライマー結合部位以外の配列を含み得、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位又はプロモーター配列は、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ及びＴＭＡなどの等温増幅技術に必要とされ得ることを理解する。
１つ又は複数のプライマー結合部位は、増幅産物が、例えば、連結／伸長が生じた場合にのみ生成されるように、基質核酸分子の連結／伸長境界を架橋することができる。或いは、プライマーは、連結／伸長された核酸分子が形成される場合にのみ（指数関数的に）増幅産物が生成されるように、連結／伸長境界のいずれかの側に結合し、境界を越えて直接増幅することができる。プライマー及び基質核酸分子（複数可）は、非特異的増幅（例えば、試料中のゲノムＤＮＡの増幅）を回避するように設計することができる。
プライマーは、合成ヌクレオチド類似体を適切に組み込むことができ、又はＲＮＡ若しくはＰＮＡに基づく、例えば、又はそれらの混合物であり得る。プライマーは、採用される検出モードに応じて、蛍光標識及び／又はＦＲＥＴ対などで標識化され得る。
プローブが、利用され得、再度、所望により、標識化され得る。検出方法は、プライマーに加えて、又はプライマーの代替物としてのヌクレオチドプローブの使用を必要とすることができる。例えば、プライマーの使用を必要としない分枝状ＤＮＡアッセイを一部の実施形態で採用することができる。
特定の態様では、本発明の方法は、試料中の微生物の存在を示す基質核酸分子に対する核酸修飾活性の作用の直接の結果として生成された修飾核酸分子を検出するために、核酸増幅技術を用いて行われる。特定の実施形態では、使用される技術は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、ＳＤＡ及びＤＮＡオリゴマー自己集合から選択される。
増幅産物の検出は、例えば、ゲル電気泳動などの日常的な方法により行うことができるが、一部の実施形態では、リアルタイム検出方法又はエンドポイント検出方法を用いて行われる。
増幅反応の生成物のリアルタイム又はエンドポイント検出のためのいくつかの技術が、当該技術分野において公知である。これらには、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版）などの挿入蛍光色素の使用が含まれ、増幅されたＤＮＡの収率を生成された蛍光量に基づいて推定することができる。リアルタイム検出方法の多くは、連続的にモニターすることができる蛍光読み出しを生成する；具体的な例には、分子ビーコン及び蛍光共鳴エネルギー移動プローブが含まれる。リアルタイム及びエンドポイント技術は、反応を「単一チューブ」に維持するため、有利である。これは、結果を得るために、下流の分析は必要なく、より迅速に結果を得ることができることを意味する。さらに、反応を「単一チューブ」環境に維持することは、交差汚染のリスクを低減し、本発明の方法からの定量的な生産を可能にする。これは、健康及び安全上の懸念が（例えば、患者試料における潜在的な微生物感染の検出において）最も重要であり得る本発明の関連において、特に重要であり得る。
ＰＣＲ反応のリアルタイム及びエンドポイント定量は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成することができる。Ｈｏｌｌａｎｄら；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ５’－３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻、７２７６～７２８０頁（１９９１年）、Ｇｅｌｍｉｎｉら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ Ｃ－Ｅｒｂ－２ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３巻、７５２～７５８頁（１９９７年）、及びＬｉｖａｋら、Ｔｏｗａｒｄｓ ｆｕｌｌｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９巻、３４１～３４２頁（１９９５年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このタイプのプローブは、一般的に、加水分解プローブと呼ばれることがある。リアルタイム又はエンドポイント検出に使用するための適切な加水分解／Ｔａｑｍａｎプローブも提供される。プローブは、例えば、以下に詳述される標識を使用して、適切に標識化され得る。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎシステムでは、Ｔｙａｇｉ ＆ Ｋｒａｍｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ－ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻、３０３～３０８頁（１９９６年）、及びＴｙａｇｉら、Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、４９～５３頁（１９９８年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ビーコンは、標的に結合したときに蛍光が回復される内部的にクエンチされたフルオロフォアを有するヘアピン形状のプローブである。これらのプローブは、ヘアピンプローブと呼ばれることがある。
本発明の方法に組み込むことができるさらなるリアルタイム蛍光ベースのシステムは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎシステムであり、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７巻、８０４～８０７頁（１９９９年８月１日）による自己プロービングアンプリコン及び蛍光を使用するＰＣＲ産物の検出を参照されたい。当業者に周知であり、市販されている追加のリアルタイム又はエンドポイント検出技術には、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）技術、Ａｍｐｌｉｆｕｏｕｒ（登録商標）プライマー技術、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６巻：５号、６２５～６３０頁（２０００年））、又はＰｌｅｘｏｒ（商標）ｑＰＣＲ及びｑＲＴ－ＰＣＲシステムが含まれる。
したがって、本発明のさらなる態様では、核酸増幅の生成物は、リアルタイム又はエンドポイント技術を用いて検出される。本発明の具体的な実施形態では、リアルタイム技術は、加水分解プローブ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システム）、ＦＲＥＴプローブ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム）、ヘアピンプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ（登録商標）システム）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓシステム）、プライマーに組み込まれたヘアピンプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブシステム）、ＤＮＡｚｙｍｅの相補配列及び切断可能な蛍光ＤＮＡｚｙｍｅ基質（ＤｚＹＮＡ）を組み込んだプライマー、Ｐｌｅｘｏｒ ｑＰＣＲ及びオリゴヌクレオチド遮断システムのいずれか１つを使用することからなる。
増幅産物を定量して、試料中の微生物の核酸修飾活性、したがって、試料中の微生物のレベルの近似を与えることができる。したがって、「不存在又は存在」は、試料中の微生物のレベルの定量化を包含することが意図される。
本発明者らは、さらに、微生物の核酸修飾活性を測定するための最適温度が、微生物の溶解のための最適温度と同じでない可能性があることを発見した。したがって、一部の実施形態では、微生物の溶解は、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップよりも低い温度で行われる。既に検討したように、本発明の一部の実施形態では、基質核酸分子は、微生物を溶解するために使用される溶解試薬に含まれる。このような実施形態は、異なる温度選好と一致する。したがって、基質核酸分子が溶解試薬に含まれ得るとしても、初期のより低い温度は、基質が、微生物から放出された核酸修飾活性によって修飾されるより高い温度でのその後のインキュベーションに悪影響を及ぼさない。したがって、一部の実施形態では、本方法は、溶解試薬が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含有する微生物の溶解ステップを伴う。このステップは、微生物から放出された酵素の活性を可能にするために、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートするその後のステップよりも低い温度で行われる。したがって、基質は、初期のより低い温度に曝露され、続いて、酵素活性が増大されるより高い温度に曝露される。
一部の実施形態では、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップは、少なくとも約３０℃の温度で行われる。温度は、任意選択で、約３０℃～４０℃又は約３２℃～３７℃、例えば、約３７℃で行うことができる。
追加の又は代替の実施形態では、微生物を溶解するステップは、約３０℃以下、任意選択で、約１５℃～３０℃又は約１８℃～２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５℃の温度で行われる。一部の実施形態では、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートする前の全てのステップは、約３０℃以下の温度で行われる。温度は、任意選択で、約１５℃～３０℃又は約１８℃～２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５℃であり得る。
このような方法は、本発明の種々の態様に関して記載された実施形態のうちのいずれか１つ又は複数から全てまでを組み込むことができる。
一部の実施形態では、本方法は、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートするステップが、少なくとも約３０℃、任意選択で、約３０℃～４０℃、又は約３２℃～３７℃、例えば、約３７℃の温度で行われるという点でさらに特徴付けられる。
追加の又は代替の実施形態では、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートする前の各ステップは、約３０℃以下、任意選択で、約１５℃～３０℃、又は約１８℃～２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５℃の温度で行われる。
上で導入されたように、試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子－微生物複合体を形成するステップの前（すなわち、ステップ（ａ）の前）に、本方法は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップを含み得る。
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップは、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを試料に添加するステップを含み得る。１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含み得、任意選択で、プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである。
試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップは、白血球などの非微生物細胞からの酵素活性を防ぎ、試料中の微生物の存在を偽って示し得る。このような選択的な溶解は、本明細書においてさらに検討される任意の適切な手段によって達成することができる。試料中に存在するが、試料中の微生物を溶解しない非微生物、特に哺乳動物細胞を溶解する任意の適切な試薬を使用することができる。試薬は、一部の実施形態においてサーファクタント又は界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤を含み得る。適切な例としては、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％が挙げられる。試薬は、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％のサポニンを含み得る。試薬は、例えば、８．５ｇ／Ｌの、塩化ナトリウムなどの金属ハロゲン化物塩を含み得る。試薬は、３つ全ての成分の混合物を含み得る。試料は、試料中に存在する場合、非微生物細胞、特に哺乳動物細胞の溶解を確実にするために、適切な条件下で試薬と混合され得るが、試料中に存在する場合、微生物の溶解はない（又はわずかである）。試料は、５、１０、１５、２０、２５又は３０分などの約５～３０分間、試薬に曝露され得る。このステップは、任意の適切な温度、例えば、１５～３０℃又は室温で行うことができる。非微生物細胞の選択的溶解は、存在する実質的に全ての非微生物細胞を溶解することができる。非微生物細胞の選択的溶解はまた、特に、微生物が脆弱であり及び／又は高濃度の抗生物質に曝露されていた場合必ずしも全てではない、試料中に存在する微生物細胞の一部を溶解することができる。
一部の実施形態では、本発明の全ての態様によれば、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞の選択的溶解は、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを試料に添加することを含む。特定の理論に拘束されることを望まないが、界面活性剤は、非微生物の細胞膜を選択的に透過するが、微生物は、それらの細胞壁によって保護される。酵素は、放出された細胞内物質及び他の細胞残屑を分解するのに有用であり、放出された酵素活性の持ち越しを防ぐのに寄与し得る。一部の実施形態では、１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はヌクレアーゼを含む。適切なプロテイナーゼには、プロテイナーゼＫが含まれる。適切なヌクレアーゼにはＤＮＡｓｅが含まれる。一実施形態では、非微生物細胞を選択的に溶解するために使用される試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びプロテイナーゼＫの組み合わせを含む。より具体的には、溶解試薬は、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び４．８μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含み得る。
非微生物細胞を溶解する場合には、放出されたいずれもの関連する酵素活性を不活化することが重要である。本発明者らは、酵素活性の効果的な不活化を確実にするために、高ｐＨ条件を利用する方法を考案した。微生物細胞は、典型的には、少なくとも処理の一部の間、無傷の状態であり、細胞内酵素活性は、高ｐＨ処理によって有意に悪影響を受けない。加えて、本発明者らは、微生物酵素が、いずれの場合においても高ｐＨ処理に対してより耐性であることを以前に示した。
したがって、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップの後、本方法は、溶解物を高ｐＨ条件に曝露するステップを含み得る。高ｐＨ条件への曝露期間は、典型的には２０分未満であり、１０、９、８、７、６又は５分以下であり得、約５、６、７、８、９又は１０分であり得る。一部の実施形態では、処理は、約２～１５分間、例えば、約５分間行われる。「約」とは、この文脈において、プラス又はマイナス３０秒を意味する。
任意の適切な試薬は、高いｐＨ条件を提供するためであり得る。特定の実施形態では、高ｐＨ条件は、試料をアルカリ又は緩衝液と接触させることを含む。特定の実施形態では、ＮａＯＨ又はＮａ２ＣＯ３が使用される。具体的な実施形態では、ＮａＯＨ又はＮａ２ＣＯ３の濃度は、約５ｍＭ又はそれ以上である。緩衝液は、９を超えるｐＫａ値を有することができる。適切な緩衝液の例としては、ホウ酸、炭酸及びピロリン酸緩衝液が挙げられる。
高ｐＨ条件は、典型的には、哺乳動物細胞などの非微生物源由来のＡＴＰ依存性リガーゼ及びポリメラーゼを含む核酸修飾酵素の活性を阻害するが、微生物のリガーゼ又はポリメラーゼの活性を阻害しない。これは、主に、非微生物酵素のみが高ｐＨ条件に曝露されることを確実にする方法において採用される示差的な溶解条件によるものである。しかしながら、これらの条件に対する微生物酵素の耐性が高いことも原因である可能性がある。「高ｐＨ」は、一般的に、約１０、１１、１２、１３又は１４などの少なくとも約１０のｐＨである。「低ｐＨ」は、一般的に、約４、３、２、若しくは１などの約４未満又はそれに等しいｐＨである。「約」とは、この文脈において、規定された値のいずれかの側のｐＨ単位の０．５を意味する。当業者に容易に理解されるように、試料のｐＨを変化させることは、任意の適切な手段を用いて達成することができる。ポリメラーゼ及びリガーゼなどの微生物の酵素は、極端なｐＨに耐性であり得るが、対応する哺乳動物の酵素は同じｐＨ条件下で不活化され得る。これは、哺乳動物細胞と微生物細胞の両方を含有する試料における微生物酵素活性の選択的検出を助ける。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞からの、ＡＴＰ依存性リガーゼなどの非微生物核酸修飾活性の活性を阻害するが、微生物リガーゼなどの核酸修飾活性の微生物源の活性を阻害しない条件は、試料を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）又は炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）で処理することを含む。このような薬剤は、本明細書に示されるように、微生物（真菌及び細菌）酵素を活性の状態にしながら、試料のｐＨを高ｐＨに増加させ、したがって、非微生物酵素活性を不活性化するために容易に使用することができる。適切な濃度及び体積の適切な薬剤は、当業者によって適用され得る。しかしながら、特定の実施形態において、ＮａＯＨは、少なくとも約５ｍＭのＮａＯＨである。一部の実施態様では、アルカリ濃度は、５、６、７、８、９又は１０ｍＭなどの１０ｍＭ以下である。
さらなる実施形態では、ｐＨは、哺乳動物の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はＡＴＰ依存性リガーゼ活性）を不活性化する約１２であるが、微生物の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ活性）を不活性化しない。具体的な実施形態では、ｐＨ条件は、少なくとも約１１、又は少なくとも１１．２まで増加され得る。この処理は、特定の期間後に、試料中の微生物の溶解をもたらし、したがって、核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ）を試料中に放出させることができる。したがって、一部の実施形態では、微生物の溶解は、高ｐＨ処理によって達成される。これは、別個の細胞溶解ステップを必要とせずに、微生物に由来する、試料中の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ）の検出を可能にする。このような条件下では、哺乳動物のリガーゼ（血中ＡＴＰ依存性リガーゼなど）は不活性化される。しかしながら、典型的には、本明細書でより詳細に検討されるように、本方法は、試料中の微生物を溶解するための別のステップを含む。
一部の実施形態では、高ｐＨ条件下での処理は、ｐＨを低下させるために試薬を添加することによって停止される。これは、微生物が溶解する前に行われる。適切な試薬は、緩衝液及び／又は酸を含む。したがって、中和緩衝液を添加することによってｐＨを低下させることができる。具体的な実施形態では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（例えば、ｐＨ７．２又は８）を含む。ｐＨを低下させるための他の適切な薬剤には、塩酸（ＨＣｌ）及び硫酸（Ｈ２ＳＯ４）などの酸が含まれる。これら（及び他の）酸は、当業者に容易に理解されるように、緩衝液中に取り込まれ得る。ｐＨが上昇した後に試料を処理するのに有用な１つの具体的な試薬は、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カリウム及びＴｒｉｓ－ＨＣｌの組み合わせを含む。より具体的には、試薬は、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物、１０ｍＭ塩化カリウム及び２０ｍＭトリス－ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］を含むことができる。
本発明の方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、任意の既に利用可能な診断技術を補完するために使用することができる。或いは、これらの方法は、迅速であり、便利な診断手段を提供するため、それら自体、予備的な診断方法として使用することができる。さらに、本発明の方法は、固有の感度のために、最小限の試料しか必要とせず、したがって、不必要な侵襲的手術を防ぐ。また、本発明の方法に従って、大型であるが濃縮されていない試料を効果的に試験することもできる。
本発明の方法は、ひとたび微生物の陽性存在が試料中に検出されると、感染の性質を同定することを伴うことができる。このさらなる同定ステップには、任意の適切な方法を採用することができる。
組成物及びキット
本発明の方法を行う過程で、新しい組成物（成分の組み合わせ）が作製される。本発明の他の態様（特に方法）に関して記載された全ての態様及び実施形態は、関連する組成物に準用される。
したがって、本発明は、ａ）抗菌剤及び生存微生物を含有する試料；及びｂ）試料中の生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子を含む組成物を提供する。
同様に、本発明は、抗菌剤及び被覆された粒子と複合体化された生存微生物を含有する試料を含む組成物を提供する。
組成物において、試料は、本明細書において定義される通りである。したがって、生存微生物細胞を含有する試料は、非微生物細胞をさらに含むことができる。非微生物細胞は、血液細胞を含み得る。血液細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
本発明は、さらに、本明細書に記載される方法のいずれかを行うためのキットを提供する。本発明の他の態様（特に方法）に関して記載された全ての態様及び実施形態は、関連するキットに準用される。
本発明は、ａ）生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子を含有する容器；ｂ）被覆された粒子を用いて回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するのに適した培地を含有する容器であって、抗菌剤及び／又は抗菌剤と結合することができる物質を含有しない容器；及び／又はｃ）試料から回収された被覆された粒子を洗浄するための洗浄緩衝液を含有する容器であって、洗浄緩衝液が生存微生物を溶解しない容器を含むキットを提供する。
キットにおいて、成分ａ）、ｂ）及びｃ）は、別々の容器内であり得る。本発明のキットに含まれる容器は、当業者に理解されるように、関連する試薬のための任意の適切な容器であり得る。典型的には、容器は、本発明の方法を１回行うのに十分な量又は濃度の試薬を含有する。したがって、キットは、単一使用キットであり得る。生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子を含有する容器は、被覆された粒子を含有するのに適した材料及び体積の容器である。一部の実施形態では、容器はまた、粒子－微生物複合体を形成するために被覆された粒子とともに試料をインキュベートするのに適した材料及び体積のものである。これは、本方法を開始するために、被覆された粒子を含有する容器に試料を単に添加することができることを意味する。培地を含有する容器は、培地を含有するのに適した材料及び体積の容器である。一部の実施形態では、容器はまた、特に粒子－微生物複合体の形態で、回収された生存微生物をさらに含有する材料及び体積のものある。したがって、容器を含有する培地は、粒子－微生物複合体をインキュベート又は培養するのに適していることができる。或いは、培地は、粒子－微生物複合体を既に含有する別の容器（典型的には、より大きな体積のもの）に添加することができる。洗浄緩衝液を含有する容器は、洗浄緩衝液を含有するのに適した材料及び体積の容器である。典型的には、洗浄緩衝液を用いて、別々の容器に含有する粒子微生物複合体を洗浄する。したがって、洗浄緩衝液は、洗浄緩衝液を含有するようにのみ設計された容器に提供され得る。複数回（例えば、２回又は３回）の洗浄が必要な場合、キットには、１回の洗浄に適した量の洗浄緩衝液を含有する複数の個々の容器を含有し得る。或いは、複数回（例えば、２回又は３回）の洗浄のために十分な洗浄緩衝液を含有する単一の容器が提供され得る。
適切な洗浄緩衝液を本明細書に記載する。キットにおいて、洗浄緩衝液は、界面活性剤不含であり得る。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ及び／又は塩化ナトリウム（適切な濃度は、本明細書の実施例に記載される）を含む。典型的には、洗浄緩衝液は、洗浄ステップにおいて非微生物細胞を除去するために使用され、したがって、洗浄緩衝液は、非微生物細胞を溶解しない。
キットに含まれる全てのさらなる手段は、必要に応じて、１つ又は複数の容器に含有され得る。
キットは、回収された生存微生物を検出及び／又は特徴付けるための手段をさらに含むことができる。任意の適切な手段を採用することができ、それらは、生存微生物を検出及び／又は特徴付けるために必要な試薬の完全なセットを表すことができる。
特定の実施形態では、検出手段は、微生物の核酸修飾活性のための基質として作用する核酸分子を含むか又はそれである。粒子ＤＮＡオリゴヌクレオチド基質分子中の適切な基質分子は、本明細書に記載され、この検討は準用される。
一部の実施形態では、検出手段は、核酸増幅のための試薬を含むか又はさらに含む。核酸増幅のための試薬は、プライマー対及び／又は少なくとも１つのプローブを含み得る。一部の実施形態では、それらのプライマー及び／又はプローブは、微生物核酸分子とハイブリダイズする。したがって、それらは、増幅された微生物核酸分子を検出することによって、試料中の微生物を検出することができる。或いは、プライマー又はプローブは、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子にハイブリダイズする。このような核酸分子は、本明細書にさらに詳細に記載される。
キットは、ａ）微生物と複合体を（選択的に）形成することができる被覆された粒子（すなわち、粒子－微生物複合体）；及び（ｂ）粒子－微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段を含み得る。検出手段は、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み得る。核酸分子は、少なくとも部分的に二本鎖であり得、任意選択で、相補鎖中にウラシル残基を含み得る。相補鎖は、その３’末端に、ＤＮＡポリメラーゼが媒介する第２鎖の伸長を遮断する塩基（例えば、ジデオキシシチジン）を含み得る。核酸分子は、本明細書に記載される核酸分子のいずれかであり得る。
したがって、キットは、ａ）生存微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子；又はｂ）生存微生物からの（抽出された）核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブをさらに含むことができる。
本発明はまた、ａ）生存微生物との複合体を形成することができる被覆された粒子を含有する容器、及びｂ）生存微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子；又は生存微生物からの核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含むキットを提供する。以下の検討は、関連する方法に準用される。
本発明の全ての態様によれば、生存微生物からの核酸は、ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子、又はＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり得る。好ましい標的は、本明細書において検討されるＩＬＶ３などの遺伝子である。他の好ましい標的は、Ｓｈｉｇａ毒素（例えば、腸管出血性大腸菌感染における）をコードするものなどの病原性遺伝子である。
本発明の全ての態様によれば、核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子は、本明細書の他の箇所に記載される。適切な基質は、本明細書においてさらに詳細に検討される。「基質」とは、微生物由来の酵素によって（直接的に）作用される核酸分子を意味する。典型的には、このような核酸分子はオリゴヌクレオチド基質である。それらは合成核酸分子である。
本発明の全ての態様によれば、生存微生物からの核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブは、細菌若しくは真菌が試料中に存在するかどうか、及び／又は細菌若しくは真菌が抗菌剤耐性遺伝子を有するかどうかの決定を可能にすることができる。キットは、微生物の検出及び／又は特徴付けのための複数のプライマー対及び／又は複数のプローブを含み得る。複数のプライマー対及び／又は複数のプローブは、細菌及び真菌の検出及び／又は特徴付けを可能にすることができる。プライマー及び／又はプローブは、試料中に存在する微生物の属及び／又は種の同定を可能にすることができる。
本発明の全ての態様によれば、「特異的にハイブリダイズする」ことにより、又は同等の言語により、プライマーが標的核酸にハイブリダイズするが、他の核酸とハイブリダイズしない（又は交差反応しない）ことを意味する。プライマー及び／又はプローブは、遺伝子内の特定のサブ領域にハイブリダイズし得る。プライマー及び／又はプローブは、微生物の属の同定を可能にするために、同一属内の複数種の同一遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる。或いは、プライマー及び／又はプローブは、微生物の種の同定を可能にするために、単一種の微生物の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる。
本発明の全ての態様によれば、国際公開第２０１８／１８９５０２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＩＬＶ３遺伝子は、ヒトゲノムとの配列同一性を欠如するために、真菌又は酵母が試料中に存在するかどうかを検出するのに特に有用である。
本発明の全ての態様によれば、真菌／酵母を検出又は特徴付けるために、プライマーは、以下を含むことができる：
ａ．以下のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種のＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー
ｉ．カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）
ｉｉ．カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）
ｉｉｉ．カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）
ｉｖ．カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）
ｖ．カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）
ｖｉ．カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）
ｖｉｉ．カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）
ｖｉｉｉ．カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）
及び任意選択で、それぞれ配列番号１及び配列番号２のヌクレオチド配列を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる；
ｂ．アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種のＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー
ｉ．アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）
ｉｉ．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）
ｉｉｉ．アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）
及び任意選択で、それぞれ配列番号７０及び７１、又は配列番号７３及び７４のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｃ．カンジダ・アルビカンスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号４及び５、又は配列番号６及び７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｄ．カンジダ・デュブリニエンシスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、又は配列番号１２及び１３のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｅ．カンジダ・トロピカリスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号１４及び１５、又は配列番号１６及び１７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｆ．カンジダ・パラプシローシスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号１８及び１９、又は配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｇ．カンジダ・グラブラタのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号２２及び２３、配列番号２４及び２５、配列番号２６及び２７、又は配列番号２８及び２９のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｈ．カンジダ・クルセイのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、配列番号３４及び３５、配列番号３６及び３７、又は配列番号３８及び３９のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｉ．カンジダ・ギリエルモンディのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号４０及び４１、配列番号４２及び４３、配列番号４４及び４５、又は配列番号４６及び４７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｊ．カンジダ・アウリスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号４８及び４９、配列番号５０及び５１、配列番号５２及び５３、配列番号５４及び５５、配列番号５６及び５７、配列番号５８及び５９、配列番号６０及び６１、配列番号６２及び６３、配列番号６４及び６５、配列番号６６及び６７、又は配列番号６８及び６９のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｋ．アスペルギルス・フミガツスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号７６及び７７、配列番号７９及び８０、配列番号８２及び８０、又は配列番号８３及び８４のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｌ．アスペルギルス・ニガーのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号８７及び８６のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｍ．アスペルギルス・フラバスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号９０及び８９、又は配列番号９０及び９２のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；並びに／或いは
ｎ．クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）のＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号９３及び９４、配列番号９６及び９７、配列番号９９及び１００、配列番号１０２及び１０３、又は配列番号１０５及び１０６のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
本発明の全ての態様によれば、真菌／酵母を検出又は特徴付けるために、プローブは、以下を含むことができる：
ａ．以下のカンジダ属種のＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ
ｉ．カンジダ・アルビカンス
ｉｉ．カンジダ・デュブリニエンシス
ｉｉｉ．カンジダ・トロピカリス
ｉｖ．カンジダ・パラプシローシス
ｖ．カンジダ・グラブラタ
ｖｉ．カンジダ・クルセイ
ｖｉｉ．カンジダ・ギリエルモンディ
ｖｉｉｉ．カンジダ・アウリス
及び任意選択で、配列番号３のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｂ．カンジダ・アルビカンスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にプローブ、及び任意選択で、配列番号１１６及び１１７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｃ．カンジダ・デュブリニエンシスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１１８、１１９及び１２０のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｄ．カンジダ・トロピカリスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１２１のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｅ．カンジダ・パラプシローシスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１２２及び１２３のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｆ．カンジダ・グラブラタのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１２４、１２５、１２６又は１２７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｇ．カンジダ・クルセイのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１２８、１２９、１３０、１３１又は１３２のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｈ．カンジダ・ギリエルモンディのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号１３３、１３４又は１３５のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｉ．カンジダ・アウリスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするフォワード及びリバースプライマー、及び任意選択で、それぞれ配列番号１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５又は１４６のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｊ．アスペルギルス属種のＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ
ｉ．アスペルギルス・フミガツス
ｉｉ．アスペルギルス・ニガー
ｉｉｉ．アスペルギルス・フラバス
及び任意選択で、配列番号７２又は７５のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｋ．アスペルギルス・フミガツスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号７８、８１及び８５のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｌ．アスペルギルス・ニガーのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号８８のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；
ｍ．アスペルギルス・フラバスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号９１のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる；並びに／或いは
ｎ．クリプトコッカス・ネオホルマンスのＩＬＶ３遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ、及び任意選択で、配列番号９５、９８、１０１、１０４又は１０７のヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
本発明の全ての態様によれば、細菌を検出及び／又は特徴付けるために、プライマー及びプローブは、細菌ＤＮＡの１６Ｓ領域の特定の部分に特異的にハイブリダイズすることができる。プライマーは、細菌ＤＮＡの１６Ｓ領域の特定の部分を増幅することができる。プライマーＰＬＫ１（５－ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３、配列番号１０８）及びＰＬＫ２（５－ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴ－３、配列番号１０９）は、真正細菌の異なるグループにおいて高度に保存されている。これらのプライマーによって１８７－ｂｐ断片が合成される。ＰＬＫ２は、フルオレセインで内部的に標識することができる。プローブは、グラム陰性菌とグラム陽性菌を区別することができる。蛍光色素標識されたハイブリダイゼーションプローブＩＳＮ２（５－ＣＣＧＣＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＴ－３、配列番号１１０）及びＩＳＰ２（５－ＣＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ－３、配列番号１１１）は、異なる波長（６４０及び７０５ｎｍ）で発光し、蛍光シグナルによる細菌ＤＮＡの検出及びグラム染色分化に使用することができる。他の適切なプライマーは、ヌクレオチド配列ＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣ（配列番号１１２）及びＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣ（配列番号１１３）を含み得る。適切なグラム陽性プローブは、ヌクレオチド配列５’－ＦＡＭ－ＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１１４）を含む。適切なグラム陰性プローブは、ヌクレオチド配列５’－ＨＥＸ－ＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号１１５）を含む。これらのプローブは、差次的な検出を可能にするために異なる標識を施されているが、本明細書に記載される別のアプローチを、検出を容易にするために採用することができることは、当業者には理解される。
したがって、キットは、ａ）生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子を含有する容器、及びｂ）生存微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子；又は酵母のＩＬＶ３遺伝子及び／又は細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含み得る。
キットは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含んでもよい。
キットは、ｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しつつ、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬をさらに含み得る。適切な試薬は、当該技術分野において公知であり、本明細書においてさらに検討される。本明細書に示されるように、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムは、非微生物細胞を含有する試料からの微生物の回収に有用である。
キットは、ｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉ）界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の例である。
抗菌剤に曝露された微生物の溶解に対する感受性の増加に鑑み、一部の実施形態では、キットは、非微生物細胞を選択的に溶解する試薬を含まない場合がある。被覆された粒子は優先的に微生物と結合するため、試料中の非微生物を溶解する絶対的必要条件はない。しかしながら、非微生物細胞（典型的には無傷の非微生物細胞）及び／又は細胞溶解物を粒子－微生物複合体から除去するために、１つ又は複数の洗浄ステップを行うことが有利であり得る。任意の適切な洗浄溶液を採用することができ、例を本明細書において検討する。
キットは、ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子；ｂ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；ｃ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬；及びｄ）粒子－微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖中にウラシル残基を含む、検出手段を含み得る。
（基質）核酸分子は、核酸修飾酵素がＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含むことに基づいて設計することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。追加の又は代替の実施形態では、核酸修飾酵素は、リガーゼ、例えば、ＡＴＰ又はＮＡＤ依存性リガーゼを含む。
検出手段は、核酸増幅のための試薬をさらに含み得、任意選択で、核酸増幅のための試薬が、核酸分子とハイブリダイズするプライマー対及び／又は少なくとも１つのプローブを含む。
キットは、粒子－微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬をさらに含み得、任意選択で、粒子－微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含む。適切な例としては、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、例えば、１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％が挙げられる。試薬は、例えば１～５％ｗ／ｖ、好ましくは約１％のサポニンを含み得る。
キットは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含み得る。
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、１つ又は複数の酵素を含むことができ、１つ又は複数の酵素は、任意選択で、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含む。適切な界面活性剤及び酵素は、本明細書において検討される。
キットは、高ｐＨ試薬、例えば、塩基又は緩衝液をさらに含み得る。これは、例えば、ＮａＯＨ、例えば、５ｍＭ ＮａＯＨであり得る。他の適切な試薬は、本明細書に記載される。
キットは、中和緩衝液をさらに含むことができる。中和緩衝液は、高ｐＨ処理後に試料のｐＨを戻すことができる。適切な試薬は本明細書に記載される。
核酸修飾酵素は、（ａ）ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩなどのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである；及び／又は（ｂ）リガーゼ、任意選択で、リガーゼがＡＴＰａｎｄ／又はＮＡＤ依存性リガーゼである、を含み得る。
全ての態様に適用可能な追加の特徴
既に述べたように、本発明は、臨床試料、特に、微生物感染に罹患していると疑われる対象から採取された試料に特に適用可能である。したがって、本発明の全ての態様によれば、試料から回収され得る（及び／又は特徴付けられる）微生物は、病原性細菌又は真菌／酵母などの病原性微生物であり得る。細菌又は真菌／酵母は、対象、好ましくはヒト対象において感染又は疾患を引き起こすことができる任意の細菌又は真菌／酵母であり得る。一実施形態では、細菌は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（及び好ましくはメチシリン耐性株）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、肺炎連鎖球菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にヒト（型）結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種、特にコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び／又は大腸菌などを含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特に、特定の実施形態ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。クロストリジウム・ディフィシルは、抗生物質関連の下痢及び大腸炎の主要な原因であり、主に他の基礎疾患を有する高齢患者に影響を及ぼす医療に関連した腸管感染症である。細菌は、シュードモナス種、特に緑膿菌を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。細菌は、クレブシエラ種、特に肺炎桿菌を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一実施形態では、真菌／酵母は、任意の１つ又は複数のカンジダ属種、アスペルギルス属種、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）種及び／又はスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）種のいずれかを含むか又はそれらから本質的になる。
微生物は、本明細書に記載されるように、その酵素活性を介して検出することができる。したがって、本方法は、抗生物質を含有する試料から回収された生存微生物の指標を提供する。ある期間後に、微生物が生存できなければ、酵素活性は試料から失われる。これは、一部の実施形態では、はるかに長く存続し得る、核酸分子、特にＤＮＡの使用を上回る、試料中の微生物の指標として酵素活性を使用する利点を表す。
本発明の方法は、一旦微生物の陽性存在が試料中に検出されると、感染の性質を同定することを伴うことができる。本明細書において検討されるように、任意の適切な方法をこのさらなる同定ステップに使用することができる。
「抗菌剤」とは、本明細書において、微生物を死滅させるか又はその増殖を阻害する任意の薬剤を包含するものとして定義される。抗菌剤は、抗生物質又は抗真菌剤であり得る。抗菌剤は、血流感染の処置において日常的に使用される任意の抗菌剤であり得る。対象を処置するために使用される抗菌剤は、対象の臨床評価に基づいてケア提供者によって選択される。この情報は、試料中にどの微生物が最も存在する可能性が高いと考えられるかを考慮する場合に、本発明を行う際に使用することができる。適切な条件、例えば、適切な選択的溶解条件の選択に寄与する可能性がある。例えば、試料がより頑丈な微生物を含有する可能性が高い場合、界面活性剤を選択的溶解に使用することができる。他方、試料がより感受性の高い微生物を含有する可能性が高い場合、界面活性剤を採用することができず、代わりに洗浄ステップを使用することができる。抗菌剤は広域スペクトルであり得、広範囲の微生物を死滅又は阻害することができる。抗菌剤の非限定的な例には、ペニシリン、メロペネム、フルクロキサシリン、アンピシリン、オキサシリン、ピペラシリン－タゾバクタム、バンコマイシン、テイコプラニン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ゲンタマイシン、アミカシン、リネゾリド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、ガチフロキサシン、ガレノキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、ドキシサイクリン、ＴＭＰ－ＳＭＸ、ポリミキシンＢ、セフォタキシム、セフォテタン、セファマンドール、セフロキシム、セフチゾキシム、セフタジジム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフェピメ、セファゾリン、セフォキシチン及びセフトリアキソンが挙げられる。抗真菌剤の非限定的な例には、フルシトシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、エトコナゾール、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、カスポファンギン、ミカファンギン及びアニデュラファンギンが挙げられる。これらの薬剤の投与量は、特定の薬剤に応じた標準的なケア手順に従って決定される。これは、試料中に存在する抗菌剤のレベルに寄与する。抗菌剤は、少なくとも０．０５、０．５、５、１０、２５、５０、７５又は１００μｇ／ｍＬの濃度で試料中に存在することができる。抗菌剤は、１００、２５０、５００若しくは１０００μｇ／ｍＬ以下又は未満の濃度で試料中に存在し得る。抗菌剤は、１００μｇ／ｍＬ以下又は未満の濃度で試料中に存在し得る。抗菌剤は、典型的には、０．５～２５０μｇ／ｍＬの濃度で試料中に存在し得る。抗菌剤は、０．５～１００μｇ／ｍＬの濃度で試料中に存在することができる。
本明細書において説明されるように、本発明は、体液（特に血液）試料を採取する前に、微生物感染の疑いのある対象が抗菌剤で処置される臨床状況において適用される。したがって、処置として対象に与えられる抗菌剤は、試料中の抗菌剤の唯一の供給源であり得る（そうすべきである）。したがって、抗菌剤は、典型的には、ケア提供者（例えば、医師又は看護師）によって選択され、対象によって実証された現在の臨床症状に基づいて投与されている。したがって、試料中の微生物は、抗菌剤に対して感受性であり得る（又は、そうであると考えられる）。
本発明の文脈における「試料」は、真菌（例えば、酵母）及び／又は細菌などの微生物を含有するか、又は含有する疑いがあり、また抗菌剤を含有するものである。典型的には、試料は液体試料である。したがって、試料は、体液試料などの臨床試料を含み、それらから本質的になるか、又はそれらからなることができる。好ましい試料タイプは血液であり、試料を含有する全血、血漿、血清及び血液であり、例えば、血液培養物又は血液ブロスが含まれる。一部の実施形態では、試料は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、尿又は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を含む。試料は、抗菌剤を用いた処置を受けているか、又は受けていた対象から採取された臨床試料であり得る。試料は、感染に罹患していると疑われるか、又は感染についてスクリーニングされている患者からの試料を含み得る。試料は、０．２～１０ｍｌ、又は１～１０ｍｌなどの任意の適切な体積であり得る。
使用される試料は、利用可能性、利便性、及び試験される条件などの様々な要因に依存する。使用することができるが、本発明を限定することを意図しない典型的な試料には、患者、最も好ましくはヒト患者から採取される、全血、血清、血漿、血小板、関節液及び尿試料などが含まれる。患者は、血流感染を患っていることが疑われるか、又はスクリーニングされている場合がある。患者は、入院している場合がある。試料は、血液１ｍｌあたり５００、１０００又は１５００万を超える白血球（ＷＢＣ）を含む対象から採取することができる。
抗菌剤に加えて、試料は、後の分析の１つ又は複数の阻害剤をさらに含み得る。後の分析の１つ又は複数の阻害剤は、血液細胞レムナント、ヘモグロビン、白血球ＤＮＡ及び血小板から選択され得る。
したがって、本発明はまた、微生物を、微生物増殖の１つ又は複数の阻害剤から分離する。
疑義を避けるために、本発明の方法はインビトロ方法を表す。それらは、対象から除去された試料上で行われる。しかしながら、より好ましくない実施形態では、本方法は、（予備ステップとして）対象から試料を得るステップを追加で含むことができる。対象から適切な試料を得る方法は、当該技術分野において周知である。しかしながら、典型的には、本方法は、別の手順で患者から既に単離された試料から開始して行うことができる。本方法は、最も好ましくは、ヒト由来の試料上で行われるが、本発明の方法は、多数の動物にとって有用性を有し得る。抗菌剤は、獣医診療及び農業において頻繁に使用されている。
試料は、１ミリリットルあたり細胞２０，０００～５００万個の濃度で非微生物細胞を含み得る。試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約１００，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。好ましくは、試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約２０，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。
本発明で使用される粒子は、被覆される。被覆は、典型的には、ポリマー被覆である。或いは、被覆された粒子は、ポリマー被覆を欠く場合がある。被覆された粒子は、クエン酸塩、デンプン、マンノース結合レクチン又はポリ－Ｌ－リジンなどの分子で被覆することができる。被覆された粒子を被覆する分子は、粒子の表面に吸着されるか、又は粒子とアマルガムを形成し得る。被覆された粒子は、完全に又は部分的に被覆され得る。
したがって、被覆された粒子は、被覆されていない粒子と区別される。被覆されていない粒子には、表面に他の分子（例えば、クエン酸塩）が吸着されていないか、又は金属若しくは金属化合物とアマルガムされていない金属又は金属化合物（例えば、金属酸化物）からなる粒子が含まれる。被覆された粒子は、様々な微生物と結合し、粒子－微生物複合体を形成することができる。したがって、それらは、微生物特異性において「汎微生物」又は「普遍的」である。被覆された粒子は、好ましくは磁性粒子であり、（抗体などの標的特異的リガンドの使用とは対照的に）非特異的結合によって微生物に結合し得る。被覆された粒子は、典型的には、非微生物細胞よりも微生物に対してより高い親和性を有する。
被覆された粒子は、試料から微生物を除去することによって作用するが、抗菌剤は形成された複合体の（重要な）部分を形成しない。したがって、被覆された粒子は、実質的に抗菌剤に結合しない。
被覆された粒子は、典型的には、ポリマーの外側表面を含む。ポリマー表面は、粒子の表面が（比較的）均一に被覆された（通常の製造公差内の）規則的な外側ポリマー表面であり得る。ポリマー表面は、炭素ベースのポリマーを含み得る。ポリマー表面は、ポリイミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、及びポリビニルアミン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリビニル、ポリスチレン、及びそれらの任意の組み合わせの誘導体及びコポリマーを含み得る。好ましくは、ポリマー表面は、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミドを含む。最も好ましくは、ポリマー表面は、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含む。
ポリマー表面は、ポリジメチルシロキサン、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリスチレンポリスルホン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリビニリジンフルオリド、ポリシリコン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（ブチレンテレフタレート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）、ポリ（エチレングリコール）、スチレン－アクリロニトリルレジン、ポリ（トリメチレンテレフタレート）、ポリビニルブチラール、ポリビニリデンジフルオリド、ポリ（ビニルピロリドン）、及びそれらの任意の組み合わせの誘導体及びコポリマーを含み得る。一部の実施形態では、ポリマー表面はシリコンベースではない。
本発明の全ての態様による特定の実施形態において、被覆された粒子は、外面に、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含み得る。これらの官能基は、本発明者らにより、普遍的な生存微生物回収において有用であることが示されている。このような官能基は、典型的には、ポリマー被覆の一部を形成し、別個の標的リガンドによって供給されない。したがって、一部の実施形態では、ｉ）カルボン酸基、ｉｉ）アミノ基、又はｉｉ）疎水性基は、ポリペプチド又はペプチド模倣物の一部でない場合がある。同様に、ｉ）カルボン酸基、ｉｉ）アミノ基、又はｉｉ）疎水性基は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、又は核酸の一部でない場合がある。同様に、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基又はｉｉ）疎水性基は、脂質、ステロイド、ホルモン又は補因子の一部でない場合がある。
被覆された粒子は磁性であり得、実際には、典型的には磁性である。磁性ビーズは常磁性であり、外部から印加された磁場に引きつけられる。磁気ビーズは周知であり、市販されている。被覆された粒子は、超常磁性であり得る。被覆された粒子は、金属又は金属化合物を含み得る。被覆された粒子は、酸化鉄を含み得る。酸化鉄は、磁鉄鉱及び／又は磁赤鉄鉱を含み得る。酸化鉄は、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋の１：１、２：１、３：１又は４：１の比率を含まない場合がある。好ましくは、酸化鉄はポリマー被覆によって封入される。被覆された粒子は、酸化鉄及びポリマーのアマルガムであり得る。被覆された粒子は、外側のポリマー表面によって部分的にカプセル化され得るが、これはあまり好ましくない。被覆された粒子は、コア及びポリマー被覆を含み得る。コアは、磁性であり得る。被覆された粒子は、クエン酸塩、デンプン、マンノース結合レクチン又はポリ－Ｌ－リジンで被覆された酸化鉄を含み得る。
被覆された粒子は、０．０５～２０μｍ、又は０．０５～１μｍ、例えば、０．１～０．５μｍ、又は０．２～０．３μｍの直径を有し得る。好ましくは、被覆された粒子は、０．２～０．３μｍの直径を有し得る。被覆された粒子は、０．１～３μｍ又は０．１～２μｍの直径を有し得る。より好ましくは、被覆された粒子は０．１～１．０μｍの直径を有する。
被覆された粒子は、
（ａ）ポリマー被覆（例えば、ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミドなど）；
（ｂ）表面に、以下の追加の基：カルボン酸、アミン又はストレプトアビジンのうちのいずれか１つを有するポリマー被覆（例えば、ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミド）；又は
ｃ）表面に付着したクエン酸塩、マンノース結合レクチン、デンプン若しくはポリ－Ｌ－リジン分子
を含み得る。
被覆された粒子は、磁性であり、
ａ）ポリマー被覆（ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミドなど）；
ｂ）表面に、以下の追加の基：カルボン酸、アミン又はストレプトアビジンのうちのいずれか１つを有するポリマー被覆（例えば、ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミド）；又は
ｃ）表面に付着したクエン酸塩、マンノース結合レクチン、デンプン又はポリ－Ｌ－リジン分子
を含み得る。
被覆された粒子は、金属（鉄など）又は金属化合物（酸化鉄など）、及び
ａ）ポリマー被覆（ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミドなど）；
ｂ）表面に、以下の追加の基：カルボン酸、アミン又はストレプトアビジンのうちのいずれか１つを有するポリマー被覆（例えば、ポリスチレン、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）又はポリアクリルアミド）；又は
ｃ）表面に付着したクエン酸塩、マンノース結合レクチン、デンプン又はポリ－Ｌ－リジン分子
を含み得る。
したがって、被覆された粒子は、外側ポリマー表面を有する。一部の実施形態では、被覆された粒子の外面は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれによっても被覆されない場合がある。マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）タンパク質は、ＭＢＬに基づく遺伝子操作タンパク質であり得る。例えば、それは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたＭＢＬの病原体結合部分（すなわち、ＦｃＭＢＬ）を含む遺伝子操作されたタンパク質であり得る。
一部の実施形態では、被覆された粒子の外面は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、又は（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質のいずれによって被覆されない場合がある。
一部の実施形態では、被覆された粒子の外面は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、又は（ｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれによっても被覆されない場合がある。
一部の実施形態では、被覆された粒子の外面は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質、又は（ｉｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれによっても被覆されない場合がある。
一部の実施形態では、被覆された粒子の外面は、ポリリジン又はポリリジン様部分で被覆されない場合がある。
抗体は、抗原特異的結合機能を保持する抗体の断片又は誘導体であり得る。このような断片及び誘導体には、Ｆａｂ断片、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、重鎖抗体などが含まれる。
炭水化物は、単糖、オリゴ糖（例えば、二糖又は三糖）、多糖及び／又はその誘導体であり得る。
被覆された粒子の外面は、リガンドで被覆されない場合がある。被覆された粒子の外面は、非特異的リガンド（例えば、国際公開第０１／５３５２５号に記載される非特異的リガンド）で被覆されない場合がある。被覆された粒子の外面は、非タンパク質性リガンド（例えば、国際公開第０１／５３５２５号に記載される非タンパク質性リガンド）で被覆されない場合がある。
被覆された粒子の外面は、カルボキシル化され得る。
被覆された粒子の外面は、ストレプトアビジンで被覆され得る。被覆された粒子の外面は、ストレプトアビジンで被覆され得、リガンドで被覆され得ない。
本発明の全ての関連する態様及び実施形態によれば、用語「ポリアネトールスルホン酸ナトリウム」は、その全ての機能的に等価な誘導体及び塩の形態（例えば、ポリアネトールスルホン酸カリウム、ポリアネトールスルホン酸マグネシウム、アミロ硫酸ナトリウムなど）を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「被覆する」又は「被覆された」とは、一般的に、粒子の最外層又は露出層上に形成された分子又は材料の層を指す。被覆が部分的であるとすると、被覆は、粒子の最外層又は露出層上に分子の連続層を含む必要はない。
この開示全体を通じて、用語「粒子」及び「ビーズ」は、互換的に使用することができる。
Ｔ＝０時間（左）及びＴ＝２時間（右）における寒天平板の画像であり、いずれも試料からの抗生物質による阻害により増殖しない中心帯を示す図である（実施例１を参照されたい）。 血液試料の画像であり、各試料セット：Ｅ－ＢＵＦ、ＵＲＥＡ、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ、凍結（左から右）についての血液溶解の程度を示す図である（実施例９を参照されたい）。 ＰＣＲ設定前の最終試料生産の画像である。この画像は、血液中の磁性ビーズを用いた試料処理のためのＳＰＳの利点を視覚的に実証するものである。ＳＰＳは、ＳＰＳの存在下で赤色溶出物が少ないことにより示されるように、血液成分のより徹底した除去を可能にするようである。血液ブロス試料セットに使用されるＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロスはまたＳＰＳを含有することに留意されたい（実施例１０を参照されたい）。
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して理解される。
［実験の部］
略語及び定義：
５ｔｈ％ ５％ＦＰＲを決定するための５番目のパーセンタイル閾値計算
（式＝ＰＥＲＣＥＮＴＩＬＥ．ＩＮＣ（アレイ，０．０５））
ＡＢＸ 抗生物質又は抗菌剤
ＢＯ ブロスのみ
ＢＢ 血液ブロス
ＣＢＡ コロンビア血液寒天培地
Ｃｆｕ コロニー形成単位
ＣＯＬ コロンビア基礎寒天培地
Ｃｏｎｆｉｒｍ グラム状態（グラム陰性、グラム陽性又はカンジダ）に応じて微生物ＤＮＡを標的とするＰＣＲ多重アッセイ
ＣＰＤ クエン酸リン酸デキストロース
Ｃｔ サイクル閾値
ＣＶ 臨界値（ｃｆｕ）：式：試料ｃｆｕ÷２ΔＣｔを用いるｃｆｕ値及びΔＣｔに基づく理論検出限界
Ｄ１．． 希釈点（１０倍系列）
Ｄｉｌ 希釈
ＤＭＢＢ 界面活性剤を含まない微生物結合緩衝液
ＤＷＢ 界面活性剤を含まない洗濯緩衝液
Ｅ－Ｂｕｆｆ 血液溶解緩衝液
Ｅ＊ｃｆｕ 希釈系列中で最高計数可能なＴＶＣを有する希釈点を用いて外挿したｃｆｕ値
ＥＣ 大腸菌
ＥＴＧＡ 酵素鋳型の生成及び増幅
ＦＡ＋ レジン、ＦＡプラスＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＧＭＢＢ 穏やかな微生物結合緩衝液を含む好気性血液培養ボトル
ＩＰＣ 内部プロセス対照：ＥＴＧＡ陰性試料の正しい試料処理を実証し、ＰＣＲ増幅を検証するためにＬＭに存在するＰＣＲ鋳型
ＬＡＷＮ コンフルエントな微生物増殖
ＬＭ 界面活性剤と微生物溶解酵素の混合物を含む微生物溶解混合物
ＭＭ マスターミックス
ＮｏＣｔ ５０サイクル後、閾値蛍光を超える増幅なし
ＮＳＣ スパイク対照なし
Ｏ／ｎ 一晩
ＰＣ ポリメラーゼスパイク対照
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｔ ＮＳＣ／ＮＣ結果から計算された陽性閾値
ｑＰＣＲ 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ 室温（＋１９～＋２０℃）
ＳＡ 標準的な好気性血液培養ボトル、ＳＡ ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ
ＳＡＢ Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天培地
ｓ／ｎ 上清
ＳＰＳ ポリアネトールスルホン酸ナトリウム
ＴＮＴＣ 多すぎて計数することができない
ＴＶＣ 生菌数合計
ＷＢ 洗浄緩衝液（特に断らない限り、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋塩化ナトリウム＋Ｉｇｅｐａｌ＋デオキシコール酸ナトリウム＋テルギトールを含有する）；又は記載のある場合は全血
ΔＣｔ ２つのＣｔ値（典型的にはＮＳＣ Ｃｔ－陽性試料Ｃｔ）間の差
実施例１
目的
抗生物質を含有する臨床血液中の微生物が、インキュベーションのための新鮮培地に接種される前に「レスキュー」され、除去され得るかどうかを評価すること。レスキューされた生物が、抗生物質を含有する血液中に保持する生物と比較してより効率的に増殖するかどうかの簡単な調査。
具体的には、本発明者らは、黄色ブドウ球菌を抑制濃度の溶解性抗生物質であるピペラシリンを含有する血液に接種し、２時間、インキュベートした場合、磁気捕捉ビーズ上に捕捉し、抗生物質を含まない血液培養ボトルにそれらを移すことにより、生物を増殖させることができることを示すことを目的とする。
材料
緩衝液組成物
Figure 2022552115000002
方法
試験生物：黄色ブドウ球菌
抗生物質：ピペラシリン ９６μｇ／ｍＬ血液
ヒト血液：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｏｎｏｒｓ， Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫから
試験生物の一晩培養物を、血液／ブロス培地（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ培養ボトルからの５０：５０ 血液：ブロス培地）中で調製した。
必要に応じて、一晩培養物の１０倍系列希釈液を血液／ブロスに調製した。
抗生物質（ａｂｘ）を必要なレベルでヒト全血液（クエン酸－リン酸－デキストロース、ＣＰＤ、抗凝固剤中）に添加した。
抗生物質を含まない対照として全血を使用した。
血液＋抗生物質又は血液には、血液１ｍＬあたり１０μＬ（実験要件のために十分調製したもの）の生物の希釈液（複数可）を添加した。
１００μＬのプレ－トカウント試料を採取した（Ｔ０試料）。
接種した試料を３７℃（静止）で２時間インキュベートした。
１００μＬのプレートカウント試料を採取した（Ｔ２試料）。
対照として、バイアルアダプター（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＰＡ，ＵＳ）を用いて、血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ培養ボトル）に５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみを添加し、自動血液培養キャビネット（アダプター除去）でインキュベートした。
「レスキュー」試験では、５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみを、以下のようにＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズ（ストレプトアビジン被覆、約３００ｎｍビーズ、Ｂｉｏ ｅｓｔａｐｏｒ、Ｍｅｒｋカタログ番号ＢＥ－Ｍ ０８／０．３）で処理した。
界面活性剤を含まない微生物結合緩衝液（ＤＭＢＢ－Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）で希釈したＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズ－５０μＬビーズ：クリーンアップあたり７００μＬ ＤＭＢＢ
５０ｍＬのコニカル遠心チューブに７５０μＬの希釈ビーズを添加する
チューブに５ｍＬのブロス地を添加する
５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみをチューブに添加する
ＩＴＬ ＴｈｅｒＭｉｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．Ｋｅｎｔ，ＵＫ）、３２．５℃／３０分／１００ｒ０ｒｐｍでインキュベートする－ランプ速度プロトコール
Ｖ＆Ｐ磁石（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｃｉａｌ Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳ）を５分間、磁化し、次に上清を除去する
ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ－Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）に再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）上の２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆフリップトップチューブに移す
５分間、磁化し、次に上清を除去する
ビーズを磁石から１ｍＬのＤＷＢに再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石に置換する
５分間、磁化し、次に上清を除去する
ビーズを１ｍＬのＤＷＢに再懸濁し、バイアルアダプターを用いて標準血液培養培地を含有する新鮮な未使用血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ培養ボトル）に添加し、インキュベーションを開始する（アダプター除去）
血液培養ボトルは、自動血液培養キャビネット（ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）内でインキュベートされ、陽性になるまでの時間を記録する。「反転」時間は、自動血液培養キャビネットによって決定した場合、ボトルが陽性になる時間である
各ボトルの「反転」時間が記録される
プレートカウント（総生菌数ＴＶＣ）を記録する
結果
表１に見ることができるように、試料４ｂ及び５ｂから回収された生物は、対照血液培養が１２０時間（５日間）で陰性のままであった場合、１０～１５時間の培養で陽性に反転した。レスキューされた生物のみが、抗生物質の存在によって対照血液培養中の生物が死滅されるか又は阻害された陽性になるまで増殖を続けた。増殖は、抗生物質を含有しない両方の試料で起こり、１つは対照として処理され、１つはレスキュー処置で処理された。
Figure 2022552115000003
結論として、本発明者らは、生物が「レスキュー」され、抗生物質を含有する血液試料から除去され、新鮮な培地に接種され、陽性になるまでインキュベートされ得ることを実証した。ここで検討した実験では、レスキューされず、抗生物質を含有する試料中に残存した生物は増殖せず、５日目で陰性のままであった。
以下の実施例は、種々の被覆された粒子が、異なる試料及び異なる条件下で粒子－微生物複合体を形成し、それにより生存微生物を回収する能力を実証する。種々の下流検出及び特徴付け方法はまた例示される。
実施例２
手動フォーマットでは、２つのビーズタイプ（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ（ストレプトアビジンコンジュゲートした）３００ｎｍビーズ（製品－ＢＥ－Ｍ０８／０３；「Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ」）及びＡｄｅｍｔｅｃｈ Ｂｉｏ－Ａｄｅｍｂｅａｄｓストレプトアビジン＋２００ｎｍビーズ（製品番号０３２２２；「Ｂｉｏ－Ａｄｅｍｔｅｃｈ」））を、ＡｐｏＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｅｐｓ６ビーズ（参照－ＭＰ２０００６；「ＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６」）と比較した。
実験１Ａでは、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（２５μＬ）のアリコート及びＡｐｏＨ Ｐｅｐ６ビーズ（１０μＬ）のアリコートを結合について比較した。Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒの体積がより大きいことは、ＡｐｏＨ材料と比較して、提供された材料中の１ｍＬあたりのビーズ数がより少ないことを反映する。３種類の微生物：大腸菌（グラム陰性菌）、表皮ブドウ球菌（グラム陽性菌）、カンジダ・アルビカンス（酵母）を試験した。０．５ｍＬの生物懸濁液を、ＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６キット（「Ｐｅｐｓ６ Ｃａｐｔｏｂａｃ」、参照ＭＰ１００３１－５０Ｔ）に提供された０．５ｍＬの「ＴＴＧＢ」微生物結合緩衝液中でビーズに曝露した。
生物を３０分間結合させた後、ビーズを濃縮するために磁場を適用し、上清をピペットで除去することにより、液体上清からビーズの試料を分離した。ビーズを３アリコートの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１％ｖ／ｖ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ｖ／ｖ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ １５－Ｓ－９）で穏やかに洗浄し、保持された上清及び洗浄されたビーズを、２つの方法：寒天ペトリ皿上のコロニー数、並びに酵素的鋳型生成及び増幅（ＥＴＧＡ）試験（Ｚｗｅｉｔｚｉｇら、２０１２年．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０巻、１４号、ｅ１０９、１～１２頁；並びに国際公開第２０１１／１３０５８４号、国際公開第２０１３／１０３７４４号及び国際公開第２０１６／００５７６８号に記載される）による微生物ＤＮＡの検出により、生存生物について分析した。
表１Ａのプレートカウントは、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒビーズ及び大腸菌では、増殖の大部分がビーズ（３３ＣＦＵ）対上清（２ＣＦＵ）から見出され、これはＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６からの結果と類似していることを示す。表皮ブドウ球菌では増殖は見られず、この生物は、元のブロスでは増殖しないようであった。カンジダ・アルビカンスは、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ及びＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６のいずれにおいても、上清中のＣＦＵの約１０％及び９０％結合を示した。これらの結果は、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒビーズが、試験条件下で市販されている生物結合ビーズＰｅｐｓ６と同等の速度で生物と結合するようであることを示している。高感度のＥＴＧＡ試験は、この結果を支持するが、より低いＣｑ値によって示されるように、表皮ブドウ球菌は、Ｐｅｐｓ６よりもＢｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒに結合する可能性があることを示している。
Figure 2022552115000004
実験１Ｂは、実験１Ａと同様の条件下での大腸菌の結合を実証するが、１Ｂでは洗浄ステップは省略された。実験１Ｂは、別のビーズ、Ｂｉｏ－Ａｄｅｍｔｅｃｈも、より低いレベルではあるが、生物と結合することを示す（表１Ｂを参照されたい）。ここで、プレート数は、生菌数の約３分の１がビーズに結合したことを示している。より高感度のＥＴＧＡ ＤＮＡポリメラーゼアッセイは、ビーズに対するＣｑ及び上清がほぼ等しいため、生物の半分がビーズ上に残存することを示している。
Figure 2022552115000005
実施例３
実験３では、カルボキシル化表面を有するＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒビーズ（製品ＭＩ－０３０／４０；「Ｅｓｔａｐｏｒ ＣＯＯＨ」）を比較した。蛍光ＡＴＰアッセイ（ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇ８２３０）を用いて、大腸菌をビーズに３０分間結合させた後、上清中に残存する生物数を測定した。これは、ビーズ上の生物の存在を直接検出しないという点で間接的な試験であるが、本発明のリガンドベースのビーズ（ＡｐｏＨ Ｐｅｐｓ６）及び非リガンドビーズ（Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒ ＣＯＯＨ）についての有用な比較試験である。１ｍＬの１０４ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌をリン酸緩衝生理食塩水から３０ｍＬ結合させた後、ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いて、生物含量の測定として、上清のアリコートをＡＴＰについてアッセイした。表２の結果は、Ｐｅｐｓ６ビーズ、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒ ＣＯＯＨの上清中の生物レベルの減少が、この技術を用いて測定した場合、それぞれ３３％、２７％及び２４％であったことを示す。
Figure 2022552115000006
実施例４
実施例４は、実施例２に記載した磁気分離方法を自動化して実施した希釈系列における大腸菌（ＥＣ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及びカンジダ・アルビカンス（ＣＡ）の試験結果を示す。アッセイには、０．２５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌを含有するＴＴＧＢの結合緩衝液を有する捕捉媒体として、Ｂｉｏ－Ｅｓｔａｐｏｒ ３００ｎｍ直径ビーズを使用した。３つの各生物の１０倍希釈を行ったため、Ｃｔの連続的変化を記録し、用量反応曲線を作成した。
Figure 2022552115000007
以下の実施例は、ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験における磁性ビーズによる微生物の普遍的な微生物捕捉を実証する。Ｍａｇｎｉｔｏｒ試験は、２つの微生物検出の読み出しからなる。
ＥＴＧＡ：無傷の微生物細胞からの微生物ポリメラーゼの検出
Ｃｏｎｆｉｒｍ：グラム状態（グラム陰性、グラム陽性、又はカンジダ）による微生物ＤＮＡの検出
主な所見：
磁性ビーズは、単純な緩衝液及び種々の複雑な生物学的な標本タイプから細菌及び真菌を捕捉する
微生物捕捉は、種々の異なるビーズサイズ（直径０．２～１．５μｍのビーズ）及び表面被覆（例えば、カルボキシル化、疎水性、アミノ化など）を用いて行う
特定の結合緩衝液成分は、Ｍａｇｎｉｔｏｒアッセイにおける微生物検出、例えば、血液の界面活性剤ベースの溶解を改善することができる。
実施例５：微生物の検出は磁性ビーズによる捕捉に依存する。
目的：
大腸菌、黄色ブドウ球菌及びカンジダ・アルビカンスについて、単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（水中でのみ起こり得る微生物浸透圧ショックを防ぐために、ｐＨを生理的塩濃度で緩衝化した）中で微生物結合性能を評価した。検出が微生物捕捉のための磁性ビーズの存在に依存することを実証するために、「ビーズなし対照」試料セットもこの実験に含まれた。
磁性ビーズの調製：
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号Ｍ１－３０／４０）を、１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液の３×１ｍＬで洗浄した：４０μＬビーズを、最終体積の４００μＬの１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（１％固形分）中に再懸濁した。
プロトコール：
ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を標準として設定した。翌日（約１６時間後）に、１．８８μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロスに添加し、１８．７５μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬのブロスに添加し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり４つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬの予備洗浄済みビーズを含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した－注記、全ての微生物試料を同じ１×緩衝液で希釈したため、ビーズを入れたチューブに１１２μＬの１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液に添加しなかった（標準プロトコールに従う）。
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬ洗浄緩衝液（ＷＢ）を添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で３分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬ溶解ミックス（ＬＭ）をチューブに添加し、磁石を取り出した（５μＬのポリメラーゼ対照（ＰＣ）を各ＰＣ試料チューブに添加した）
ＥＴＧＡ反応：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間行った
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000008
Figure 2022552115000009
Figure 2022552115000010
Figure 2022552115000011
Figure 2022552115000012
Figure 2022552115000013
分析：
「（＋）ＢＥＡＤＳ」試料のＭａｇｎｉｔｏｒ結果は、３つの全ての微生物種について、非常に強い細胞密度特異的なＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍシグナルを示し、広範囲の微生物群（ＧｒＮｅｇ、ＧｒＰｏｓ、カンジダ）のビーズ特異的結合を実証する。
カンジダ結果は、より良好な細胞密度傾向に従うことができたが、液体培養は、連続希釈の質に影響を与えた可能性がある完全に粒子であったことに留意されたい
微生物細胞のいくつかの証拠は「（－）ＢＥＡＤＳ」対照において引き継がれるが、単一の洗浄ステップでのみ期待される。
実施例６：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、単純及び複雑な血液溶解緩衝液中で起こり、遠心分離による捕捉に匹敵する微生物検出を可能にする
目的：
単純で迅速な「Ｒａｐｉｄ Ｍａｇｎｉｔｏｒ」試験（プロトコールには洗浄ステップが含まれていない）を開発するために、２つの異なる希釈フォーマットの２つの異なる血液溶解緩衝液を比較することである。
試験条件：
２×ＥＢＢ １ｍＬの２×ＥＢＢ＋１ｍＬ標本
１０×ＥＢＢ １１２μＬの１０×ＥＢＢ＋１ｍＬ標本
２×Ｂ－ＢＵＦ １ｍＬの２×Ｂ－ＢＵＦ＋１ｍＬ標本
１０×Ｂ－ＢＵＦ １１２μＬの１０×Ｂ－ＢＵＦ＋１ｍＬ標本
１０×ＥＢＢ：５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
１０×Ｂ－ＢＵＦ：５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋５％デオキシコール酸ナトリウム＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
試料設定：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養１Ｅ－３希釈液を血液ブロス（１ｍＬあたり６．２５μＬのｏ／ｎ：２４４μＬのｏ／ｎ＋３９ｍＬ血液ブロス）にスパイクし、３７℃で５００ｒｐｍの振とうインキュベーターで６０分間の成長を行った
２時間の成長後、１ｍＬの標本を、緩衝液（及びＭａｇビーズ試料セット用に１５μＬのＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ－Ｍ ０８／０．３））を含有する２ｍＬのチューブに添加することによって試料を生成した：試験条件ごとに３重の大腸菌（ＥＣ）及びスパイク対照（ＮＳＣ）試料
１００μＬのＴＶＣをＮＳＣ及び大腸菌について行った（計数可能なプレートを確実にするために標本の希釈を含む）
プロトコール：
上記のように設定された試料は、すぐにスピン又はＭａｇビーズプロトコールに進行した。
スピンプロトコール
試料を３分間、９０００×ｇで遠心分離した（チューブヒンジはペレットトレーサビリティのために外側に面する）
上清を除去した
５０μＬのＬＭを試料（ペレットを再懸濁するための約１０×ピペットミックス）に添加した
試料を９００ｒｐｍで５分間、次に、８００ｒｐｍで５５分間（２６℃）の振とうインキュベーターに配置した
試料を１７０００×ｇで１分間遠心分離後、ｑＰＣＲを設定した
Ｍａｇビーズプロトコール
試料を９００ｒｐｍで３０分間（３７℃）、振とうインキュベーターに配置した
試料をＤｙｎａＭａｇ－２磁気ラック上に５分間配置し、次に上清を除去した
５０μＬのＬＭを試料（ペレットを再懸濁するための約１０×ピペットミックス）に添加した
試料を５分間、９００ｒｐｍの振とうインキュベーターに配置し、次に５５分間（２６℃）、８００ｒｐｍに配置した
試料を３分間、磁化した後、ｑＰＣＲを設定した
ＥＴＧＡマスターミックスのみの手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000014
Figure 2022552115000015
分析：
磁性ビーズによる微生物結合は、次のように起こる：
単純及び複雑な血液溶解緩衝液（ＥＢＢ＝Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；Ｂ－ＢＵＦ＝Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋塩化ナトリウム＋Ｉｇｅｐａｌ＋デオキシコール酸ナトリウム＋Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）であるが、血液由来の試験シグナルは、血液溶解緩衝液の成分によって異なる
希釈（２×緩衝液：１部の標本に１部の血液溶解緩衝液）され、及び濃縮（１０×緩衝液：９部の標本に１部の血液溶解緩衝液）された試料フォーマット
さらに、磁性ビーズによる微生物捕捉のための微生物検出シグナルは、遠心分離による捕捉に匹敵する。
実施例７：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、血液溶解に依存しないが、下流の微生物検出は、微生物結合が溶解血液中で起こる場合に改善される
目的：
複数のビーズタイプ／サイズが、微生物の連続希釈及びＮＳＣについて同様のＭａｇｎｉｔｏｒ結果をもたらすという最近の発見を考慮すると、Ｍｏｍｅｎｔｕｍの結合緩衝液内の成分が、観察されたこの普遍的な微生物結合特性を媒介／促進している可能性があると考えられた。この可能性を調査するために、標準結合緩衝液（Ｂ－ＢＵＦ）とＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋ＮａＣｌのみからなる界面活性剤を含まないＢ－ＢＵＦを比較して、大腸菌の希釈系列を行い、界面活性剤一般が微生物結合に重要であるかどうかを試験した。試料セットは、血液ブロス、ブロスのみ、及び１×結合緩衝液のみについて調製し、異なる標本タイプについての結果を比較した。
調製：
新たに調製した１００ｍＬの１０×結合緩衝液：
Ｂ－ＢＵＦ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋５％デオキシコール酸ナトリウム＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号Ｍ１－３０／４０）を、それぞれの１×緩衝液（希釈された１０×Ｂ－ＢＵＦ又は１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）中で３×１ｍＬ洗浄した：４０μＬビーズを４００μＬの１×緩衝液（１％固形分）の最終濃度に再懸濁した。
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養液をＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、１．８８μＬ ｏ／ｎを３ｍＬのブロス（６．２５μＬ／ｍＬでブロスに添加されるＥＣ １Ｅ－１希釈に匹敵する）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長を行った。
２時間の成長後、大腸菌の前培養物は、予め加温された血液－ブロス（ＢＢ）、ブロスのみ（ＢＯ）又は１×緩衝液（Ｂ－ＢＵＦ若しくはＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ）のいずれかでＥＣ １Ｅ－６まで連続希釈（ＤＦ１０）された。
１００μＬのＴＶＣを全ての大腸菌希釈液及びＮＳＣに対して行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬの結合緩衝液（Ｂ－ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌのいずれか：ＢＢ及びＢＯ試料セットについては１０×；及び緩衝液試料セットについては１×）＋１５μＬビーズ（それぞれの緩衝液中で予備洗浄する）を含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで２分間、混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
チューブに５０μＬのＬＭを添加し、磁石を取り出した（５μＬのポリメラーゼコントロール（ＰＣ）を各ＰＣ試料チューブに添加する）
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
観察：
予想通り、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌでは血液溶解は観察されなかった
界面活性剤が存在しない場合、ビーズはより粒状／凝結している
結果：
Figure 2022552115000016
Figure 2022552115000017
Figure 2022552115000018
Figure 2022552115000019
Figure 2022552115000020
Figure 2022552115000021
分析：
界面活性剤は、血液の存在下で良好なＥＴＧＡ結果を得るために重要であるが（「ＢＢを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」についての不良なＥＴＧＡ結果によって示される）、微生物捕捉／検出は、血液溶解が存在しない場合においてなおも明白である（（「ＢＢを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットの結果によって示される）。
血液が存在しない場合の良好なＥＴＧＡ結果は、結合緩衝液の成分としての界面活性剤が、大腸菌のビーズへの結合に必要でないことを示す
「１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットにおける良好なＥＴＧＡ結果は、血液及び／又はブロス中の生物学的成分が微生物結合に必要でないことを実証する。
興味深いことに、Ｂ－ＢＵＦは、ＢＯ及び１×のＢ－ＢＵＦ試料セットを用いた１０×Ｂ－ＢＵＦにおいて、ＥＴＧＡシグナルに対してわずかに阻害作用を示すようであるが、最近の他の研究では、デオキシコール酸ナトリウムはこのアッセイに対していくぶん阻害作用を示す可能性があることが示されているため、この観察は予想外ではない
Ｃｏｎｆｉｒｍは「１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌを有する１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットにおいて最良に行われる。他の全ての類似した試料セットは、同様のＣｏｎｆｉｒｍ ＧｒＮｅｇ結果を生じた。
予想され得るように、ＩＰＣシグナルは血液の存在によっていくぶん阻害された。
これらの結果は、界面活性剤及び生物学的試料のいずれも、大腸菌についての微生物結合のメディエーターではないことを実証する
実施例８：血液が存在しない場合、塩によるｐＨ緩衝化又は浸透圧安定化にかかわらず、磁性ビーズによる微生物捕捉が起こる
目的：
微生物結合の媒介におけるＭｏｍｅｎｔｕｍの結合緩衝液の重要性をさらに調べるために、結合におけるｐＨ緩衝化及び塩の効果を、クリーンな系（すなわち、血液又はブロスのいずれも存在しない場合）で調べた。
１０×緩衝液調製：
２５ｍＬの各緩衝液を新たに作製した：
ＢＵＦ－１ ５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］＋１．５Ｍ ＮａＣｌ
ＢＵＦ－２ ５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ ＮａＣｌ
ＢＵＦ－３ ５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．５］＋１．５Ｍ ＮａＣｌ
ＢＵＦ－４ ５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］のみ
ＢＵＦ－５ １．５Ｍ ＮａＣｌのみ
ＢＵＦ－６ 水のみ
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログＭ１－３０／４０）を、それぞれ１×緩衝液（１０×緩衝液の希釈）中で３×１ｍＬ洗浄した：３０μＬビーズを、３００μＬの１×緩衝液（１％固形分）の最終体積中に再懸濁した。
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロス（ＳＰＳを含む）及びニュートリエントブロス（ＳＰＳを含まないＮＢ）における標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、１．８８μＬ ｏ／ｎを、各ブロスタイプ（午前にＮＢ及び午後にＰＬＵＳブロス）について３ｍＬブロス（６．２５μＬ／ｍＬでブロスに添加されるＥＣ １Ｅ－１希釈に匹敵する）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長インキュベーションを行った。
各実験（ＮＢ及びＰＬＵＳ）について、１Ｅ－１大腸菌の前培養物は、各１×緩衝液（ＢＵＦ－１～ＢＵＦ－６）中で大腸菌の１Ｅ－６まで希釈（ＤＦ１０）した
関連するブロス（ＮＢ又はＰＬＵＳブロス）で行われた別々のＥＣ希釈セットを用いて１００μＬのＴＶＣを行い、異なる１×緩衝液から生じるプレートの生存率の不一致を防ぐ
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬのそれぞれ１×緩衝液＋１５μＬビーズ（それぞれの緩衝液中で予備洗浄する）を含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで２分間、混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
チューブに５０μＬのＬＭを添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000022
Figure 2022552115000023
Figure 2022552115000024
Figure 2022552115000025
Figure 2022552115000026
Figure 2022552115000027
Figure 2022552115000028
Figure 2022552115000029
Figure 2022552115000030
Figure 2022552115000031
分析：
水のみを含む全ての緩衝液は、同様に大腸菌の捕捉を実証した（同様のＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ結果により示される）－しかしながら、水中の低細胞密度のみでは浸透圧微生物溶解が示される場合もあった（ＢＵＦ－６）
ＰＬＵＳブロスとＮＢ増殖大腸菌はいずれも、試験した全ての緩衝液について非常に類似したＭａｇｎｉｔｏｒ結果を生じたが、これは、ＳＰＳが大腸菌の微生物結合の媒介において明確な役割を果たさないことを示している
これらの結果は、Ｅｓｔａｐｏｒ（カルボキシル化）ビーズへの大腸菌の結合には緩衝液成分が必須でないことを示している
実施例９：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、種々の異なる血液溶解法を用いて行うことができる
目的：
代替の血液溶解法を用いる場合に、微生物の捕捉及び検出が起こり得るかどうかを判定すること。
調製：
結合緩衝液を以下のように調製した：
Ｅ－ＢＵＦ＝５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
ＵＲＥＡ＝８３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１０Ｍ尿素
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ＝５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ－Ｍ ０８／０．３）を使用前に再懸濁した。
プロトコール：
黄色ブドウ球菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、３．０μＬ ｏ／ｎを３ｍＬの血液ブロス（１Ｅ－３希釈）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで４時間の成長を行った。
４時間の成長後、黄色ブドウ球菌の前培養物は、予め加温された血液ブロス中で１Ｅ－６まで連続希釈（ＤＦ１０）された。
全ての黄色ブドウ球菌希釈液及びＮＳＣに対して１００μＬのＴＶＣを行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石を使用した手動試料処理及びピペットによる手動液体移送：
初期設定
尿素を用いた試料について、０．７５ｍＬの尿素＋１５μＬビーズを含有する２ｍＬチューブに０．２５ｍＬの標本を添加した
凍結する試料について、１ｍＬの標本を２ｍＬチューブに添加し、次に、ドライアイス上で５分間、迅速に凍結させた。標本を３７℃で５分間解凍し、次に、１１２μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ＋１５μＬビーズを添加した
Ｅ－ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌを使用する試料について、１ｍＬの標本を、１１２μＬの結合緩衝液（Ｅ－ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌのいずれか）＋１５μＬのビーズを含有する２ｍＬチューブに添加した
全試料の処理
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化する
全てのｓ／ｎを除去する
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブを３７℃で３分間混合する（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化する
全てのｓ／ｎを除去する
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出す
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲ設定する（１０μＬ反応）
観察：
血液溶解は、解凍後の凍結試料で観察された（図２を参照されたい）
尿素ではほぼ瞬時に血液溶解が観察された
いくつかのビーズは、尿素を用いた試料の処理中に喪失するように見えた
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セットでは明らかな血液溶解は観察されなかった（予想通り）
結果：
Figure 2022552115000032
Figure 2022552115000033
Figure 2022552115000034
Figure 2022552115000035
Figure 2022552115000036
Figure 2022552115000037
図２は、Ｅ－ＢＵＦ、尿素、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ、凍結（左から右）の各試料セットの血液溶解の程度を示す。
分析：
磁性ビーズによる黄色ブドウ球菌の微生物捕捉及び検出は、Ｃｏｎｆｉｒｍによって決定されるように、代替の溶解法に匹敵し、血液溶解はない。しかしながら、ＥＴＧＡによる微生物検出は、血液由来ＥＴＧＡシグナルの減少に影響するため、代替の血液溶解法によって異なる程度に改善される。
実施例１０：ＳＰＳは、全血における最適なビーズ性能、試料処理及び微生物検出に必要である
目的：
１ｍＬの全血試料を用いて、Ｍａｇｎｉｔｏｒ迅速テストに最適なＳＰＳ濃度を決定すること。副次的目的は、ＴＶＣにより決定した全血中の微生物生存率におけるＳＰＳの効果を評価することであった。
試験条件：
２×５ｍＬの全血又はＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性血液ブロス（１：３比）を各試料セット（大腸菌及びＮＳＣ試料）に分注した。次に、ＳＰＳを次のように添加した：
試料セット １０％ＳＰＳ（μＬ）
ＢＢ なし
ＷＢ０％ なし
ＷＢ０．０１％ ５
ＷＢ０．０２％ １０
ＷＢ０．０４％ ２０
ＷＢ０．０６％ ３０
ＷＢ０．０８％ ４０
ＷＢ０．１０％ ５０
次に、５μＬの大腸菌１Ｅ－２前培養液を５ｍＬの各標本チューブに添加し、標準１Ｅ－５希釈試料を再作製した
プロトコール：
ニュートリエントブロス（ＮＢ）中の１．８８μＬの正味（ｎｅａｔ）ｏ／ｎを３ｍＬのＮＢに添加し；２時間、３７℃、５００ｒｐｍでインキュベートした
２時間後、大腸菌の前培養物を温めたＮＢで１０倍に希釈し；次に、５μＬを各５ｍＬの標本チューブ（試験条件において示されるように調製される）に添加した
直ちにＭａｇｎｉｔｏｒ試験を開始し、以下に詳述されるようにＴＶＣを行った。
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬのＥ－ＢＵＦ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）＋１５μＬビーズ（ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ－Ｍ ０８／０．３）を各試料チューブに予め装填し、次に１ｍＬの標本を試料チューブに添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで３分間混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
ＴＶＣ分析
ゼロ時間でＣＯＬプレートに１００μＬ
試料ビジョウス（約２ｍＬの試料を含有する）を室温（２０．４℃）でベンチ上に放置した（静止）
ＴＶＣを表に示される時間点で行った：試料を播種前に完全に混合した
Figure 2022552115000038
Figure 2022552115000039
Figure 2022552115000040
Figure 2022552115000041
分析：
ＳＰＳは、ＴＶＣアッセイに基づいて全血に微生物保護／生存率を提供する利点を示しているが、全血中の大腸菌の生存率に一般的に大きな問題はない。
ＳＰＳの取り込みは、ＥＴＧＡとＣｏｎｆｉｒｍの読み出しの両方の試料処理効率及び微生物検出性能を改善した
０．０６％のＳＰＳは、ＴＶＣベースの生存率；ＥＴＧＡ検出（大腸菌及びＮＳＣ試料Ｃｔを考慮した最良の結果）；及びＩＰＣ Ｃｔ値で示されるＰＣＲ阻害に関して最良の結果をもたらした。Ｃｏｎｆｉｒｍ ＧｒＮｅｇ結果はまた、全血にＳＰＳを加えることによって改善されたが、ＳＰＳの正確な濃度はそれほど重要ではなかった。
実施例１１：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、同サイズ（約３００ｎｍ直径）の種々の市販のカルボキシル化ビーズ製品を使用して起こる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒアッセイを用いて、同サイズの代替のカルボキシル化磁性ビーズを比較すること。
試験条件：
Figure 2022552115000042
プロトコール：
大腸菌及び化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｏ／ｎ液体培養物をそれぞれ３ｍＬブロス及び血液ブロス（ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性）における標準として設定し、１６～２０時間（３７℃）インキュベートした
翌日：
大腸菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ－３に希釈し、次に、血液ブロス（血液ブロス１ｍＬあたり６．２５μＬ）にスパイクし、１時間３０分（３７℃）プレインキュベートした
化膿連鎖球菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ－１に希釈し、次に、血液ブロス（血液ブロス１ｍＬあたり６．２５μＬ）にスパイクし、２時間３０分（３７℃）プレインキュベートした
午前に行われた大腸菌実験
大腸菌の１Ｅ－３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、５希釈点（１Ｅ－３～１Ｅ－７）を生成した
試料は、１５μｌの１％固体ビーズ＋１１２μＬの結合緩衝液を予め装填した２ｍＬチューブに１ｍＬ標本を添加することにより設定され；及びＭａｇｎｉｔｏｒ Ｖ４．０試験を行った：３つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり５希釈点＋３つのＮＳＣ（８つの試料セット）を各ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７３ｍで試験した
午後に行われた化膿連鎖球菌実験
化膿連鎖球菌の１Ｅ－３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、５希釈点（１Ｅ－１～１Ｅ－５）を生成した
試料は、１５μｌの１％固体ビーズ＋１１２μＬの結合緩衝液を予め装填した２ｍＬチューブに１ｍＬ標本を添加することにより設定され；及びＭａｇｎｉｔｏｒ Ｖ４．０試験を行った：３つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり５希釈点＋３つのＮＳＣ（８つの試料セット）を各ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７３ｍで試験した
Ｍａｇｎｉｔｏｒ Ｖ４．０プロトコール（ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７３ｍ上の自動化試料処理）
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に０．８２ｍＬのＷＢをチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
内部陽性閾値（Ｐｔ）を各ビーズタイプについてＮＳＣ（ｎ＝６）を用いて計算した：式＝ＰＥＲＣＥＮＴＩＬＥ．ＩＮＣ（アレイ，０．０５）
Figure 2022552115000043
Figure 2022552115000044
Figure 2022552115000045
観察：
ビーズＢは、１％固形分に希釈する前に再懸濁することが困難であり、１％固形分に希釈した後、目視でより希釈されているように見えた
処理の終了時に、試料をＤｙｎａＭａｇ－２磁気ラック上に配置し、全てのビーズタイプＣ－Ｇは、重いペレットを有すると思われるビーズＡ、及び非常に小さなビーズペレットを有するビーズＢとは別に、同様に磁化した
分析：
ここで試験した全てのカルボキシル化磁性ビーズは、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合、微生物結合を実証する。しかしながら、微生物検出の感度は、血液由来ＥＴＧＡシグナル及び／又はアッセイ阻害のレベルに依存して、いくぶん変化する。
実施例１２：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆を用いて起こる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。自動化（プロトコール１）及び手動（プロトコール２）試料処理のための微生物捕捉を実証するために、２つの実験を行った。重要なことに、プロトコール２は、３つのビーズ再懸濁洗浄を含み、ＥＴＧＡ／Ｃｏｎｆｉｒｍシグナルが試料キャリーオーバーよりもビーズ結合した微生物細胞に特異的であることをより説得力をもって実証する（単一ビーズを磁化した洗浄ステップを含むプロトコール１とは対照的である）。
試験条件：
Figure 2022552115000046
試料設定（プロトコール１及び２について別々に行い、異なる日に行った）：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物を３ｍＬブロス（ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性）における標準として設定し、１６～２０時間（３７℃）インキュベートした
翌日、大腸菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ－３に希釈し、２時間の成長インキュベーション（５００ｒｐｍで３７℃）を行った
２時間の成長インキュベーション後、大腸菌の１Ｅ－３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、３つの希釈点（ＥＣ １Ｅ－６～１Ｅ－８）を生成した
１ｍＬの標本（３つの大腸菌希釈物及び３つのＮＳＣ試料：６つの試料セット）を１１２μＬの１０×Ｅ－ＢＵＦ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）＋１５μＬビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬ試料チューブに添加し、次に、プロトコール１又はプロトコール２（下記参照）のいずれかに従ってＭａｇｎｉｔｏｒ試験を開始した。
プロトコール１（ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７３ｍでの自動化試料処理）：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に、０．８２ｍＬのＷＢをチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に、５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
プロトコール２（ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及びピペットによる手動液体移送を使用した手動試料処理）：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000047
Figure 2022552115000048
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
実施例１３：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、血液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。大腸菌は、以前に、（ビーズサイズ及び被覆Ｉ：供給源実験：２０１９０２２１＿ＷＰ７＿Ｂｅａｄ－Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ及び２０１９０２２８＿ＷＰ７＿Ｂｅａｄ－Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ－３－ｗａｓｈ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ）試験された：この以前の研究を拡大するために、３つの追加微生物種を試験した（黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス）。
試験条件：
Figure 2022552115000049
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）における微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）の設定。翌日（約１６時間後）、３ｍＬ血液ブロス（１Ｅ－１希釈）に３００μＬの肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス液体培養物を接種し、３ｍＬ血液ブロス（１Ｅ－３希釈）に３μＬの黄色ブドウ球菌液体培養物を接種し；２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物前培養物を血液ブロスで希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石を用いて行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション及び手動液体移送：
１５μＬのビーズ（１％固体）及び１１２μＬのＥ－ＢＵＦ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合する（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000050
Figure 2022552115000051
Figure 2022552115000052
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定されるように、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
実施例１４：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。この実験は、標本として単純な緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）及び洗浄緩衝液を用いて行われ、すなわち微生物溶解混合物を添加するまで界面活性剤を使用しなかった。
試験条件：
Figure 2022552115000053
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を設定する。翌日（約１６時間後）に、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ－３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ－１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬのビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢ（１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）を添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000054
Figure 2022552115000055
Figure 2022552115000056
分析：
これらの結果は、クリーンな系（すなわち、生物学的標本の代わりに単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液）において、種々の異なるビーズサイズ及び機能性表面（カルボキシル化及び疎水性）が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する。
興味深いことに、アミノ化ビーズ（ＮＨ２－１．５）は、微生物結合がほとんど／全くないことを示す標本タイプの極めて不良なＭａｇｎｉｔｏｒ結果を生じた。この観察は、アミノ化されたビーズが試験された他のビーズと同等レベルの微生物捕捉を生成した血液ブロス標本の状況とは異なる。
実施例１５：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、非溶解血液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、血液溶解の不存在下、すなわち結合緩衝液中に界面活性剤を含まない場合、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。
試験条件：
Figure 2022552115000057
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を設定する。翌日（約１６時間後）に、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ－３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬの血液ブロス（１Ｅ－１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を血液ブロス中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬのビーズ（１％固体）及び１１２μＬの結合緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋塩化ナトリウム）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000058
Figure 2022552115000059
Figure 2022552115000060
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、血液溶解の不存在下で、血液から同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する
しかしながら、ＥＴＧＡによる微生物検出は、微生物結合中の血液溶解に関する以前の実験と比較した場合、血液溶解の不存在下でのＮＳＣ ＥＴＧＡシグナルの増加によって実質的に減少する。
実施例１６：磁性ビーズによる微生物捕捉は、種々の複雑な生物学的標本タイプにおいて起こる
目的：
磁性ビーズを用いた微生物捕捉が、血液に加えて、他の複雑な生物学的流体に対して可能かどうかを調べること。
試験条件：
Figure 2022552115000061
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、３μＬ ｏ／ｎを３ｍＬのブロス（大腸菌１Ｅ－３）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長インキュベーションを行った。
２時間の成長後、大腸菌１Ｅ－３の前培養物を各標本タイプにおいて５連続希釈点（大腸菌１Ｅ－６～１Ｅ－９）に希釈した。ＣＯＬ寒天プレート上で１００μＬのＴＶＣを行った。
ＤｙｎａＭａｇ－２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１ｍＬの標本は、１１２μＬの結合緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ＋０．５％デオキシコール酸ナトリウム）＋１５μＬビーズ（ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ；Ｍｅｒｃｋ ＃ＢＥ－Ｍ０８／０３（１％固体））を予め装填した２ｍＬの試料チューブに添加された－注記、Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ試料セットについての試料チューブは、１１２μＬの結合緩衝液を予め装填していない（再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるためである）
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間混合する（１０００ｒｐｍ）－注記、再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるために、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セット用の洗浄緩衝液の代わりに１ｍＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液を添加した
Ｄｙｎｍａｇ－２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出す－注記、再増殖アッセイのために１００μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液にビーズを再懸濁した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000062
対のＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セットの再増殖アッセイ
１．１００μｌのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ標本を播種／接種した－「標本」
２．１００μｌの上清を微生物結合ステップ後に播種／接種した－「結合後」
３．１００μｌの上清を洗浄ステップ後に播種／接種した－「洗浄後」
４．５０μＬのビーズを１００μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁し、播種／接種した（すなわち、５０％の材料をプレート上に、及び５０％の材料を液体培養物に接種した）－「ビーズ」
プレート及び液体培養物を一晩、３７℃でインキュベートした
Figure 2022552115000063
Figure 2022552115000064
Figure 2022552115000065
注記、Ｃｏｎｆｉｒｍのカンジダチャンネルでは観察可能な増幅はなかった
Figure 2022552115000066
分析：
これらの結果は、磁性ビーズが、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合、種々の複雑な生物学的標本タイプから微生物を捕捉するために使用し得ることを実証する。
再増殖アッセイは、大腸菌が磁性ビーズに結合した後、「ビーズ」試料セットの観察可能な増殖によって決定した場合、寒天及び液体培養物上で再増殖し得ることを実証する。
実施例１７：標本溶解の不存在において、非血液標本から微生物の捕捉及び検出が可能である
目的：
非溶解性結合緩衝液及び非溶解性洗浄緩衝液を用いて、ミルク及び尿の非血液標本における微生物捕捉及び検出を示すこと。
調製：
１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ結合緩衝液＝５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ洗浄緩衝液＝１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ結合緩衝液の１０分の１希釈
新鮮な（ヒト）尿
半脱脂（低温殺菌）牛乳
ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ－Ｍ ０８／０．３）を使用前に再懸濁した。
プロトコール：
ＢａｃＴｅｃ ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として大腸菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌ｏ／ｎ液体培養物を設定した
翌日（約１６時間後）、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌ｏ／ｎを使用して、新鮮な３ｍＬのブロス培養物（１Ｅ－３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌を使用して、新鮮な３ｍＬのブロス培養物（１Ｅ－１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を予め温めた新鮮な尿及び新鮮なミルク中で連続希釈（ＤＦ１０）し、５つの希釈点：大腸菌１Ｅ－５～１Ｅ－９、黄色ブドウ球菌１Ｅ－５～１Ｅ－９、カンジダ・アルビカンス１Ｅ－２～１Ｅ－６、及び肺炎連鎖球菌１Ｅ－２～１Ｅ－６を生じさせた。
ミルク及び尿中で試験した各微生物希釈について１００μＬのＴＶＣを行い、ミルク及び尿のＮＳＣを３種類の寒天プレート（ＳＡＢ、ＣＯＬ及びＣＢＡ）上に播種した
１１２μＬの結合緩衝液＋１５μＬビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬ試料チューブに、１ｍＬの標本（各微生物種の５希釈及び４つのＮＳＣ試料：標本タイプあたり２４試料）を添加し、次に自動化Ｍａｇｎｉｔｏｒ試験を開始した。
ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７３ｍ上での自動化試料処理：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に０．８２ｍＬのＷＢ（１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）をチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
結果：
Figure 2022552115000067
Figure 2022552115000068
Figure 2022552115000069
分析：
これらの結果は、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、標本溶解の不存在において、磁性ビーズによる微生物捕捉が血液に代わる標本（特に、尿及びミルク）で可能であることを実証する。
しかしながら、これらの標本タイプ（特に、ミルク）における共生微生物の存在は、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しのバックグラウンドシグナルのレベルに影響を与える。
実施例１８～２５
目的
抗菌剤を含有し得るか又は含有し得ない臨床血液中の微生物が、インキュベーションのための新鮮な培地に接種される前に「レスキューされ」、除去されるかどうかを評価すること。レスキューされた生物が、血液や抗生物質を含有する血液中に残存する生物と比較してより効率的に増殖するかどうかの調査。本方法の意図される使用は、微生物の回収及び検出性を増強することである。
導入
既に抗生物質を投与されている患者から血液培養物を採取した場合、患者が明らかに感染している場合でさえ、血液培養物は、しばしば生物を増殖させないことは広く知られている。近年、主要な血液培養供給者は抗生物質吸収性レジンを含有するボトルを提供しているが、これは課題を部分的に解決したにすぎない。本調査では、本発明者らは、阻害濃度の抗生物質を含有する血液に生物を接種する場合、本発明者らの磁気捕捉ビーズを用いて生物を捕捉し、抗生物質を含まない血液培養ボトルに移すことによって、微生物を増殖させることができることを示すことを目的とする。一連の生物及びある範囲の抗生物質を試験した。
主要所見：
ウマとヒトの血液の間の反転時間に２～４時間の差が見られたが、最終結果は同等であった。したがって、その後の実験は、（ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックのために）ヒトの血液が利用できないこの時期に実際的に重要なウマの血液を用いて行うことができる。
磁気ビーズの存在下での試料インキュベーションは、生物の増殖を助けるか又は妨げることはなかった。
大腸菌及び黄色ブドウ球菌の異なる捕捉試薬間の反転時間は非常に類似しており、このレスキュー法が生物の回収を可能にし、血液溶解剤の有無にかかわらずに行うことができることを示す。
抗菌剤を含む血液中の細菌を含有する標準的な好気性（ＳＡ）ボトルでは、レスキュー法は、５日目に陰性であった血液培養（ＢＣ）対照の前に常に陽性に反転した。カンジダ・アルビカンスでは、レスキュー法の反転時間はＢＣ対照よりも２７時間ほど速く、クリプトコッカス・ネオホルマンスでは１３時間を超えて速かった。
生物捕捉のための異なる磁性ビーズタイプを比較した場合（実施例２３）、５日後に陰性であったレスキューしない血液培養対照と比較して、全てのビーズレスキュー試料は１８時間以内に陽性を反転した。これは、試験した５種類のビーズタイプ全てについて、及び０．０７５ｍｇ／Ｌのシプロフロキサシンを含有する血液中の大腸菌血液と５００ｍｇ／Ｌのバンコマイシンを含有する血液中の黄色ブドウ球菌の両方についてあてはまる。
生物捕捉についてさらに５種類の異なる磁性ビーズタイプを比較した場合（実施例２４）、全てのビーズレスキュー試料は、陰性であったレスキューなし血液培養対照と比較して、黄色ブドウ球菌について１７時間以内に陽性に反転した。これは、試験した６種類のビーズタイプ全てについて、５００ｍｇ／Ｌのバンコマイシンを含有する血液中の黄色ブドウ球菌についてあてはまる。大腸菌については、ビーズレスキュー試料は、０．０７５ｍｇ／Ｌのシプロフロキサシンを含有する血液中で試験された６種類のビーズタイプ全てについて、３０時間以内に陽性に反転した。血液培養対照（ビーズレスキューなし）は陰性であった。
Ｆｌａｙｈａｒｔら、２００７年が報告したように、抗生物質－血液（セフトリアキソン）の高いピーク血清濃度では、ＦＡ＋血液培養ボトルは肺炎連鎖球菌を回収することができない。本明細書に提示されたデータは、本発明の方法を使用して、肺炎連鎖球菌を回収し、高いピーク血清濃度の抗生物質を含有する血液から成功裏に増殖させることができることを示す。
Ｃｈｕｎｇら、２０１９年が報告したように、抗生物質－血液の高いピーク血清濃度では、ＦＡ＋血液培養ボトルは生物を回収することができない。本明細書に提示されたデータは、本発明の方法を使用して、生物を回収し、高いピーク血清濃度の抗生物質を含有する血液から１８０ｃｆｕ／ｍＬという低い濃度から成功裏に増殖させることができることを示す。
材料
緩衝液及び試薬組成物
Figure 2022552115000070
生物、抗菌剤及び他の材料
血液：ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫのウマ（脱線維素）
試験生物：
グラム陽性：黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３；肺炎連鎖球菌ＡＴＣＣ ４９６１９
グラム陰性：大腸菌ＡＴＣＣ ２５９２２、肺炎桿菌ＡＴＣＣ １３８８３、緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３
真菌／酵母：カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ １０２３１、クリプトコッカス・ネオホルマンスＮＣＰＦ ８２８１
抗生物質：
グラム陽性：肺炎連鎖球菌についてバンコマイシン、ピペラシリン、セフェピム、セフトリアキソン
グラム陰性：シプロフロキサシン、ピペラシリン、メロペネム、セフォタキシム及びセフェピム
酵母：アムホテリシンＢ
実施例１８：ピペラシリンを含有する血液からの黄色ブドウ球菌レスキュー
目的：
この反復実験の目的は、ヒトの血液が利用できない時間中に、馬の血液がヒトの血液の代わりになり得るかどうかを評価することである。
プロトコール：
１日目：血液／ブロス培地（５０：５０ 血液：ブロス）中に試験生物の一晩培養物を調製し、振とうインキュベーター中、３７℃でインキュベートする。
２日目：必要に応じて、血液／ブロス中の一晩培養物の１０倍希釈系列を調製する。
必要なレベルで全血（脱線維素ウマ血液）に抗生物質を添加する
抗生物質なしの対照としての全血
血液＋抗生物質又は血液に、血液１ｍＬあたり１０μＬ（実験要件のために十分調製したもの）の生物の試験希釈液（複数可）を添加する
１００μＬのプレ－トカウント試料を採取する（Ｔ０試料）。
患者における抗生物質への生物曝露を模倣するために、３７℃で２時間のインキュベートする（静止）
１００μＬのプレートカウント試料を採取する（Ｔ２試料）
５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみを血液培養ボトル（バイアルアダプターを使用する）に添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみ（同じ供給源から）を以下のようにＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズを用いて処理する
１．界面活性剤を含まない微生物結合緩衝液（ＤＭＢＢ）に希釈したＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズ－クリーンアップあたり５０μＬビーズ：７００μＬ ＤＭＢＢ
２．５０ｍＬのコニカル遠心チューブに７５０μＬの希釈ビーズを添加する
３．５ｍＬの移動培地をチューブに添加する
４．５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみをチューブに添加する
５．ＩＴＬ ＴｈｅｒＭｉｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で３２．５℃／３０分／１０００ｒｐｍでインキュベートする－ランプ速度プロトコール
６．Ｖ＆Ｐ磁石（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｃｉａｌ Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳ）上で１０分間、磁化し、次に、上清を除去する
７．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆフリップトップチューブに移す
８．３分間磁化し、次に上清を除去する
９．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ）において磁石から再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石に置き換える
１０．３分間磁化し、次に上清を除去する
１１．ビーズを１ｍＬ ＤＷＢに再懸濁し、（バイアルアダプターを用いて）新しい血液培養ボトルに添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
３日目：プレート数を記録する。
各ボトル又はボトル結果の「反転」時間を、５日間のインキュベーションの終了時に記録する。「反転」時間は、自動血液培養キャビネットによって測定した場合、ボトルが陽性になる時間であり、陽性になるまでの時間を記録する。
結果：
Figure 2022552115000071
コメント：
ウマとヒトの血液の間の反転時間に２～４時間の差が見られたが、最終結果は同等であった。
したがって、その後の実験は、ヒトの血液が利用できないこの時間に、ウマの血液を用いて行うことができる。
実施例１９：ブレイクポイント実験の詳細
目的：
その後の実験のための抗生物質濃度及び微生物負荷に関する出発点を決定すること。抗生物質濃度範囲を試験し、実験に使用するための適切なブレイクポイントを見出した。ある範囲の抗生物質濃度を所与の微生物負荷に対して試験し、増殖が阻害されたが微生物は死滅されなかった濃度を決定した。これは、０、２．５及び５時間の間隔でプレース数によって測定された。
プロトコール：
１．１日目：３ｍＬの血液／ブロス溶液（１．５ｍＬの脱線維素ウマ血液：１．５ｍＬの移動培地）を用いて、試験生物の一晩培養物を調製する。
２．２日目：必要な希釈物に抗生物質を溶解して、適切なストック溶液を調製し、ヌクレアーゼを含まない水で希釈系列を調製して、１００～０．００１の範囲及び０ｍｇ／Ｌの最終濃度にする。
３．微生物の一晩培養物を、予め加温した血液／ブロス溶液中で必要な点まで希釈する。これは、各々の生物／抗生物質の組み合わせについて決定する必要がある場合があり、開始希釈として１０－４が使用される（試料中の最終濃度は１０－５となる）。
４．９８０μＬの予め加温した脱線維素ウマ血液を必要数の２ｍＬフリップトップチューブに分注する。
５．１０μＬの希釈した抗生物質を関連するチューブに添加し、１０μＬの希釈液を対照として最終試験管に添加する。混合する。
６．微生物の一晩培養物の必要な希釈物１０μＬを添加する。混合する。
７．各チューブから１００μＬずつサンプリングし、コロンビア血液寒天培地上で時間０カウント用にプレートアウトする。
８．１００μＬの希釈した一晩培養液を増殖対照／非増殖対照としてプレートする。
９．試料を振とうインキュベーター（４５０ｒｐｍ）中、３７℃でインキュベートし、プレートカウント用に２．５時間及び５時間の間隔で１００μＬをサンプリングする。
１０．プレートを３７℃で一晩インキュベートする。
１１．３日目：プレートをカウントし、結果を表にする。微生物が完全に死滅することなく、増殖を阻害する抗生物質濃度を決定する。
このプロトコールによって決定された濃度は、特に断らない限り、以下の実施例において使用された。
実施例２０：磁性ビーズ及び／又は抗生物質の存在下及び非存在下での生物の増殖
目的：
この実験の目的は、磁性ビーズの存在により、生物がビーズに結合し、固体基質のように増殖するため、生物がより速く増殖することができるかどうかを評価することである。この実験では、抗生物質の有無にかかわらず、磁性ビーズの有無にかかわらず、血液ブロス中の生物の相対増殖速度を調べる（ビーズ移動なし）。
プロトコール：
１日目：血液／ブロス培地（５０：５０ 血液：ブロス）中に試験生物の一晩培養物を調製し、振とうインキュベーター中で３７℃にてインキュベートする。
２日目：必要に応じて、血液／ブロス中の一晩培養物の１０倍希釈系列を調製し、３７℃で２時間インキュベートして増殖させる。
試料セット１では、血液中の試験生物の希釈物はビーズを含有し、試料の複製セット（セット２）はビーズを含有しない。いずれのセットも抗生物質を含有しない。
試料セット３では、血液中の試験生物の希釈液は抗生物質及びビーズを含有し、試料の複製セット（セット４）はビーズを含有しない。これらのセットはいずれも抗生物質を含有する含有する。
必要なレベルで全血（脱線維素ウマ血液）に抗生物質を添加する。
抗生物質を含まない対照としての全血。
試料あたり１０ｍＬの予め加温した全血を用いて、血液１ｍＬあたり１０μＬの生物の試験希釈物を添加する。複製セットで、３本の試験管の各々に関連する抗菌剤を添加する。
これらの試料１００μＬをＴ０ ＴＶＣ用にプレートする。
１０ｍＬの試料から５ｍＬを取り出し、セット１及びセット３を作製する。
血液５ｍＬあたり５０μＬの未加工磁性ビーズをセット１及びセット３の試料試験管に添加し、セット２及びセット４にビーズを含まないものする。
バイアルアダプター（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＰＡ，ＵＳ）を用いて、血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ培養ボトル）に５ｍＬのスパイク血液＋ビーズ（セット１）及び５ｍＬのスパイク血液／Ａｂｘ＋ビーズ（セット３）を添加する。
次に、５ｍＬのスパイク血液（同じ供給源から）、ビーズなし対照（セット２及びセット４）を血液培養ボトルに添加する。
アダプターを取り外し、自動血液培養キャビネット（ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）で血液培養ボトルを最大５日間インキュベートする。
３日目：ＴＶＣプレートをカウントし、記録する。
各ボトル又はボトル結果の「反転」時間を、５日間のインキュベーションの終了時に記録する。「反転」時間は、自動血液培養キャビネットによって測定した場合、ボトルが陽性になる時間であり、陽性になるまでの時間を記録する。
結果：
Figure 2022552115000072
コメント：
磁性ビーズの存在下での試料のインキュベーションは、生物の増殖を助けることもなく又は妨げたりすることもなかった。
生物レスキュー実験用のプロトコール（実施例２１～実施例２４）
１日目：血液／ブロス培地（５０：５０ 血液：ブロス）中に試験生物の一晩培養物を調製し、振とうインキュベーター中、３７℃（又はクリプトコッカス・ネオホルマンスでは３０℃）にてインキュベートする。
２日目：クリーンルームで、実験に使用するための抗生物質の適切な体積を調製する。
式１０００／Ｐ×Ｖ×Ｃ＝Ｗを用いてストック溶液を調製する。
Ｐ＝製造業者により与えられた効力（μｇ／ｍｇ）、Ｖ＝必要な体積（ｍＬ）、Ｃ＝溶液の最終濃度（１０００の倍数）（ｍｇ／Ｌ）、及びＷ＝体積Ｖ（ｍＬ）に溶解させる抗生物質の重量（ｍｇ）
必要に応じて、血液／ブロス中の一晩培養物の１０倍希釈系列を調製し、３７℃（又はクリプトコッカス・ネオホルマンスでは３０℃）で２時間インキュベートして増殖させる。
必要なレベルで全血（脱線維素ウマ血液）に抗生物質を添加する
抗生物質なしの対照としての全血
生物の試験希釈液（複数可）を血液＋抗生物質又は血液のみに１０μＬ／ｍＬ血液の濃度で添加する（実験要件のために十分に調製したもの）
１００μＬのプレートカウント試料を採取する（Ｔ０試料）
３７℃（又はクリプトコッカス・ネオホルマンスでは３０℃）で２時間インキュベートする（静止）
１００μＬのプレートカウント試料を採取する（Ｔ２試料）
５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみを血液培養ボトル（バイアルアダプターを使用する）に添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみ（同じ供給源から）を以下のようにＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズを用いて処理する
１．関連する捕捉に希釈した捕捉ビーズ－５０μＬビーズ：７００μＬ捕捉試薬／クリーンアップ
２．５０ｍＬの三角遠心管に７５０μＬの希釈ビーズを添加する
３．５ｍＬの移動培地を試験管に添加する
４．５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみをチューブに添加する
５．ＩＴＬ ＴｈｅｒＭｉｘ（３２．５℃／３０分／１０００ｒｐｍ－傾斜した速度プロトコール）でインキュベートする
６．Ｖ＆Ｐ磁石上で１０分間、磁化し、次に、上清を除去する
７．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ）において磁石から再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石上の２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆフリップトップチューブに移す
８．３分間磁化し、次に上清を除去する
９．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ）において磁石から再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石に置き換える
１０．３分間磁化し、次に上清を除去する
１１．ビーズを１ｍＬ ＤＷＢに再懸濁し、（バイアルアダプターを用いて）新しい血液培養ボトルに添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
３日目：プレート数の記録。
各ボトル又はボトル結果の「反転」時間を、５日間のインキュベーションの終了時に記録する。「反転」時間は、自動血液培養キャビネットによって測定した場合、ボトルが陽性になる時間であり、陽性になるまでの時間を記録する。
実施例２１：界面活性剤を含まない緩衝液又は血液溶解捕捉緩衝液を使用した場合の生物レスキューの比較
目的：
生物レスキュー法を行う場合に、界面活性剤を含まない緩衝液又は血液溶解捕捉緩衝液を比較すること。異なる捕捉緩衝液は、成功した生物のレスキューに影響を及ぼすか？ＤＭＢＢ、Ｅ－Ｂｕｆｆ及びＧＭＢＢを大腸菌及び黄色ブドウ球菌の回収の捕捉試薬として比較し、全ての洗浄にＤＷＢを使用する。
結果：
Figure 2022552115000073
コメント：
大腸菌及び黄色ブドウ球菌の異なる捕捉試薬間の反転時間は非常に類似しており、このレスキュー法が生物の回収を可能にし、血液溶解剤の有無にかかわらず行うことができることを示す。
実施例２２：さらなる微生物及び抗菌剤に対する生物レスキューの適用
目的：
レスキュー法が多種多様な微生物及び抗菌剤に適用可能であることを実証すること。
バンコマイシンの調製：
効力が１００８μｇ／ｍｇであるバンコマイシン（Ｌｏｔ番号０５８Ｍ４００９Ｖ）の場合、次式を使用して、１０，０００ｍｇ／ｍＬストック溶液１ｍＬを作製するために必要な重量を求める：
バンコマイシンストック溶液は、式１０００／Ｐ×Ｖ×Ｃ＝Ｗを用いて調製された。
Ｐ＝製造業者により与えられた効力（μｇ／ｍｇ）、Ｖ＝必要な体積（ｍＬ）、Ｃ＝溶液の最終濃度（１０００の倍数）（ｍｇ／Ｌ）、及びＷ＝体積Ｖ（ｍＬ）に溶解される抗生物質の重量（ｍｇ）
したがって、１０００／１００８×１０ｍＬ×１０＝Ｗ
０．９９２×１０×１０＝Ｗ
１０，０００ｍｇ／ｍＬのストック溶液の場合、１０ｍＬの生理食塩水（０．９％）でＷ＝９９．２ｍｇ。
黄色ブドウ球菌の２つの異なる株は、全ての時間点でバンコマイシンの全ての希釈液で増殖した。薬物が比較的遅く作用し、実験の長さを妥当な時間枠内に維持する必要があることを考慮して、その後の実験には５００ｍｇ／Ｌの最終濃度を使用することを決定した。
結果：
Figure 2022552115000074
コメント：
抗菌剤対照なしについては、血液培養はレスキュー法の前に常に陽性に反転した。
抗菌剤を含む血液中の細菌を含有する標準的なＳＡボトルでは、レスキュー法は５日目に陰性であったＢＣ対照よりも前に常に陽性に反転した。カンジダ・アルビカンスについては、レスキュー法の反転時間は、ＢＣ対照よりも２７時間ほど速く、クリプトコッカス・ネオホルマンスでは１３時間を超えて速かった。
実施例２３：異なる磁性ビーズタイプＩを用いた生物レスキューの比較
目的：
疎水性、アミノ化、カルボキシル化、ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ及びストレプトアビジン被覆の５種類のビーズタイプを用いてレスキュー法を行い、捕捉及び回収の効率を比較すること。
Figure 2022552115000075
結果：
Figure 2022552115000076
Figure 2022552115000077
コメント：
全てのビーズレスキュー試料は、５日後に陰性であった、レスキューなしの血液培養対照と比較して、２４時間以内（黄色ブドウ球菌については１８時間以内）に陽性に反転した。
これは、０．０７５ｍｇ／Ｌシプロフロキサシンを含有する血液中の大腸菌、及び５００ｍｇ／Ｌバンコマイシンを含有する血液中の黄色ブドウ球菌について試験した全ての５種類のビーズについてあてはまる。
実施例２４：異なる磁性ビーズタイプＩＩを用いた生物レスキューの比較
目的：
さらに５種類のビーズタイプ；クエン酸塩キャップ化、デンプンキャップ化、ポリアクリルアミド、マンノース結合レクチン及びポリリジンを用いてレスキュー法を行い、捕捉及び回収の効率を比較すること。
Figure 2022552115000078
結果：
Figure 2022552115000079
Figure 2022552115000080
コメント：
全てのビーズレスキュー試料は、陰性であった、レスキューなしの血液培養対照と比較して、黄色ブドウ球菌では１７時間以内に陽性に反転した。これは、５００ｍｇ／Ｌバンコマイシンを含有する血液中の黄色ブドウ球菌について試験した全ての６種類のビーズについてあてはまる。
大腸菌については、ビーズレスキュー試料は、０．０７５ｍｇ／Ｌシプロフロキサシンを含有する血液中で試験した全ての６種類のビーズについて、３０時間以内に陽性を反転した。血液培養対照（ビーズレスキューなし）は陰性であった。
実施例２５：抗生物質存在下でＦＡプラスＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトルにおいて回収できなかった微生物の生物レスキューの比較
Ｆｌａｙｈａｒｔら及びＣｈｕｎｇらの作業を再現するためのプロトコール
１日目：血液／ブロス培地（５０：５０ 血液：ブロス）中に試験生物の一晩培養物を調製し、振とうインキュベーター中、３７℃でインキュベートする。
２日目：クリーンルームで、実験に使用するための抗生物質の適切な体積を調製する。
式１０００／Ｐ×Ｖ×Ｃ＝Ｗを用いてストック溶液を調製する。
Ｐ＝製造業者により与えられた効力（μｇ／ｍｇ）、Ｖ＝必要な体積（ｍＬ）、Ｃ＝溶液の最終濃度（１０００の倍数）（ｍｇ／Ｌ）、及びＷ＝体積Ｖ（ｍＬ）に溶解させる抗生物質の重量（ｍｇ）
必要に応じて、血液／ブロス中の一晩培養物の１０倍希釈系列を調製し、３７℃で２時間インキュベートして増殖させる。
必要なレベルで全血（脱線維素ウマ血液）に抗生物質を添加する
抗生物質なしの対照としての全血
生物の試験希釈液（複数可）を血液＋抗生物質又は血液のみに１０μＬ／ｍＬ血液の濃度で添加する（実験要件のために十分に調製したもの）
１００μＬのプレートカウント試料を採取する（Ｔ０試料）
バイアルアダプターを用いて、５ｍＬのスパイクした血液＋ａｂｘ又は血液のみを血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＦＡ＋培養ボトル）に添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
以下のようなＭｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズを用いて、５ｍＬのスパイクした血液＋ａｂｘ又は血液のみ（同じ供給源から）を処理する
１．Ｍｏｍｅｎｔｕｍ捕捉ビーズを、関連する捕捉試薬－５０μＬビーズ：７００μＬ捕捉試薬／クリーンアップで希釈する
２．５０ｍＬの三角遠心管に７５０μＬの希釈ビーズを添加する
３．５ｍＬの移動培地を試験管に添加する
４．５ｍＬのスパイク血液＋ａｂｘ又は血液のみをチューブに添加する
５．ＩＴＬ ＴｈｅｒＭｉｘ（３２．５℃／３０分／１０００ｒｐｍ－傾斜した速度プロトコール）でインキュベートする
６．Ｖ＆Ｐ磁石上で１０分間、磁化し、次に、上清を除去する
７．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ）において磁石から再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石上の２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆフリップトップチューブに移す
８．３分間磁化し、次に上清を除去する
９．ビーズを１ｍＬの界面活性剤を含まない洗浄緩衝液（ＤＷＢ）において磁石から再懸濁し、ＤｙｎａＭａｇ－２磁石に置き換える
１０．３分間磁化し、次に上清を除去する
１１．ビーズを１ｍＬ ＤＷＢに再懸濁し、バイアルアダプターを用いて未使用の血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＦＡ＋培養ボトル）に添加し、インキュベーションを開始する（アダプターを取り外す）
３日目：プレート数の記録。
各ボトル又はボトル結果の「反転」時間を、５日間のインキュベーションの終了時に記録する。「反転」時間は、自動血液培養キャビネットによって測定した場合、ボトルが陽性になる時間であり、陽性になるまでの時間を記録する。
Ｆｌａｙｈａｒｔら、２００７年による実験の再現
目的：
セフトリアキソンの肺炎連鎖球菌において、ＦＡプラスボトルからの微生物捕捉とレスキューを比較すること。Ｆｌａｙｈａｒｔら、２００７年による再現実験は２５０、１２５及び９４ｍｇ／Ｌの抗生物質濃度を試験し、また５０及び１０ｍｇ／Ｌの濃度も含む。
結果：
下記の表において、「対照」は、ＦＡプラスボトル（最終カラムでは「ＢＣ」とも呼ばれる）を用いて処理された試料を表し、「ビーズレスキュー」は、本発明の方法に従って処理された試料を表す。
Figure 2022552115000081
コメント：
Ｆｌａｙｈａｒｔら、２００７が報告したように、抗生物質－血液（セフトリアキソン）の高いピークの血清濃度では、ＦＡ＋血液培養ボトルは肺炎連鎖球菌を回収することができない。このデータは、本発明の方法を使用して、肺炎連鎖球菌を回収し、高いピークの血清濃度の抗生物質を含有する血液から成功裏に増殖させることができることを示す。この実験は、本発明の方法が、Ｆｌａｙｈａｒｔにより試験されたようなＦＡプラスボトルを上回る改良であることを示す。
Ｃｈｕｎｇら、２０１９年による実験の再現
目的：
それぞれの抗生物質を含む下記の表における生物において、ＦＡプラスボトルからの生物捕捉とレスキューを比較すること。Ｃｈｕｎｇら、２０１９年による論文で報告されているように、さらに抗生物質濃度を試験した（セフェピム、セフォタキシム、メロペネムについてそれぞれ１６４ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ及び４９ｍｇ／Ｌ）。
Figure 2022552115000082
結果：
下記の表において、「対照」は、ＦＡプラスボトル（最終カラムでは「ＢＣ」とも呼ばれる）を用いて処理された試料を表し、「ビーズレスキュー」は、本発明の方法に従って処理された試料を表す。
Figure 2022552115000083
コメント：
Ｃｈｕｎｇら、２０１９年が報告したように、抗生物質－血液の高いピークの血清濃度では、ＦＡ＋血液培養ボトルは微生物を回収することができない。このデータは、本発明の方法を使用して、生物を回収し、高いピークの血清濃度の抗生物質を含有する血液から成功裏に増殖させることができることを示す。この実験は、本発明の方法が、Ｃｈｕｎｇにより試験されたようなＦＡプラスボトルを上回る改良であることを示す。
参考文献：
Flayhart D, Borek AP, Wakefield T, Dick J,Carroll KC. Comparison of BACTEC PLUS blood culture media to BacT/Alert FAblood culture media for detection of bacterial pathogens in samples containingtherapeutic levels of antibiotics. J Clin Microbiol. 2007 Mar;45(3):816-21.doi: 10.1128/JCM.02064-06. Epub 2006 Dec 13. PMID: 17166960; PMCID: PMC1829095.
Chung Y, Kim IH, Han M, Kim HS, Kim HS,Song W, Kim JS. A comparative evaluation of BACT/ALERT FA PLUS and FN PLUSblood culture bottles and BD BACTEC Plus Aerobic and Anaerobic blood culturebottles for antimicrobial neutralization. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019Dec;38(12):2229-2233. doi: 10.1007/s10096-019-03663-3. Epub 2019 Aug 2. PMID:31375943.

Claims (27)

  1. 微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から生存微生物を回収する方法であって、
    ａ）前記試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体を形成するステップと、
    ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離し、それによって試料から生存微生物を回収するステップと
    を含む方法。
  2. 回収された生存微生物を検出及び／又は特徴付けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 抗菌剤を含み、微生物を含有することが疑われる試料中の生存微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、
    ａ）前記試料を被覆された粒子とともにインキュベートして、微生物が試料中に存在する場合は、粒子－微生物複合体を形成するステップと、
    ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離し、それによって試料から生存微生物を回収するステップと、
    ｃ）回収された微生物の不存在又は存在を確認するステップと
    を含む方法。
  4. ステップｂ）において回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するステップさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 微生物細胞及び抗菌剤を含む試料から回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養する方法であって、
    ａ）前記試料を被覆された粒子とともにインキュベートして粒子－微生物複合体を形成するステップと、
    ｂ）粒子－微生物複合体を抗菌剤から分離し、それによって試料から生存微生物を回収するステップと、
    ｃ）回収された生存微生物のインキュベート及び／又は培養するステップと
    を含む方法。
  6. 対象からの試料に対して請求項５に記載の方法を行うステップを含む、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法であって、任意選択で、対象が抗菌剤で処理されている方法。
  7. 前記感染に関与する微生物を特徴付けるステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記試料がまた非微生物細胞も含み、ステップｂ）が粒子－微生物複合体を抗微生物剤及び非微生物細胞から分離し；任意選択で、非微生物細胞が血液細胞を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップｂ）が、界面活性剤の不存在下で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ステップｂ）が、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. ステップｂ）が、分離された粒子－微生物複合体を洗浄するステップを含み、任意選択で、分離された粒子－微生物複合体が、界面活性剤を含有しない溶液で洗浄される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ステップｂ）が、磁場又は遠心分離を使用するステップを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ａ）抗菌剤及び生存微生物を含有する試料と、
    ｂ）試料中の生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子と
    を含む組成物。
  14. 抗菌剤と、被覆された粒子と複合体化された生存微生物とを含有する試料を含む組成物。
  15. 生存微生物細胞を含有する試料が、非微生物細胞をさらに含み、任意選択で、非微生物細胞が血液細胞を含む、請求項１３又は請求項１４に記載の組成物。
  16. ａ）生存微生物と複合体を形成することができる被覆された粒子を含有する容器；
    ｂ）被覆された粒子を用いて回収された生存微生物をインキュベート及び／又は培養するのに適した培地であって、抗菌剤及び／又は抗菌剤と結合することができる薬剤を含有しない培地を含有する容器；及び／又は
    ｃ）試料から回収された被覆された粒子を洗浄するための洗浄緩衝液を含有する容器であって、洗浄緩衝液は生存微生物を溶解しない容器
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
  17. 成分ａ）、ｂ）及びｃ）（別々の容器内）を含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 前記洗浄緩衝液が、
    ａ）界面活性剤を含まず；
    ｂ）Ｔｒｉｓ及び／又は塩化ナトリウムを含み；及び／又は
    ｃ）は非微生物細胞を溶解しない、
    請求項１７に記載のキット。
  19. ａ）生存微生物の核酸修飾活性の基質として作用し、したがって、微生物が試料中に存在するかどうかの検出を可能にする核酸分子；並びに／又は
    ｂ）生存微生物由来の核酸に特異的にハイブリダイズし、したがって、試料中の微生物の特徴付けを可能にするプライマー及び／若しくはプローブ
    をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のキット。
  20. 前記微生物が細菌又は真菌である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～１９のいずれか一項に記載のキット。
  21. 前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌剤である、請求項１～１２及び２０のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び２０のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２０のいずれか一項に記載のキット。
  22. 前記試料が、前記抗菌剤を用いた処置を受けているか、又は受けていた対象から採取された臨床試料である、請求項１～１２、２０及び２１のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５、２０及び２１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載のキット。
  23. 前記試料が、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、尿及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）から選択される、請求項１～１２及び１９～２２のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び１９～２２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 前記試料が血液又は血液培養試料を含み、任意選択で、前記試料が全血を含む、請求項１～１２及び１９～２３のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び１９～２３のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２３のいずれか一項に記載のキット組成物。
  25. 前記被覆された粒子が磁性である、請求項１～１２及び１９～２４のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び１９～２４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２４のいずれか一項に記載のキット。
  26. 前記被覆された粒子がポリマー表面を含み、任意選択で、前記ポリマー表面が炭素ベースのポリマーを含む、請求項１～１２及び１９～２５のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び１９～２５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２５のいずれか一項に記載のキット。
  27. 前記被覆された粒子が、外面に、
    ｉ）カルボン酸基
    ｉｉ）アミノ基
    ｉｉｉ）疎水性基、及び
    ｉｖ）ストレプトアビジン
    のうちのいずれか１つ又は複数を含む、請求項１～１２及び１９～２５のいずれか一項に記載の方法、請求項１３～１５及び１９～２５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６～２５のいずれか一項に記載のキット。
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