KR20220077926A - 항균제-함유 용액에서의 미생물 포획 - Google Patents

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폴 제이
다니엘 락하트
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Abstract

항균제를 포함하는 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 방법은 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계 및 이어서 항균제에서 입자-미생물 복합체를 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 항균제를 또한 함유하는 샘플에서 미생물의 부재 또는 존재를 검출하기 위해 사용된다. 해당 조성물 및 키트가 또한 제공된다.

Description

항균제-함유 용액에서의 미생물 포획
본 발명은 일반적으로 항균제를 함유하는 샘플로부터 미생물을 회수하는 분야에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 방법으로 정제되지 않은 혈액, 혈액 배양물, 및 기타 체액과 같은 임상 샘플에서 미생물 병원체의 부재 및 존재를 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 방법의 수행에 유용한 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 적용은 생존(viable) 미생물의 존재 또는 부재의 결정, 이들의 그람(Gram) 상태, 종, 및 항균제 민감성/저항성의 결정을 포함한다. 본 발명은 또한 환자의 항균 치료의 효과를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 미생물 감염이 의심되는 대상체에서 채취한 샘플의 대부분이 실제로 감염된 대상체의 것이 아님에도 불구하고 기존에 상상했던 것 보다 훨씬 더 많은 수준의 유핵 혈액 세포(nucleated blood cell)(백혈구)가 존재함을 인식하였다. 이는 감염에 대해 스크리닝된 환자로부터 채취한 혈액 샘플에서 혈액 세포, 특히 백혈구에서 잠재적인 미생물을 분리하는 개선된 방법에 대한 요구로 이어졌다.
이미 항균제를 투여받은 환자로부터 혈액 샘플을 채취하면, 환자가 분명히 감염된 경우에도 후속 혈액 배양에서 미생물이 자라지 않는 경우가 종종 있다(문헌[Scerbo et al., Surg Infect (Larchmt). 2016 Jun;17(3):294-302]; 문헌[Sinha et al., Clin Microbiol Rev. 2018 Feb 28;31(2), e00089-17]; 문헌[Scheer et al., Clin Microbiol Infect. 2019 Mar;25(3):326-331]).
이러한 문제를 해결하기 위해, 혈액 배양 공급업체는 항생제-흡수 수지가 함유된 혈액 배양 병(예컨대, Becton Dickinson의 BACTEC PLUS 병 및 bioMerieux의 BacT/Alert 병)을 제공해 왔다. Flayhart 등(문헌[J. Clin. Microbiol. (2007), 816-821])은 시뮬레이션된 조건에서 BACTEC PLUS 및 BacT/Alert 병의 시험을 기술한다. 세프트리악손(ceftriaxone)의 존재 하에, 두 시스템 모두 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)를 회수할 수 없었다.
Chung 등(문헌[Eur J Clin Microbiol Infect Dis. (2019), 38(12):2229-2233])은 또한 시뮬레이션된 조건에서 BacT/Alert 병 및 BACTEC Plus 병의 시험을 기술한다. 두 시스템 모두 특정 항균제의 존재 하에 검출 비율이 낮거나 0인 것으로 나타났다. 예컨대, 세페핌(cefepime)의 존재 하에 E. 콜리(E. coli) 또는 K. 뉴모니아(K. pneumoniea); 세포탁심(cefotaxmine)의 존재 하에 E. 콜리; 및 메로페넴(meropenem)의 존재 하에 E. 콜리, K. 뉴모니아, 또는 P.에루기노사(P. aeruginosa). 따라서, 두 시스템 모두 항균제를 함유하는 샘플에서 미생물을 보편적으로 회수할 수 없다.
국제공개 WO2009/007719호에서, NAD-의존적 리가제(ligase)가 샘플에 미생물이 존재하는 지를 보여주는 유용한 지표(indicator)로서 기술되어 있다. 리가제는 핵산 분자의 결찰(ligation)을 촉매하는 효소이다. 결찰 반응은 관련 리가제에 따라 보조-인자로서 ATP 또는 NAD+를 필요로 한다.
국제공개 WO2011/130584호는 DNA 또는 RNA 중합 효소의 검출에 기반한 생존 미생물의 검출 방법을 기술하고 있으며 여기서 샘플은 미생물 중합효소의 기질 역할을 하는 핵산 기질과 접촉하고, 온전한(intact) 미생물의 중합효소 활성에 적합한 조건 하에 인큐베이션되고 모든 생성된 핵산 생성물이 정량적 중합효소 연쇄 반응과 같은 핵산 증폭 기술을 사용하여 결정된다. 이러한 분석은 "ETGA 분석"이라고 지칭되며, 여기서 ETGA는 효소 주형 생성 및 증폭(Enzymatic Template Generation and Amplification)을 나타낸다. 조 샘플(clude sample)에서 생존 미생물에 대한 ETGA 분석의 문제는 숙주(예컨대 인간) 세포 및 죽은 미생물에서 발생하는 미생물 외부의 오염 중합효소 활성의 존재이다. ETGA 분석은 미생물 중합효소 활성과 숙주의 중합효소 활성 또는 죽은 미생물의 중합효소 활성을 구별할 수 없다.
국제공개 WO2010/119270호는 온전한 미생물 외부에서 DNA 리가제 활성을 제거하는 방법을 기술한다. 국제공개 WO2011/070507호는 비-이온성 세제 및 완충액을 사용하는 동물 세포의 선택적 용해(lysis)를 기술한다. 국제공개 WO2017/182775호는 비-미생물 세포를 또한 함유할 수 있는 샘플에서 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 방법을 기술하며, 이는 비-미생물 세포를 선택적 용해시키는 단계, 용해물을 여과하는 단계, 및 필터 안에 남아있거나 필터 상에 남아있는 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
항체와 같이 특정 결합 모이어티로 코팅된 자기 비드(magnetic bead)를 사용하면 표적화된 종을 포획할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 생성물의 특이성은 항체 또는 다른 결합 리간드의 특이성에 의해 정의되며, 일반적으로 특정 목적을 위해 선택되어 특정 미생물을 단리할 수 있도록 매우 특이적이다.
국제공개 WO03/102184호는 응집제(flocculating agent), 예컨대 폴리아민 또는 양이온 세제를 사용하여 세포(예컨대 박테리아)를 농축하거나 분리하여 세포와 복합체를 형성하여 세포를 응집시키는 방법, 조성물, 및 키트를 기술한다. 응집된 세포의 분리는 자기 비드와 같이 세포를 결합할 수 있는 고체 상으로 수행될 수 있다.
국제공개 WO01/53525호는 샘플에서 세포(예컨대 미생물)를 단리하는 방법을 기술하며 상기 방법은 고체 지지체 상에 고정된 탄수화물 리간드에 의해 세포를 고체 지지체 상에 결합시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법을 수행하기 위한 키트는 DiaSorin Molecular("Bugs'n BeadsTM" 키트)에서 판매된다.
미생물을 단리하기 위한 다른 키트는 ApoH-Technologies Peps6 자기 비드를 포함한다. 비드는 β-2 당단백질로도 알려진 아포지질단백질 H 단백질(ApoH)로부터 유래된 합성 분자인 Peps6으로 코팅되어 있다.
Cartwright 등(문헌[EBioMedicine (2016) 9:217-227])은 만노스 결합 렉틴(mannose binding lectin)으로 코팅된 자기 비드를 사용하여 병원체-관련 분자 패턴(PAMP: Pathogen-Associated Molecular Pattern)을 포획하는 것을 기술한다. Cartwright에 따르면, PAMP는 다양한 유형의 살아있는 병원체 및 죽은 병원체에 의해 방출되는 탄수화물 세포 벽 물질 및 외막 소포이다. Cartwright는 항생제에 의해 사멸될 때 병원체에 의한 PAMP의 방출이 증가한다고 언급하였다. Cartwright 분석은 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 것을 목표로 하고 있지 않다.
국제공개 WO2018/044966호, 유럽특허 EP1118676호, 중국특허 CN109929763호, 중국특허 CN109741896호는 항균제를 함유하지 않는 샘플로부터 미생물을 포획하기 위해 비드를 사용하는 것을 기술한다.
본 발명은 코팅된 입자로 미생물을 포획하여 입자-미생물 복합체를 형성하고 항균제로부터 입자-미생물 복합체를 분리함으로써 미생물 세포 및 항균제를 포함하는 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 것에 관한 것이다. 본 발명자들은 코팅된 입자가 미생물에 보편적으로 결합할 수 있고 따라서 어떠한 유형이 샘플에 사전에 존재하는지 몰라도 박테리아 및 진균과 같은 다양한 미생물을 회수할 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따른 범-미생물 회수는 항균제의 증식-억제 효과를 제거하는데 효과적이다. 이는 본원에 보고된 비교 실험에서 입증된 바와 같이 항생제-흡수 수지를 함유하는 혈액 배양 병을 사용하여 현재 임상 실습에서 해결되는 문제를 해결하는 대안적이고 보다 효과적인 방법을 제공한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 회수된 미생물은 생존이 유지되고 빠르게 회복되어 성장을 보인다. 본 발명자들은 놀랍게도 표적화된 방식으로 (특이적) 미생물에 결합하는 항체와 같은 복잡한 모이어티가 결여된 코팅된 입자로도 이러한 회수가 가능하다는 것을 발견하였다.
항균제로부터 미생물을 구하는 것 외에도, 본 발명은 또한 분자 검출 및 식별과 같은 기술에 심각한 영향을 미칠 수 있는 혈액 세포 잔류물, 헤모글로빈, 및 백혈구 DNA와 같은 추후 분석의 억제제로부터 미생물을 구조할 수 있도록 한다. 혈소판 제거는 항균제 감수성을 결정하기 위한 일부 기술에서도 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 특히 항생제-흡수 수지를 함유하는 혈액 배양 병(예컨대 Becton Dickinson의 BACTEC PLUS 병 및 bioMerieux의 BacT/Alert 병)과 비교할 때, 상당한 농도의 미생물을 초래한다(예컨대, 5 mL 혈액 샘플 중의 미생물이 수십 μL로 농축될 수 있음). 이는 더 높은 농도의 미생물을 필요로 하는 다운스트림 적용에 유리하다. 분자 시험을 포함한 다양한 시험이 회수된 생존 미생물을 검출하고/하거나 특성분석하기 위해 수행될 수 있으며 보다 농축된 샘플은 일반적으로 이러한 분석을 수행하는데 필요하거나 이러한 분석의 맥락에서 유리하다. EGTA 분석, PCR 또는 서열 분석, 및 항-미생물 감수성 시험(AST: anti-microbial susceptibility testing), 특히 상대적으로 낮은 부피로 수행되는 다중-웰 AST를 비롯하여, 적합한 분석법이 본원에 논의되어 있다. 적합하게 농축된 샘플을 제공하면 미생물의 다운스트림 시험에서 추가 농축 단계를 피할 수 있으므로 초기에 처리 시간이 향상된다.
방법
본 발명은 미생물 세포 및 항균제를 포함하는 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계; 및 b) 항균제로부터 입자-미생물 복합체를 분리하는 단계를 포함하며; 이에 따라 샘플에서 생존 미생물이 회수된다.
용어 "생존(viable) 미생물"은 죽지 않은 미생물을 지칭하며 본 개시내용의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 이는 항균제에 의해 사멸되지 않는 미생물이다. 생존 미생물은 항균제 노출로부터 대사 회복할 수 있고/있거나 적절한 조건 하에 성장할 수 있다(본원에 기술된 바와 같이, 항균제를 함유하는 샘플에서 일단 회수되면). "성장"은 부피/크기의 증가와 증식 능력 둘 모두를 의미하며 특히 증식 능력(합성, DNA 복제, 및 세포 분열을 통해)을 의미한다.
샘플에서 생존 미생물을 회수함에 있어서, 회수된 생존 미생물이 노출되는 항균제의 농도는 실질적으로 감소될 수 있다. 샘플에서 생존 미생물을 회수함에 있어서, 생존 미생물의 농도는 샘플에 비해 증가될 수 있다. 생존 미생물의 농도가 증가하면 생존 미생물의 특성분석화와 같은 다운스트림 공정에 도움이 될 수 있다.
"샘플을 인큐베이션"하는 단계는 입자-미생물 복합체의 형성에 도움이 되는 조건 하에서 샘플을 코팅된 입자와 접촉시키는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하는 단계는 특정 온도(예컨대 37℃)에서 일정 기간(예컨대 30분) 동안 코팅된 입자를 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. 인큐베이션은 진탕과 함께 수행되거나 진탕 없이 수행될 수 있다(예컨대 500 내지 1000 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기, 오비탈 진탕기(orbital shaker), 또는 진탕 인큐베이터에 의해). 인큐베이션은 고정제(fixative agent) 없이 수행될 수 있다. 고정제는 가교결합 또는 비-가교결합 고정제일 수 잇다. 가교결합 고정제는 샘플 중의 미생물과 화학 결합을 함으로써 기능을 한다. 비-가교결합 고정제는 샘플 중의 미생물을 화학적으로 변경하지 않고; 오히려 단순히 이를 침전시킨다.
방법은 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생존 미생물은 코팅된 입자에 부착된 상태(즉, 복합체로)를 유지하는 동안 인큐베이션하고/하거나 배양될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 회수된 생존 미생물을 배양하는 단계는 생존 미생물의 수를 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하는 단계는 별개의 단계로 간주될 수 있으므로 생존 미생물의 수를 증가시키는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 항균제에 노출된 미생물은 회복 후 일정 기간 동안 성장할 수 있는 위치에 있지 않을 수 있다. 따라서, 회수된 생존 미생물을 인큐베이션 하는 단계는 유기체가 항균제에 노출된 후 대사 회복을 겪도록 하는 것을 포함할 수 있다. 일부 다운스트림 특성분석 방법의 경우, 미생물이 성장할 필요가 없다; 그러나 대사 회복이 중요할 수 있다. 따라서, 일부 방법은 회복 후 배양 단계를 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 대사 회복 후, 생존 미생물은 성장 단계에 들어갈 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 대사 회복 후 성장할 수 있게 하기 위해 인큐베이션 및 배양 둘 모두를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 미생물 세포 및 항균제를 포함하는 샘플로부터 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계; b) 항균제로부터 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 단계; 및 c) 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 회수된 생존 미생물을 검출하고/하거나 특성분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. "검출"은 회수된 샘플 중에 실제로 생존 미생물이 있는지 여부를 적합한 수단으로 결정하거나 확인하는 것을 지칭한다. "특성분석"은 미생물의 존재 또는 부재를 검출하는 것보다 더 나아가 회수된 생존 미생물에 대한 추가 정보를 제공한다. 특성분석은 샘플이 박테리아 및/또는 진균을 함유하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 특히 감염된 것으로 의심되는 대상체(예컨대 잠재적 패혈증 환자)로부터 채취한 임상 샘플과 특히 관련이 있다. 특성분석은 추가로(이는 후속적일 수 있음, 즉, 먼저 미생물(예컨대 박테리아 또는 진균)이 존재하는 여부를 결정하고, 존재하는 경우 추가 특성분석 단계를 수행할 수 있음) 또는 대안적으로 샘플로부터 회수된 미생물의 속 또는 종을 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 특성분석은 미생물의 그람(Gram) 상태(즉, 박테리아가 그람 음성 또는 그람 양성인지 여부)를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 특성분석은 샘플을 채취한 대상체에 가장 적합한 항균제의 유형을 결정하는데 특히 유용할 수 있다. 특성분석은 미생물의 항균제 감수성 및/또는 저항성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 방법이 이러한 추가 단계에 사용될 수 있으며; 이러한 방법의 예가 본원에서 추가로 논의된다.
따라서, 본 발명은 항균제를 포함하고 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 생존 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계(미생물이 샘플에 존재하는 경우임; 미생물이 존재하지 않는 경우에는 복합체가 형성될 수 없음); b) 항균제로부터 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 단계; 및 c) 생존 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
유사하게, 본 발명은 항균제를 포함하고 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 생존 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계 (미생물이 샘플에 존재하는 경우임; 미생물이 존재하지 않는 경우에는 복합체가 형성될 수 없음); b) 항균제로부터 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 단계; c) 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 단계; 및 d) 생존 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상체의 샘플 상에서 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하는 단계를 포함하여 대상체에서 생존 미생물 감염의 부재 또는 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 대상체는 항균제로 처리된다. 이는 이제 샘플에서 항균제의 공급원(source)이다. 샘플은 전형적으로 본원에 논의된 바와 같은 임상 샘플이다. 대상체는 전형적으로 인간 대상체이며, 종종 감염(박테리아 또는 진균 감염일 수 있음)으로 고통받는 것으로 의심되는 인간 대상체이다.
이러한 방법에서, 상기 방법은 감염의 원인이 되는 미생물을 특성분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 임의의 적합한 특성분석 방법이 사용될 수 있다(이러한 논의는 필요한 부분만 수정하여 적용됨).
이미 언급한 바와 같이, 본 발명은 특히 임상 샘플에 적용가능하다. 이러한 샘플은 전형적으로 비-미생물 세포를 함유한다. 실제로, 이는 비-미생물 세포를 주로 함유할 수 있다(즉, 샘플에 비-미생물 세포보다 미생물 세포가 더 적거나, 전형적으로 상당히 더 적음). 따라서, 코팅된 입자가 항균제 및 비-미생물 둘 모두를 함유하는 샘플로부터 미생물을 제거할 수 있다는 본 발명자들의 발견은 본 발명에서 특히 유리하다.
따라서 본 발명은 미생물 세포, 비-미생물 세포, 및 항균제를 포함하는 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계; 및 b) 항균제 및 비-미생물 세포로부터 입자-미생물 복합체를 분리하는 단계; 이에 따라 샘플로부터 생존 미생물을 회수하는 단계를 포함한다.
이러한 방법에서, 샘플은 비-미생물 세포를 포함하고 단계 b)에는 항균제 및 비-미생물 세포로부터 입자-미생물 복합체를 분리한다. 비-미생물 세포는 혈액 세포를 포함할 수 있다. 혈액 세포는 적색(적혈구) 및/또는 백색 혈액 세포(백혈구)를 포함할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위하여, 비-미생물 세포는 분리가 일어나기 전에 용해될 수 있다. 따라서, 비-미생물 세포로부터 입자-미생물 복합체를 분리하는 것은 비-미생물 세포 용해물로부터 입자-미생물 복합체를 분리하는 단계를 포함한다. 그러나, 분리는 또한 비-미생물 세포가 온전하게 유지될 때 수행될 수 있다.
항균제에 대한 미생물의 노출은 미생물을 사멸시키거나 성장을 방지하기 위한 것이다. 이는 생존 미생물을 회수하려고 시도할 때 문제가 된다. 따라서, 본 방법은 항균제에 노출된 후 샘플에 남아있는 생존 미생물을 보존하기 위한 조건에 의존할 수 있다. 이러한 미생물은 세포 사멸 및 용균에 더 취약할 수 있다. 따라서, 샘플 중의 미생물보다 비-미생물 세포를 우선적으로 용해시키는데 유용할 수 있는 특정 제제는 본 발명의 특정 실시형태에서 적합하지 않을 수 있다. 이러한 제제는 특히 고농도의 세제를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법(단계 b))은 세제의 부재 하에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 b)는 소듐 폴리아네톨 설포네이트(sodium polyanethol sulfonate)의 존재 하에 수행될 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, 이러한 시약은 비-미생물 세포를 함유하는 샘플로부터 미생물을 회수하는데 유용하다.
추가 실시형태에서, 단계 b)는 추가적으로 또는 대안적으로 샘플에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약(예컨대 세제)의 존재 하에 수행될 수 있다. 적합한 시약이 당업계에 알려져 있고 본원에서 추가로 논의된다.
용해에 대한 항균제-노출된 미생물의 민감도가 증가한다는 점에서, 일부 실시형태에서는 샘플 중의 비-미생물로부터 미생물의 분리를 용이하게 하기 위해 비-미생물 세포의 용해가 수행되지 않는다. 코팅된 입자는 미생물에 우선적으로 결합하기 때문에 샘플에서 비-미생물을 용해시키기 위한 절대적인 요구사항은 없다. 그러나, 입자-미생물 복합체로부터 비-미생물 세포(전형적으로 온전한 비-미생물 세포) 및/또는 세포의 용해물을 제거하기 위해 하나 이상의 세척 단계를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 분리된 입자-미생물 복합체를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 세척 용액이 사용될 수 있으며, 예가 본원에서 논의된다. 일부 실시형태에서, 분리된 입자-미생물 복합체는 세제를 함유하지 않는 용액으로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 Tris 및/또는 소듐 클로라이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 약 7 내지 9, 예컨대 7.5 내지 8.5의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 염 예컨대 금속 할라이드 염을 함유한다. 바람직한 예는 소듐 클로라이드이다. 염 농도는 약 50 내지 150 mM일 수 있다. 바람직하게는, 세척 완충액은 인산염 완충된 염수(PBS: phosphate buffered saline), Tris 또는 Tricine을 포함한다.
다른 실시형태에서, 분리된 입자-미생물 복합체는 세제(detergent)를 함유하는 용액으로 세척될 수 있다. 상기 용액은 미생물의 용해 위험을 감소시키기 위한 약한 세제 용액일 수 있다. 상기 용액은 미생물을 실질적으로 용해시키지 않는 농도의 세제를 포함할 수 있다. 적합한 예는 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 모노라우레이트(polyethylene glycol sorbitan monolaurate)(Tween 20)를 포함한다. 시약은 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 사포닌을 포함할 수 있다. 미생물은 미생물을 실질적으로 용해시키지 않는 기간 동안 세제 용액에 노출될 수 있다. 상기 용액은 샘플 중의 비-미생물의 적어도 일부를 선택적으로 용해시킬 수 있다.
샘플에 존재하는 비-미생물을 세포를 선택적으로 용해시키면서 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하는 시약은 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 효소는 단백질분해효소(proteinase) 및/또는 DNA 분해효소(DNAse)를 포함할 수 있다. 적합한 효소가 본원에 논의되어 있다.
그러나, 이미 언급한 바와 같이, 항균제에 노출된 후 취약할 수 있는 미생물을 다룰 때, 단계 a)와 단계 b)에서 수행되는 임의의 세척은 세제의 부재 하에 수행되는 것이 바람직하다. 전체 방법은 일부 실시형태에서 세제의 부재 하에 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 회수된 생존 미생물의 검출 및/또는 특성분석하는 것을 제외하고 세제의 보재 하에 수행될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 미생물 세포의 내용물은 분석을 위해 방출되어야할 수 있다. 적합한 용해 시약은 세제를 포함할 수 있다. 이러한 세제는 미생물의 완전한 용해를 보장하기 위해 높은 농도일 수 있다.
상기 방법에서, 단계 b)는 전형적으로 샘플의 나머지 부분으로부터 입자-미생물 복합체의 물리적 분리의 일부 형태를 수반한다. 이는 임의의 적합한 분리 수단의 사용을 포함할 수 있다. 예컨대, 분리는 자기장을 사용하여 달성될 수 있다. 자기장을 사용하려면 입자가 자성 입자이고 입자-미생물 복합체를 끌어당기는 것이 필요하다. 대안적으로, 원심분리, 또는 여과와 같은 다른 분리 방법이 사용될 수 있다. 단계 (b)는 흡인(aspiration)에 의해 입자-미생물 복합체로부터 비-미생물 세포를 제거하는 단계를 포함하거나 추가로 포함할 수 있다.
의심의 여지를 없애기 위하여, 세척 단계는 물리적 분리 단계 또는 단계들을 이후에 실행할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 (단계 b)의 일부로서) 분리된 입자-미생물 복합체를 세척하여 항균제 및/또는 비-미생물 세포 또는 입자-미생물 복합체로부터 용해물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 일반적으로, 단계 b)는 입자-미생물 복합체로부터 비-미생물 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
선택적 용해가 사용되는 경우, 샘플로부터 비-미생물 세포를 제거하기 위해(그리고 생존 미생물을 유지하기 위해), 이는 상기 방법의 임의의 적합한 단계에서 수행될 수 있다. 따라서 이는 샘플이 코팅된 입자와 인큐베이션되기 전에 초기 공정 단계로서 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 단계 a)는 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시킴으로써 선행될 수 있다.
샘플 중에 존재하는 임의의 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 단계는 삼투 용해 또는 세제 첨가를 포함할 수 있다. 세제는 미생물을 실질적으로 용해시키지 않는 비-미생물 세포(예컨대 혈액 세포)의 용해를 야기할 수 있는 약한 세제일 수 있다. 적합한 예는 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 모노라우레이트(Tween 20)를 포함한다. 시약은 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 사포닌을 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 단계 a)는 전형적으로 수용액에서 수행된다. 단계 a)는 완충액의 존재 하에 수행될 수 있다. 완충액은 비제한적으로 인산염 완충된 염수(PBS), TAPS([Tris(히드록시메틸)메틸아미노]프로판설폰산), Bicine(2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)아세트산), Tris(Tris(히드록시메틸)아미노메탄), Tricine(3-[N-Tris(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산), TAPSO(3-[N-Tris(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산), HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), TES(2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산), MOPS(3-(N-모폴리노)프로판설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), Cacodylate(디메틸아르센산), MES(2-(N-모폴리노)에탄설폰산), 비스-tris(2-[Bis(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올), 말리에이트, 포스페이트, 글리신, 시트레이트, 글리실글리신, 포르메이트, 숙시네이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 피페라진, 히스티딘, 에탄올아민, 이미다졸, 보레이트, 카보네이트 중 임의의 하나 이상을 포함하여 임의의 적합한 완충제를 포함할 수 있다. 완충액은 7.4 내지 8.5 사이의 pH를 가질 수 있다.
바람직하게는, 완충액은 인산염 완충된 염수(PBS), Tris 또는 Tricine을 포함한다. 상기 방법에서, 단계 a)는 소듐 클로라이드의 존재 하에 수행될 수 있다. 소듐 클로라이드는 50 내지 500 mM의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 소듐 클로라이드는 약 150 mM의 농도로 존재할 수 있다.
상기 방법에서, 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약은 세제, 특히 약한 세제일 수 있다. 상기 방법에서, 세제는 비-이온성일 수 있다. 상기 방법에서, 세제는 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 입자에 접합되지 않을 수 있다. 따라서, 전형적으로 세제는 입자가 첨가되는 용액의 일부를 형성하고 입자 자체의 일부를 형성하지 않는다.
이미 소개된 바와 같이, 본 발명의 방법은 회수된 생존 미생물의 검출 및/또는 특성분석하는 단계를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 단계는 (i) 미생물의 효소적 활성을 검출하는 단계, (ii) 미생물로부터 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하는 단계, (iii) 세포계측법 또는 현미경에 의해 미생물을 직접적으로 검출하는 단계, 또는 (iv) 세포 배양 후 미생물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 모든 관련 양태에 따른 입자-미생물 복합체 중의 미생물의 부재 또는 존재의 검출은 임의의 원하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 미생물의 단순한 부재 또는 존재를 검출하는 단계를 수반할 수 있다. 이는 존재하는 경우 미생물의 정량화를 수반할 수 있다. 이는 또한 일부 실시형태에서 미생물의 특성의 특성분석을 수반할 수 있다. 따라서, 박테리아 및/또는 진균의 검출이 수행될 수 있다. 그람 양성과 그람 음성 박테리아의 구별도 또한 수행될 수 있다. 유기체의 종 및 항균제 감수성 및/또는 저항성의 식별도 또한 수행될 수 있다.
검출 및/또는 특성분석은 입자-미생물 복합체로부터 미생물을 제거(또는 회수)한 후에 발생할 수 있다. 회수된 미생물은 검출 전에 용해될 수 있다. 회수는 온전한 미생물 또는 미생물의 용해 후 용해물의 회수일 수 있다(본원에서 보다 상세하게 논의됨).
바람직하게는, 검출은 입자-미생물 복합체로부터 미생물의 사전 제거(또는 회수) 없이 발생한다. 이러한 실시형태는 특히 본 발명을 자기 비드-처리 기기에 적용하는데 유용하다(즉, 입자가 자성인 경우, 이는 본 발명의 방법의 특히 유용한 구현을 나타냄).
미생물과 관련된 핵산 분자의 검출이 당업계에 알려져 있으며 DNA 또는 RNA 수준에서 수행될 수 있다. 이는 임의의 적합한 방법, 예컨대 증폭(예컨대 PCR) 또는 서열분석(특히 차세대 서열분석)으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 미생물과 비-미생물, 예컨대 인간, DNA 및 RNA 간의 서열 분기를 이용할 수 있다. 이러한 방법은 핵산 성분의 방출을 위해 미생물(예컨대 입자-미생물 복합체의 형태로 존재함)을 용해시키는 것을 수반할 수 있다.
미생물의 직접 검출도 또한 알려져 있다. 이는 예컨대 세포계측법에 의한 유세포 분석을 수반할 수 있다. 이는 예컨대 입자-미생물 복합체로부터 회수된 미생물을 시각화하거나 입자-미생물 복합체 중의 미생물을 시각화하기 위해 현미경의 사용을 수반할 수 있다.
미생물의 수를 증가시키기 위해, 미생물 검출이 또한 세포 배양 후에 수행될 수 있다. 따라서, 입자-미생물 복합체 내에서 초기에 포획된 미생물은 검출 전에 정해진 기간 동안 배양될 수 있다. 배양 방법을 사용하면 본래 샘플에서 미생물을 직접 검출할 수 있다. 대안적으로, 미생물은 검출 전에(그러나 확장 없이) 항균제에 대한 노출로부터 대사 회복을 가능케 하기 위해, (배양될 때 보다) 더 짧은 기간 동안 인큐베이션될 수 있다.
그러나, 바람직한 실시형태에서, 회수된 미생물의 부재 또는 존재에 대한 검출은 미생물과 관련된 효소 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 효소 활성은 전형적으로 핵산 변형 활성이고 본원에서 보다 상세히 논의된다.
따라서, 상기 방법에서, 미생물을 검출하는 단계는 (i) 입자-미생물 복합체 중의 미생물을 용해시키는 단계; (ii) 용해물을 미생물의 핵산 변형 활성에 대한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (iii) 미생물의 부재 또는 존재를 나타내기 위해 기질 핵산 분자에 핵산 변형 효소가 작용하여 발생하는 변형된 핵산 분자의 부재 또는 존재를 구체적으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 기질이 본원에서 추가로 상세히 논의된다. "기질"은 미생물-유래 효소에 의해 작용하는 핵산 분자를 의미한다. 전형적으로, 이러한 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 기질이다. 이는 합성 핵산 분자이다.
입자-미생물 복합체 중의 미생물의 용해는 핵산 분자 또는 미생물 내의 효소, 예컨대 핵산 변형 효소의 검출을 가능케 한다. 용해는 용해 혼합물의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 용해 혼합물은 일반적으로 본 발명의 상기 방법에서 유용하다. 용해 혼합물은 세포 내에서 핵산 분자 및/또는 효소 활성, 예컨대 핵산 변형 활성에 악영향을 미치지 않으면서 미생물의 효율적인 용해를 보장하기 위한 특정 성분의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 성분은 담체/혈청 단백질 예컨대 BSA, 계면활성제/세제, 금속 할라이드 염, 완충액, 킬레이트제 등으로부터 선택될 수 있다. 기본 형태에서, 본 발명의 용해 혼합물은 다음의 성분을 포함할 수 있다:
1. 계면활성제/세제
2. 혈청 단백질 예컨대 알부민(예컨대 BSA)
3. 완충액
4. 뉴클레오티드, 예컨대 dNTP
5. 핵산 분자(본 발명의 분석에서 기질로서 작용함).
적합한 용해 혼합물이 하기 제시되어 있다:
L1: 360 mL 중의 252 mL LM
1.46% (w/v) BSA
0.15% Triton X100
0.15% Tween 20
L2: 360 mL 중의 36 mL LM
100 mM 암모늄 설페이트
20 mM 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트
100 mM 포타슘 클로라이드
200 mM Tris-HCl [pH 8.0]
L3: 360 mL 중의 36 mL LM
0.1 μM PTO-AS 올리고
0.1 μM PTO-S1 올리고
20 mM Tris-HCl [pH 8.5]
10 mM 포타슘 클로라이드
10 μM EDTA
10 mM dNTP: 360 mL LM 중의 3.6 mL
PTO-IPC 저장액: 360 mL 중의 약 180 μL LM
H2O: 360 mL 중의 약 32.4 mL LM
"PTO-AS 올리고"는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 의미한다. "PTO-S1 올리고"는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 2개의 올리고뉴클레오티드는 서로 혼성되어 기질 핵산 분자를 형성한다.
"PTO-IPC"는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함하는 IPC 분자를 의미한다.
적합한 기질 및 IPC 분자가 본원에서 보다 상세히 논의된다.
각 성분의 예시적인 양 및 농도가 열거되어 있지만 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이 변형될 수 있다.
용해는 또한 세포의 파쇄를 필요로 할 수 있다. 예컨대, 세포는 물리적 및/또는 효소적 수단과 조합하여 용해 혼합물을 사용하여 파쇄될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 상기 방법에서 세포는 물리적 파쇄 없이 용해된다. 일부 실시형태에서, 물리적 파쇄는 파쇄기를 사용한다. 파쇄기는 세포를 용해시키기 위한 비드 예컨대 유리 비드를 포함할 수 있다. 적합한 장치가 상업적으로 이용 가능하며 Scientific Industries, Inc.가 제조한 Disruptor Genie를 포함한다. 초음파처리는 예컨대 초음파 호른(ultra sonic horn)을 적용하여 이용될 수 있다. 효소적 파쇄는 일부 실시형태에서 리소스타핀(lysostaphin), 리소자임 및/또는 리티케이스(lyticase)로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 사용을 필요로 할 수 있다.
샘플에 존재하는 미생물이 용해되면, 생존 미생물이 샘플에 존재하는지(그리고 이로부터 회수되었는지) 여부를 나타내기 위해 방출된 핵산 및/또는 효소가 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용해물은 (미생물의) 핵산 변형 활성에 대한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 함께 인큐베이션된다. 이어서 기질 핵산 분자에 대한 핵산 변형 효소의 작용으로부터 기인한 변형된 핵산 분자의 부재 또는 존재가 미생물의 부재 또는 존재를 나타내기 위해 결정된다. 핵산 기질 분자는 검출될 핵산 변형 활성에 따라 설계된다. 당업자는 적합한 기질 핵산 분자를 잘 설계할 수 있다. 초기 샘플이 핵산 변형 활성의 비-미생물 공급원을 함유할 수 있지만, 본 발명의 방법은 기질 핵산 분자에 작용하는 이러한 오염 활성을 방지한다.
본 발명의 방법에 따르면 검출될 수 있는 전형적인 핵산 변형 활성은 중합효소 및/또는 리가제 활성을 포함한다. 핵산 변형 효소는 DNA 또는 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, DNA 중합효소는 DNA-의존적 DNA 중합효소이다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 DNA 중합효소 I이다. 핵산 변형 효소는 리가제를 포함할 수 있으며, 선택적으로 핵산 변형 효소는 NAD-의존적 리가제(박테리아의 존재를 나타내기 위한 것) 및/또는 ATP-의존적 리가제(진균 또는 박테리아의 존재를 나타내기 위한 것)이다. NAD-의존적 리가제는 (진핵)박테리아에서만 발견되므로, 이러한 활성을 검출하면 추가적인 수준의 특이성을 제공할 수 있다. 이는 국제공개 WO2009/007719호 및 국제공개 WO2010/119270호에 추가로 논의되어 있다(이의 관련 개시내용이 본원에 포함됨). 포스파타제, 키나제 및/또는 뉴클레아제 활성과 같은 생존력과 관련된 다른 핵산 변형 활성이 대안적으로 측정될 수 있다.
이미 논의된 바와 같이, 상기 방법은 비-미생물 세포 또는 용해물을 제거하기 위해 분리된 입자-미생물 복합체를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척 단계는 후속 분석의 억제제 예컨대 PCR 억제제를 제거할 수 있다. 세척 단계는 전형적으로 입자-미생물 복합체가 해리되지 않는 조건 하에서 수행된다.
일부 실시형태에서, "기질" 핵산 분자에 대한 핵산 변형 활성의 작용은 연장된 핵산 분자를 생성한다. 이는 가닥 연장(중합효소 활성) 및/또는 2개의 핵산 분자의 결찰(리가제 활성)에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소 또는 리가제에 의해 작용될 수 있는 기질이 이용되는데 이는 어느 하나의 활성이 샘플 중의 미생물의 존재를 나타내기 때문이다. 일부 실시형태에서, 관련 활성은 생성되는 신규 핵산 분자의 관점에서 구별될 수 있다.
기질은 미생물의 핵산 변형 활성에 대한 주형일 수 있다. 예컨대, 기질은 DNA 또는 RNA 중합효소, 바람직하게는 DNA-의존적 DNA 중합효소에 대한 주형일 수 있으며, 선택적으로 DNA 중합효소는 DNA 중합효소 I이다.
미생물의 핵산 변형 활성에 대한 기질로서 작용하는 적합한 핵산 분자가 국제공개 WO2011/130584호, 국제공개 WO2010/119270호, 및 국제공개 WO2009/007719호(이의 관련 개시내용은 인용되어 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 포스파타제 활성의 경우, 적합한 핵산 분자가 국제공개 WO2006/123154호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 인용되어 본원에 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 방법에서 사용되는 (기질) 핵산 분자는 적어도 부분적으로 이중 가닥이며 상보적 가닥에 우라실 잔기를 포함하고 변형된 핵산 분자의 부재 또는 존재를 구체적으로 결정하는 단계는 상보적 가닥의 우라실 잔기를 분해하기 위해 샘플에 우라실 DNA 글리코실라제(UDG: Uracil DNA Glycosylase)를 첨가하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, (기질) 핵산 분자는 DNA 분자, 전형적으로 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 DNA 분자, 전형적으로 DNA 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, (기질) 핵산 분자는 DNA를 포함하고 부분적으로 이중 가닥이다.
일부 실시형태에서, (기질) 핵산 분자는 센스 올리고뉴클레오티드(DNA) 가닥 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(DNA) 가닥으로 이루어진 핵산을 포함하고, 2개의 가닥은 중첩되어 이중 가닥 영역을 형성하고 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥의 단일 가닥 부분은 중합효소 활성의 존재 하에 연장 생성물을 생성하기 위한 프라이머로서 작용하는 이중 가닥 영역의 센스 올리고뉴클레오티드 가닥과 함께 주형으로서 작용한다;
특정 실시형태에서, 부분적으로 이중 가닥의 (기질) 핵산 분자의 제1 가닥은 합성 뉴클레오티드(예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 포함하고(또는 이로 이루어지고) 제2(상보적) 가닥은 우라실 잔기 및, 선택적으로, 합성 뉴클레오티드(예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 포함한다(또는 이로 이루어진다). 바람직하게는, 이중 가닥 영역은 제1 및 제2(상보적) 가닥의 3' 말단 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2(상보적) 가닥은 제2 가닥의 DNA 중합효소-매개 연장을 차단하는 이의 3' 말단에 염기(예컨대 디데옥시시티딘(dideoxycytidine))를 포함한다. 이러한 부분적으로 이중 가닥의 (기질) 핵산 분자는 예컨대 Zweitzig et al., 2012(문헌[Characterization of a novel DNA polymerase activity assay enabling sensitive, quantitative and universal detection of viable microbes. Nucleic Acids Research 40, 14, e109, 1-12], 인용되어 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 바람직하게는, 이중 가닥 영역은 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 또는 적어도 25개 뉴클레오티드이며; 선택적으로, 이중 가닥 영역은 50개 이하의 뉴클레오티드이다. 제1 가닥은 비보호된(또는 표준) 뉴클레오티드를 포함하는 연장된 제1 가닥을 형성하기 위해 샘플에서 미생물의 중합효소 활성에 의해 보호되지 않은(또는 표준) dNTP를 사용하여, 본원에 기술된 바와 같이, 인큐베이션 단계 동안 연장될 수 있다. 이러한 단계는 제2 가닥을 주형으로서 사용하는 것에 의존한다(제1 가닥과 제2 가닥 사이의 상보성 영역의 상류). 인큐베이션 단계 후, 제2(상보적) 가닥은 합성 뉴클레오티드 및 비보호된 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 분자로서 연장된 제1 가닥을 남기는 샘플에 우라실 DNA 글루코실라제(UDG)를 첨가하여 분해될 수 있다. 제2 가닥의 분해 후, (기질) 핵산 분자의 연장된 제1 가닥은 증폭 단계에서 검출될 수 있다. 본 발명자들은 상기와 같은 부분적으로 이중 가닥 (기질) 핵산 분자의 사용이 샘플 중의 미생물의 검출을 향상시킨다는 것을 발견하였다.
일부 실시형태에서, 기질 핵산 분자는 뉴클레아제 활성으로부터 보호하기 위해 사전 변형되며, 즉 핵산 분자는 분석에 첨가되기 전에 뉴클레아제 활성으로부터 보호하도록 변형된다. 본 발명자들은 본 발명의 분석과 관련하여 뉴클레아제 활성으로부터 기질 핵산 분자를 보호하는 것이 유리하다고 판단하였다. 보다 구체적으로, 보호된 핵산 분자를 본 발명의 방법에 포함시키면 검출 감도가 향상된다. 핵산 분자를 뉴클레아제 활성으로부터 보호하기 위해 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 핵산 분자에 메틸화의 통합, 3' 및/또는 5' 말단의 보호와 같은 말단 변형, 및 합성 뉴클레오티드의 통합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 합성 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 및/또는 잠금(locked) 핵산 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 합성 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 합성 뉴클레오티드는 핵산 분자에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 내지 전체 뉴클레오티드를 대체한다.
(기질) 핵산 분자는 (새로운 검출가능한) 핵산 분자를 생성하기 위해 핵산 변형 활성에 의해 작용할 수 있는 임의의 천연 핵산 및 천연 또는 합성 유사체를 포함할 수 있다. 기질은 특정 실시형태에서 연장 및/또는 결찰될 수 있다. 핵산 기질 분자의 조합은 일부 실시형태에서 중합효소 및 리가제 활성을 검출 하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 기질은 샘플에서 핵산 변형 활성(미생물에 의해 제공됨)에 비해 과량으로, 특히 큰 몰 과량으로 존재할 수 있다. 새로운 연장 또는 결찰된 핵산 분자가 검출되기 때문에, 샘플에서 이러한 분자의 존재만이 검출 방법이 효과적으로 작동하는 데 필수적이다. 따라서, 다른 핵산 분자가 예를 들어 검출될 미생물 또는 포유동물 또는 예를 들어 시험될 샘플에서 발견될 수 있는 다른 공급원으로부터 샘플에 존재하는 경우 본 발명의 방법에 해가 되지 않는다.
본 발명자들은 이전에 그들의 방법과 관련하여 내부 양성 대조군(IPC: internal positive control) 분자의 사용을 조사하였다. 따라서, 모든 양태에 따르면, 본 발명은 IPC 분자를 포함하는 것에 의존할 수 있다. 일부 실시형태에서, IPC는 IPC가 동일한 조건에 노출되도록 기질 핵산 분자와 함께 포함된다. 일부 실시형태에서, IPC 분자는 뉴클레아제 활성으로부터 보호하도록 사전 변형된다, 즉, 핵산 분자는 분석에 첨가되기 전에 뉴클레아제 활성으로부터 보호되도록 변형된다. 본 발명자들은 본 발명의 분석과 관련하여 뉴클레아제 활성으로부터 IPC 분자를 보호하는 것이 유리하다고 판단하였다. 핵산 분자를 뉴클레아제 활성으로부터 보호하기 위해 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 핵산 분자에 메틸화의 통합, 3' 및/또는 5' 말단의 보호와 같은 말단 변형, 및 합성 뉴클레오티드의 통합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 합성 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 및/또는 잠금 핵산 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 합성 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 합성 뉴클레오티드는 IPC 분자에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 내지 전체 뉴클레오티드를 대체한다. 바람직하게는, 기질 및 IPC 분자는 본 발명의 분석에서 유사하게 거동하는 것이 유리하므로 동일한 방식으로 변형된다.
일부 실시형태에서, 내부 양성 대조군(IPC) 핵산 분자는 기질 핵산 분자에 대한 동일한 프라이머 결합 부위를 포함하여 핵산 분자 및 IPC 둘 다를 함유하는 핵산 증폭 반응에서 프라이머 결합에 대한 경쟁이 존재하도록 한다.
본 발명의 모든 방법에서 변형된 핵산 분자의 부재 또는 존재를 구체적으로 결정하는 단계는 핵산 증폭 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 방법을 최대한 민감하게 만드는 역할을 한다. 이러한 증폭 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, PCR, NASBA(문헌[Compton, 1991]), 3SR(문헌[Fahy et al., 1991]), 회전 환 복제(rolling circle replication), 전사 매개 증폭(TMA: transcription mediated amplification), 가닥 치환 증폭(SDA: strand displacement amplification) 문헌[Clinical Chemistry 45: 777-784, 1999], 미국특허 US6261846호(본원에 인용되어 포함됨)에 기술된 DNA 올리고머 자가-조립 공정, 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction)(문헌[Barringer et al., 1990]), 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(미국특허 US6410276호), 임의의 프라이밍된 PCR(국제공개 WO 90/06995호), 공통 서열 프라이밍된 PCR(미국특허 US4437975호), 인베이더 기술(invader technology), 가닥 변위 기술 및 닉 변위 증폭(nick displacement amplification)(국제공개 WO 2004/067726호)와 같은 방법을 포함한다. 상기 목록은 전체 목록이 아니다. 적절한 핵산 산물이 특이적으로 증폭된다면 임의의 핵산 증폭 기술이 사용될 수 있다.
유사하게, 서열분석 기반 방법론은 일부 실시형태에서 차세대 서열분석 플랫폼, 예컨대 클론 증폭 서열 합성에 의한 서열분석(Illumina), 피로시퀀싱(pyrosequencing), 454 서열분석(Roche), 나노포어 서열분석(예컨대 Oxford Nanopore), 이온 토렌트(ThermoFisher), 및 단일 분자 실시간(SMRT: single molecule real-time) 서열분석(Pacific Biosystems)의 범위 중 임의의 범위를 포함하기 위해 사용될 수 있다. 새로운 핵산 분자가 생성된다는 사실은 서열분석 접근법이 변형된 핵산 분자의 존재 여부를 확인할 수 있고 또한 해당 분자의 정량화를 제공할 수 있음을 의미한다.
증폭은 검출될 변형된 핵산 분자의 서열에 특이적인 증폭 프라이머를 사용하여 달성된다. 핵산 분자에 대한 특이성을 제공하기 위해 서열의 적합한 영역에 상응하는 프라이머 결합 부위가 선택될 수 있다. 숙련된 독자는 핵산 분자가 샘플에서 활성을 변형함으로써 생성된 신규 핵산 분자의 검출에 필요한 프라이머 결합 부위 이외의 서열을 또한 포함할 수 있음을 이해할 것이며, 예컨대 RNA 중합효소 결합 부위 또는 프로모터 서열이 등온 증폭 기술, 예컨대 NASBA, 3SR, 및 TMA에 필요할 수 있음을 이해할 것이다.
하나 이상의 프라이머 결합 부위는 기질 핵산 분자의 결찰/연장 경계를 연결하여 예를 들어 결찰/연장이 발생한 경우에만 증폭 산물이 생성되도록 할 수 있다. 대안적으로, 프라이머는 결찰/연장 경계의 양쪽 중 어느 하나에 결합할 수 있고 결찰/연장된 핵산 분자가 형성되는 경우에만 증폭 산물이 (기하급수적으로) 생성되도록 경계를 가로질러 직접 증폭할 수 있다. 프라이머 및 기질 핵산 분자는 비특이적인 증폭(예컨대 샘플의 게놈 DNA)을 방지하도록 설계될 수 있다.
프라이머는 합성 뉴클레오티드 유사체를 적절하게 포함할 수 있거나, 예를 들어 RNA 또는 PNA 기반, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 프라이머는 사용된 검출 방식에 따라 형광 표지 및/또는 FRET 쌍과 같이 표지될 수 있다.
프로브가 사용될 수 있으며, 원하는 대로 표지될 수 있다. 검출 방법은 프라이머에 추가로 또는 프라이머에 대한 대안으로 뉴클레오티드 프로브의 사용을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 사용을 필요로 하지 않는 분지형 DNA 분석이 일부 실시형태에서 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 미생물의 존재를 나타내는 기질 핵산 분자의 핵산-변형 활성의 작용의 직접적인 결과로서 생성된 변형된 핵산 분자를 검출하기 위해 핵산 증폭 기술을 사용하여 수행된다. 특정 실시형태에서 사용된 기술은 PCR, NASBA, 3SR, TMA, SDA, 및 DNA 올리고머 자가-조립으로부터 선택된다.
증폭 산물의 검출은 예를 들어 겔 전기영동과 같은 일상적인 방법에 의해 수행될 수 있지만, 일부 실시형태에서는 실시간 또는 종점 검출 방법을 사용하여 수행된다.
증폭 반응 생성물의 실시간 또는 종점 검출을 위한 다수의 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이는 삽입(intercalating) 형광 염료 예컨대 SYBR Green I(문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third edition])의 사용을 포함하며, 이는 생성된 형광의 양에 따라 증폭된 DNA의 수율을 추정할 수 있게 한다. 다수의 실시간 검출 방법은 지속적으로 모니터링될 수 있는 형광 판독값을 생성하며; 특정 예는 분자 비콘(molecular beacon) 및 형광 공명 에너지 전달 프로브를 포함한다. 실시간 및 종점 기술은 반응을 "단일 튜브"로 유지하기 때문에 유리하다. 즉, 결과를 얻기 위해 다운스트림 분석이 필요하지 않으므로 결과를 더 빨리 수득할 수 있다. 또한 "단일 튜브" 환경에서 반응을 유지하는 하면 교차 오염의 위험이 감소되고 본 발명의 방법으로부터 정량적 출력이 가능케 된다. 이는 건강 및 안전 문제가 가장 중요할 수 있는(예컨대 환자 샘플에서 잠재적인 미생물 감염을 검출하는 경우와 같이) 본 발명과 관련하여 특히 중요할 수 있다.
PCR 반응의 실시간 및 종점 정량은 TaqMan® 시스템(Applied Biosystems), 문헌[Holland et al] 참조; Thermus aquaticus DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 활용하여 특정 중합효소 연쇄 반응 생성물의 검출; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280 (1991), Gelmini et al]. C-Erb-2 종양유전자 증폭을 측정하기 위한 형광 프로브를 사용한 정량적 중합효소 연쇄 반응-기반 균질 분석. 문헌[Clin. Chem. 43, 752-758 (1997)], 및 문헌[Livak et al. Towards fully automated genome wide polymorphism screening. Nat. Genet. 9, 341-342 (19995)](인용되어 본원에 포함됨)을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 일반적으로 가수분해 프로브로 지칭될 수 있다. 실시간 또는 종점 검출에 사용하기에 적합한 가수분해/Taqman 프로브가 또한 제공된다. 프로브는 예를 들어 아래에 상세히 설명된 표지를 사용하여 적절하게 표지될 수 있다.
분자 비콘 시스템에 대해서는, 문헌[Tyagi & Kramer. Molecular beacons - probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14, 303-308 (1996)] 및 문헌[Tyagi et al. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16, 49-53 (1998)](인용되어 본원에 포함됨)을 참조하며, 비콘은 표적에 결합될 때 형광이 복원되는 내부 켄칭된 형광단을 갖는 헤어핀 모양(hairpin-shaped)의 프로브이다. 이러한 프로브는 헤어핀 프로브라고 지칭될 수 있다.
본 발명의 방법에 포함될 수 있는 추가 실시간 형광 기반 시스템은 Scorpion 시스템이며, 문헌[Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence by Whitcombe et al. Nature Biotechnology 17, 804 - 807 (01 Aug 1999)]을 참조한다. 당업자에게 잘 알려져 있고 상업적으로 이용 가능한 추가적인 실시간 또는 종점 검출 기술은 Lightcycler® 기술, Amplifluour® 프라이머 기술, DzyNA 프라이머(문헌[Todd et al., Clinical Chemistry 46:5, 625-630 (2000)]), 또는 PlexorTM qPCR 및 qRT-PCR 시스템을 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가 양태에서 핵산 증폭의 생성물은 실시간 또는 종점 기술을 사용하여 검출된다. 본 발명의 특정 실시형태에서 실시간 기술은 가수분해 프로브(Taqman® 시스템), FRET 프로브(Lightcycler® 시스템), 헤어핀 프라이머(Amplifluour® 시스템), 헤어핀 프로브(Molecular beacons 시스템), 프라이머에 통합된 헤어핀 프로브(Scorpion® 프로브 시스템), DNAzyme과 절단 가능한 형광 DNAzyme 기질(DzYNA)의 상보적 서열을 통합한 프라이머, Plexor qPCR, 및 올리고뉴클레오티드 차단 시스템 중 임의의 하나를 사용하는 것으로 구성된다.
증폭 산물은 정량화되어 샘플에서 미생물 핵산 변형 활성에 대한 근사치를 제공하며 따라서 샘플 중의 미생물 수준을 제공할 수 있다. 따라서 "부재 또는 존재"는 샘플 중의 미생물 수준의 정량화를 포함하도록 의도된다.
본 발명자들은 또한 미생물의 핵산 변형 활성을 측정하기 위한 최적의 온도가 미생물의 용해를 위한 최적의 온도와 동일하지 않을 수 있음을 발견하였다. 따라서, 일부 실시형태에서, 미생물의 용해는 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 함께 용해물을 인큐베이션하는 단계보다 더 낮은 온도에서 수행된다. 이미 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태에서, 기질 핵산 분자는 미생물을 용해시키기 위해 사용되는 용해 시약에 포함된다. 이러한 실시형태는 상이한 온도 선호도와 일치한다. 따라서, 기질 핵산 분자가 용해 시약에 포함될 수 있다 하더라도, 초기 저온은 미생물로부터 방출된 핵산 변형 활성에 의해 기질이 변형되는 고온에서의 후속 인큐베이션에 악영향을 미치지 않는다. 따라서, 일부 실시형태에서 상기 방법은 미생물의 용해 단계를 포함하며 여기서 용해 시약은 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 함유한다. 이러한 단계는 용해물을 기질 핵산 분자와 함께 인큐베이션하여 미생물에서 방출된 효소의 활성을 활성화시키는 후속 단계보다 낮은 온도에서 수행된다. 따라서, 기질은 초기에 더 낮은 온도에 노출되고, 그 다음에는 효소 활성이 강화되는 더 높은 온도에 노출된다.
일부 실시형태에서, 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 함께 용해물을 인큐베이션하는 단계는 적어도 약 30℃의 온도에서 수행된다. 상기 온도는 선택적으로 약 30℃ 내지 40℃ 사이 또는 32℃ 내지 37℃ 사이, 예컨대 약 37℃일 수 있다.
추가의 또는 대안적인 실시형태에서, 미생물의 용해 단계는 약 30℃ 이하, 선택적으로 약 15℃ 내지 30℃ 사이 또는 약 18℃ 내지 25℃ 사이, 예컨대 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자와 용해물을 인큐베이션하기 전의 모든 단계는 약 30℃ 이하의 온도에서 수행된다. 상기 온도는 선택적으로 약 15℃ 내지 30℃ 사이 또는 약 18℃ 내지 25℃ 사이, 예컨대 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25℃에서 수행된다.
이러한 방법은 본 발명의 다양한 양태와 관련하여 설명된 실시형태 중 임의의 하나 이상 내지 모두를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 용해물을 기질 핵산 분자와 함께 인큐베이션하는 단계가 적어도 약 30℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 40℃ 사이 또는 약 32℃ 내지 37℃ 사이, 예컨대 약 37℃의 온도에서 수행되는 것을 또한 특징으로 한다.
추가의 또는 대안적 실시형태에서, 용해물을 기질 핵산 분자와 함께 인큐베이션하기 전의 각 단계는 약 30℃ 이하, 선택적으로 약 15℃ 내지 30℃ 사이, 또는 약 18℃ 내지 25℃ 사이, 예컨대 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25℃의 온도에서 수행된다.
상기 소개된 바와 같이, 입자-미생물 복합체를 형성하기 위해 샘플을 자성 입자와 함께 배양하는 단계 이전에(즉, 단계 (a) 이전에), 상기 방법은 샘플에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 단계를 포함할 수 있습니다.
샘플에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 단계는 세제와 하나 이상의 효소의 조합을 샘플에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 효소는 단백질분해효소(proteinase) 및/또는 DNA 분해효소(DNAse)를 포함할 수 있고, 선택적으로 단백질분해효소는 단백질분해효소 K이다.
샘플에 존재하는 온전한 임의의 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 단계는 샘플 중에 미생물의 존재를 잘못 표시하는 백혈구와 같은 비-미생물 세포의 효소 활성을 방지할 수 있다. 이러한 선택적인 용해는 본원에서 추가로 논의되는 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 샘플에 존재하지만 샘플 중의 미생물을 용해시키지 않는 비-미생물, 특히 포유동물 세포를 용해시키는 임의의 적합한 시약이 사용될 수 있다. 상기 시약은 비이온성 세제와 같이 계면활성제 또는 일부 실시형태에서의 세제를 포함할 수 있다. 적합한 예는 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 모노라우레이트(Tween 20)를 포함한다. 상기 시약은 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 사포닌을 포함할 수 있다. 상기 시약은 예컨대 8.5 g/l의 금속 할라이드 염, 예컨대 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 시약은 상기 3가지 성분의 혼합물을 모두 포함할 수 있다. 샘플은 샘플에 존재하는 경우 비-미생물 세포, 특히 포유동물 세포의 용해를 보장하지만 샘플에 존재하는 경우 미생물의 용해가 없는(또는 미미한) 것을 보장하기 위한 적합한 조건에서 시약과 혼합될 수 있다. 샘플은 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30분과 같이 약 5 내지 30분 사이의 기간 동안 시약에 노출될 수 있다. 이러한 단계는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 15 내지 30℃ 사이 또는 실온에서 수행될 수 있다. 비-미생물 세포의 선택적인 용해는 존재하는 실질적으로 모든 비-미생물 세포를 용해시킬 수 있다. 비-미생물 세포의 선택적인 용해는 또한 샘플에 존재하는 미생물 세포의 일부를 용균할 수 있지만 결정적으로 전부는 아니며, 특히 미생물이 취약하고/하거나 고농도의 항생제에 노출된 경우에 그러하다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 모든 양태에 따르면, 샘플에 존재하는 온전한 임의의 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해하는 것은 세제와 하나 이상의 효소의 조합을 샘플에 첨가하는 단계를 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 세제는 비-미생물 세포막을 선택적으로 투과시키는 반면, 미생물은 세포벽에 의해 보호된다. 효소는 방출된 세포내 물질 및 기타 세포 파편을 분해하는 데 유용하며 방출된 효소 활성의 이동(carryover)을 방지하는 데 기여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 효소는 단백질분해효소 및/또는 뉴클레아제를 포함한다. 적합한 단백질분해효소는 단백질분해효소 K를 포함한다. 적합한 뉴클레아제는 DNA 분해효소(DNAse)를 포함한다. 한 실시형태에서, 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키기 위해 사용되는 시약은 triton X-100과 단백질분해효소 K의 조합을 포함한다. 보다 구체적으로, 용해 시약은 0.25% Triton X-100 및 4.8 μg/mL 단백질분해효소 K를 포함할 수 있다.
비-미생물 세포가 용해되는 경우 방출되는 임의의 관련 효소 활성을 불활성화하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 효소 활성의 효과적인 불활성화를 보장하기 위해 높은 pH 조건을 이용하는 방법을 고안하였다. 미생물 세포는 전형적으로 적어도 일부 처리 기간 동안 온전하게(intact) 유지되며, 세포내 효소 활성은 높은 pH 처리에 의해 크게 악영향을 받지 않는다. 또한, 본 발명자들은 미생물 효소가 어떠한 경우에도 높은 pH 처리에 더 내성이 있음을 이전에 보여주었다.
따라서, 샘플에 존재하는 온전한 임의의 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 단계 후에, 상기 방법은 용해물을 높은 pH 조건에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 높은 pH 조건에 대한 노출 기간은 전형적으로 20분 미만이고 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5분 이하일 수 있으며 약 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리는 약 5분과 같이 약 2분 내지 15분 사이 동안 수행된다. 이러한 맥락에서 "약"은 플러스 또는 마이너스 30초를 의미한다.
높은 pH 조건을 제공하기 위해 임의의 적합한 시약이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 높은 pH 조건은 샘플을 알칼리 또는 완충제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, NaOH 또는 Na2CO3이 사용된다. 특정 실시형태에서, NaOH 또는 Na2CO3의 농도는 약 5 mM 이상이다. 완충제는 9를 초과하는 pKa 값을 가질 수 있다. 적합한 완충제의 예는 보레이트, 카보네이트, 및 피로포스페이트 완충제를 포함한다.
높은 pH 조건은 전형적으로 포유동물 세포와 같은 비-미생물 공급원으로부터 ATP-의존성 리가제 및 중합효소를 비롯한 핵산 변형 효소의 활성을 억제하지만 미생물 리가제 또는 중합효소의 활성은 억제하지 않는다. 이는 주로 비-미생물 효소만 높은 pH 조건에 노출되도록 하는 방법에 사용된 차등 용해 조건 때문이다. 그러나, 이러한 조건에 대한 미생물 효소의 저항성이 더 크기 때문일 수도 있다. "높은 pH"는 일반적으로 약 10, 11, 12, 13, 또는 14와 같이 적어도 약 10의 pH이다. "낮은 pH"는 일반적으로 약 4, 3, 2, 또는 1과 같이 약 4 이하의 pH이다. 이와 관련하여 "약"은 명시된 값의 양쪽 중 어느 하나에 있는 pH 단위의 0.5를 의미한다. 샘플의 pH를 변경하는 것은 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이 임의의 적합한 수단을 사용하여 달성될 수 있다. 중합효소 및 리가제와 같은 미생물 효소는 극한의 pH에 내성이 있을 수 있는 반면, 상응하는 포유동물 효소는 동일한 pH 조건에서 불활성화될 수 있다. 이는 포유동물 세포와 미생물 세포 둘 모두를 함유하는 샘플에서 미생물 효소 활성의 선택적인 검출을 돕는다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포로부터의 ATP-의존성 리가제와 같은 비-미생물 핵산 변형 활성의 활성을 억제하지만 미생물 리가제와 같은 핵산 변형 활성의 미생물 공급원의 활성을 억제하지 않는 조건은 샘플을 소듐 히드록시드(NaOH) 또는 소듐 카보네이트(Na2CO3)로 처리하는 단계를 포함한다. 이러한 제제는 본원에 제시된 바와 같이 샘플의 pH를 높은 pH로 증가시켜 미생물(진균 및 박테리아) 효소의 활성을 유지하면서 비-미생물 효소 활성을 불활성화시키기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 적절한 제제의 적합한 농도 및 부피가 당업자에 의해 적용될 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서, NaOH는 적어도 약 5 mM NaOH이다. 일부 실시형태에서, 알칼리 농도는 10 mM 이하, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mM이다.
추가 실시형태에서, pH는 약 12 정도이며, 이는 포유동물 핵산 변형 활성(예컨대 중합효소 및/또는 ATP-의존성 리가제 활성)을 불활성화하지만 미생물 핵산 변형 활성(예컨대 중합효소 및/또는 리가제 활성)은 불활성화 하지 않는다. 특정 실시형태에서, pH 조건은 적어도 약 11, 또는 적어도 11.2로 증가될 수 있다. 이러한 처리는 특정 기간 후에 샘플 중의 미생물을 용해시켜 샘플 내로 핵산 변형 활성(예컨대 중합효소 및/또는 리가제)을 방출할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 미생물의 용해는 높은 pH 처리에 의해 달성된다. 이를 통해 별도의 용해 단계 없이도 미생물에서 유래한 샘플에서 핵산 변형 활성(예컨대 중합효소 및/또는 리가제)을 검출할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 포유동물 리가제(예컨대 혈액 ATP-의존적 리가제)는 불활성화된다. 그러나, 전형적으로 상기 방법은 본원에서 더 상세히 논의된 바와 같이 샘플 중의 미생물을 용해시키기 위한 별도의 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 높은 pH 조건 하에서의 처리는 pH를 낮추기 위한 시약을 첨가함으로써 중단된다. 이는 미생물이 용해되기 전에 수행된다. 적합한 시약은 완충액 및/또는 산을 포함한다. 따라서, 중화 완충액을 첨가하여 pH를 낮출 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충제는 Tris-HCl 완충제(예를 들어, pH 7.2 또는 8)를 포함한다. pH를 낮추기 위한 다른 적합한 제제는 염산(HCl) 및 황산(H2SO4)과 같은 산을 포함한다. 이들 (및 기타) 산은 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이 완충액에 혼입될 수 있다. pH가 상승한 후 샘플을 처리하는 데 유용한 한 가지 특정 시약은 암모늄 설페이트, 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트, 포타슘 클로라이드와 Tris-HCl의 조합을 포함한다. 보다 구체적으로, 시약은 10 mM 암모늄 설페이트, 2 mM 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트, 10 mM 포타슘 클로라이드, 및 20 mM Tris-HCl [pH 8.0]을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 잠재적으로 초기 진단을 확인하는 방법으로서 임의의 이미 이용 가능한 진단 기술을 보완하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 빠르고 편리한 진단 수단을 제공하기 때문에, 상기 방법은 그 자체로 예비 진단 방법으로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 이의 고유의 민감도로 인해 최소한의 샘플만 필요로 하므로, 불필요한 침습적 수술을 방지할 수 있다. 또한, 크지만 농축되지 않은 샘플도 본 발명의 방법에 따라 효과적으로 시험될 수 있다.
본 발명의 방법은 일단 미생물의 양성 존재가 샘플에서 검출되면, 감염의 성질을 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 방법이 이러한 추가 식별 단계에 사용될 수 있다.
조성물 및 키트
본 발명의 방법을 수행하는 과정에서 새로운 조성물(성분의 조합)이 생성된다. 본 발명(특히 방법)의 다른 양태와 관련하여 기술된 모든 양태 및 실시형태는 필요한 수정을 가하여 관련 조성물에 적용한다.
따라서, 본 발명은 a) 항균제 및 생존 미생물을 함유하는 샘플; 및 b) 샘플 중의 생존 미생물과 함께 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 항균제 및 코팅된 입자와 복합된 생존 미생물을 함유하는 샘플을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물에서, 샘플은 본원에 정의된 바와 같다. 따라서, 생존 미생물 세포를 함유하는 샘플은 비-미생물 세포를 추가로 포함할 수 있다. 비-미생물 세포는 혈액 세포를 포함할 수 있다. 혈액 세포는 적혈구 및/또는 백혈구 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명(특히 방법)의 다른 양태와 관련하여 기술된 모든 양태 및 실시형태는 필요한 수정을 가하여 관련 키트에 적용한다.
본 발명은 a) 생존 미생물과 함께 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 함유하는 용기; b) 코팅된 입자를 사용하여 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하기에 적합한 배지를 함유하지만 항균제 및/또는 항균제에 결합할 수 있는 제제를 함유하지 않는 용기; 및/또는 c) 샘플에서 회수된 코팅된 입자를 세척하기 위한 세척 완충액을 함유하는 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 세척 완충액은 생존 미생물을 용해시키지 않는다.
키트에서, 성분 a), b), 및 c)는 별도의 용기에 있을 수 있다. 본 발명의 키트에 포함된 용기는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 관련 시약을 위한 임의의 적합한 용기일 수 있다. 전형적으로, 용기는 본 발명의 방법을 한번 수행하기에 충분한 양 또는 농도의 시약을 함유한다. 따라서, 키트는 일회용 키트일 수 있다. 생존 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 함유하는 용기(vessel)는 코팅된 입자를 함유하기에 적합한 재료 및 부피의 용기(container)이다. 일부 실시형태에서, 용기는 또한 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하기에 적합한 재료 및 부피의 용기이다. 이는 상기 방법을 시작하기 위해 코팅된 입자를 함유하는 용기에 샘플이 단순히 첨가될 수 있음을 의미한다. 배지를 함유하는 용기는 배지를 함유하기에 적합한 재료 및 부피의 용기이다. 일부 실시형태에서, 용기는 또한 회수된 생존 미생물을 특히 입자-미생물 복합체 형태로 부가적으로 함유하기 위한 재료 및 부피의 용기이다. 따라서, 배지를 함유하는 용기는 입자-미생물 복합체를 인큐베이션하거나 배양하기에 적합할 수 있다. 대안적으로, 배지는 이미 입자-미생물 복합체를 함유하는 또 다른 용기(전형적으로 더 큰 부피)에 첨가될 수 있다. 세척 완충액을 함유하는 용기는 세척 완충액을 함유하기에 적합한 재료 및 부피의 용기이다. 전형적으로, 세척 완충액은 별도의 용기에 함유된 입자 미생물 복합체를 세척하기 위해 사용된다. 따라서, 세척 완충액은 세척 완충액만을 함유하도록 설계된 용기에 제공될 수 있다. 다중(예컨대 2 또는 3회) 세척이 필요한 경우 키트는 단일 세척을 위한 적절한 양의 세척 완충액을 각각 함유하는 여러 개의 개별 용기를 함유할 수 있다. 대안적으로, 다중(예컨대 2 또는 3회) 세척에 충분한 세척 완충액을 함유하는 단일 용기가 제공될 수 있다.
적합한 세척 완충액이 본원에 기술되어 있다. 키트에서, 세척 완충액은 세제가 없을 수 있다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 Tris 및/또는 소듐 클로라이드를 포함한다(적합한 농도가 본원의 실시예에 기술되어 있다). 전형적으로, 세척 완충액은 세착 단계에서 비-미생물 세포를 제거하기 위해 사용되며 따라서 세척 완충액은 비-미생물 세포를 용해시키지 않는다.
키트에 포함된 모든 추가 수단은 적절하게 하나 이상의 용기에 함유될 수 있다.
키트는 회수된 생존 미생물의 검출 및/또는 특성분석하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있으며 이는 생존 미생물의 검출 및/또는 특성분석에 필요한 완전한 시약 세트를 나타낼 수 있다.
특정 실시형태에서, 검출 수단은 미생물의 핵산 변형 활성에 대한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 포함하거나 그러한 핵산 분자이다. 입자 DNA 올리고뉴클레오티드 기질 분자 중의 적합한 기질 분자가 본원에 기술되어 있으며 이러한 논의는 필요한 부분만 수정하여 적용된다.
일부 실시형태에서, 검출 수단은 핵산 증폭을 위한 시약을 포함하거나 추가로 포함한다. 핵산 증폭을 위한 시약은 프라이머 쌍 및/또는 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 프라이머 및/또는 프로브는 미생물 핵산 분자와 혼성된다. 이는 따라서 증폭된 미생물 핵산 분자를 검출함으로써 샘플 중의 미생물의 검출을 허용할 수 있다. 대안적으로, 프라이머 또는 프로브는 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자에 혼성된다. 이러한 핵산 분자는 본원에서 추가로 상세히 기술된다.
키트는 a) 미생물과 (선택적으로) 복합체(즉, 입자-미생물 복합체)를 형성할 수 있는 코팅된 입자; 및 b) 입자-미생물 복합체 중의 미생물의 부재 또는 존재를 검출하기 위한 검출 수단을 포함할 수 있다. 검출 수단은 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 적어도 부분적으로 이중 가닥일 수 있고, 선택적으로 상보적 가닥에 우라실 잔기를 포함할 수 있다. 상보적 가닥은 제2 가닥의 DNA 중합효소-매개 확장을 차단하는 염기(예컨대 디데옥시시티딘)를 이의 3' 말단에 포함할 수 있다. 핵산 분자는 본원에 기술된 임의의 핵산 분자일 수 있다.
따라서, 키트는 a) 생존 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자; 또는 b) 생존 미생물 유래의 (추출된) 핵산에 특이적으로 혼성되는 프라이머 및/또는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 a) 생존 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 함유하는 용기 및 b) 생존 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자; 또는 생존 미생물 유래의 핵산에 특이적으로 혼성되는 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 키트를 제공한다. 하기 논의는 필요한 수정을 가하여 관련 방법에 적용한다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 생존 미생물 유래의 핵산은 DNA 분자, 예컨대 유전자, 또는 예컨대 mRNA 또는 miRNA와 같은 RNA 분자일 수 있다. 바람직한 표적은 본원에 논의된 바와 같은 ILV3과 같은 유전자이다. 다른 바람직한 표적은 시가(Shiga) 독소(예컨대 장출혈성 E. 콜리 감염에서)를 코딩하는 것과 같은 병원성 유전자이다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자가 본원의 다른 곳에서 설명된다. 적합한 기질이 본원에서 추가로 상세히 논의되어 있다. "기질"은 미생물-유도된 효소에 의해 (직접적으로) 작용하는 핵산 분자를 의미한다. 전형적으로, 이러한 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 기질이다. 이는 합성 핵산 분자이다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 생존 미생물 유래의 핵산에 특이적으로 혼성되는 프라이머 및/또는 프로브는 박테리아 또는 진균이 샘플 중에 존재하는지 여부 및/또는 박테리아 또는 진균이 항생제 저항성 유전자를 갖고 있는지 여부의 결정을 가능케 한다. 키트는 미생물의 검출 및/또는 특성분석을 위한 다수의 프라이머 쌍 및/또는 다수의 프로브를 포함할 수 있다. 다수의 프라이머 쌍 및/또는 다수의 프로브는 박테리아 및 진균의 검출 및/또는 특성분석을 가능케 한다. 프라이머 및/또는 프로브는 샘플 중에 존재하는 미생물의 속 및/또는 종의 식별을 가능케 할 수 있다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, "특이적으로 혼성된다", 또는 동등한 언어는 프라이머가 표적 핵산에 혼성되지만 다른 핵산에는 혼성(또는 교차-반응)되지 않음을 의미한다. 프라이머 및/또는 프로브는 유전자 내의 특정 하위-영역에 혼성될 수 있다. 프라이머 및/또는 프로브는 미생물의 속을 식별할 수 있도록 동일한 속의 여러 종의 동일한 유전자에 특이적으로 혼성될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및/또는 프로브는 미생물의 종을 식별할 수 있도록 미생물의 단일 종의 유전자에 특이적으로 혼성될 수 있다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 국제공개 WO2018189502호(인용되어 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이, ILV3 유전자는 인간 게놈과의 서열 동일성의 결여로 인해 샘플 중에 진균 또는 효모가 존재하는지 여부를 검출하는데 특히 유용하다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 진균/효모의 검출 또는 특성분석을 위해, 프라이머는 다음을 포함할 수 있다:
a. 다음의 칸디다(Candida) 종의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고
i 칸디다 알비칸스(Candida albicans)
ii. 칸디다 듀블리니엔시스 (Candida dubliniensis)
iii. 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)
iv. 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis)
v. 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)
vi. 칸디다 크루세이(Candida krusei)
vii. 칸디다 구일리엘몬디이(Candida guilliermondii)
viii. 칸디다 아우리스(Candida auris)
각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
b. 다음의 아스퍼질러스(Aspergillus) 종의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고
i. 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)
ii. 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)
iii. 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)
각각 SEQ ID NO: 70 및 71 또는 SEQ ID NO: 73 및 74의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
c. 칸디다 알비칸스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 4 및 5 또는 SEQ ID NO: 6 및 7의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
d. 칸디다 듀블리니엔시스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, SEQ ID NO: 10 및 11, 또는 SEQ ID NO: 12 및 13의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
e. 칸디다 트로피칼리스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 14 및 15 또는 SEQ ID NO: 16 및 17의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
f. 칸디다 파라프실로시스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 18 및 19 또는 SEQ ID NO: 20 및 21의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
g. 칸디다 글라브라타의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 22 및 23, SEQ ID NO: 24 및 25, SEQ ID NO: 26 및 27, 또는 SEQ ID NO: 28 및 29의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
h. 칸디다 크루세이의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 30 및 31, SEQ ID NO: 32 및 33, SEQ ID NO: 34 및 35, SEQ ID NO: 36 및 37, 또는 SEQ ID NO: 38 및 39의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
i. 칸디다 구일리엘몬디이의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 40 및 41, SEQ ID NO: 42 및 43, SEQ ID NO: 44 및 45, 또는 SEQ ID NO: 46 및 47의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
j. 칸디다 아우리스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 48 및 49, SEQ ID NO: 50 및 51, SEQ ID NO: 52 및 53, SEQ ID NO: 54 및 55, SEQ ID NO: 56 및 57, SEQ ID NO: 58 및 59, SEQ ID NO: 60 및 61, SEQ ID NO: 62 및 63, SEQ ID NO: 64 및 65, SEQ ID NO: 66 및 67, 또는 SEQ ID NO: 68 및 69의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
k. 아스퍼질러스 푸미가투스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 76 및 77, SEQ ID NO: 79 및 80, SEQ ID NO: 82 및 80, 또는 SEQ ID NO: 83 및 84의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
l. 아스퍼질러스 니게르의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 87 및 86의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머;
m. 아스퍼질러스 플라버스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 90 및 89 또는 SEQ ID NO: 90 및 92의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머; 및/또는
n. 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 각각 SEQ ID NO: 93 및 94, SEQ ID NO: 96 및 97, SEQ ID NO: 99 및 100, SEQ ID NO: 102 및 103, 또는 SEQ ID NO: 105 및 106의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 정방향 및 역방향 프라이머.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 진균/효모의 검출 또는 특성분석을 위해, 프로브는 다음을 포함할 수 있다:
a. 다음의 칸디다 종의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고
i. 칸디다 알비칸스
ii. 칸디다 듀블리니엔시스
iii. 칸디다 트로피칼리스
iv. 칸디다 파라프실로시스
v. 칸디다 글라브라타
vi. 칸디다 크루세이
vii. 칸디다 구일리엘몬디이
viii. 칸디다 아우리스
SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
b. 칸디다 알비칸스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 116 또는 117의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
c. 칸디다 듀블리니엔시스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 118, 119, 또는 120의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
d. 칸디다 트로피칼리스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 121의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
e. 칸디다 파라프실로시스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 122 또는 123의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
f. 칸디다 글라브라타의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 124, 125, 126, 또는 127의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
g. 칸디다 크루세이의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 128, 129, 130, 131, 또는 132의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
h. 칸디다 구일리엘몬디이의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 133, 134, 또는 135의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
i. 칸디다 아우리스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 또는 146의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
j. 다음의 아스퍼질러스 종의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고
i. 아스퍼질러스 푸미가투스
ii. 아스퍼질러스 니게르
iii. 아스퍼질러스 플라버스
SEQ ID NO: 72 또는 75의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
k. 아스퍼질러스 푸미가투스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 78, 81, 또는 85의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
l. 아스퍼질러스 니게르의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 88의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브
m. 아스퍼질러스 플라버스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 91의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브; 및/또는
n. 크립토코커스 네오포만스의 ILV3 유전자에 특이적으로 혼성되고 SEQ ID NO: 95, 98, 101, 104, 또는 107의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어져 있거나, 이로 이루어지는 프로브.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 박테리아의 검출 및/또는 특성분석을 위해, 프라이머 및 프로브는 박테리아 DNA의 16S 영역의 특정 부분에 특이적으로 혼성될 수 있다. 프라이머는 박테리아 DNA의 16S 영역의 특정 부분을 증폭할 수 있다. 프라이머 PLK1(5-TACGGGAGGCAGCAGT-3 - SEQ ID NO: 108) 및 PLK2(5-TATTACCGC GGCTGCT-3 - SEQ ID NO: 109)는 상이한 진균 군에서 잘 보존되어 있다. 187-bp 단편은 이러한 프라이머에 의해 합성된다. PLK2는 내부적으로 플루오레세인(fluorescein)으로 표지될 수 있다. 프로브는 그람-음성 박테리아와 그람-양성 박테리아를 구별할 수 있다. 형광 염료가 표지된 혼성화 프로브 ISN2(5-CCGCAGAATAAG CACCGGCTAACTCCGT-3 - SEQ ID NO: 110) 및 ISP2(5-CCT AAC CAG AAA GCC ACG GCT AAC TAC GTG-3 - SEQ ID NO: 111)는 상이한 파장(640 및 705 nm)에서 빛을 방출하며 형광 신호에 의해 박테리아 DNA의 검출 및 그람 염색 감별에 사용될 수 있다. 다른 적합한 프라이머는 뉴클레오티드 서열 CAACGCGAAGAACCTTACC(SEQ ID NO: 112) 및 ACGTCATCCCCACCTTCC(SEQ ID NO: 113)를 포함할 수 있다. 적합한 그람-양성 프로브는 뉴클레오티드 서열 5'-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3'(SEQ ID NO: 114)을 포함한다. 적합한 그람-음성 프로브는 뉴클레오티드 서열 5'-HEX-ACGACAGCCATGCAGCACCT-TAMRA'3(SEQ ID NO: 115)을 포함한다. 이러한 프로브는 차별적 검출을 허용하기 위해 상이하게 표지되지만, 본원에 기술된 바와 같은 대안적 접근법이 검출을 용이하게 하기 위해 채택될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
따라서, 키트는 a) 생존 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 함유하는 용기 및 b) 생존 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자; 또는 효모에서 ILV3 유전자 및/또는 박테리아의 16S rRNA 유전자에 특이적으로 혼성되는 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있다.
키트는 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
키트는 i) 소듐 폴리아네톨 설포네이트; 및 ii) 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 적어도 하나의 시약을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 시약은 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 추가로 논의된다. 본원에 제시된 바와 같이, 소듐 폴리아네톨 설포네이트은 비-미생물 세포를 함유하는 샘플로부터 미생물의 회수에 유용하다.
키트는 i) 소듐 폴리아네톨 설포네이트; 및 ii) 세제를 추가로 포함할 수 있다. 세제는 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약의 예이다.
용해에 대한 항균제-노출 미생물의 민감성이 증가된 점에서, 일부 실시형태에서 키트는 비-미생물 세포를 선택적으로 용해하는 시약을 포함하지 않을 수 있다. 코팅된 입자는 미생물에 우선적으로 결합하기 때문에 샘플에서 비-미생물을 용해시키기 위한 절대적인 요구사항은 없다. 그러나, 입자-미생물 복합체로부터 비-미생물 세포(전형적으로 온전한 비-미생물 세포) 및/또는 세포 용해물을 제거하기 위해 하나 이상의 세척 단계를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 임의의 적합한 세척액이 사용될 수 있으며, 예는 본원에서 논의된다.
키트는 a) 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 입자; b) 소듐 폴리아네톨 설포네이트; c) 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 적어도 하나의 시약; 및 d) 입자-미생물 복합체에서 미생물의 부재 또는 존재를 검출하기 위한 검출 수단을 포함할 수 있으며, 상기 검출 수단은 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 적어도 부분적으로 이중 가닥이고 상보적 가닥에 우라실 잔기를 포함한다.
(기질) 핵산 분자는 핵산 변형 효소가 DNA 또는 RNA 중합효소, 바람직하게는 DNA-의존적 DNA 중합 효소를 포함하는 것을 기반으로 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 DNA 중합효소 I이다. 추가의 또는 대안적인 실시형태에서, 핵산 변형 효소는 리가제, 예컨대 ATP- 또는 NAD-의존적 리가제를 포함한다.
검출 수단은 핵산 증폭용 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 핵산 증폭용 시약은 프라이머 쌍 및/또는 핵산 분자와 혼성화하는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
키트는 입자-미생물 복합체 중의 미생물을 용해시킬 수 있는 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 입자-미생물 복합체 중의 미생물을 용해시킬 수 있는 시약은 미생물의 핵산 변형 활성을 위한 기질로서 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 적합한 예는 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 폴리에틸렌 글리콜 솔비탄 모노라우레이트(Tween 20)를 포함한다. 시약은 예컨대 1 내지 5% w/v, 바람직하게는 약 1%의 사포닌을 포함할 수 있다.
키트는 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하면서 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시키는 시약은 하나 이상의 효소를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 효소는 선택적으로 단백질분해효소 및/또는 DNA 분해효소를 포함한다. 적합한 세제 및 효소가 본원에 논의되어 있다.
키트는 높은 pH 시약 예컨대 염기 또는 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 이는 예컨대 NaOH, 예컨대 5 mM NaOH일 수 있다. 다른 적합한 시약이 본원에 기술되어 있다.
키트는 중화 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 중화 완충액은 높은 pH 처리 후 샘플의 pH를 회복시킬 수 있다. 적합한 시약이 본원에 기술되어 있다.
핵산 변형 효소는 다음을 포함할 수 있다: (a) DNA 또는 RNA 중합효소, 선택적으로 상기 DNA 중합효소는 DNA-의존적 DNA 중합효소 예컨대 DNA 중합효소 I임, 및/또는 (b) 리가제, 선택적으로 상기 리가제는 ATP- 및/또는 NAD-의존적 리가제임.
모든 양태에 적용 가능한 추가 특징
이미 언급한 바와 같이, 본 발명은 특히 임상 샘플, 특히 미생물에 감염된 것으로 의심되는 대상체에서 채취한 샘플에 적용 가능하다. 따라서, 본 발명의 모든 양태에 따르면, 샘플로부터 회수될 수 있는(그리고 검출 및/또는 특성분석될 수 있는) 미생물은 병원성 미생물, 예컨대 병원성 박테리아 또는 진균/효모일 수 있다. 박테리아 또는 진균/효모는 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에서 감염 또는 질환을 야기할 수 있는 임의의 박테리아 또는 진균/효모일 수 있다. 일 실시형태에서, 박테리아는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(및 바람직하게는 메티실린 내성 균주)를 포함하는 스타필로코커스 종, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia)를 포함하는 스트렙토코커스 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 마이코박테리움(Mycobacterium) 종, 특히 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 비브리오(Vibrio) 종, 특히 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 살모넬라(Salmonella) 및/또는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 등 중 임의의 하나 이상을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 박테리아는 클로스트리디움(Clostridium) 종 특히 특정 실시형태에서 C. 디피실(C. difficile)을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. C. 디피실은 다른 기저 질환이 있는 노인 환자에게 주로 영향을 미치는 의료 관련 장 감염인, 항생제-관련 설사 및 대장염의 주요 원인이다. 박테리아는 슈도모나스 종, 특히 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 박테리아는 클렙시엘라 종, 특히 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 진균/효모는 임의의 하나 이상의 칸디다(Candida), 아스퍼질러스, 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 및/또는 스타치보트리스(Stachybotrys) 종을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.
미생물은 본원에 기술된 바와 같은 이의 효소 활성을 통해 검출될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 항생제-함유 샘플에서 회수된 생존 미생물의 지표를 제공한다. 일정 시간 후에, 미생물이 생존할 수 없는 경우, 샘플에서 효소 활성이 손실된다. 이는 핵산 분자, 특히 DNA를 사용하는 것에 비해 샘플에서 미생물의 지표로서 효소 활성을 사용하는 이점을 나타내며, 이는 일부 실시형태에서 훨씬 더 오래 지속될 수 있다.
본 발명의 방법은 일단 미생물의 양성 존재가 샘플에서 검출되면 감염의 성질을 식별하는 단계를 수반할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이 임의의 적합한 방법이 이러한 추가 식별 단계에 대해 사용될 수 있다.
"항균제"는 미생물을 사멸시키거나 미생물의 성장을 억제하는 임의의 제제를 포함하도록 본원에서 정의된다. 항균제는 항생제 또는 항진균제일 수 있다. 항균제는 혈류 감염의 치료에서 일상적으로 사용되는 임의의 항생제일 수 있다. 대상체를 치료하기 위해 사용되는 항균제는 대상체의 임상 평가에 기초하여 간병인에 의해 선택될 것이다. 이러한 정보는 샘플에 존재할 가능성이 가장 높은 것으로 간주되는 미생물을 고려할 때 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 적합한 조건, 예컨대 적합한 선택적인 용해 조건을 선택하는데 기여할 수 있다. 예컨대, 샘플이 더 강력한 미생물을 함유할 가능성이 있는 경우, 세제는 선택적 용해를 위해 사용될 수 있다. 반면에, 샘플이 보다 민감성인 미생물을 함유할 가능성이 있는 경우, 세제는 사용되지 않을 수 있으며 대신 세척 단계가 사용될 수 있다. 항균제는 광범위한 미생물을 사멸시키거나 억제할 수 있는 광범위한 스펙트럼일 수 있다. 항생제의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 페니실린, 메로페넴, 플루클록사실린, 암피실린, 옥사실린, 피페라실린-타조박탐, 반코마이신, 테이코플라닌, 답토마이신, 티게사이클린, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 겐타마이신, 아미카신, 리네졸리드, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 시프로옥사신, 레보플록사신, 스파플록사신, 가티플록사신, 가레녹사신, 제미플록사신, 목시플록사신, 독시사이클린, TMP-SMX, 폴리믹신 B, 세포탁심, 세포테탄, 세파만돌, 세푸록심, 세프티족심, 세프타지딤, 세픽심, 세포페라존, 세페핌, 세파졸린, 세폭시틴, 및 세프트리악손. 항진균제의 비-지한적인 예는 다음을 포함한다: 플루시토신, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸, 포사코나졸, 에토코나졸, 그리세오풀빈, 암포테리신 B, 카스포펀진, 미카펀진, 및 아니둘라펀진. 이러한 제제의 투여량은 특정 제제에 따른 치료 절차의 표준에 따라 결정된다. 이는 샘플에 존재하는 항균제의 수준에 기여한다. 항균제는 샘플에 적어도 0.05, 0.5, 5, 10, 25, 50, 75, 또는 100 μg/mL 초과의 농도로 존재할 수 있다. 항균제는 샘플에 100, 250, 500, 또는 1000 μg/mL 이하(no more than or less than)의 농도로 존재할 수 있다. 항균제는 샘플에 100 μg/mL 이하(no more than or less than)의 농도로 존재할 수 있다. 항균제는 전형적으로 샘플에 0.5 내지 250 μg/mL 사이의 농도로 존재할 수 있다. 항균제는 샘플에 0.5 내지 100 μg/mL의 농도로 존재할 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 체액(특히 혈액) 샘플을 채취하기 전에 미생물 감염이 의심되는 대상체를 항균제로 치료하는 임상 환경에 적용된다. 따라서, 치료제로서 대상체에 제공되는 항균제는 샘플에서 항균제의 유일한 공급원일 수 있다(그리고 그래야만 한다). 따라서 항균제는 전형적으로 간병인(예컨대 의사 또는 간호사)에 의해 선택되고 대상체에 의해 입증되는 현재 임상 증상을 기반으로 투여된다. 따라서, 샘플 중의 미생물은 항균제에 민감할 수 있다(또는 그렇게 여겨질 수 있다).
본 발명과 관련하여 "샘플"은 진균(예컨대 효모) 및/또는 박테리아와 같은 미생물을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 것이며 또한 항균제를 함유하는 것이다. 전형적으로, 샘플은 액체 샘플이다. 따라서 샘플은 체액 샘플과 같은 임상 샘플을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 샘플 유형은 혈액이며, 전혈, 혈장, 혈청, 및 샘플, 예컨대 혈액 배양물 또는 혈액 브로쓰를 함유하는 혈액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈액, 뇌척수액(CSF: cerebral spinal fluid), 관절액, 소변, 또는 기관지폐포 세척(BAL: bronchoalveolar lavage)을 포함한다. 샘플은 항균제를 사용하여 치료를 받는 중이거나, 받아왔던 대상체에서 채취한 임상 샘플일 수 있다. 샘플은 감염된 것으로 의심되거나 감염에 대해 스크리닝된 환자 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 샘플은 0.2 내지 10 ml, 또는 1 내지 10 ml와 같은 임의의 적합한 부피일 수 있다.
사용되는 샘플은 이용 가능성, 편의성, 및 시험중인 조건과 같은 다양한 인자에 따라 달라진다. 사용될 수 있지만 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 전형적인 샘플은 환자, 가장 바람직하게는 인간 환자로부터 채취된 전혈, 혈청, 혈장, 혈소판, 관절액, 및 소변 샘플 등을 포함한다. 환자는 혈류가 감염된 것으로 의심될 수 있거나 혈류 감염에 대해 스크리닝될 수 있다. 환자는 입원 환자일 수 있다. 샘플은 혈액 1 ml당 5백만, 1천만, 또는 1500만 이상의 백혈구 세포(WBC)를 포함하는 대상체에서 채취될 수 있다.
항균제 외에, 샘플은 추후 분석을 위한 하나 이상의 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 추후 분석을 위한 하나 이상의 억제제는 혈액 세포 잔재, 헤모글로빈, 백혈구 DNA, 및 혈소판으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 미생물을 하나 이상의 미생물 성장 억제제로부터 분리한다.
의심의 여지를 없애기 위하여, 본 발명의 방법은 시험관 내 방법을 나타낸다. 이는 대상체에서 제거된 샘플에서 수행된다. 그러나, 덜 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(예비 단계로서). 대상체로부터 적합한 샘플을 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 그러나, 전형적으로, 상기 방법은 별도의 절차에서 환자로부터 이미 단리된 샘플로 시작하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 가장 바람직하게는 인간 유래의 샘플에서 수행되지만, 본 발명의 방법은 많은 동물에서 유용할 수 있다. 항균제는 수의학 및 농업 분야에서 빈번하게 사용된다.
샘플은 밀리리터당 20,000 내지 500만개 세포의 농도로 비-미생물 세포를 포함할 수 있다. 샘플은 밀리리터당 적어도 약 100,000개 세포의 농도로 비-미생물 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 밀리리터당 적어도 약 20,000개 세포의 농도로 비-미생물 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 입자는 코팅된다. 코팅은 전형적으로 중합체 코팅이다. 대안적으로, 코팅된 입자는 중합체 코팅이 결여될 수 있다. 코팅된 입자는 시트레이트, 전분, 만노스 결합 렉틴, 또는 폴리-L-리신과 같은 분자로 코팅될 수 있다. 코팅된 입자를 코팅하는 분자는 입자의 표면에 흡착되거나 입자와 아말감(amalgam)을 형성할 수 있다. 코팅된 입자는 완전히 또는 부분적으로 코팅될 수 있다.
따라서 코팅된 입자는 코팅되지 않은 입자와 구별된다. 코팅되지 않은 입자는 금속 또는 금속 화합물(예컨대 금속 산화물)로 이루어진 입자를 포함하며 표면(예컨대 시트레이트)에 다른 분자가 흡착되지 않거나 금속 또는 금속 화합물과 합병된다. 코팅된 입자는 다양한 미생물과 결합하여 입자-미생물 복합체를 형성할 수 있다. 따라서 이는 이의 미생물 특이성에서 "범-미생물(pan-microorganism)"이거나 "범용적(universal)이다. 코팅된 입자, 바람직하게는 자성 입자는 비-특이적 결합에 의해 미생물에 결합할 수 있다(항체 등과 같은 표적-특이적 리간드의 사용과 대조적으로). 코팅된 입자는 전형적으로 비-미생물 세포보다 미생물에 대해 더 큰 친화성을 갖는다.
코팅된 입자는 샘플에서 미생물을 제거함으로써 작용하는 반면, 항균제는 형성된 복합체의 (중요한) 부분을 형성하지 않는다. 따라서, 코팅된 입자는 항균제에 실질적으로 결합하지 않는다.
코팅된 입자는 전형적으로 중합체성 외부 표면을 포함한다. 중합체성 표면은 규칙적인 외부 중합체성 표면일 수 있으며, 상기 입자의 표면은 (상대적으로) 균일하게 코팅된다(일반적인 제조 허용오차 내에서). 중합체성 표면은 탄소-기반 중합체를 포함할 수 있다. 중합체성 표면은 폴리이미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌이민, 및 폴리비닐아민, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아미드, 폴리에스터, 폴리카보네이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 및 이들의 임의의 조합의 유도체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 중합체성 표면은 폴리스티렌 및/또는 폴리(스티렌/디비닐 벤젠) 또는 폴리아크릴아미드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 중합체성 표면은 폴리스티렌 및/또는 폴리(스티렌/디비닐 벤젠)을 포함한다.
중합체성 표면은 폴리디메틸실록산, 폴리이미드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌 폴리설폰, 폴리카보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리프로필렌, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 폴리실리콘, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리부타디엔, 폴리(부틸렌 테레프탈레이트), 폴리(에터 설폰), 폴리(에터 에터 케톤), 폴리(에틸렌 글리콜), 스티렌-아크릴로니트릴 수지, 폴리(트리메틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 부티랄, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 폴리(비닐 피롤리돈), 및 이들의 임의의 조합의 유도체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체성 표면은 실리콘 기재가 아니다.
특정 실시형태에서 본 발명의 모든 양태에 따르면, 코팅된 입자는 외부 표면 상에, i) 카복실산기; ii) 아미노기, iii) 소수성기; 및 iv) 스트렙타비딘 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 범용 생존 미생물의 회수에서 유용한 것으로 본 발명자들에 의해 입증되었다. 이러한 작용기는 전형적으로 중합체 코팅의 일부를 형성하며 별도의 표적화 리간드에 의해 제공되지 않는다. 따라서, i) 카복실산기, ii) 아미노기; 또는 iii) 소수성기는 일부 실시형태에서 폴리펩티드의 일부 또는 펩티드 모방체의 일부가 아닐 수 있다. 유사하게, i) 카복실산기, ii) 아미노기; 또는 iii) 소수성기는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 핵산의 일부가 아닐 수 있다. 또한 유사하게, i) 카복실산기; ii) 아미노기 또는 iii) 소수성기는 지질, 스테로이드, 호르몬, 또는 보조인자(cofactor)의 일부가 아닐 수 있다.
코팅된 입자는 자성일 수 있으며 실제로 전형적으로 자성이다. 자기 비드는 상자성(paramagnetic)이며 외부에서 인가된 자기장에 끌린다. 자기 비드는 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 코팅된 입자는 초자성(superparamagnetic)일 수 있다. 코팅된 입자는 금속 또는 금속 화합물을 포함할 수 있다. 코팅된 입자는 철 산화물을 포함할 수 있다. 철 산화물은 자철광(magnetite) 및/또는 마그헤마이트(maghemite)를 포함할 수 있다. 철 산화물은 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 또는 4 : 1 비율의 Fe2+ 및 Fe3+을 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 철 산화물은 중합체 코팅으로 캡슐화된다. 코팅된 입자는 철 산화물과 중합체의 아말감일 수 있다. 코팅된 입자는 외부 중합체 표면에 의해 부분적으로 캡슐화될 수 있지만, 이는 덜 바람직하다. 코팅된 입자는 코어와 중합체 코팅을 포함할 수 있다. 코어는 자성일 수 있다. 코팅된 입자는 시트레이트, 전분, 만노스 결합 렉틴, 또는 폴리-L-리신으로 코팅된 철 산화물을 포함할 수 있다.
코팅된 입자는 0.05 내지 20 μm 사이, 또는 0.05 내지 1 μm 사이, 예컨대 0.1 내지 0.5 μm 사이, 또는 0.2 내지 0.3 μm 사이의 직경을 가질 수 있다. 바람직하게는, 코팅된 입자는 0.2 내지 0.3 μm 사이의 직경을 가질 수 있다. 코팅된 입자는 0.1 내지 3 μm 사이 또는 0.1 내지 2 μm 사이의 직경을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 코팅된 입자는 0.1 내지 1.0 μm 사이의 직경을 갖는다.
코팅된 입자는 다음을 포함할 수 있다:
a) 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드);
b) 표면 상에 다음의 추가 기 중 하나를 갖는 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드): 카복실산, 아민, 또는 스트렙타비딘; 또는
c) 표면 상에 부착된 시트레이트, 만노스 결합 렉틴, 전분, 또는 폴리-L-리신 분자.
코팅된 입자는 자성일 수 있으며 다음을 포함한다:
a) 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드);
b) 표면 상에 다음의 추가 기 중 하나를 갖는 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드): 카복실산, 아민, 또는 스트렙타비딘; 또는
c) 표면 상에 부착된 시트레이트, 만노스 결합 렉틴, 전분, 또는 폴리-L-리신 분자.
코팅된 입자는 금속(예컨대 철) 또는 금속 화합물(예컨대 철 산화물) 및 다음을 포함할 수 있다:
a) 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드);
b) 표면 상에 다음의 추가 기 중 하나를 갖는 중합체 코팅(예컨대 폴리스티렌, 폴리(스티렌/디비닐 벤젠), 또는 폴리아크릴아미드): 카복실산, 아민, 또는 스트렙타비딘; 또는
c) 표면 상에 부착된 시트레이트, 만노스 결합 렉틴, 전분, 또는 폴리-L-리신 분자.
따라서 코팅된 입자는 외부 중합체성 표면을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코팅된 입자의 외부 표면은 (i) 항체, (ii) 탄수화물, (iii) 아포지질단백질 H 단백질로부터 유도된 펩티드, (iv) 만노스 결합 렉틴 단백질, (v) 폴리아민, 또는 (vi) 양이온성 세제 중 임의의 하나로 코팅되지 않을 수 있다. 만노스 결합 렉틴(MBL: Mannose Binding Lectin) 단백질은 MBL 기재의 유전적으로 조작된 단백질일 수 있다. 예컨대, 이는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 MBL의 병원체-결합 부위(즉. FcMBL)를 포함하는 유전적으로 조작된 단백질일 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 일부 실시형태에서 (i) 항체, (ii) 탄수화물, 또는 (iii) 선천성(innate) 면역계 단백질 중 임의의 하나로 코팅되지 않을 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 일부 실시형태에서 (i) 항체, (ii) 탄수화물, (iii) 아포지질단백질 H 단백질로부터 유도된 펩티드, (iv) 만노스 결합 렉틴, 또는 (v) 응집제(예컨대 국제 공개 WO 03/102184호에 정의된 바와 같은 응집제) 중 임의의 하나로 코팅되지 않을 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 일부 실시형태에서 (i) 항체, (ii) 탄수화물, (iii) 선천성 면역계 단백질, 또는 (iv) 응집제(예컨대 국제 공개 WO 03/102184호에 정의된 바와 같은 응집제) 중 임의의 하나로 코팅되지 않을 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 일부 실시형태에서 폴리리신 또는 폴리리신 유사 모이어티로 코팅되지 않을 수 있다.
항체는 항원-특이적 결합 기능을 보유하는 항체의 단편 또는 유도체일 수 있다. 이러한 단편 및 유도체는 Fab 단편, ScFv, 단일 도메인 항체, 나노항체, 중쇄 항체 등을 포함한다.
탄수화물은 모노사카라이드, 올리고사카라이드(예컨대 디사카라이드 또는 트리사카라이드), 폴리사카라이드, 및/또는 이들의 유도체일 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 리간드로 코팅되지 않을 수 있다. 코팅된 입자의 외부 표면은 비-특이적 리간드(예컨대 국제 공개 WO01/53525호에 기술된 바와 같은 비-특이적 리간드)로 코팅되지 않을 수 있다. 코팅된 입자의 외부 표면은 비-단백질성 리간드(예컨대 국제 공개 WO01/53525호에 기술된 바와 같은 비-단백질성 리간드)로 코팅되지 않을 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 카복실화될 수 있다.
코팅된 입자의 외부 표면은 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있다. 코팅된 입자의 외부 표면은 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있고 리간드로 코팅되지 않을 수 있다.
본 발명의 모든 관련 양태 및 실시형태에 따르면, 용어 "소듐 폴리아네톨 설포네이트"는 모든 작용적으로 동등한 유도체 및 이의 염 형태(예컨대 포타슘 폴리아네톨 설포네이트, 마그네슘 폴리아네톨 설포네이트, 소듐 아밀로 설페이트, 등)를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "코팅" 또는 "코팅된"은 일반적으로 입자의 최외측 또는 노출된 층 상에 형성된 분자 또는 물질의 층을 지칭한다. 코팅이 부분적일 수 있다는 점에서, 코팅은 입자의 최외측 또는 노출된 층 상에 연속적인 분자 층을 포함할 필요가 없다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 용어 "입자" 및 "비드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
도 1은 T = 0시간(좌측) 및 T = 2시간(우측)의 한천 플레이트의 이미지로서 두 이미지 모두 샘플로부터의 항생제에 의한 억제로 인한 무성장의 중심 영역을 보여준다(실시예 1 참조).
도 2는 혈액 샘플의 이미지이며 각 샘플 세트에 대한 혈액 용해(blood lysis)의 정도를 보여준다: E-BUF, 우레아, Tris+NaCl, 동결(좌측에서 우측으로)(실시예 9 참조).
도 3은 PCR 설정 이전의 최종 샘플 출력의 이미지이다. 본 이미지는 혈액 중 자기 비드를 사용하는 샘플 처리에 대한 SPS의 이점을 시각적으로 보여준다: SPS는 SPS가 존재하는 경우 더 적은 적색 용출액으로 표시되는 바와 같이 혈액 성분을 보다 철저하게 제거할 수 있는 것으로 보인다. 혈액 브로쓰 샘플-세트에 사용된 BacTec PLUS 호기성 브로쓰는 또한 SPS를 함유함에 유의한다(실시예 10 참조).
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예와 관련하여 이해될 것이다:
실험 섹션
약어 & 정의
5th% 5% FPR을 결정하기 위한 5 번째 백분위수 임계값 계산
(공식 = PERCENTILE.INC(어레이, 0.05))
ABX 항생제 또는 항균제
BO 오직 브로쓰만(Broth Only)
BB 혈액 브로쓰(Blood Broth)
CBA 콜롬비아 혈액 한천(Columbia blood agar)
Cfu 콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit)
COL 콜롬비아 기재 한천(Columbia base agar)
Confirm 그람 상태(그람 음성, 그람 양성 또는 칸디다)에 따라 미생물 DNA를 표적으로 하는 PCR 다중 분석 확인
CPD 시트레이트 포스페이트 덱스트로스(Citrate Phosphate Dextrose)
Ct 주기 임계값(Cycle Threshold Value)
CV 임계값(Critical Value)(cfu): 다음 공식을 사용하여 cfu 값 및 ΔCt를 기반으로 하는 이론적 검출 한계: 샘플 cfu ÷ 2ΔCt
D1.. 희석점(Dilution point)(10-배 연속)
Dil 희석(Dilution)
DMBB 세제가 없는 미생물 결합 완충액(Detergent-free Microbial Binding Buffer)
DWB 세제가 없는 세척 완충액(Detergent-free Wash Buffer)
E-Buff 혈액 용해 완충액(Blood lysis buffer)
E*cfu 희석 시리즈에서 계수 가능한 TVC가 가장 높은 희석점을 사용하여 외삽된 cfu 값
EC 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)
ETGA 효소 주형 생산 및 증폭(Enzyme Template Generation and Amplification)
FA+ 수지, FA 및 BioMerieuxGMBB Gentle Microbial Binding Buffer가 포함된 호기성 혈액 배양 병
IPC 내부 처리 대조군(Internal Process Control): 정확한 샘플 처리를 보여주고 ETGA 음성 샘플에서 PCR 증폭을 확인하기 위해 LM에 존재하는 PCR 주형
LAWN 컨플루언트 미생물 성장(Confluent microbial growth)
LM 세제 및 미생물 용해 효소의 혼합물을 함유하는 미생물 용해 혼합물
MM 마스터 혼합물(Master Mix)
NoCt 50주기 후 역치 형광 이상 증폭 없음
NSC 스파이크 대조군 없음(No Spike Control)
O/n 오버나잇(Overnight)
PC 중합효소-스파이크 대조군
PCR 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)
Pt NSC/NC 결과로부터 계산된 양성 임계값
qPCR 정량적 중합효소 연쇄 반응
RT 실온(Room temperature)(+19 내지 +20℃)
SA 표준 호기성 혈액 배양 병, SA BioMerieux
SAB Sabouraud 덱스트로스 한천(Sabouraud dextrose agar)
s/n 상등액(Supernatant)
SPS 소듐 폴리아네톨 설포네이트(Sodium polyanethol sulfonate)
TNTC 셀 수 없을 정도로 많음(Too Numerous To Count)
TVC 총 생존 수(Total Viable Count)
WB 세척 완충액(Wash Buffer)(달리 언급되지 않는 한 Tris-HCl + 소듐 클로라이드 + Igepal + 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate) + Tergitol 함유; 또는 언급되는 경우 전혈.
ΔCt 두 Ct 값 사이의 차이(전형적으로 NSC Ct - 양성 샘플 Ct)
실시예 1
목적
항생제를 함유한 임상 혈액 중의 미생물이 인큐베이션을 위해 새로운 배지에 접종되기 전에 '구조(rescued)'되고 제거될 수 있는지 여부를 평가한다. 구조된 유기체가 항생제-함유 혈액에 남아 있는 유기체에 비해 더 효율적으로 성장하는지에 대한 간략한 조사.
구체적으로, 억제 농도의 용해성 항생제인 피페라실린을 함유한 혈액에 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하고 2시간 동안 배양할 때, 자기 포획 비드에 포획하여 항생제가 없는 혈액 배양 병으로 옮겨서 유기체가 성장할 수 있음을 보여주는 것을 목표로 한다.
재료
완충액 조성물
Figure pct00001
방법
시험 유기체: S. 아우레우스
항생제: 피페라실린 96 ug/mL 혈액
인간 혈액: 영국 런던 소재 Cambridge Bioscience, Research Donors로부터.
시험 유기체의 오버나잇 배양물(overnight culture)을 혈액/브로쓰 배지(BioMerieux SA 배양 병의 50 : 50 혈액 : 브로쓰 배지)에서 제조하였다.
오버나잇 배양물의 10배 연속 희석물을 필요에 따라 혈액/브로쓰 중에서 제조하였다.
항생제(abx)를 필요한 수준으로 전(whole) 인간 혈액(시트레이트-포스페이트-덱스트로스, CPD, 항응고제 중)에 첨가하였다.
전혈을 무항생제 대조군으로서 사용하였다.
유기체의 시험 희석물을 혈액 1 mL당 10 μL로 혈액 + 항생제 또는 혈액 단독에 첨가하였다(실험 요구 사항에 대해 충분하게 제조함).
100 μL 플레이트 계수 샘플(plate count sample)을 채취하였다(T0 샘플).
접종된 샘플을 37℃(정적)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취하였다(T2 샘플).
대조군의 경우, 바이알 어댑터(미국 PA 소재 West Pharmaceutical Services, Inc)를 사용하여 혈액 배양 병(BioMerieux SA 배양 병)에 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 첨가하고 자동 혈액 배양 캐비닛(어댑터가 제거됨)에서 인큐베이션하였다.
'구조' 시험의 경우, 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 Momentum Capture Beads(스트렙타비딘-코팅됨, 약 300 nm 비드, Bio estapor, Merk Cat# BE-M 08/0.3)로 아래와 같이 처리하였다:
● 세제가 없는 미생물 결합 완충액(DMBB - Tris+NaCl) 중에 희석된 Momentum Capture Beads - 클린-업 당 50 μL 비드 : 700 μL DMBB
● 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브에 750 μL의 희석된 비드 첨가
● 튜브에 5 mL의 브로쓰 배지를 첨가
● 튜브에 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독 첨가
● ITL TherMix(영국 Kent 소재 Integrated Technologies Ltd.) 상에서 인큐베이션, 32.5℃/30분/1000 rpm - 속도 증가 프로토콜
● V&P 자석(미국 CA 소재 V&P scientific Inc)에서 5분 동안 자성화한 후 상등액 제거
● 자석이 제거된 1 mL 세제가 없는 세척 완충액(DWB - Tris+NaCl) 중에 비드를 재현탁하고 DynaMag-2 자석(영국 Paisley 소재 Thermo Fisher Scientific, Life Technologies Ltd.) 위에 2 mL Eppendorf 플립-탑 튜브(flip-top tube)로 옮김
● 5분 동안 자성화한 후 상등액 제거
● 자석이 제거된 1 mL DWB 중에 비드를 재현탁한 다음 DynaMag-2 자석으로 교체
● 5분 동안 자성화한 후 상등액 제거
● 1 mL DWB 중에 비드를 재현탁하고, 바이알 어댑터를 사용하여 표준 혈액 배양 성장 배지를 함유하는 신선한, 미사용 혈액 배양 병(BioMerieux SA 배양 병)에 첨가하고, 인큐베이션 시작(어댑터 제거).
● 혈액 배양 병은 양성까지의 시간을 기록하는 자동화된 혈액 배양 캐비닛(BacT/ALERT BioMerieux)에서 배양됨. "플립" 시간은 자동 혈액 배양 캐비닛에 의해 결정된 바와 같이 병이 양성으로 변하는 때임.
● 각 병의 "플립" 시간을 기록함.
● 플레이트 계수(총 생존 계수 TVC)를 기록함.
결과
표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군 혈액 배양이 120시간(5일)에 음성으로 유지되었을 때 샘플 4b 및 5b에서 회수된 유기체는 10 내지 15시간 사이의 배양에서 양성으로 플립되었다. 구조된 유기체만이 대조군 혈액 배양의 유기체가 항생제의 존재에 의해 사멸되거나 억제되는 양성으로 성장을 계속하였다. 항생제를 함유하지 않는 두 샘플 모두에서 성장이 발생하였으며, 하나는 대조군으로서 처리하였고 하나는 구조 절차로 처리하였다.
[표 1]
항생제-함유 혈액으로부터 S. 아우레우스 의 회수를 보여주는 결과
Figure pct00002
결론적으로, 우리는 유기체가 항생제를 함유하는 혈액 샘플에서 '구조'되고 제거될 수 있고, 신선한 배지에 접종되고 양성으로 성장할 때까지 배양될 수 있음을 입증하였다. 본원에서 논의된 실험에서, 구조되지 않고 항생제-함유 샘플에 남아 있던 유기체는 성장하지 않았고 5일째에 음성으로 남아 있었다.
다음 실시예는 다양한 샘플과 상이한 조건에서 입자-미생물 복합체를 형성하여 생존 미생물을 회수하는 다양한 코팅된 입자의 능력을 보여준다. 상이한 다운스트림 검출 및 특성화 방법이 또한 예시된다.
실시예 2
수동 형식에서, 두 가지 비드 유형(Merck Bio-Estapor(스트렙타비딘-접합됨) 300 nm 비드(제품 - BE-M08/03; "Bio-Estapor") 및 ademtech Bio-Adembeads 스트렙타비딘 플러스 200 nm 비드(제품 번호 03222; "Bio-Ademtech"))를 ApoH Technologies Peps6 비드(참조 - MP20006; "ApoH Peps6")와 비교하였다.
실험 1A에서, Bio-Estapor 비드(25 uL)의 분취량과 ApoH Pep6 비드의 분취량(10 uL)을 결합에 대해 비교하였다. Bio-Estapor의 부피가 클수록 ApoH 물질과 비교하여 제공된 물질의 mL당 비드 수가 적음을 반영한다. E. 콜리(E. coli)(그람 음성 박테리아), S. 에피더미디스(S. epidermidis)(그람 양성 박테리아), 및 C.알비칸스(C. albicans)(효모)의 세 가지 유기체를 시험하였다. 0.5 mL의 유기체 현탁액을 ApoH Peps6 키트("Peps6 Captobac", 참조 MP10031-50T)에 제공된 0.5 mL "TTGB" 미생물 결합 완충액 중의 비드에 노출시켰다.
유기체를 30분 동안 결합시킨 후, 자기장을 인가하여 비드를 농축하고 피펫으로 상등액을 제거하여 비드 샘플을 액체 상등액으로부터 분리하였다. 비드를 3 개의 분취량의 세척 완충액(50 mM Tris pH 8, 1% v/v Igepal CA-630, 150 mM NaCl, 0.25% v/v Tergitol 15-S-9)으로 부드럽게 세척하고 잔류 상등액과 세척된 비드를 2가지 방법으로 생존 유기체에 대해 분석하였다; Agar Petri 접시의 콜로니 계수 및 효소 주형 생성 및 증폭(ETGA) 시험에 의한 미생물 DNA의 검출(문헌[Zweitzig et al., 2012. Characterization of a novel DNA polymerase activity assay enabling sensitive, quantitative and universal detection of viable microbes. Nucleic Acids Research 40, 14, e109, 1-12]; 및 국제 공개 WO2011/130584호, 국제 공개 WO2013/103744호, 및 국제 공개 WO2016/005768호에 기술된 바와 같음).
표 1A의 플레이트 계수는 Bio-Estapor 비드 및 E. 콜리의 경우 대부분의 성장이 비드(33 CFU) 대 상등액(2 CFU)에서 발견되며 이는 ApoH Peps6의 결과와 유사함을 보여준다. S. 에피더미디스에서는 성장이 발견되지 않았으며 이러한 유기체는 원래의 브로쓰에서 자라지 않는 것으로 나타났다. C. 알비칸스는 Bio-Estapor와 ApoH Peps6 둘 모두에 대해 상등액에서 대략 10%의 CFU와 90%의 결합을 보였다. 이러한 결과는 Bio-Estapor 비드가 시험 조건에서 상업적으로 이용 가능한 유기체-결합 비드 Peps6과 동일한 속도로 유기체를 결합하는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 민감성 ETGA 시험은 결과를 뒷받침하지만 S. 에피더미디스가 더 낮은 Cq 값에서 볼 수 있듯이 Peps6보다 Bio-Estapor에 더 잘 결합할 수 있음을 나타낸다.
[표 1A]
Figure pct00003
실험 1B는 세척 단계가 생략되었지만 실험 1B는 실험 1A와 유사한 조건에서 E. 콜리 결합을 보여준다. 실험 1B는 또 다른 비드인 Bio-Ademtech 또한 낮은 수준이지만 유기체에 결합한다는 것을 보여준다(표 1B 참조). 여기서 플레이트 계수는 생존 수의 약 1/3이 비드에 결합되었음을 나타낸다. 더 민감한 ETGA DNA 중합효소 분석은 비드와 상층액에 대한 Cq가 거의 같기 때문에 유기체의 절반이 비드에 남아 있음을 나타낸다.
[표 1B]
Figure pct00004
실시예 3
실험 3에서, ApoH Peps6, Bio-Estapor, 및 카복실화된 표면이 있는 Estapor 비드(제품 MI-030/40, "Estapor COOH")를 비교하였다. E. 콜리를 비드에 30 분간 결합시킨 후 상등액에 남아있는 유기체의 수를 형광 ATP 분석법(BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay; Promega Corporation, G8230)을 사용하여 측정하였다. 이는 비드 상의 유기체의 존재를 직접 검출하지 않는다는 점에서 간접적인 시험이지만, 리간드-기반 비드(ApoH Peps6)와 본 발명의 비-리간드 비드(Bio-Estapor 및 Estapor COOH)에 대해 유용한 비교 시험이다. 1 mL의 104 CFU/mL E. 콜리를 30 mL에 대한 인산 식염수 완충액으로부터 결합한 후, 상등액의 분취량을 BacTiter-Glo 분석법을 사용하여 유기체 함량의 척도로서 ATP에 대해 분석하였다. 표 2의 결과는 이러한 기술을 사용하여 측정했을 때 Peps6 비드, Bio-Estapor, 및 Estapor COOH에 대한 상등액 중의 유기체 수준 감소가 각각 33%, 27%, 및 24%였음을 보여준다.
[표 2]
Figure pct00005
실시예 4
실시예 4는 실시예 2에 기술된 자기 분리 방법을 자동화하여 수행한 희석 시리즈 중의 E. 콜리(EC), S. 아우레우스(SA), 및 C. 알비칸스(CA)를 시험한 결과를 보여준다. 분석법은 0.25% Tergitol을 함유하는 TTGB의 결합 완충액과 함께 캡처 배지로서 Bio-Estapor 300 nm 직경 비드를 사용하였다. 세 가지 유기체 각각이 10배로 희석됨에 따라, Ct의 지속적인 변화를 기록하여 용량 반응 곡선이 구성되게 하였다.
[표 3]
Figure pct00006
다음 실시예는 Momentum의 Magnitor 시험에서 자기 비드에 의한 미생물의 범용 미생물 포획을 보여준다. Magnitor 시험은 다음 두 가지 미생물 검출 판독값으로 구성된다:
● ETGA: 온전한 미생물 세포로부터 미생물 중합효소의 검출
● Confirm: 그람 상태(그람 음성, 그람양성, 또는 칸디다)에 따른 미생물 DNA 검출
주요 발견:
● 자기 비드는 단순한 완충액과 다양한 복합적인 생물학적 표본 유형에서 박테리아와 진균을 포획한다
● 다양한 비드 크기(0.2 내지 1.5 μm 직경의 비드) 및 표면 코팅(예컨대 카복실화, 소수성, 아민화 등)을 사용하여 미생물 포획이 발생한다.
특정 결합 완충액 성분은 예를 들어 세제-기반 혈액 용해와 같이 Magnitor 분석에서 미생물 검출을 향상시킬 수 있다.
실시예 5: 미생물 검출은 자기 비드에 의한 포획에 의존한다
목표:
E. 콜리, S. 아우레우스, 및 C. 알비칸스에 대한 미생물 결합 성능을 간단한 Tris+NaCl 완충액(물에서만 발생할 수 있는 미생물 삼투 충격을 방지하기 위해 생리학적 염 농도로 완충된 pH)에서 평가하였다. 검출이 미생물 포획을 위한 자기 비드의 존재에 의존함을 입증하기 위해 "비드 대조군이 없는" 샘플-세트 또한 본 실험에 포함시켰다.
자기 비드 제조:
Estapor 비드(Merck, Cat# M1-30/40)를 1X Tris+NaCl 완충액에서 3 x 1 mL로 세척하였다: 400 μL 1X Tris+NaCl 완충액(1% 고형분)의 최종 부피에 40 μL 비드를 재현탁하였다.
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰(한천 플레이트로부터 3 mL 브로쓰 접종)에서 미생물 오버나잇 액체 배양(o/n)을 표준으로 설정하였다. 다음날(대략 16시간 후) 1.88 μL E. 콜리 및 S. 아우레우스 액체 배양물을 3 mL 브로쓰에 첨가하고, 18.75 μL C. 알비칸스 액체 배양물을 3 mL 브로쓰에 첨가하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장을 수행하였다.
● 2시간 동안 성장시킨 후, 미생물 예비배양물을 1X Tris+NaCl 완충액(50 mM Tris-HCl [pH8.0] + 150 mM NaCl) 중에 희석(DF10)하여 미생물당 4개의 희석점을 생성하였다.
● 100 μL TVC를 각 미생물 희석에 대해 수행하였다
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 1 mL 샘플을 15 μL의 예비세척된 비드를 함유하는 2 mL 튜브에 첨가하였다 - 모든 미생물 샘플을 동일한 1X 완충액에 희석하였기 때문에 112 μL의 1X Tris+NaCl 완충액을 비드가 있는 튜브에 첨가하지 않았음에 유의한다(표준 프로토콜에 따름).
● 37℃에서 30분 동안 진탕하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n 제거하였다.
● 1 mL 세척 완충액(WB)을 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● Dynmag-2에서 3분 자기화하였다.
● 모든 s/n 제거하였다.
● 50 μL의 용해 혼합물(LM: Lysis Mix)을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다(5 μL의 중합효소 대조군(PC: Polymerase Control)을 각각의 PC 샘플 튜브에 첨가함).
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 확인을 위한 수동 qPCR 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
TVC(COL/SAB 한천 플레이트)
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
분석:
● '(+) 비드' 샘플에 대한 Magnitor 결과는 세 가지 미생물 종 모두에 대해 매우 강한 세포-밀도 특이적 ETGA 및 Confirm 신호를 보여 광범위한 미생물 군(GrNeg, GrPos, 칸디다)의 비드-특이적 결합을 입증한다.
● 칸디다 결과는 보다 우수한 세포 밀도 경향을 따를 수 있었지만, 액체 배양물은 상당히 미립자여서 연속 희석의 품질에 영향을 미칠 수 있음에 유의한다.
'(-) 비드' 대조군에서 미생물 세포 이동의 일부 증거가 있었지만, 이는 단 한번의 세척 단계로 예상된다.
실시예 6: 자기 비드에 의한 혈액에서의 미생물 포획은 단순하고 복합적인 혈액 용해 완충액에서 발생하며, 이는 원심분리에 의한 포획에 필적하는 미생물 검출을 가능케 한다
목표:
간단하고 신속한 'Rapid Magnitor' 시험(해당 프로토콜에는 세척 단계가 포함되어 있지 않음)의 개발을 위해 두 가지 상이한 희석제 형식의 두 가지 상이한 혈액 용해 완충액을 비교한다.
시험 조건:
● 2X EBB 1 mL 2X EBB + 1 mL 표본
● 10X EBB 112 μL 10X EBB + 1 mL 표본
● 2X B-BUF 1 mL 2X B-BUF + 1 mL 표본
● 10X B-BUF 112 μL 10X B-BUF + 1 mL 표본
● 10X EBB: 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 2.5% Tergitol
● 10X B-BUF: 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 5% 소듐 디옥시콜레이트 + 2.5% Tergitol
샘플 설정:
● E. 콜리 o/n 액체 배양물을 1E-3로 희석한 희석물을 혈액 브로쓰(6.25 μL o/n per mL: 244 μL o/n + 39 mL 혈액 브로쓰)에 스파이크하고 37℃, 500 rpm에서 진탕 인큐베이터에서 60분간 성장을 수행하였다.
● 2시간 동안 성장시킨 후, 1 mL 표본을 완충액(및 Mag Beads 샘플-세트를 위한 15 μL BioEstapor 비드(Merck, Cat# BE-M 08/0.3))을 함유하는 2 mL 튜브에 첨가하여 샘플을 생성하였다: 시험 조건 당 E. 콜리(EC) 및 스파이크없는 대조군(NSC: No Spike Control) 샘플을 3회 반복하였다.
● NSC 및 E. 콜리에 대해 100 μL TVC를 수행하였다(플레이트를 계수할수 있도록 표본 희석 포함).
프로토콜:
샘플을 상기와 같이 설정하고, Spin 또는 Mag Beads 프로토콜로 즉시 진행하였다.
Spin 프로토콜
● 9000 xg에서 3분 동안 샘플을 원심분리하였다(펠릿 추적성(pellet traceability)을 위해 튜브 힌지가 바깥쪽을 향함).
● 상등액을 제거하였다.
● 50 μL LM을 샘플에 첨가하였다(펠릿을 재현탁하기 위해 대략 10x 피펫 혼합).
● 샘플을 900 rpm의 진탕 인큐베이터에 5분 동안 둔 다음 800 rpm에서 55분 동안 두었다(26℃).
● qPCR 설정 전에 샘플을 17000 xg에서 1분 동안 원심분리하였다.
Mag Beads 프로토콜
● 샘플을 900 rpm의 진탕 인큐베이터에 30분 동안 두었다(37℃).
● 샘플을 DynaMag-2 자기 랙에 5분 동안 둔 다음 상등액을 제거하였다.
● 50 μL LM을 샘플에 첨가하였다(펠릿을 재현탁하기 위해 대략 10x 피펫 혼합).
● 샘플을 900 rpm의 진탕 인큐베이터에 5분 동안 둔 다음 800 rpm에서 55분 동안 두었다(26℃).
● qPCR 설정 전에 샘플을 3분 동안 자성화하였다.
● ETGA 마스터믹스(mastermix) 단독에 대해서만 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
cfu 계산
샘플 및 샘플의 희석물을 COL 플레이트에 플레이팅하였다(100 μL).
Figure pct00012
Figure pct00013
분석:
● 자기 비드에 의한 미생물 결합은 다음에서 발생한다:
○ 단순 및 복합 혈액 용해 완충액(EBB = Tris-HCl + Tergitol; B-BUF = Tris-HCl + 소듐 클로라이드 + Igepal + 소듐 디옥시콜레이트 + Tergitol), 그러나 혈액-유래 시험 신호는 혈액 용해 완충액 구성성분에 따라 다름
○ 희석(2X 완충액: 1-부 표본에 대한 1-부 혈액 용해 완충액) 및 농축(10X 완충액: 9 부 표본에 대한 1-부 혈액 용해 완충액) 샘플 형식
또한, 자기 비드에 의한 미생물 포획에 대한 미생물 검출 신호는 원심분리에 의한 포획과 유사하다.
실시예 7: 자기 비드에 의한 혈액에서의 미생물 포획은 혈액 용해에 의존하지 않지만, 용해된 혈액에서 미생물 결합이 발생하면 다운스트림 미생물 검출이 개선된다
목표:
여러 비드 유형/크기가 미생물 연속 희석 및 NSC에 대해 유사한 Magnitor 결과를 생성한다는 최근 발견을 감안할 때, Momentum의 결합 완충액 내의 구성성분이 관찰된 범용 미생물 결합 특성을 매개/촉진할 수 있다고 생각되었다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 표준 결합 완충액(B-BUF)과 Tris-HCl [pH8.0] + NaCl로만 구성된 세제가 없는 B-BUF를 비교하여 E. 콜리의 희석 시리즈 수행하여, 일반적으로 미생물 결합에 세제가 중요한지 여부를 시험하였다. 샘플 세트를 혈액-브로쓰, 브로쓰-단독 및 1X 결합 완충액 단독에서 제조하여 다양한 표본 유형에 대한 결과를 비교하였다.
제조:
신선하게 제조된 100 mL 10X 결합 완충액:
● B-BUF: 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 5% 소듐 디옥시콜레이트 + 2.5% Tergitol
● Tris+NaCl: 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드
Estapor 비드(Merck, Cat# M1-30/40)를 각각의 1X 완충액(희석된 10X B-BUF 또는 10X Tris+NaCl)에 3 x 1 mL로 세척하였다: 400 μL 1X 완충액(1% 고체 함량)의 최종 부피에 40 μL 비드를 재현탁하였다.
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰에서 E. 콜리 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정하고, 다음 날(대략 16시간 후) 3 mL 브로쓰(6.25 μL/mL로 브로쓰에 첨가된 EC 1E-1 희석물과 동등)에 1.88 μL o/n을 첨가하고, 37℃, 500 rpm에서 2시간 동안 성장을 수행하였다.
● 2시간 동안 성장시킨 후, E. 콜리 예비배양물은 예열된 혈액-브로쓰(BB), 브로쓰 단독(BO), 또는 1X 완충액(B-BUF 또는 Tris+NaCl)에서 EC 1E-6까지 연속으로 희석(DF10)하였다.
● 모든 E. 콜리 희석물 및 NSC에 대해 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 112 μL의 결합 완충액(B-BUF 또는 Tris+NaCl: BB 및 BO 샘플 세트의 경우 10X; 및 완충액 샘플 세트의 경우 1X) + 15 μL 비드(각각의 완충액에서 미리 세척됨)을 함유하는 2 mL 튜브에 1 mL 샘플을 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 진탕하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● Dynmag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다(각 PC 샘플 튜브에 5 μL 중합효소 대조군(PC: Polymerase Control)을 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
관찰:
● 예상대로 Tris+NaCl에서 혈액 용해가 관찰되지 않았다.
● 세제가 없을 때 비드가 더 거칠고/뭉쳤다.
결과:
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
분석:
● 세제는 혈액 존재 하에 우수한 ETGA 결과를 생성하는 데 중요하지만('BB와 함께 10X Tris+NaCl’의 경우 더 불량한 ETGA 결과에 의해 지시되는 바와 같이), 혈액 용해 부재 시에도 미생물 포획/검출이 분명하였다('BB와 함께 10X Tris+NaCl' 샘플 세트에 대한 결과로 입증되는 바와 같이).
● 혈액 부재 시 우수한 ETGA 결과는 결합 완충액의 구성성분인 세제가 E. 콜리를 비드에 결합시키는 데 필요하지 않음을 나타낸다.
● '1X Tris+NaCl과 함께 10X Tris+NaCl' 샘플 세트에서의 우수한 ETGA 결과는 혈액 및/또는 브로쓰의 생물학적 구성성분이 미생물 결합에 필요하지 않음을 보여준다.
● 흥미롭게도, B-BUF는 BO 및 1X B-BUF 샘플 세트가 있는 10X B-BUF에서 ETGA 신호를 약간 억제하는 것으로 보이지만, 다른 곳의 최근 연구에서는 소듐 디옥시콜레이트가 분석을 다소 억제할 수 있음을 보여주었으며, 이러한 관찰은 예상하지 못한 것은 아니다.
● '1X Tris+NaCl이 있는 10X Tris+NaCl' 샘플 세트에서 Confirm이 가장 잘 수행되었다. 다른 모든 유사한 샘플 세트는 유사한 Confirm GrNeg 결과를 생성하였다.
● IPC 신호는 예상할 수 있는 대로 혈액의 존재 하에 다소 억제되었다.
● 이러한 결과는 세제나 생물학적 샘플이 E. 콜리에 대한 미생물 결합의 매개체가 아님을 보여준다.
실시예 8: 혈액 부재 시, 자기 비드에 의한 미생물 포획은 pH 완충이나 염에 의한 삼투 안정화와 관계없이 발생한다
목표:
미생물 결합을 매개하는 Momentum의 결합 완충액의 중요성을 추가로 조사하기 위해 결합에 대한 pH 완충과 염의 효과를 깨끗한 시스템(즉, 혈액 또는 브로쓰가 없는 상태)에서 조사하였다.
10X 완충액 제조:
25 mL의 각각의 완충액을 신선하게 제조하였다:
● BUF-1 500 mM Tris-HCl [pH7.4] + 1.5 M NaCl
● BUF-2 500 mM Tris-HCl [pH8.0] + 1.5 M NaCl
● BUF-3 500 mM Tris-HCl [pH8.5] + 1.5 M NaCl
● BUF-4 500 mM Tris-HCl [pH8.0] 단독
● BUF-5 1.5 M NaCl 단독
● BUF-6 물 단독.
Estapor 비드(Merck, Cat# M1-30/40)를 각각의 1X 완충액(희석된 10X 완충액)에 3 x 1 mL로 세척하였다: 300 μL 1X 완충액(1% 고체 함량)의 최종 부피에 30 μL 비드를 재현탁하였다.
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰(SPS 함유) 및 영양 브로쓰(Nutrient Broth)(NB, SPS 미함유)에서 E. 콜리 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정하고, 다음 날(대략 16시간 후) 각 브로쓰 유형(오전에는 NB 및 오후에는 PLUS 브로쓰)에 대해 3 mL 브로쓰(6.25 μL/mL로 브로쓰에 첨가된 EC 1E-1 희석물과 동등)에 1.88 μL o/n을 첨가하고, 37℃, 500 rpm에서 2시간 동안 성장을 수행하였다.
● 각각의 실험(NB 및 PLUS)에서, 1E-1 E. 콜리 예비배양물을 1X 완충액(BUF-1 내지 BUF-6)에서 E. 콜리 1E-6(DF10)으로 희석하였다.
● 상이한 1X 완충액으로 인한 플레이트 생존력 불일치를 방지하기 위해 관련 브로쓰(NB 또는 PLUS 브로쓰)에서 수행된 별도의 EC 희석 세트를 사용하여 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 112 μL의 각각의 1X 완충액 + 15 μL 비드(각각의 완충액에서 미리 세척됨)을 함유하는 2 mL 튜브에 1 mL 샘플을 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 진탕하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● Dynmag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
분석:
● 물만 단독으로 포함한 모든 완충액은 E. 콜리의 포획을 유사하게 잘 보여주었다(유사한 ETGA 및 Confirm 결과로 표시되는 바와 같음) - 그러나 물 단독에서(BUF-6) 더 낮은 세포 밀도에서 삼투성 미생물 용해의 일부 징후가 있었다.
● PLUS 브로쓰와 NB에서 배양한 E. 콜리 둘 모두는 시험된 모든 완충액에 대해 매우 유사한 Magnitor 결과를 생성했으며, 이는 SPS가 E. 콜리의 미생물 결합을 매개하는 데 명백한 역할을 하지 않는다는 것을 나타낸다.
● 이러한 결과는 E. 콜리가 Estapor(카복실화) 비드에 결합하는 데 필수적인 완충 성분이 없음을 나타낸다.
실시예 9: 다양한 혈액 용해 방법을 사용하여 자기 비드에 의해 혈액에서 미생물 포획을 수행할 수 있다
목표:
대체 혈액 용해 방법을 사용할 때 미생물 포획 및 검출이 발생할 수 있는지 여부를 결정하였다.
제조:
결합 완충액을 다음과 같이 제조하였다:
● E-BUF = 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 2.5% Tergitol
● UREA = 83 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 10 M 우레아
● Tris+NaCl = 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드.
사용 전 BioEstapor 비드(Merck, Cat# BE-M 08/0.3)를 재현탁하였다.
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰에서 S. 아우레우스 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정하고, 다음 날(대략 16시간 후) 3 mL 브로쓰(1E-3 희석물)에 3.0 μL o/n을 첨가하고 37℃, 500 rpm에서 4시간 동안 성장을 수행하였다.
● 4시간 동안 성장시킨 후, S. 아우레우스 예비 배양물을 예열된 혈액 브로쓰에서 1E-6까지 연속적으로 희석(DF10)하였다.
● 모든 S. 아우레우스 희석물 및 NSC에 대해 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 피펫에 의한 수동 액체 이송을 사용하여 수동 샘플 처리:
초기 설정
● 우레아를 사용하는 샘플의 경우, 0.25 mL 표본을 0.75 mL의 우레아 + 15 μL 비드를 함유하는 2 mL 튜브에 첨가하였다.
● 동결될 샘플의 경우, 1 mL 표본을 2 mL 튜브에 첨가한 다음 드라이 아이스 상에서 5분 동안 신속하게 동결하였다. 표본을 37℃에서 5분 동안 해동한 다음, 112 μL Tris+NaCl + 15 μL 비드를 첨가하였다.
● E-BUF 또는 Tris+NaCl을 사용하는 샘플의 경우, 1 mL 표본을 112 μL의 결합 완충액(E-BUF 또는 Tris+NaCl) + 15 μL 비드를 함유하는 2 mL 튜브에 첨가하였다.
모든 샘플 처리
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 37℃에서 3분 동안 혼합하였다(1000rpm).
● Dynmag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
관찰:
● 동결된 샘플에 대해 해동 후 혈액 용해가 관찰되었다(도 2 참조).
● 우레아 사용 시 혈액 용해가 거의 즉각적으로 관찰되었다
● 우레아를 사용한 샘플의 처리 동안 일부 비드가 손실된 것으로 나타났다.
● Tris+NaCl 샘플 세트에 대해 명백한 혈액 용해가 관찰되지 않았다(예상한 바와 같음).
결과:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
도 2는 각 샘플 세트에 대한 혈액 용해 정도를 보여준다: E-BUF, 우레아, Tris+NaCl, 동결(왼쪽에서 오른쪽으로).
분석:
● 자기 비드에 의한 S. 아우레우스의 미생물 포획 및 검출은 Confirm에 의해 결정된 바와 같이 대체 용해 방법 및 혈액 용해가 없는 경우와 유사하다. 그러나 ETGA에 의한 미생물 검출은 혈액 유래 ETGA 신호의 감소에 대한 영향으로 인해 대체 혈액 용해 방법에 의해 다양한 정도로 개선된다.
실시예 10: 최적의 비드 성능, 샘플 처리, 및 전혈에서의 미생물 검출을 위해 SPS가 필요하다
목표:
1 mL 전혈 샘플을 사용하여 Magnitor Rapid 시험에 대한 최적의 SPS 농도를 결정하고자 하였다. 2차 목적은 TVC에 의해 결정된 전혈의 미생물 생존력에 대한 SPS의 영향을 평가하는 것이었다.
시험 조건:
각 샘플 세트(E. 콜리 및 NSC 샘플)에 대해 2 x 5 mL의 전혈 또는 BacTec PLUS 호기성 혈액 브로쓰(1 : 3 비율)로 분주하였다. 그런 다음 SPS를 다음과 같이 첨가하였다:
샘플 세트 10% SPS (μL)
BB 없음
WB 0% 없음
WB 0.01% 5
WB 0.02% 10
WB 0.04% 20
WB 0.06% 30
WB 0.08% 40
WB 0.10% 50
그런 다음 표준 1E-5 희석 샘플을 재생성하기 위해 각 5-mL 표본 튜브에 5 μL의 E. 콜리 1E-2 예비배양물을 첨가하였다.
프로토콜:
● 영양 브로쓰(NB) 중의 1.88 μL 순수 o/n을 3 mL NB에 첨가하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
● 2시간 후, E. 콜리 예비배양물을 따뜻한 NB에 10배 희석하였다; 그런 다음 각각의 5 mL 표본 튜브(시험 조건에 제시된 바와 같이 제조함)에 5 μL를 첨가하였다.
● Magnitor 시험을 즉시 개시하고, TVC를 하기 세부사항과 같이 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 112 μL E-BUF(500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 2.5% Tergitol) + 15 μL 비드(BioEstapor, Merck, Cat# BE-M 08/0.3)를 각각의 샘플 튜브에 사전 로딩한 다음, 1 mL 표본을 샘플 튜브에 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 3분 동안 혼합하였다(1000rpm).
● Dynmag-2에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
TVC 분석
● 0시간(Time Zero)에 COL 플레이트에 100 μL를 플레이트한다.
● 상온(20.4℃)에서 벤치(정적)에 대략 2 mL 샘플을 포함하는 샘플 bijous를 놔둔다.
● TVC를 표에 표시된 시점에 수행한다: 플레이팅 전에 샘플을 철저히 혼합
Figure pct00027
Figure pct00028
주의: 분석을 위해 50 Ct로 NoCt 변화; 처리 동안 상당한 펠릿 손실로 인한 * 이상치 배제
Figure pct00029
분석:
● SPS는 TVC 분석을 기반으로 하여 전혈에서 미생물 보호/생존력을 제공하는 이점을 나타낸다; 그러나 일반적으로 전혈에서 E. 콜리 생존력에는 큰 문제가 없다.
● SPS의 통합으로 ETGA 및 Confirm 판독값 모두에 대한 샘플 처리 효율성 및 미생물 검출 성능이 향상되었다.
● 0.06%의 SPS는 TVC-기반 생존력에 대해 최상의 결과를 생성하였다; ETGA 검출(E. 콜리 및 NSC 샘플 Ct를 고려한 최상의 결과); 및 IPC Ct 값으로 표시되는 PCR 억제. GrNeg Confirm 결과는 전혈에 SPS를 첨가하여 또한 개선되었지만, SPS의 정확한 농도는 덜 중요하였다.
실시예 11: 유사한 크기(직경 약 300 nm)의 다양한 상업적으로 이용 가능한 카복실화된 비드 제품을 사용하여 자기 비드로 혈액에서 미생물을 포획한다
목표:
Momentum의 Magnitor 분석을 사용하여 유사한 크기의 대체 카복실화된 자기 비드를 비교하고자 하였다.
시험 조건:
Figure pct00030
프로토콜:
E. 콜리 및 S. 피오제네스 o/n 액체 배양물을 3 mL 브로쓰 및 혈액 브로쓰(BacTec PLUS 호기성) 각각에 표준으로 설정하고, 16 내지 20시간(37℃) 동안 인큐베이션하였다.
다음날:
● E. 콜리 액체 배양물을 혈액 브로쓰에서 1E-3로 희석한 다음 혈액 브로쓰(혈액 브로쓰 1 mL당 6.25 μL) 내로 스파이크하고; 1시간 30분(37℃) 동안 사전 인큐베이션하였다.
● S. 피오제네스 액체 배양물을 혈액 브로쓰에서 1E-1로 희석한 다음 혈액 브로쓰(혈액 브로쓰 1 mL당 6.25 μL) 내로 스파이크하고; 2시간 30분(37℃) 동안 사전 인큐베이션하였다.
E. 콜리 실험을 오전에 수행하였다
● E. 콜리 1E-3 예비배양물을 혈액 브로쓰에 연속적으로 희석하여 5개의 희석점을 생성하였다(1E-3 내지 1E-7).
● 1 mL 표본을 15 μl의 1% 고체 비드 + 112 μL의 결합 완충액으로 사전 로딩된 2 mL 튜브에 첨가하여 샘플을 설정하였고; Magnitor V4.0 시험을 수행하였다: 각 epMotion 5073m에서 시험된 3개의 비드 유형을 사용하여 비드 유형당 5개의 희석점 + 3 NSC(8개 샘플 세트).
S. 피오제네스 실험을 오후에 수행하였다
● S. 피오제네스 1E-3 예비배양물을 혈액 브로쓰에 연속적으로 희석하여 5개의 희석점을 생성하였다(1E-1 내지 1E-5).
● 1 mL 표본을 15 μl의 1% 고체 비드 + 112 μL의 결합 완충액으로 사전 로딩된 2 mL 튜브에 첨가하여 샘플을 설정하였고; Magnitor V4.0 시험을 수행하였다: 각 epMotion 5073m에서 시험된 3개의 비드 유형을 사용하여 비드 유형당 5개의 희석점 + 3 NSC(8개 샘플 세트).
Magnitor V4.0 프로토콜(epMotion 5073m에서 자동화된 샘플 처리)
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● 15분 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 0.82 mL WB를 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 자기화 스위치를 끄고 ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
각 비드 유형에 대해 NSC(n = 6)를 사용하여 계산된 내부 양성 임계값(Pt): 공식 = PERCENTILE.INC(어레이, 0.05)
Figure pct00031
Pt(5th%) 방법은 n = 6 내에서 하나의 위양성(false positive)을 생성할 것임에 유의한다: 아래의 주요 결과 표 내에서 빨간색 글꼴로 강조 표시됨.
Figure pct00032
Figure pct00033
관찰:
● 비드 B는 1% 고체 함량으로 희석하기 전에 재현탁하기가 어렵다; 그리고 1% 고체로 희석한 후 시각적으로 더 희석된 것으로 나타났다.
● 처리가 끝나면, 샘플을 DynaMag-2 자기 랙에 놓았고, 모든 비드 유형 C-G를 다음을 제외하고 유사하게 자화하였다: 비드 A, 이는 무거운 펠릿을 가지고 있는 것으로 보임; 및 비드 B, 이는 매우 작은 비드 펠릿을 가졌음.
분석:
여기에서 시험된 모든 카복실화된 자기 비드는 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 바와 같은 미생물 결합을 보여준다. 그러나, 미생물 검출의 민감도는 혈액-유래 ETGA 신호 및/또는 분석 억제 수준에 따라 다소 다르다.
실시예 12: 다양한 비드 크기와 기능성 코팅을 사용하여 자기 비드에 의한 혈액 속 미생물 포획이 발생한다
목표:
Momentum Magnitor 시험(ETGA 및 Confirm 기술)을 사용하여 다양한 크기와 기능성 코팅의 다양한 상업적으로 이용 가능한 자기 비드에 대한 미생물 포획 성능을 비교하고자 하였다. 자동화(프로토콜 1) 및 수동(프로토콜 2) 샘플 처리를 위한 미생물 포획을 입증하기 위해 두 가지 실험을 수행하였다. 중요하게도, 프로토콜 2는 ETGA/Confirm 신호가 샘플 이동(carryover)(단일 비드-자화 세척 단계를 포함하는 프로토콜 1과 반대)가 아닌 비드-결합된 미생물 세포에 특이적임을 보다 설득력 있게 입증하기 위해 3개의 비드 재현탁 세척을 포함하였다.
시험 조건:
Figure pct00034
모든 비드를 1 mL 1X E-BUF(50 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 150 mM 소듐 클로라이드 + 1% Igepal + 0.25% Tergitol)에서 세척하고 1X E-BUF 에서 1% 고체로 재현탁하였다
샘플 설정(상이한 날짜에 수행된 프로토콜 1 및 2에 대해 별도로 수행됨):
● 3 mL 브로쓰(BacTec PLUS 호기성)에 E. 콜리 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정하고 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다(37℃).
● 다음 날, E. 콜리 액체 배양물을 혈액 브로쓰 에 1E-3로 희석하고 2-시간 성장 인큐베이션을 수행하였다(37℃, 500 rpm에서),
● 2-시간 성장 인큐베이션 후, E. 콜리 1E-3 예비배양물을 혈액 브로쓰에 연속적으로 희석하여 3개의 희석점(EC 1E-6 내지 1E-8)을 생성하였다.
● 1 mL 표본(3개의 E. 콜리 희석물 및 3개의 NSC 샘플: 6 샘플 세트)을 112 μL 10X E-BUF(500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 2.5% Tergitol) + 15 μL 비드(1% 고체)로 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가한 다음, Magnitor 시험을 프로토콜 1 또는 프로토콜 2(하기 참조)에 따라 개시하였다:
프로토콜 1(epMotion 5073m 상에서 자동화된 샘플 처리):
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● 15분 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 0.82 mL WB를 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 자기화 스위치를 끄고 ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
프로토콜 2(DynaMag-2 자석 및 피펫에 의한 수동 액체 이송을 사용하여 수동 샘플 처리)
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 2분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm에 대한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
프로토콜 1(epMotion 5073m 상에서 자동화된 샘플 처리) - 20190221 상에서 수행함
Figure pct00035
프로토콜 2(DynaMag-2 자석 및 피펫에 의한 수동 액체 이송을 사용하여 수동 샘플 처리) - 20190228 상에서 수행함
Figure pct00036
분석:
이러한 결과는 다양한 비드 크기와 기능성 코팅이 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 바와 같이 유사한 수준의 미생물 결합을 생성한다는 것을 보여준다.
실시예 13: 다양한 크기와 기능성 코팅의 자기 비드를 사용하여 혈액에서 광범위한 미생물 종(그람 음성, 그람 양성, 및 칸디다)을 포획할 수 있다
목표:
Momentum Magnitor 시험(ETGA 및 Confirm 기술)을 사용하여 다양한 크기와 기능성 코팅의 다양한 상업적으로 이용 가능한 자기 비드에 대한 미생물 포획 성능을 비교하고자 하였다. E. 콜리는 이전에 시험하였다(비드 크기 및 코팅 I: 소스 실험: 20190221_WP7_Bead-Comparison_Analysis 및 20190228_WP7_Bead-Comparison-3-wash_Analysis): 이러한 이전 작업(previous work)을 확장하기 위해, 세 가지 추가 미생물 종을 시험하였다(S. 아우레우스, S. 뉴모니아, 및 C. 알비칸스).
시험 조건:
Figure pct00037
모든 비드를 1 mL 1X Tris+NaCl 중에서 세척하고 1X Tris+NaCl 중에서 1% 고체로 재현탁하였다.
프로토콜:
샘플 설정:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰(한천 플레이트로부터 3 mL 브로쓰 접종)에서 미생물 오버나잇 액체 배양물(o/n)을 설정하였다. 다음 날(대략 16시간 후) 300 μL S. 뉴모니아 및 C. 알비칸스 액체 배양물을 3 mL 혈액 브로쓰(1E-1 희석)에 접종하였고, 3 μL S. 아우레우스 액체 배양물을 3 mL 혈액 브로쓰(1E-3 희석)에 접종하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장을 수행하였다.
● 2시간 성장 후, 미생물 예비배양물을 혈액 브로쓰에 희석하여(DF10) 미생물당 3개의 희석점을 생성하였다.
● 각각의 미생물 희석물에 대해 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 1 mL 표본(미생물 종당 3개의 희석물 및 3개의 NSC 샘플: 12개의 샘플 세트)을 15 μL 비드(1% 고체)와 112 μL E-BUF(500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 2.5% Tergitol)가 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 3분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm에 대한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
분석:
● 이러한 결과는 다양한 비드 크기와 기능성 코팅이 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 바와 같이 유사한 수준의 미생물 결합을 생성한다는 것을 보여준다.
실시예 14: 다양한 크기와 기능성 코팅의 자기 비드를 사용하여 단순 Tris+NaCl 완충액에서 광범위한 미생물 종(그람 음성, 그람 양성, 및 칸디다)을 포획할 수 있다
목표:
Momentum Magnitor 시험(ETGA 및 Confirm 기술)을 사용하여 다양한 크기와 기능성 코팅의 다양한 상업적으로 이용 가능한 자기 비드에 대한 미생물 포획 성능을 비교하고자 하였다. 이러한 실험은 표본으로 단순 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 150 mM NaCl)과 세척 완충액을 사용하여 수행하였으며, 즉 미생물 용해 혼합물을 첨가할 때까지 세제를 사용하지 않았다.
시험 조건:
Figure pct00041
모든 비드를 1 mL 1X Tris+NaCl(50 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 150 mM NaCl) 중에서 세척하고 1X Tris+NaCl 중에서 1% 고체로 재현탁하였다.
프로토콜:
샘플 설정:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰(한천 플레이트로부터 3 mL 브로쓰 접종)에서 미생물 오버나잇 액체 배양물(o/n)을 설정하였다. 다음 날(대략 16시간 후) 300 μL의 E. 콜리 및 S. 아우레우스 액체 배양물을 3 mL 브로쓰(1E-3 희석)에 접종하였고, 300 μL의 C. 알비칸스 액체 배양물을 3 mL 브로쓰(1E-1 희석)에 접종하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장을 수행하였다.
● 2시간 성장 후, 미생물 예비배양물을 1X Tris+NaCl 완충액에 희석하여(DF10) 미생물당 3개의 희석점을 생성하였다.
● 각각의 미생물 희석물에 대해 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 1 mL 표본(미생물 종당 3개의 희석물 및 3개의 NSC 샘플: 12개의 샘플 세트)을 15 μL 비드(1% 고체)가 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB(1X Tris+NaCl)를 첨가하고 튜브를 RT에서 3분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm에 대한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
분석:
● 이러한 결과는 깨끗한 시스템(즉, 생물학적 표본 대신 단순 Tris+NaCl 완충액)에서 다양한 비드 크기와 기능성 표면(카복실화 및 소수성)이 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 것과 같은 유사한 수준의 미생물 결합을 생성한다는 것을 보여준다.
● 흥미롭게도, 아민화된 비드(NH2-1.5)는 미생물 결합이 거의/전혀 없음을 나타내는 표본 유형에서 매우 열악한 Magnitor 결과를 생성하였다. 이러한 관찰은 아민화된 비드가 시험된 다른 비드와 유사한 수준의 미생물 포획을 생성한 혈액 브로쓰 표본의 상황과 다르다.
실시예 15: 다양한 크기와 기능성 코팅의 자기 비드를 사용하여 비-용해 혈액에서 광범위한 미생물 종(그람 음성, 그람 양성, 및 칸디다)을 포획할 수 있다
목표:
혈액 용해의 부재 하에 즉 결합 완충액 중에 세제가 없을 때 Momentum Magnitor 시험(ETGA 및 Confirm 기술)을 사용하여 다양한 크기와 기능성 코팅의 다양한 상업적으로 이용 가능한 자기 비드에 대한 미생물 포획 성능을 비교하고자 하였다.
시험 조건:
Figure pct00045
모든 비드를 1 mL 1X Tris+NaCl(50 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 150 mM NaCl) 중에서 세척하고 1X Tris+NaCl 중에서 1% 고체로 재현탁하였다
프로토콜:
샘플 설정:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰(한천 플레이트로부터 3 mL 브로쓰 접종)에서 미생물 오버나잇 액체 배양물(o/n)을 설정하였다. 다음 날(대략 16시간 후) 3 μL E. 콜리 및 S. 아우레우스 액체 배양물을 3 mL 브로쓰(1E-3 희석)에 접종하였고, 300 μL C. 알비칸스 액체 배양물을 3 mL 혈액 브로쓰(1E-1 희석)에 접종하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장을 수행하였다.
● 2시간 성장 후, 미생물 예비배양물을 혈액 브로쓰에 희석하여(DF10) 미생물당 3개의 희석점을 생성하였다.
● 각각의 미생물 희석물에 대해 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 1 mL 표본(미생물 종당 3개의 희석물 및 3개의 NSC 샘플: 12개의 샘플 세트)을 15 μL 비드(1% 고체)와 112 μL 결합 완충액(Tris-HCl + 소듐 클로라이드)으로 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가하였다.
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 3분 동안 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm에 대한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
분석:
● 이러한 결과는 다양한 비드 크기와 기능성 코팅이 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 것과 같이 혈액 용해의 부재 시 혈액으로부터 유사한 수준의 미생물 결합을 생성한다는 것을 보여준다.
● 그러나, ETGA에 의한 미생물 검출은 미생물 결합 동안 혈액 용해에 대한 이전 실험과 비교할 때 혈액 용해가 없을 때 NSC ETGA 신호의 증가에 의해 상당히 감소한다.
실시예 16: 자기 비드에 의한 미생물 포획은 다양한 복합 생물학적 표본 유형에서 발생한다
목표:
자기 비드를 사용한 미생물 포획이 혈액 외에 다른 복합 생체액에서도 가능한지 여부를 조사하고자 하였다.
시험 조건:
Figure pct00049
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰에서 E. 콜리 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정한 다음, 다음 날(대략 16시간 후) 3 μL o/n을 3 mL 브로쓰(E. 콜리 1E-3)에 첨가하고, 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장 인큐베이션을 수행하였다.
● 2시간 성장 후, E. 콜리 1E-3 예비배양물을 희석하여 각 표본 유형에서 5개의 연속 희석점(E. 콜리 1E-6 내지 1E-9)을 생성하였다. COL 한천 플레이트에서 100 μL TVC를 수행하였다.
DynaMag-2 자석 및 수동 액체 이송을 사용하여 수행된 Magnitor의 수동 시뮬레이션:
● 1 mL 표본을 112 μL 결합 완충액(500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드 + 10% Igepal + 2.5% Tergitol + 0.5% 소듐 디옥시콜레이트) + 15 μL 비드(BioEstapor 비드; Merck #BE-M08/03 (1% 고체))로 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가하였다 - Tris+NaCl 샘플 세트에 대한 샘플 튜브는 112 μL 결합 완충액으로 사전 로딩되지 않음에 유의한다(재성장 분석의 경우 미생물 성장을 억제할 수 있는 세제의 포함을 피하기 위함).
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 1 mL WB를 첨가하고 튜브를 RT에서 3분 동안 혼합하였다(1000 rpm) - 재성장 분석에서 미생물 성장을 억제할 수 있는 세제의 포함을 피하기 위해 Tris+NaCl 샘플 세트의 경우 세척 완충액 대신 1 mL Tris+NaCl 완충액을 첨가하였음에 유의한다.
● DynaMag-2 상에서 5분 자기화하였다.
● 모든 s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 자석이 제거된 튜브에 첨가하였다 - 재성장 분석의 경우 100 μL Tris+NaCl 완충액에서 비드를 재현탁하였음에 유의한다.
● ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm에 대한 수동 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
TVC(COL 플레이트 상에서 100 μL)
Figure pct00050
쌍을 이룬 Tris+NaCl 샘플 세트에 대한 재성장 분석
1. 100 μl의 Tris+NaCl 표본을 플레이팅/접종하였다 - '표본'.
2. 미생물 결합 단계 후 100 μl의 상등액을 플레이팅/접종하였다 - '결합 후'.
3. 세척 단계 후 100 μl의 상등액을 플레이팅/접종하였다 - '세척 후'.
4. 100 μL의 Tris+NaCl 완충액 중에 50 μl의 비드를 재현탁하고 플레이팅/접종하였다(즉 플레이트 상의 50% 물질 및 액체 배양물에 접종된 50% 물질) - '비드'.
플레이트 및 액체 배양물을 37℃에서 오버나잇 인큐베이션 하였다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Confirm에 대해 칸디다 채널에서 관찰 가능한 증폭이 없음에 유의한다.
Figure pct00054
분석:
● 이러한 결과는 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 바와 같이 자기 비드를 사용하여 다양한 복합 생물학적 표본 유형에서 미생물을 포획할 수 있음을 보여준다.
● 재성장 분석은 '비드' 샘플 세트에 대한 관찰 가능한 성장에 의해 결정된 바와 같이, E. 콜리가 자기 비드에 결합한 후 한천 및 액체 배양물에서 재성장할 수 있음을 보여준다.
실시예 17: 표본 용해 없이 비-혈액 표본에서 미생물 포획 및 검출이 가능하다
목표:
비-용해 결합 완충액 및 비-용해 세척 완충액을 사용하여 우유 및 소변의 비-혈액 표본에서 미생물 포획 및 검출을 보여주고자 하였다.
제조:
● 10X Tris+NaCl 결합 완충액 = 500 mM Tris-HCl [pH 8.0] + 1.5 M 소듐 클로라이드
● 1X Tris+NaCl 세척 완충액 = 10 X Tris+NaCl 결합 완충액 중의 10개의 희석물 중 1
● 신선한 (인간) 소변
● 반-탈지(저온살균) 우유
사용 전에 BioEstapor 비드(Merck, Cat# BE-M 08/0.3)를 재현탁하였다.
프로토콜:
● BacTec PLUS 호기성 브로쓰에서 E. 콜리, S. 아우레우스, C. 알비칸스 ,및 S. 뉴모니아 o/n 액체 배양물을 표준으로 설정하였다
● 다음 날(대략 16시간 후) 3 μL의 E. 콜리 및 S. 아우레우스 o/n을 사용하여 3 mL 브로쓰 배양물(1E-3 희석)에 접종하였고, 300 μL C. 알비칸스 및 S. 뉴모니아를 사용하여 신선한 3 mL 브로쓰 배양물(1E-1 희석)에 접종하였고; 37℃, 500 rpm에서 2시간 성장을 수행하였다.
● 2시간 성장 후, 미생물 예비배양물을 예열된 신선한 소변 및 신선한 우유에 연속 희석하여(DF10) 5개의 희석점을 생성하였다: E. 콜리 1E-5 내지 1E-9; S. 아우레우스 1E-5 내지 1E-9; C. 알비칸스 1E-2 내지 1E-6; 및 S. 뉴모니아 1E-2 내지 1E-6.
● 우유 및 소변에서 시험된 각각의 미생물 희석물에 대해 100 μL TVC를 수행하였다; 우유 및 소변에 대한 NSC를 3가지 유형의 한천 플레이트(SAB, COL, 및 CBA)에 플레이팅하였다.
● 1 mL 표본(각 미생물 종에 대해 5개의 희석물 및 4개의 NSC 샘플: 표본 유형당 24개 샘플)을 112 μL 결합 완충액 + 15 μL 비드(1% 고체)로 사전 로딩된 2 mL 샘플 튜브에 첨가한 다음, 자동화된 Magnitor 시험을 개시하였다.
epMotion 5073m 상에서 자동화된 샘플 처리:
● 37℃에서 30분 동안 오비탈 혼합하였다(1000 rpm).
● 15분 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 0.82 mL WB(1X Tris+NaCl)를 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 1 mL s/n을 제거하였다.
● 50 μL LM을 튜브에 첨가하면서 비드를 자기화하였다.
● 자기화 스위치를 끄고 ETGA 반응을 수행하였다: 26℃에서 1000 rpm에서 5분, 이어서 800 rpm에서 55분.
● ETGA 및 Confirm을 위한 qPCR을 설정하였다(10 μL 반응).
결과:
Figure pct00055
*계수 가능한 가장 높은 TVC에서 외삽된 Cfu/mL 값
(NB: 소변은 비-멸균 용액이므로 NSC 플레이트의 콜로니는 예상치 못한 것이 아님)
(NB: 저온살균 우유는 미생물을 함유하므로 NSC 플레이트에 콜로니가 있어야 함)
Figure pct00056
NB: 저온살균 우유는 박테리아를 함유함; 이는 일관된 ETGA Ct~22를 나타냄
Figure pct00057
분석:
● 이러한 결과는 ETGA 및 Confirm 판독값에 의해 결정된 바와 같이 표본 용해가 없는 혈액(특히 소변 및 우유)에 대한 대체 표본에서 자기 비드에 의한 미생물 포획이 가능함을 보여준다.
● 그러나 이러한 표본 유형(특히 우유)에 공생 미생물이 있으면 ETGA 및 Confirm 판독값에 대한 배경 신호 수준에 영향을 미친다.
실시예 18 내지 25
목적
항균제를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 임상 혈액의 미생물이 인큐베이션을 위해 신선한 배지에 접종되기 전에 '구조'되고 제거될 수 있는지 평가하고자 하였다. 구조된 유기체가 혈액 또는 항생제-함유 혈액에 남아 있는 유기체에 비해 더 효율적으로 성장하는지 여부에 대한 조사. 이러한 방법의 의도된 사용은 미생물의 회수 및 검출 가능성을 향상시키는 것이다.
소개
이미 항생제를 투여받은 환자에서 혈액 배양을 하면 환자가 분명히 감염되었더라도 혈액 배양에서 유기체가 자라지 않는 경우가 많다는 것은 널리 알려져 있다. 최근 몇 년 동안, 주요 혈액 배양 공급업체에서 항생제-흡수 수지가 포함된 병을 제공했지만 이는 문제를 부분적으로만 해결하였다. 이러한 조사에서 우리는 억제 농도의 항생제가 포함된 혈액에 유기체를 접종할 때 자기 포획 비드를 사용하여 유기체를 포획하고 항생제가 없는 혈액 배양 병에 유기체를 옮김으로써 유기체가 성장할 수 있음을 보여주는 것을 목표로 한다. 유기체 패널과 다양한 항생제를 시험하였다.
주요 발견:
● 말 혈액과 인간 혈액사이의 플립시간에 2 내지 4시간의 차이가 있지만 최종 결과는 유사하다. 따라서 말의 혈액을 사용하여 후속 실험을 수행할 수 있으며, 이는 (COVID-19 전염병으로 인해) 인간의 혈액을 사용할 수 없는 이 시기에 실질적으로 중요하다.
● 자기 비드가 있는 상태에서 샘플을 인큐베이션하여도 유기체의 성장을 돕거나 방해하지 않았다.
● E. 콜리와 S. 아우레우스에 대한 상이한 다른 포획 시약들 사이의 플립 시간은 매우 유사하며 이 구조 방법이 유기체 회수를 허용하고 혈액 용해제의 유무에 관계없이 수행될 수 있음을 보여준다.
● 항균제와 함께 혈액 내 박테리아를 포함하는 표준 호기성(SA) 병에서, 구조 방법은 5일째에 음성인 혈액 배양(BC) 대조군보다 전에 항상 양성으로 플립되었다. C. 알비칸스의 경우, 구조 방법 플립 시간이 BC 대조군보다 27시간 더 빨랐고 C. 네오포만스의 경우 13시간 이상 빨랐다.
● 유기체 포획을 위해 상이한 자기 비드 유형을 비교할 때(실시예 23), 모든 비드 구조 샘플은 5일 후에 음성이었던 비-구조된 혈액 배양 대조군과 비교하여 18시간 이내에 양성으로 플립되었다. 이는 시험된 5가지 모든 비드 유형과, 0.075 mg/L 시프로플록사신(Ciprofloxacin)을 포함하는 혈액 중의 E. 콜리 및 500 mg/L 반코마이신을 포함하는 혈액 중의 S. 아우레우스 모두에 해당된다.
● 유기체 포획을 위한 5가지 추가의 상이한 자기 비드 유형을 비교할 때(실시예 24), 음성이었던 비-구조된 혈액 배양 대조군과 비교하여 S. 아우레우스에 대해 모든 비드 구조 샘플이 17시간 이내에 양성으로 플립되었다. 이는 500 mg/L 반코마이신을 함유한 혈액 중의 S. 아우레우스에 대해 시험된 6가지 비드 유형 모두에 해당된다. E. 콜리의 경우, 0.075 mg/L 시프로플록사신을 함유한 혈액에서 시험된 6가지 모든 비드 유형에 대해 비드 구조 샘플이 30시간 이내에 양성으로 플립되었다. 혈액 배양 대조군(비드 구조 없음)은 음성이었다.
● 항생제-혈액(세프트리악손)의 높은 피크 혈청 농도에서, FA+ 혈액 배양 병은 문헌[Flayhart et al. 2007]에서 보고된 바와 같이, S. 뉴모니아를 회수하지 못한다. 본원에 제시된 데이터는 본 발명의 방법을 사용하여 S. 뉴모니아가 높은 피크 혈청 농도의 항생제를 함유하는 혈액에서 회수되고 성공적으로 성장할 수 있음을 보여준다.
● 문헌[Chung et al. 2019]에 의해 보고된 바와 같이, 항생제-혈액의 높은 피크 혈청 농도에서, FA+ 혈액 배양 병은 유기체를 회수하지 못한다. 본원에 제시된 데이터는 본 발명의 방법을 사용하여 높은 피크 혈청 농도의 항생제를 함유하는 혈액에서 유기체가 180 cfu/mL만큼 낮은 농도에서 회수되고 성공적으로 성장할 수 있음을 보여준다.
재료
완충액 및 시약 조성
Figure pct00058
유기체, 항균제, 및 기타 재료
● 혈액: 영국 Buckingham 소재 CS Biosciences Ltd.의 말(섬유소 제거)
● 시험 유기체:
○ 그람 양성: S. 아우레우스 ATCC 25923; S. 뉴모니아 ATCC 49619.
○ 그람 음성: E. 콜리 ATCC 25922, 클렙시엘라 뉴모니아 ATCC 13883, 슈도모나스 애루기노사 ATCC 27853.
○ 진균/효모: 칸디다 알비칸스 ATCC 10231, 크립토코커스 네오포만스 NCPF 8281.
● 항생제:
○ 그람 양성: S. 뉴모니아의 경우 반코마이신, 피페라실린, 세페핌, 세프트리악손
○ 그람 음성: 시플록사신, 피페라실린, 메로페넴, 세포탁심, 및 세페핌.
○ 효모: 암포테리신 B.
실시예 18: 피페라실린을 함유하는 혈액에서 S. 아우레우스 를 구조한다
목표:
본 반복 실험의 목적은 인간 혈액을 사용할 수 없는 시기에 말의 혈액이 인간 혈액을 대체할 수 있는지 여부를 평가하고자 하는 것이다.
프로토콜:
1일차: 혈액/브로쓰 배지(50 : 50 혈액 : 브로쓰)에서 시험 유기체의 오버나잇 배양물을 제조하고 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션한다.
2일차: 필요에 따라 혈액/브로쓰에서 오버나잇 배양물의 10배 연속 희석을 제조한다.
● 전혈(섬유소 제거된 말 혈액)에 필요한 수준의 항생제를 첨가한다.
● 무항생제 대조군으로서 전혈
● 유기체의 시험 희석물을 1 mL당 10 μL로 혈액 + 항생제 또는 혈액 단독에 첨가한다(실험 요구사항을 위해 충분히 제조함).
● 100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취한다(T0 샘플).
● 37℃(정적)에서 2시간 인큐베이션한다, 환자의 항균제에 대한 유기체의 노출 모방함.
● 100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취한다(T2 샘플).
● 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 혈액 배양 병에 첨가하고(바이알 어댑터 사용) 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
● 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독(동일한 기원)을 하기와 같이 Momentum 포획 비드로 처리한다:
1. 세제가 없는 미생물 결합 완충액(DMBB)에 Momentum 포획 비드를 희석한다 - 클린-업당 50 μL 비드 : 700 μL DMBB.
2. 750 μL 의 희석된 비드를 50 mL 원추형 원심분리 튜브에 첨가한다.
3. 5 mL의 전달 배지(transfer medium)를 튜브에 첨가한다.
4. 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 튜브에 첨가한다.
5. ITL TherMix(영국 Kent 소재 Integrated Technologies Ltd.) 상에서 인큐베이션한다, 32.5℃/30분/1000 rpm - 속도 증가 프로토콜.
6. V&P 자석(미국 CA 소재 V&P scientific Inc)에서 10분 동안 자기화한 다음 상등액을 제거한다.
7. 자석이 제거된 1 mL 세제가 없는 세척 완충액(DWB)에 비드를 재현탁하고 DynaMag-2 자석(영국 Paisley 소재 Thermo Fisher Scientific, Life Technologies Ltd.) 상의 2 mL Eppendorf 플립-탑 튜브로 옮긴다.
8. 3분 동안 자기화한 다음 상등액을 제거한다.
9. 자석이 제거된 1 mL 세제가 없는 세척 완충액(DWB)에 비드를 재현탁한 다음 DynaMag-2 자석으로 교체한다.
10. 3분 동안 자기화한 다음 상등액을 제거한다.
11. 1 mL DWB에 비드를 재현탁하고, 새로운 혈액 배양 병에 첨가하고(바이얼 어댑터 사용) 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
3일차: 플레이트 계수를 기록한다.
5일간의 인큐베이션 종료 시 각 병(bottle) 또는 병 결과(bottle result)의 "플립" 시간을 기록한다. "플립" 시간은 양성까지의 시간을 기록하는 자동화된 혈액 배양 캐비닛에 의해 결정된 바와 같이 병이 양성으로 변하는 때이다.
결과:
Figure pct00059
코멘트:
● 말과 인간 혈액 사이의 플립 시간에 2 내지 4시간의 차이가 있지만, 최종 결과는 유사하다.
● 따라서 인간 혈액을 사용할 수 없는 이 시기에 말의 혈액을 사용하여 후속 실험을 수행할 수 있다.
실시예 19: 중단점 실험 세부사항
목표:
후속 실험을 위한 항생제 농도 및 미생물 부하 측면에서 시작점을 결정하고자 하였다. 실험에 사용하기에 적절한 중단점을 찾기 위해 항생제 농도 범위를 시험하였다. 소정의 미생물 부하에 대해 다양한 항생제 농도를 시험하여 성장이 억제되었지만 미생물이 사멸되지 않은 농도를 결정하였다. 이는 0, 2.5, 및 5시간 간격으로 플레이트 계수에 의해 결정되었다.
프로토콜:
1. 1일차: 혈액/브로쓰 용액(1.5 mL 섬유소가 제거된 말 혈액: 1.5 mL 전달 배지)에서 시험 유기체의 오버나잇 배양물을 제조한다.
2. 2일차: 필요한 희석제에 항생제를 용해하여 적절한 저장 용액을 제조하고 최종 농도 범위가 100 내지 0.001 및 0 mg/L이 되도록 뉴클레아제가 없는 물에 희석 시리즈를 제조한다.
3. 예열된 혈액/브로쓰 용액에서 미생물의 오버나잇 배양물을 필요한 지점까지 희석한다. 이는 각 유기체/항생제 조합에 대해 결정해야 할 수 있지만, 시작 희석으로서 10-4가 사용된다(샘플에서 10-5의 최종 농도 제공).
4. 예열된 섬유소가 제거된 말 혈액 980 μL를 필요한 수의 2 mL 플립-탑 튜브에 분주한다.
5. 희석된 항생제 10 μL를 해당 튜브에 첨가하고, 마지막 튜브에 희석제 10 μL를 대조군으로서 첨가한다. 혼합.
6. 미생물의 오버나잇 배양물에 필요한 희석물 10 μL를 첨가한다. 혼합.
7. 각 튜브에서 100 μL의 샘플을 채취하고 시간 0 계수 동안 콜롬비아 혈액 한천(Columbia Blood Agar) 베이스에 플레이팅한다.
8. 성장/무성장 대조군으로서 희석된 오버나잇 배양물 100 μL를 플레이팅한다.
9. 진탕 인큐베이터(450 rpm)에서 37℃에서 샘플을 인큐베이션하고 2.5시간 및 5시간 간격으로 플레이트 계수를 위해 샘플 100 μL를 채취한다.
10. 플레이트를 37℃에서 오버나잇 인큐베이션한다.
11. 3일차: 플레이트를 계수하고 결과를 표로 작성한다. 미생물의 완전한 사멸 없이 성장을 억제하는 항생제 농도를 결정한다.
이 프로토콜에 의해 결정된 농도는 달리 명시되지 않는 한 다음 실시예에서 사용되었다.
실시예 20: 자기 비드 및/또는 항생제가 있거나 없는 유기체 성장
목표:
본 실험의 목적은 자기 비드의 존재가 유기체가 비드에 결합하고 고체 기질처럼 자라기 때문에 유기체가 더 빨리 성장할 수 있는지 여부를 평가하는 것이다. 이러한 실험은 항생제 유무와 자기 비드 유무(비드 이동 없음)의 혈액 브로쓰에서 유기체의 상대적 성장 속도를 조사한다.
프로토콜:
1일차: 혈액/브로쓰 배지(50 : 50 혈액 : 브로쓰)에서 시험 유기체의 오버나잇 배양물을 제조하고 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션한다.
2일차: 필요에 따라 혈액/브로쓰에서 오버나잇 배양물의 10배 연속 희석물을 제조하고 37℃에서 2시간 동안 성장을 위해 인큐베이션한다.
샘플 세트 1에서, 혈액 중의 시험 유기체의 희석물은 비드를 함유하고, 샘플의 복제 세트(세트 2)는 비드를 함유하지 않는다. 이러한 세트는 어느 것도 항생제를 함유하지 않는다.
샘플 세트 3에서, 혈액 중의 시험 유기체의 희석물은 항생제와 비드를 함유하며, 샘플의 복제 세트(세트 4)는 비드를 함유하지 않는다. 이 두 세트는 항생제를 함유한다.
필요한 수준에서 전혈(섬유소 제거된 말 혈액)에 항생제를 첨가한다.
무항생제 대조군으로서의 전혈.
샘플당 10 mL의 예열된 전혈을 사용하여, 혈액 1 mL당 10 μL의 유기체 시험 희석물을 첨가한다. 복제 세트에서, 3개의 튜브 각각에 관련 항균제를 첨가한다.
T0 TVC에 대해 이러한 샘플의 100 μL를 플레이팅한다.
10 mL 샘플에서 5 mL를 제거하여 세트 1과 세트 3을 생성한다.
5 mL 혈액당 50 μL의 원료 자기 비드를 세트 1과 세트 3 샘플 튜브에 첨가하고, 세트 2와 세트 4는 비드 없이 그대로 둔다.
바이알 어댑터(미국 PA 소재 West Pharmaceutical Services, Inc.)를 사용하여 5 mL의 스파이크 혈액 + 비드(세트 1) 및 5 mL의 스파이크 혈액/Abx + 비드(세트 3)를 혈액 배양 병(BioMerieux SA 배양 병)에 첨가한다.
그런 다음 5 mL의 스파이크 혈액(동일한 기원), 비드가 없는 대조군(세트 2 및 세트 4)을 혈액 배양 병에 첨가한다.
어댑터를 제거하고 자동 혈액 배양 캐비닛(BacT/ALERT BioMerieux)에서 혈액 배양 병을 최대 5일 동안 인큐베이션한다.
3일차: TVC 플레이트를 계수하고 기록한다.
5일간의 인큐베이션 종료 시 각 병 또는 병 결과의 "플립" 시간을 기록한다. "플립" 시간은 양성까지의 시간을 기록하는 자동화된 혈액 배양 캐비닛에 의해 결정된 바와 같이 병이 양성으로 변하는 때이다.
결과:
Figure pct00060
코멘트:
자기 비드가 있는 상태에서 샘플을 인큐베이션하여도 유기체의 성장을 돕거나 방해하지 않았다.
유기체 구조 실험을 위한 프로토콜(실시예 21 내지 실시예 24)
1일차: 혈액/브로쓰 배지(50 : 50 혈액 : 브로쓰)에서 시험 유기체의 오버나잇 배양물을 제조하고 진탕 인큐베이터에서 37℃(또는 C. 네오포만스의 경우 30℃)에서 인큐베이션한다.
2일차: 클린 룸에서, 실험에 사용할 항생제를 적당량 제조한다.
● 공식 1000/P x V x C = W를 사용하여 저장 용액을 제조한다.
● 상기 식에서 P = 제조업체가 제공한 역가(μg/mg), V = 필요한 부피(mL), C = 용액의 최종 농도(1000의 배수)(mg/L), 및 W = 부피 V(mL)에 용해될 mg 단위의 항생제 중량.
● 필요에 따라 혈액/브로쓰에서 오버나잇 배양물의 10배 연속 희석물을 제조하고 2시간 동안 성장을 위해 37℃(또는 C. 네오포만스의 경우 30℃)에서 인큐베이션한다.
● 전혈(섬유소가 제거된 말 혈액)에 필요한 수준의 항생제를 첨가한다.
● 무항생제 대조군으로서의 전혈
● 유기체의 시험 희석물을 혈액 1 mL당 10 μL로 혈액 + 항생제 또는 혈액 단독에 첨가한다(실험 요구 사항을 위해 충분히 제조함).
● 100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취한다(T0 샘플).
● 37℃(또는 C. 네오포만스의 경우 30℃)에서 2시간 인큐베이션한다(정적).
● 100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취한다(T2 샘플).
● 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 혈액 배양 병에 첨가하고(바이알 어댑터 사용) 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
● 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독(동일한 기원)을 아래와 같이 Momentum 포획 비드로 처리한다:
1. 포획 비드를 해당 포획 시약에 희석한다 - 50 μL 비드 : 클린업당 700 μL 포획 시약.
2. 50 mL 원추형 원심분리기 튜브에 희석된 비드 750 μL를 첨가한다.
3. 5 mL의 전달 배지를 튜브에 첨가한다.
4. 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 튜브에 첨가한다.
5. ITL TherMix에서 인큐베이션한다(32.5℃/30분/1000 rpm - 속도 증가 프로토콜).
6. V&P 자석에 10분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
7. 자석이 제거된 1 mL의 세제가 없는 세척 완충액(DWB) 중에 비드를 재현탁하고 DynaMag-2 자석 상의 2 mL Eppendorf 플립-탑 튜브로 옮긴다.
8. 3분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
9. 자석이 제거된 1 mL의 세제가 없는 세척 완충액(DWB)에 비드를 재현탁한 다음 DynaMag-2 자석으로 교체한다.
10. 3분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
11. 1 mL DWB에 비드를 재현탁하고, 새로운 혈액 배양 병에 첨가하고(바이알 어댑터 사용) 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
3일차: 플레이트 계수를 기록한다.
5일간의 인큐베이션 종료 시 각 병 또는 병 결과의 "플립" 시간을 기록한다. "플립" 시간은 양성까지의 시간을 기록하는 자동화된 혈액 배양 캐비닛에 의해 결정된 바와 같이 병이 양성으로 변하는 때이다.
실시예 21: 세제가 없거나 혈액 용해 포획 완충액을 사용할 때 유기체 구조의 비교.
목표:
유기체 구조 방법을 수행할 때 무세제 또는 혈액 용해 포획 완충액을 비교하고자 하였다. 상이한 포획 완충액은 성공적인 유기체 구조에 영향을 미치는가?
DMBB, E-Buff, 및 GMBB를 E. 콜리 및 S. 아우레우스 회수 모두에서 포획 시약으로서 비교하고 모든 세척에 DWB를 사용한다.
결과:
Figure pct00061
코멘트:
E. 콜리 및 S. 아우레우스에 대한 상이한 포획 시약 사이의 플립 시간은 매우 유사하며 이 구조 방법이 유기체 회수를 허용하고 혈액-용해제의 유무에 관계없이 수행될 수 있음을 보여준다.
실시예 22: 추가 미생물 및 항균제에 대한 유기체 구조의 적용
목표:
구조 방법이 다양한 미생물 및 항균제에 적용 가능함을 입증하고자 하였다.
반코마이신의 제조:
역가(potency)가 1008 μg/mg인 반코마이신(Lot# 058M4009V)의 경우, 다음 방정식을 사용하여 10,000 mg/mL 저장 용액 1 mL를 제조하는데 필요한 중량을 찾는다:
반코마이신 저장 용액은 공식 1000/P x V x C = W를 사용하여 제조하였다.
상기 식에서 P = 제조업체가 제공한 역가(μg/mg), V = 필요한 부피(mL), C = 용액의 최종 농도(1000의 배수)(mg/L), 및 W = 부피 V(mL)에 용해될 mg 단위의 항생제의 중량.
따라서, 1000/1008 x 10 mL x 10 = W
0.992 x 10 x 10 = W
W = 10,000 mg/mL 저장 용액의 경우 10 mL 식염수(0.9%) 중 99.2 mg.
S. 아우레우스의 두 가지 상이한 균주는 모든 시점에서 반코마이신의 모든 희석에서 성장하였다. 약물이 상대적으로 느리게 작용하고 실험 기간이 합리적인 시간 프레임 내에서 유지되어야 한다는 점을 감안할 때 후속 실험에 500 mg/L의 최종 농도를 사용하기로 결정하였다.
결과:
Figure pct00062
코멘트:
무항생제 대조군의 경우, 구조 방법 전에 혈액 배양이 항상 양성으로 플립되었다.
항균제와 함께 혈액 내 박테리아를 포함하는 표준 SA 병에서, 구조 방법은 5일차에 음성인 BC 대조군보다 전에 항상 양성으로 플립되었다. C. 알비칸스의 경우, 구조 방법 플립 시간이 BC 대조군보다 27시간 더 빨랐고 C. 네오포만스의 경우 13시간 이상 빨랐다.
실시예 23: 상이한 자기 비드 유형 I을 사용한 유기체 구조 비교
목표:
다음 5가지 상이한 비드 유형을 사용하여 구조 방법을 수행하고자 한다: 소수성, 아민화, 카복실화, SpeedBeads 및 스트렙타비딘 코팅, 및 포획 및 회수 효율성 비교.
Figure pct00063
결과:
Figure pct00064
Figure pct00065
코멘트:
모든 비드 구조 샘플은 5일 후에 음성이었던 비-구조된 혈액 배양 대조군과 비교하여 24시간 이내에(S. 아우레우스의 경우 18시간 이내) 양성으로 플립되었다.
이는 0.075 mg/L의 시프로플록사신을 함유하는 혈액 중의 E. 콜리와 500 mg/L의 반코마이신을 함유하는 혈액 중의 S. 아우레우스에 대해 시험된 5가지 비드 유형 모두에 해당된다.
실시예 24: 상이한 자기 비드 유형 II를 사용한 유기체 구조 비교
목표:
추가의 다음 5가지 상이한 비드 유형을 사용하여 구조 방법을 수행하고자 하였다: 시트레이트-캡핑, 전분-캡핑, 폴리아크릴아미드, 만노스-결합 렉틴 및 폴리리신, 및 포획 및 회수 효율 비교.
Figure pct00066
결과:
Figure pct00067
Figure pct00068
코멘트:
모든 비드 구조 샘플은 음성인 비-구조된 혈액 배양 대조군과 비교하여 S. 아우레우스의 경우 17시간 이내에 양성으로 플립되었다. 이는 500 mg/L의 반코마이신을 함유하는 혈액 중의 S. 아우레우스에 대해 시험된 6가지 비드 유형 모두에 해당된다.
E. 콜리의 경우, 비드 구조 샘플은 0.075 mg/L 시플록사신을 함유하는 혈액에서 시험된 6가지 비드 유형 모두에 대해 30분 이내에 양성으로 플립되었다. 혈액 배양 대조군(비드 구조 없음)은 음성이었다.
실시예 25: 항생제가 있는 상태에서 FA와 BacT/ALERT 혈액 배양 병에서 회수되지 않는 미생물의 유기체 구조 비교
문헌[Flayhart et al. ] 및 문헌[Chung et al .]의 작업을 재현하기 위한 프로토콜
1일차: 혈액/브로쓰 배지(50 : 50 혈액 : 브로쓰)에서 시험 유기체의 오버나잇 배양물을 제조하고 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션한다.
2일차: 클린 룸에서, 실험에 사용할 항생제를 적당량 제조한다.
● 공식 1000/P x V x C = W를 사용하여 저장 용액을 제조한다.
● 상기 식에서 P = 제조업체가 제공한 역가(μg/mg), V = 필요한 부피(mL), C = 용액의 최종 농도(1000의 배수)(mg/L), 및 W = 부피 V(mL)에 용해될 mg 단위의 항생제의 중량.
● 필요에 따라 혈액/브로쓰에서 오버나잇 배양물의 10배 연속 희석물을 제조하고 2시간 동안 성장을 위해 37℃에서 인큐베이션한다.
● 전혈(섬유소가 제거된 말 혈액)에 필요한 수준의 항생제를 첨가한다.
● 무항생제 대조군으로서의 전혈
● 유기체의 시험 희석물을 혈액 1 mL당 10 μL로 혈액 + 항생제 또는 혈액 단독에 첨가한다(실험 요구 사항을 위해 충분히 제조함).
● 100 μL 플레이트 계수 샘플을 채취한다(T0 샘플).
● 바이알 어댑터를 사용하여, 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 혈액 배양 병(BioMerieux FA+ 배양 병)에 첨가하고 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
● 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독(동일한 기원)을 다음과 같이 Momentum 포획 비드로 처리한다:
1. Momentum 포획 비드를 관련 포획 시약 중에 희석한다 - 클린-업 당 50 μL 비드 : 700 μL 포획 시약.
2. 750 μL의 희석된 비드를 50 mL 원추형 원심분리 튜브에 첨가한다.
3. 5 mL의 전달 배지를 튜브에 첨가한다.
4. 5 mL의 스파이크 혈액 + abx 또는 혈액 단독을 튜브에 첨가한다.
5. ITL TherMix 상에서 인큐베이션한다(32.5℃/30 분/1000 rpm - 속도 증가 프로토콜).
6. V&P 자석에 10분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
7. 자석이 제거된 1 mL의 세제가 없는 세척 완충액(DWB) 중에 비드를 재현탁하고 DynaMag-2 자석 상의 2 mL Eppendorf 플립-탑 튜브로 옮긴다.
8. 3분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
9. 자석이 제거된 1 mL의 세제가 없는 세척 완충액(DWB)에 비드를 재현탁한 다음 DynaMag-2 자석으로 교체한다.
10. 3분 동안 자기화한 후 상등액을 제거한다.
11. 1 mL DWB에 비드를 재현탁하고, 바이알 어댑터를 사용하여 사용하지 않은 혈액 배양 병(BioMerieux FA+ 배양 병)에 첨가하고 인큐베이션을 시작한다(어댑터 제거).
3일차: 플레이트 계수를 기록한다.
5일간의 인큐베이션 종료 시 각 병 또는 병 결과의 "플립" 시간을 기록한다. "플립" 시간은 양성까지의 시간을 기록하는 자동화된 혈액 배양 캐비닛에 의해 결정된 바와 같이 병이 양성으로 변하는 때이다.
문헌[Flayhart et al. 2007]에 의한 실험 재현
목표:
세프트리악손 중의 S. 뉴모니아에 대한 FA 플러스 병의 유기체 포획 및 구조를 비교하고자 하였다. 250, 125, 및 94 mg/L의 항생제 농도를 시험하고 50 및 10 mg/L의 농도도 또한 포함하는 문헌[Flayhart et al. 2007]의 실험을 재현하였다.
결과:
하기 표에서, "대조군"은 FA 플러스 병(마지막 컬럼에서 "BC"로도 지칭됨)에서 처리된 샘플을 나타내고 "비드 구조"는 본 발명의 방법에 따라 처리된 샘플을 지칭한다.
Figure pct00069
코멘트:
항생제-혈액(세프트리악손)의 높은 피크 혈청 농도에서, FA+ 혈액 배양 병은 문헌[Flayhart et al. 2007]에 의해 보고된 바와 같이 S. 뉴모니아를 회수하지 못한다. 이러한 데이터는 본 발명의 방법을 사용하여, S. 뉴모니아가 높은 피크 혈청 농도의 항생제를 함유하는 혈액에서 회수되고 성공적으로 성장할 수 있음을 보여준다. 이러한 실험은 본 발명의 방법이 Flayhart에 의해 시험된 바와 같이 FA 플러스 병보다 개선되었음을 보여준다.
문헌[Chung et al. 2019]에 의한 실험 재현
목표:
FA 플러스 병으로부터 유기체 포획 및 구조를 비교하기 위해, 아래 표의 유기체에 대해 각각의 항생제를 사용하였다. 문헌[Chung et al. 2019]의 논문에 보고된 바와 같이, 추가 항생제 농도를 시험하였다(세페핌, 세포탁심, 및 메로페넴 각각에 대해 164 mg/L, 100 mg/L, and 49 mg/L).
Figure pct00070
결과:
하기 표에서, "대조군"은 FA 플러스 병(마지막 컬럼에서 "BC"로도 지칭됨)에서 처리된 샘플을 나타내고 "비드 구조"는 본 발명의 방법에 따라 처리된 샘플을 지칭한다.
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
코멘트:
항생제-혈액의 높은 피크 혈청 농도에서, FA+ 혈액 배양 병은 문헌[Chung et al. 2019]에 의해 보고된 바와 같이 유기체를 회수하지 못한다. 이러한 데이터는 본 발명의 방법을 사용하여, 유기체가 높은 피크 혈청 농도의 항생제를 함유하는 혈액에서 회수되고 성공적으로 성장할 수 있음을 보여준다. 이러한 실험은 본 발명의 방법이 Chung에 의해 시험된 FA 플러스 병보다 개선되었음을 보여준다.
참고문헌:
Flayhart D, Borek AP, Wakefield T, Dick J, Carroll KC. Comparison of BACTEC PLUS blood culture media to BacT/Alert FA blood culture media for detection of bacterial pathogens in samples containing therapeutic levels of antibiotics. J Clin Microbiol. 2007 Mar;45(3):816-21. doi: 10.1128/JCM.02064-06. Epub 2006 Dec 13. PMID: 17166960; PMCID: PMC1829095.
Chung Y, Kim IH, Han M, Kim HS, Kim HS, Song W, Kim JS. A comparative evaluation of BACT/ALERT FA PLUS and FN PLUS blood culture bottles and BD BACTEC Plus Aerobic and Anaerobic blood culture bottles for antimicrobial neutralization. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019 Dec;38(12):2229-2233. doi: 10.1007/s10096-019-03663-3. Epub 2019 Aug 2. PMID: 31375943.
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<400> 116 cggcggtaca cctgctgtta tgaa 24 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer seqeuence <400> 117 tgcttgattg tggatgtagc aaatgtcc 28 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 118 aattgcatgg ctttcaagcc agcc 24 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 119 attagccgac ttcaagccat ccgg 24 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 120 tgcctcgtcg tttgacatta ccatca 26 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 121 aggtacttac ttcaagggta aagctagagt 30 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 122 tactatcttg ccagggtctc ccaca 25 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 123 tcctgctatt gctgacaaga ttga 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 124 aggtcggtgg tactcaaagt gtca 24 <210> 125 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 125 tgctaagtta gtctctaatg cctccc 26 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 126 tcagcaaagc gcaagttggt gttg 24 <210> 127 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 127 agagaaatta tcgcagactc tttcgagact 30 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 128 attctctggc ggttctcacg gttt 24 <210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 129 acccaagact tctgaggctg aagc 24 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 130 tggttcttgc tggtggtctg gaaa 24 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 131 agaagctttc gaaggcggtc caat 24 <210> 132 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 132 cctctcttat atttcaactc tggcct 26 <210> 133 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 133 tgcttgtctc ggaagaaatt ctcgct 26 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 134 tgcttcgcaa gccatgttgt atgc 24 <210> 135 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 135 accgttggtg ataccatcag aaactcc 27 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 136 tctgacagca ctccattgtt ggct 24 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 137 aaaggctaga gtgtttgacg ccga 24 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe or primer sequence <400> 138 tgcttgatgg tgaccagatg actgt 25 <210> 139 <211> 25 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<400> 146 aagaaagaag tggctgcctc ctga 24

Claims (27)

  1. 미생물 세포 및 항균제를 포함하는 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 방법으로서,
    a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계; 및
    b) 항균제에서 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    회수된 생존 미생물의 검출 및/또는 특성분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 항균제를 포함하고 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 생존 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 방법으로서,
    a) 샘플에 미생물이 존재하는 경우 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계;
    b) 항균제에서 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 단계; 및
    c) 회수된 미생물의 부재 또는 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 미생물 세포 및 항균제를 포함하는 샘플에서 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 방법으로서,
    a) 샘플을 코팅된 입자와 함께 인큐베이션하여 입자-미생물 복합체를 형성하는 단계;
    b) 항균제에서 입자-미생물 복합체를 분리하여 샘플에서 생존 미생물을 회수하는 단계; 및
    c) 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 대상체 유래의 샘플에서 제5항의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 대상체에서 미생물 감염의 부재 또는 존재를 검출하는 방법으로서,
    선택적으로 상기 대상체는 항균제로 처리되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 감염의 원인이 되는 미생물을 특성분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 또한 비-미생물 세포를 포함하고, 단계 b)는 항균제와 비-미생물 세포로부터 입자-미생물 복합체를 분리하며, 선택적으로 상기 비-미생물 세포는 혈액 세포를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 세제의 부재 하에 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 소듐 폴리아네톨 설포네이트 및/또는 샘플 중의 비-미생물 세포를 선택적으로 용해하면서 샘플 중에 존재하는 온전한 미생물을 유지하는 시약의 존재 하에 수행되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 분리된 입자-미생물 복합체를 세척하는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 분리된 입자-미생물 복합체는 세제를 함유하지 않는 용액으로 세척되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 자기장 또는 원심분리를 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 조성물로서,
    a) 항균제 및 생존 미생물을 함유하는 샘플; 및
    b) 샘플 중의 생존 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 포함하는, 조성물.
  14. 항균제 및 코팅된 입자와 복합된 생존 미생물을 함유하는 샘플을 포함하는, 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    생존 미생물 세포를 함유하는 샘플은 비-미생물 세포를 추가로 포함하며, 선택적으로 상기 비-미생물 세포는 혈액 세포를 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    a) 생존 미생물과 복합체를 형성할 수 있는 코팅된 입자를 함유하는 용기; 및
    b) 코팅된 입자를 사용하여 회수된 생존 미생물을 인큐베이션하고/하거나 배양하기에 적합한 배지 및 항균제 및/또는 항균제와 결합할 수 있는 제제를 함유하지 않는 용기; 및/또는
    c) 샘플에서 회수된 코팅된 입자를 세척하기 위한 세척 완충액을 함유하는 용기로서, 상기 세척 완충액은 생존 미생물을 용해하지 않는 용기를 포함하는, 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    (별개의 용기에) 구성성분 a), b), 및 c)를 포함하는, 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    세척 완충액은
    a) 세제가 없고;
    b) Tris 및/또는 소듐 클로라이드를 포함하고/하거나;
    c) 비-미생물 세포를 용해시키지 않는, 키트.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 생존 미생물의 핵산 변형 활성에 대한 기질로서 작용하여 샘플에 미생물의 존재 여부의 결정을 가능케 하는 핵산 분자; 및/또는
    b) 생존 미생물 유래의 핵산에 특이적으로 혼성화되어 샘플 중의 미생물의 특성분석을 가능케 하는 프라이머 및/또는 프로브를 추가로 포함하는, 키트.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 박테리아 또는 진균인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  21. 제1항 내지 제12항 및 제20항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제20항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항균제는 항생제 또는 항진균제인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  22. 제1항 내지 제12항, 제20항, 및 제21항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 항균제를 투여받고 있거나, 투여 받았거나, 항균제를 사용하여 치료된 대상체로부터 채취된 임상 샘플인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  23. 제1항 내지 제12항 및 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 혈액, 뇌척수액(CSF), 관절액, 소변, 및 기관지폐포 세척(BAL)으로부터 선택되는, 방법, 조성물 또는 키트.
  24. 제1항 내지 제12항 및 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 혈액 또는 혈액 배양 샘플을 포함하고, 선택적으로 상기 샘플은 전혈을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  25. 제1항 내지 제12항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    코팅된 입자는 자성인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  26. 제1항 내지 제12항 및 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    코팅된 입자는 중합체성 표면을 포함하고, 선택적으로 상기 중합체성 표면은 탄소-기재 중합체인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  27. 제1항 내지 제12항 및 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항, 제13항 내지 제15항 및 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항, 또는 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    코팅된 입자는 외부 표면 상에:
    i) 카복실산기
    ii) 아미노기
    iii) 소수성기; 및
    iv) 스트렙타비딘
    중 어느 하나 이상을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
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