ES2966701T3 - Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos - Google Patents

Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos Download PDF

Info

Publication number
ES2966701T3
ES2966701T3 ES20793076T ES20793076T ES2966701T3 ES 2966701 T3 ES2966701 T3 ES 2966701T3 ES 20793076 T ES20793076 T ES 20793076T ES 20793076 T ES20793076 T ES 20793076T ES 2966701 T3 ES2966701 T3 ES 2966701T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
microorganisms
blood
microorganism
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES20793076T
Other languages
English (en)
Inventor
Helen Victoria Bennett
Paul Jay
Daniel Lockhart
William Mullen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Momentum Bioscience Ltd
Original Assignee
Momentum Bioscience Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Momentum Bioscience Ltd filed Critical Momentum Bioscience Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2966701T3 publication Critical patent/ES2966701T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Los métodos para recuperar microorganismos viables de una muestra que comprende un agente antimicrobiano comprenden incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo y luego separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano. Estos métodos se utilizan para detectar la ausencia o presencia de un microorganismo en una muestra que también contiene un agente antimicrobiano. También se proporcionan las composiciones y kits correspondientes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de la recuperación de microorganismos a partir de muestras que contienen un agente antimicrobiano. Por lo tanto, los métodos de la invención permiten la determinación de la ausencia y presencia de patógenos microbianos en muestras clínicas tales como sangre no purificada, hemocultivos y otros fluidos corporales. Las aplicaciones de la presente invención incluyen la determinación de la presencia o ausencia de microorganismos viables, la determinación de su estado Gram, especies y susceptibilidad/resistencia a los antimicrobianos. La presente invención también se puede utilizar para controlar la eficacia del tratamiento antimicrobiano de un paciente.
Antecedentes de la invención
Los presentes inventores han reconocido que en muestras tomadas de sujetos sospechosos de portar una infección microbiana hay niveles mucho mayores de células sanguíneas nucleadas (leucocitos) de lo que se imaginaba anteriormente, aunque la mayoría de las muestras no provienen en realidad de sujetos infectados. Esto ha llevado a la necesidad de métodos mejorados para separar microbios potenciales de las células sanguíneas, en particular leucocitos, en muestras de sangre tomadas de pacientes examinados para detectar infección.
Cuando se toman muestras de sangre de pacientes a los que ya se les ha administrado un agente antimicrobiano, en los hemocultivos posteriores a menudo no se desarrollan microorganismos, incluso cuando el paciente claramente tiene una infección. Scerbo et al., Surg Infect (Larchmt). Junio de 2016; 17 (3): 294-302; Sinha et al., Clin Microbiol Rev. 28 de febrero de 2018; 31 (2), e00089-17; Scheer et al., Clin Microbiol Infect. 2019 marzo;25(3):326-331).
Para solucionar este problema, los proveedores de hemocultivos han proporcionado frascos de hemocultivo que contienen resina absorbente de antibióticos (por ejemplo, frascos BACTEC PLUS de Becton Dickinson y frascos BacT/Alert de bioMerieux). Flayhart et al. (J.Clin. Microbiol. (2007), 816-821) describe las pruebas de frascos BACTEC PLUS y BacT/Alert en condiciones simuladas. En presencia de ceftriaxona, ninguno de los sistemas pudo recuperarseStreptococcus pneumoniae.
Chung et al. (Eur J Clin Microbiol Infect Dis. (2019), 38(12):2229-2233) también describe la prueba de frascos BacT/Alert y frascos BACTEC Plus en condiciones simuladas. Ambos sistemas mostraron tasas de detección bajas o nulas en presencia de ciertos agentes antimicrobianos. Por ejemplo,E. colioK. neumoníaen presencia de cefepima;E. colien presencia de cefotaxmina; yE. coli, K. pneumoniea o P. aeruginosa en presencia de meropenem.Por tanto, ninguno de los sistemas puede recuperar universalmente microorganismos de una muestra que contiene un agente antimicrobiano.
En el documento WO2009/007719, las ligasas dependientes de NAD se describen como un indicador útil de la presencia de un microorganismo en una muestra. Las ligasas son enzimas que catalizan la ligadura de moléculas de ácido nucleico. La reacción de ligadura requiere ATP o NAD+ como cofactor dependiendo de la ligasa en cuestión.
El documento WO2011/130584 describe un método para la detección de microorganismos viables basado en la detección de ADN o ARN polimerasas en donde una muestra se pone en contacto con un sustrato de ácido nucleico que actúa como sustrato para la polimerasa microbiana, se incuba en condiciones adecuadas para la actividad polimerasa de microorganismos intactos y cualquier producto de ácido nucleico resultante se determina usando una técnica de amplificación de ácido nucleico tal como reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Estos ensayos se han denominado "ensayos ETGA", donde ETGA significa Generación y amplificación de plantillas enzimáticas. Un problema con los ensayos ETGA para microorganismos viables en muestras crudas es la presencia de actividad polimerasa contaminante fuera de los microorganismos que surgen de células huésped (por ejemplo, humanas) y microorganismos muertos. El ensayo ETGA no puede distinguir la actividad polimerasa de los microorganismos de la del huésped o de los microorganismos muertos.
El documento WO2010/119270 describe un método para eliminar la actividad de la ADN ligasa fuera de los microorganismos intactos. El documento WO2011/070507 describe la lisis selectiva de células animales utilizando un detergente no iónico y un tampón. El documentoWO2017/182775 describe un método para detectar la ausencia o presencia de un microorganismo en una muestra que también puede contener células que no son microorganismos, que comprende la lisis selectiva de células que no son microorganismos, filtrar el lisado y detectar la ausencia o presencia de microorganismos retenidos dentro o sobre el filtro.
Se conoce el uso de perlas magnéticas recubiertas con restos de unión específicos, tales como anticuerpos, para la captura de especies objetivo. La especificidad de estos productos se define por la especificidad del anticuerpo u otro ligando de unión, que generalmente se elige para un propósito particular por ser altamente específico para permitir el aislamiento de un microorganismo particular.
El documento WO03/102184 describe métodos, composiciones y kits para concentrar o separar células (por ejemplo, bacterias) usando agentes floculantes, tales como poliaminas o detergentes catiónicos, para formar complejos con células que hacen que se agreguen. La separación de las células agregadas se puede efectuar con una fase sólida que sea capaz de unir las células, tal como perlas magnéticas.
El documento WO01/53525 describe un método para aislar células (por ejemplo, microorganismos) de una muestra, método que comprende unir las células a un soporte sólido por medio de un ligando de carbohidrato inmovilizado sobre el soporte sólido. DiaSorin Molecular vende un kit para realizar dicho método (kit "Bugs'n Beads™").
Otros kits para aislar microorganismos incluyen perlas magnéticas ApoH-Technologies Peps6. Las perlas están recubiertas con la molécula sintética Peps6, que se deriva de la proteína apolipoproteína H (ApoH), también conocida como glicoproteína p-2.
Cartwright et al. (EBioMedicine (2016) 9:217-227) describe la captura de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) utilizando perlas magnéticas recubiertas con lectina de unión a manosa. Los PAMP son, de acuerdo con Cartwright, materiales de la pared celular de carbohidratos y vesículas de la membrana externa que son liberados por diversos tipos de patógenos vivos y muertos. Cartwright afirma que la liberación de PAMP por parte de los patógenos aumenta cuando los antibióticos los matan. El ensayo Cartwright no tiene como objetivo recuperar microorganismos viables de una muestra.
Los documentos WO2018/044966, EP1118676, CN109929763, CN109741896 describen el uso de perlas para capturar microorganismos de muestras que no contienen un agente antimicrobiano.
Descripción de la invención
La invención se refiere a la recuperación de microorganismos viables a partir de una muestra que comprende células de microorganismos y un agente antimicrobiano capturando microorganismos con partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo y separando los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano. Los inventores han descubierto que las partículas recubiertas son capaces de unirse universalmente a microorganismos y, por lo tanto, pueden recuperar una variedad de tipos de microorganismos, tales como bacterias y hongos, sin saber qué tipo está presente en la muestra apriori.La recuperación de panmicroorganismos de acuerdo con la invención es eficaz para eliminar el efecto inhibidor del crecimiento del agente antimicrobiano. Esto proporciona una forma alternativa y, como se demuestra en los experimentos comparativos presentados en el presente documento, más eficaz de abordar el problema que se aborda actualmente en la práctica clínica mediante el uso de frascos de hemocultivo que contienen resina absorbente de antibióticos. Como se demuestra en el presente documento, los microorganismos recuperados permanecen viables y se recuperan rápidamente para demostrar crecimiento. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que esta recuperación se puede lograr con partículas recubiertas que carecen de fracciones complejas, tales como anticuerpos, que se unen a microorganismos (específicos) de manera específica.
Además de rescatar los microorganismos de un agente antimicrobiano, la presente invención también permite rescatar microorganismos de inhibidores de análisis posteriores tales como restos de células sanguíneas, hemoglobina y ADN de leucocitos que pueden afectar gravemente técnicas tales como la detección e identificación molecular. La eliminación de plaquetas también puede resultar útil en algunas técnicas para determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos.
La presente invención también da como resultado una concentración significativa de los microorganismos (por ejemplo, los microorganismos en una muestra de sangre de 5 ml se pueden concentrar en decenas de jl), particularmente cuando se compara con frascos de hemocultivo que contienen resina absorbente de antibióticos (por ejemplo, frascos BACTEC PLUS de Becton Dickinson y frascos BacT/Alert de bioMerieux). Esto es ventajoso para aplicaciones posteriores que requieren una mayor concentración de microorganismos. Se pueden realizar diversas pruebas, incluyendo pruebas moleculares, para detectar y/o caracterizar microorganismos viables recuperados y generalmente se requiere una muestra más concentrada para realizar, o es ventajosa en el contexto de, tales ensayos. En el presente documento se analizan ensayos adecuados, incluyendo ensayos de EGTA, PCR o ensayos de secuenciación y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST), en particular AST de múltiples pocillos que se realiza en volúmenes relativamente bajos. Proporcionar una muestra adecuadamente concentrada mejora inicialmente los tiempos de procesamiento, ya que se puede evitar un paso de concentración adicional en las pruebas posteriores de los microorganismos.
Métodos
La invención proporciona un método para recuperar microorganismos viables a partir de una muestra que comprende células de microorganismos y un agente antimicrobiano, comprendiendo el método: a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo; y b) separar los complejos partículamicroorganismo del agente antimicrobiano; recuperando así microorganismos viables de la muestra; y c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados en el paso b), en donde la muestra es de un sujeto que ha sido tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
El término "microorganismos viables" se refiere a microorganismos que no están muertos y se aplica a todos los aspectos de la divulgación. Por lo tanto, son microorganismos que no han sido matados por el agente antimicrobiano. Los microorganismos viables pueden ser capaces de recuperarse metabólicamente de la exposición al agente antimicrobiano y/o crecer en condiciones adecuadas (una vez recuperados de la muestra que contiene el agente antimicrobiano, como se describe en el presente documento). Por "crecimiento" se entiende tanto un aumento en volumen/tamaño como la capacidad de proliferar, en particular la capacidad de proliferar (a través de síntesis, replicación de ADN y división celular).
Al recuperar microorganismos viables de la muestra, se puede reducir sustancialmente la concentración de agente antimicrobiano a la que están expuestos los microorganismos viables recuperados. Al recuperar microorganismos viables de la muestra, se puede aumentar la concentración de microorganismos viables con respecto a la muestra. La mayor concentración de microorganismos viables puede ayudar en procesos posteriores, tal como la caracterización de los microorganismos viables.
El paso de "incubar la muestra" se refiere a poner en contacto la muestra con las partículas recubiertas en condiciones propicias para la formación de complejos partícula-microorganismo. En algunas realizaciones, el paso de incubar la muestra con partículas recubiertas comprende poner en contacto las partículas recubiertas con la muestra durante un período de tiempo fijo (por ejemplo, 30 minutos) a una temperatura especificada (por ejemplo, 37 °C). La incubación se puede realizar con o sin agitación (por ejemplo, mediante un agitador de plataforma, un agitador orbital o una incubadora con agitación ajustada a 500-1000 rpm). La incubación puede realizarse en ausencia de un agente fijador. Un agente fijador puede ser un agente fijador reticulante o no reticulante. Los fijadores reticulantes funcionan formando enlaces químicos entre los microorganismos de la muestra. Los fijadores no reticulantes no alteran químicamente los microorganismos de la muestra; más bien simplemente los precipitan.
El método de la invención comprende incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados. Los microorganismos viables pueden incubarse y/o cultivarse mientras permanecen unidos a las partículas recubiertas (es decir, en complejo).
De acuerdo con los métodos de la invención, cultivar los microorganismos viables recuperados puede comprender aumentar el número de microorganismos viables. En los métodos, la incubación de los microorganismos viables recuperados puede considerarse una fase distinta y, por lo tanto, puede no comprender aumentar el número de microorganismos viables. Es posible que los microorganismos expuestos a agentes antimicrobianos no estén en condiciones de crecer durante un período posterior a la recuperación. Por lo tanto, incubar los microorganismos viables recuperados puede comprender permitir que los organismos experimenten una recuperación metabólica después de la exposición al agente antimicrobiano. Para algunos métodos de caracterización posteriores, no es necesario que los microorganismos crezcan; sin embargo, la recuperación metabólica puede ser importante. Por lo tanto, es posible que algunos métodos no impliquen un paso de cultivo después de la recuperación. Sin embargo, tras la recuperación metabólica, los microorganismos viables pueden entrar en una fase de crecimiento. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden comprender tanto incubación como cultivo, para permitir la recuperación metabólica seguida del crecimiento.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para incubar y/o cultivar microorganismos viables recuperados de una muestra que comprende células de microorganismos y un agente antimicrobiano, comprendiendo el método: a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo; b) separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano, recuperando así microorganismos viables de la muestra; y c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados, en donde la muestra proviene de un sujeto que ha sido tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
Los métodos de la invención pueden comprender además detectar y/o caracterizar los microorganismos viables recuperados. "Detectar" se refiere a determinar o confirmar, mediante cualquier medio adecuado, si efectivamente había microorganismos viables en la muestra que se ha recuperado. La "caracterización" va más allá de detectar la presencia o ausencia de microorganismos y proporciona información adicional sobre los microorganismos viables recuperados. La caracterización puede comprender determinar si la muestra contiene bacterias y/u hongos. Esto es particularmente relevante en muestras clínicas, especialmente aquellas tomadas de sujetos sospechosos de tener una infección (por ejemplo, pacientes con posible sepsis). La caracterización puede comprender adicionalmente (que puede ser secuencial, es decir, determinar primero si hay un microorganismo (tal como bacteria u hongo) presente y, de ser así, realizar un paso de caracterización adicional) o, alternativamente, identificar el género o especie de microorganismo recuperado de la muestra. La caracterización puede comprender determinar el estado Gram del microorganismo (es decir, si la bacteria es gramnegativa o grampositiva). Estos tipos de caracterización pueden ser particularmente útiles para determinar qué tipo de agente antimicrobiano es el más adecuado para el sujeto del que se tomó la muestra. La caracterización puede comprender determinar la susceptibilidad y/o resistencia a los antimicrobianos de los microorganismos. Se puede emplear cualquier método adecuado para estos pasos adicionales; ejemplos de tales métodos se analizan más detalladamente en el presente documento.
Por tanto, la invención proporciona un método para detectar la ausencia o presencia de un microorganismo viable en una muestra que comprende un agente antimicrobiano y que se sospecha que contiene un microorganismo, comprendiendo el método: a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partículamicroorganismo ( si el microorganismo está presente en la muestra; si no está presente no se pueden formar complejos); b) separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano, recuperando así microorganismos viables de la muestra; y c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables; y d) detectar la ausencia o presencia de microorganismos viables, en donde la muestra proviene de un sujeto que ha sido tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
De manera similar, la invención proporciona un método para detectar la ausencia o presencia de un microorganismo viable en una muestra que comprende un agente antimicrobiano y que se sospecha que contiene un microorganismo, comprendiendo el método: a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partículamicroorganismo ( si el microorganismo está presente en la muestra; si no está presente no se pueden formar complejos); b) separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano, recuperando así microorganismos viables de la muestra; c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados; y d) detectar la ausencia o presencia de microorganismos viables, en donde la muestra proviene de un sujeto que ha sido tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
El sujeto se ha tratado con un agente antimicrobiano. Esta es entonces la fuente del agente antimicrobiano en la muestra. La muestra es típicamente una muestra clínica como se analiza en el presente documento. El sujeto es típicamente un sujeto humano, a menudo un sujeto humano del que se sospecha que padece una infección (que puede ser una infección bacteriana o fúngica).
En estos métodos, el método puede comprender además caracterizar el microorganismo responsable de la infección. Se puede emplear cualquier método adecuado de caracterización, como se analiza en el presente documento (cuya discusión se aplicamutatis mutandis).
Como ya se mencionó, la presente invención es particularmente aplicable a muestras clínicas. Estas muestras suelen contener células que no son microorganismos. De hecho, pueden contener predominantemente células que no son microorganismos (es decir, hay menos células de microorganismos, normalmente significativamente menos, que células que no son de microorganismos en la muestra). Por tanto, el hallazgo de los presentes inventores de que las partículas recubiertas pueden eliminar microorganismos de muestras que contienen tanto un agente antimicrobiano como células que no son microorganismos es particularmente ventajoso en la presente invención.
Por lo tanto, la invención proporciona un método para recuperar microorganismos viables a partir de una muestra que comprende células de microorganismos, células que no son microorganismos y un agente antimicrobiano, comprendiendo el método: a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partículamicroorganismo; y b) separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano y las células que no son microorganismos; recuperando así microorganismos viables de la muestra, c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados, en donde la muestra es de un sujeto que ha sido tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles a el agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
En estos métodos, la muestra comprende células que no son microorganismos y el paso b) separa los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano y las células que no son microorganismos. Las células que no son microorganismos pueden comprender células sanguíneas. Las células sanguíneas pueden comprender glóbulos rojos (eritrocitos) y/o blancos (leucocitos). Para evitar dudas, las células que no son microorganismos pueden lisarse antes de que tenga lugar la separación. Por lo tanto, la separación de complejos de partículas-microorganismo de células que no son microorganismos abarca la separación de complejos de partículas-microorganismo de lisados de células que no son de microorganismos. Sin embargo, la separación también se puede realizar cuando las células que no son microorganismos permanecen intactas.
La exposición de microorganismos a un agente antimicrobiano tiene como objetivo matar o prevenir el crecimiento de los microorganismos. Esto presenta un desafío al intentar recuperar microorganismos viables. Por lo tanto, los presentes métodos pueden depender de condiciones destinadas a preservar los microorganismos viables que permanecen en la muestra después de la exposición a un agente antimicrobiano. Esos microorganismos pueden ser más susceptibles a la muerte y lisis celular. Por lo tanto, ciertos agentes que podrían ser útiles para lisar preferentemente células que no son microorganismos sobre microorganismos en una muestra pueden no ser adecuados en ciertas realizaciones de la invención. Tales agentes incluyen detergentes, en particular en concentraciones más altas. Por tanto, los métodos de la invención (paso b)) se pueden realizar en ausencia de un detergente.
En algunas realizaciones, el paso b) se puede realizar en presencia de polianetolsulfonato de sodio. Como se muestra en el presente documento, este reactivo es útil para la recuperación de microorganismos a partir de muestras que contienen células que no son microorganismos.
En realizaciones adicionales, el paso b) se puede realizar adicional o alternativamente en presencia de un reactivo (tal como un detergente) que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra. Los reactivos adecuados son conocidos en la técnica y se analizan más detalladamente en el presente documento.
En vista de la mayor sensibilidad de los microorganismos expuestos al agente antimicrobiano a la lisis, en algunas realizaciones no se realiza lisis de células que no son microorganismos para facilitar la separación de los microorganismos de los que no son microorganismos en la muestra. Debido a que las partículas recubiertas se unen preferentemente a microorganismos, no existe un requisito absoluto para lisar los no microorganismos en la muestra. Sin embargo, puede ser ventajoso realizar uno o más pasos de lavado para eliminar células que no son microorganismos (típicamente células que no son microorganismos intactos) y/o lisado celular de los complejos partícula-microorganismo. Así, el paso b) de los métodos de la invención puede comprender lavar los complejos de partículas-microorganismo separados. Se puede emplear cualquier solución de lavado adecuada; en el presente documento se analizan ejemplos. En algunas realizaciones, los complejos de partículas-microorganismo separados se lavan con una solución que no contiene detergente. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende Tris y/o cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 7 a 9, tal como de 7.5 a 8.5. En algunas realizaciones, el tampón de lavado contiene una sal tal como una sal de haluro metálico. Un ejemplo preferido es el cloruro de sodio. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 50 a 150 mM. Preferiblemente, el tampón de lavado comprende solución salina tamponada con fosfato (PBS), Tris o Tricina.
En otras realizaciones, los complejos de partículas-microorganismo separados se pueden lavar con una solución que contiene detergente. La solución puede ser una solución detergente débil para reducir el riesgo de lisis de microorganismos. La solución puede comprender detergente en una concentración que no lisa sustancialmente los microorganismos. Los ejemplos adecuados incluyen monolaurato de polietilenglicol sorbitán (Tween 20), por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. El reactivo puede incluir una saponina, por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. Los microorganismos pueden exponerse a la solución detergente durante un período de tiempo que no los lisa sustancialmente. La solución puede lisar selectivamente al menos una proporción de no microorganismos en la muestra.
El reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra puede comprender una o más enzimas. La una o más enzimas pueden comprender una proteinasa y/o una ADNasa. En el presente documento se analizan enzimas adecuadas.
Sin embargo, como ya se mencionó, cuando se trata de microorganismos que pueden ser frágiles después de la exposición a un agente antimicrobiano, es preferible que el paso a) y cualquier lavado realizado en el paso b) se realicen en ausencia de detergente. En algunas realizaciones, todos los métodos se pueden realizar en ausencia de detergente. En otras realizaciones, los métodos se pueden realizar en ausencia de detergente excepto para detectar y/o caracterizar los microorganismos viables recuperados. En esta realización, es posible que sea necesario liberar el contenido de las células del microorganismo para su análisis. Un reactivo de lisis adecuado puede comprender detergente. Dicho detergente puede estar en alta concentración para asegurar la lisis completa de los microorganismos.
En los métodos, el paso b) normalmente implica alguna forma de separación física de los complejos partículamicroorganismo del resto de la muestra. Esto puede comprender el uso de cualquier medio de separación adecuado. Por ejemplo, la separación se puede lograr usando un campo magnético. El uso de un campo magnético requiere que las partículas sean partículas magnéticas y atraigan los complejos partícula-microorganismo. Alternativamente, se pueden emplear centrifugación u otros métodos de separación tales como filtración. El paso (b) puede comprender o comprender además eliminar las células que no son microorganismos de los complejos partícula-microorganismo mediante aspiración.
Para evitar dudas, los pasos de lavado pueden seguir al paso o pasos de separación física. Por lo tanto, el método puede comprender además (como parte del paso b)) lavar los complejos de partículas-microorganismo separados para eliminar el agente antimicrobiano y/o células que no son microorganismos o lisado de los complejos de partículasmicroorganismo.
De manera más general, el paso b) puede comprender además eliminar las células que no son microorganismos de los complejos partícula-microorganismo.
Cuando se emplea lisis selectiva, para eliminar células que no son microorganismos de la muestra (y retener microorganismos viables), se puede realizar en cualquier paso adecuado de los métodos. Por lo tanto, puede realizarse como un paso de procesamiento inicial, antes de que la muestra se incube con las partículas recubiertas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el paso a) puede estar precedido por la lisis selectiva de células que no son microorganismos en la muestra mientras se conservan intactos los microorganismos presentes en la muestra.
Lisar selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras se mantienen intactos los microorganismos presentes en la muestra puede comprender lisis osmótica o agregar un detergente. El detergente puede ser un detergente débil que provoca la lisis de células que no son microorganismos (tales como células sanguíneas), pero no lisa sustancialmente los microorganismos. Los ejemplos adecuados incluyen monolaurato de polietilenglicol sorbitán (Tween 20), por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. El reactivo puede incluir una saponina, por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%.
En los métodos, la paso a) normalmente se realiza en solución acuosa. El paso a) se puede realizar en presencia de un tampón. El tampón puede comprender cualquier agente tampón adecuado que incluye, entre otros, uno o más de solución salina tamponada con fosfato (PBS), TAPS (ácido [tris(hidroximetil)metilamino]propanosulfónico), bicina (ácido 2-(bis(2-hidroxietil)amino)acético), Tris (Tris(hidroximetil)aminometano), Tricina (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico), TAPSO (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), TES (ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]etanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis(2-etanosulfónico)), cacodilato (ácido dimetilarsénico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), Bis-tris (2-[Bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol), maleato, fosfato, glicina, citrato, glicilglicina, formiato, succinato, acetato, propionato, piperazina, histidina, etanolamina, imidazol, borato, carbonato. El tampón puede tener un pH entre 7.4 y 8.5.
Preferiblemente, el tampón comprende solución salina tamponada con fosfato (PBS), Tris o Tricina. En los métodos, el paso a) se puede realizar en presencia de cloruro de sodio. El cloruro de sodio puede estar presente en una concentración de entre 50 y 500 mM. Preferiblemente, el cloruro de sodio puede estar presente en una concentración de aproximadamente 150 mM.
En los métodos, el reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra puede ser un detergente, en particular un detergente débil. En los métodos, el detergente puede ser no iónico. En los métodos, el detergente no puede conjugarse con partículas capaces de formar complejos con microorganismos. Por tanto, normalmente el detergente forma parte de una solución a la que se añaden las partículas y no forma parte de las partículas mismas.
Como ya se introdujo, los métodos de la invención pueden implicar detectar y/o caracterizar los microorganismos viables recuperados. En algunas realizaciones, detectar la ausencia o presencia de un microorganismo puede comprender (i) detectar una actividad enzimática del microorganismo, (ii) detectar un ácido nucleico o polipéptido del microorganismo (iii) detectar el microorganismo directamente mediante citometría o microscopía, o (iv) detectar el microorganismo después del cultivo celular.
La detección de la ausencia o presencia de microorganismos en los complejos partícula-microorganismo de acuerdo con todos los aspectos relevantes de la invención se puede realizar de acuerdo con cualquier método deseado. El método puede implicar detectar la simple ausencia o presencia del uno o más microorganismos. Puede implicar la cuantificación de los microorganismos, si están presentes. También puede implicar la caracterización de la naturaleza del microorganismo en algunas realizaciones. Por tanto, se puede realizar la detección de bacterias y/u hongos. También se puede realizar la discriminación entre bacterias Gram positivas y Gram negativas. También se puede realizar la identificación de especies y la susceptibilidad y/o resistencia a los antimicrobianos de los organismos.
La detección y/o caracterización puede ocurrir después de la eliminación (o recuperación) de los microorganismos de los complejos partícula-microorganismo. Los microorganismos recuperados pueden lisarse antes de la detección. La recuperación puede ser de los microorganismos intactos o de un lisado después de la lisis de los microorganismos (como se analiza con mayor detalle en el presente documento).
Preferiblemente, la detección se produce sin eliminación previa (o recuperación) de los microorganismos de los complejos partícula-microorganismo. Esta realización es particularmente útil para aplicar la invención a instrumentación de procesamiento de perlas magnéticas (es decir, donde las partículas son magnéticas, lo que representa una implementación particularmente útil de los métodos de la invención).
La detección de moléculas de ácido nucleico asociadas con microorganismos se conoce en la técnica y puede realizarse a nivel de ADN o ARN. Puede realizarse mediante cualquier método adecuado, tal como amplificación (por ejemplo, PCR) o secuenciación (en particular secuenciación de próxima generación). Dichos métodos pueden aprovechar la divergencia de secuencias entre microorganismos y no microorganismos, tales como el ADN y el ARN humanos. Dichos métodos pueden implicar la lisis de los microorganismos (por ejemplo, presentes en forma de complejos partícula-microorganismo) para liberar el componente de ácido nucleico.
También se conoce la detección directa de microorganismos. Esto puede implicar un análisis citométrico, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Puede implicar el uso de microscopía, por ejemplo, para visualizar los microorganismos recuperados de complejos de partículas-microorganismo o para visualizar microorganismos en complejos de partículas-microorganismo.
La detección de microorganismos también se puede realizar después del cultivo celular, para ampliar el número de microorganismos. Por tanto, los microorganismos inicialmente capturados dentro de complejos partículamicroorganismo pueden cultivarse durante un período de tiempo determinado, antes de su detección. Los métodos de cultivo pueden permitir la detección directa de microorganismos en la muestra original. Alternativamente, los microorganismos pueden incubarse durante un período más corto (que cuando se cultivan), para permitir la recuperación metabólica de la exposición al agente antimicrobiano, antes de la detección (pero sin expansión).
Sin embargo, en realizaciones preferidas, la detección de la ausencia o presencia de microorganismos recuperados puede comprender detectar una actividad enzimática asociada con el microorganismo. Las actividades enzimáticas adecuadas son típicamente actividades modificadoras de ácidos nucleicos y se analizan con mayor detalle en el presente documento.
Por consiguiente, en los métodos, el paso de detectar los microorganismos puede comprender los pasos de: (i) lisar los microorganismos en los complejos partícula-microorganismo; (ii) incubar el lisado con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos; y (iii) determinar específicamente la ausencia o presencia de una molécula de ácido nucleico modificada resultante de la acción de la enzima modificadora de ácido nucleico sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la ausencia o presencia del microorganismo. Los sustratos adecuados se analizan con más detalle en el presente documento. Por "sustrato" se entiende una molécula de ácido nucleico sobre la que actúa la enzima derivada del microorganismo. Normalmente, dichas moléculas de ácido nucleico son sustratos de oligonucleótidos. Son moléculas de ácido nucleico sintéticas.
La lisis de microorganismos en los complejos partícula-microorganismo permite la detección de moléculas de ácido nucleico o enzimas dentro de los microorganismos, tales como enzimas modificadoras de ácidos nucleicos. La lisis se puede lograr mediante la adición de una mezcla de lisis. La mezcla de lisis es generalmente útil en los métodos de la invención. La mezcla de lisis puede incluir una mezcla específica de componentes para asegurar una lisis eficaz de microorganismos sin afectar negativamente a las moléculas de ácido nucleico y/o la actividad enzimática, tal como la actividad modificadora de ácidos nucleicos, dentro de las células. Los componentes se pueden seleccionar entre proteínas portadoras/suero tales como BSA, tensioactivos/detergentes, sales de haluro metálico, tampones, quelantes, etc. En su forma básica, la mezcla de lisis de la invención puede incluir los siguientes componentes:
1. Un tensioactivo/detergente
2. Proteína sérica tal como la albúmina (por ejemplo, BSA)
3. Tampón
4. Nucleótidos, tales como los dNTP
5. Molécula de ácido nucleico (que actúa como sustrato en los ensayos de la invención).
A continuación, se expone una mezcla de lisis adecuada:
L1: 252 ml en 360 ml LM
1.46% (p/v) BSA
0.15% Tritón X100
0.15% Tween 20
L2: 36 ml en 360 ml LM
Sulfato de amonio 100 mM
Heptahidrato de sulfato de magnesio 20 mM
Cloruro de potasio 100 mM
Tris-HCl 200 mM [pH 8.0]
L3: 36 ml en 360 ml LM
Oligo PTO-AS 0.1 pM
Oligo PTO-S1 0.1 pM
Tris-HCl 20 mM [pH 8.5]
Cloruro de potasio 10 mM
EDTA10 pM
dNTP 10 mM: 3.6 ml en 360 ml LM
Existencias de PTO-IPC: ~180 μl en 360 ml LM
H2O: ~32.4 ml en 360 ml LM
Por "oligo PTO-AS" se entiende un oligonucleótido antisentido que comprende nucleótidos de fosforotioato. Por "oligo PTO-S1" se entiende un oligonucleótido con sentido que comprende nucleótidos de fosforotioato. Los dos oligonucleótidos se hibridan entre sí para formar la molécula de ácido nucleico sustrato.
Por "PTO-IPC" se entiende una molécula de IPC que comprende nucleótidos de fosforotioato.
El sustrato adecuado y las moléculas de IPC se analizan con más detalle en el presente documento.
Se enumeran cantidades y concentraciones ejemplares de cada componente, pero pueden modificarse como apreciará fácilmente un experto en la técnica.
La lisis también puede requerir la alteración de las células. Por ejemplo, las células pueden romperse usando la mezcla de lisis en combinación con medios físicos y/o enzimáticos. Sin embargo, normalmente los métodos en los que se lisan las células evitan el uso de alteración física. En algunas realizaciones, la alteración física emplea un disruptor. El disruptor puede incorporar perlas tales como perlas de vidrio para lisar las células. Los aparatos adecuados están disponibles comercialmente e incluyen el Disruptor Genie fabricado por Scientific Industries, Inc. Puede utilizarse sonicación, por ejemplo, aplicando una bocina ultrasónica. La alteración enzimática puede requerir el uso de uno o más agentes seleccionados entre lisostafina, lisozima y/o liticasa en algunas realizaciones.
Una vez que los microorganismos, si están presentes en la muestra, se lisan, el ácido nucleico y/o las enzimas liberadas pueden detectarse para indicar si había microorganismos viables presentes en (y recuperados de) la muestra. En algunas realizaciones, el lisado se incuba con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora del ácido nucleico (de los microorganismos). Luego se determina la ausencia o presencia de una molécula de ácido nucleico modificada resultante de la acción de la enzima modificadora de ácido nucleico sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la ausencia o presencia del microorganismo. La molécula sustrato de ácido nucleico se diseña de acuerdo con la actividad modificadora del ácido nucleico que se va a detectar. Un experto en la técnica es muy capaz de diseñar moléculas de ácido nucleico sustrato adecuadas. Aunque la muestra inicial puede contener fuentes no microbianas de actividad modificadora de ácidos nucleicos, los métodos de la invención evitan que esta actividad contaminante actúe sobre las moléculas de ácido nucleico sustrato.
De acuerdo con los métodos de la invención, la actividad modificadora de ácidos nucleicos típica que puede detectarse comprende actividad polimerasa y/o ligasa. La enzima modificadora de ácidos nucleicos puede comprender una ADN o ARN polimerasa. En realizaciones preferidas, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa dependiente de ADN. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es ADN polimerasa I. La enzima modificadora de ácido nucleico puede comprender una ligasa, opcionalmente en donde la enzima modificadora de ácido nucleico es una ligasa dependiente de NAD (para indicar la presencia de bacterias) y/o una ligasa dependiente de ATP (para indicar la presencia de hongos o bacterias). Las ligasas dependientes de NAD solo se encuentran en (eu)bacterias y, por lo tanto, la detección de dicha actividad puede proporcionar un nivel adicional de especificidad. Esto se analiza más a fondo en los documentos WO2009/007719 y WO2010/119270. Como alternativa, se pueden medir otras actividades modificadoras de ácidos nucleicos relevantes para la viabilidad, tales como la actividad fosfatasa, quinasa y/o nucleasa.
Como ya se ha comentado, los métodos pueden comprender lavar los complejos de partículas-microorganismo separados para eliminar células que no son microorganismos o lisado. El paso de lavado puede eliminar inhibidores del análisis posterior, por ejemplo, Inhibidores de la PCR. El paso de lavado normalmente se realiza en condiciones que no disocian los complejos partícula-microorganismo.
En algunas realizaciones, la acción de la actividad modificadora del ácido nucleico sobre la molécula de ácido nucleico "sustrato" produce una molécula de ácido nucleico extendida. Esto puede ser mediante extensión de cadena (actividad polimerasa) y/o mediante ligadura de dos moléculas de ácido nucleico (actividad ligasa). En algunas realizaciones, se utiliza un sustrato sobre el que puede actuar la polimerasa o la ligasa, ya que cualquiera de las actividades es indicativo de la presencia de un microorganismo en la muestra. En algunas realizaciones, la actividad relevante se puede distinguir en términos de la nueva molécula de ácido nucleico que se produce.
El sustrato puede ser un molde para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. Por ejemplo, el sustrato puede ser un molde para una ADN o ARN polimerasa, preferiblemente una ADN polimerasa dependiente de ADN, opcionalmente en donde la ADN polimerasa es ADN polimerasa I.
Las moléculas de ácido nucleico adecuadas que actúan como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos se describen en los documentos WO2011/130584, WO2010/119270 y WO2009/007719. En el caso de la actividad fosfatasa, las moléculas de ácido nucleico adecuadas se describen en el documento WO2006/123154.
En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico (sustrato) utilizada en los métodos de la invención es al menos parcialmente bicatenaria y comprende residuos de uracilo en la cadena complementaria y el paso de determinar específicamente la ausencia o presencia de la molécula de ácido nucleico modificada comprende agregar Uracilo ADN glicosilasa (UDG) a la muestra para degradar los residuos de uracilo en la cadena complementaria.
En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico (sustrato) comprende o es una molécula de ADN, normalmente un oligonucleótido de ADN. En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico (sustrato) comprende ADN y es parcialmente bicatenaria.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico (sustrato) comprende un ácido nucleico que consiste en una cadena de oligonucleótido (ADN) sentido y una cadena de oligonucleótido (ADN) antisentido, en donde las dos cadenas se superponen para formar una región bicatenaria y una porción monocatenaria de la cadena de oligonucleótido antisentido actúa como plantilla y la cadena de oligonucleótido sentido de la región bicatenaria actúa como cebador para crear un producto de extensión en presencia de actividad polimerasa;
En determinadas realizaciones, la primera cadena de la molécula de ácido nucleico (sustrato) parcialmente bicatenaria comprende (o consiste en) nucleótidos sintéticos (por ejemplo, nucleótidos de fosforotioato) y la segunda cadena (complementaria) comprende (o consiste en) residuos de uracilo y, opcionalmente, nucleótidos sintéticos (por ejemplo, nucleótidos de fosforotioato). Preferiblemente, la región bicatenaria abarca las regiones del extremo 3' de las cadenas primera y segunda (complementarias). En algunas realizaciones, la segunda cadena (complementaria) comprende una base (por ejemplo, didesoxicitidina) en su extremo 3' que bloquea la extensión de la segunda cadena mediada por la ADN polimerasa. Tales moléculas de ácido nucleico parcialmente bicatenario (sustrato) se describen, por ejemplo, en Zweitzig et al., 2012 (Characterization of a novel DNA polymerase activity assay enabling sensitive, quantitative and universal detection of viable microbes. Nucleic Acids Research 40, 14, e109, 1-12. Preferiblemente, la región bicatenaria tiene al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos; opcionalmente, la región bicatenaria no tiene más de 50 nucleótidos. La primera cadena puede extenderse durante un paso de incubación, como se describe en el presente documento, se utilizan dNTP desprotegidos (o estándar) mediante la actividad polimerasa de un microorganismo en la muestra para formar una primera cadena extendida que comprende nucleótidos desprotegidos (o estándar). Este paso se basa en el uso de la segunda cadena como plantilla (aguas arriba de la región de complementariedad entre las cadenas primera y segunda). Después del paso de incubación, la segunda cadena (complementaria) se puede degradar agregando uracilo ADN glicosilasa (UDG) a la muestra, dejando la primera cadena extendida como una molécula monocatenaria que comprende nucleótidos sintéticos y nucleótidos desprotegidos. Después de la degradación de la segunda cadena, la primera cadena extendida de la molécula de ácido nucleico (sustrato) puede detectarse en un paso de amplificación. Los inventores han descubierto que el uso de una molécula de ácido nucleico (sustrato) parcialmente bicatenario como se describe anteriormente mejora la detección de un microorganismo en la muestra.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico sustrato se modifica previamente para protegerla de la actividad nucleasa, es decir, la molécula de ácido nucleico se modifica para protegerla de la actividad nucleasa antes de agregarla al ensayo. Los inventores han determinado que la protección de la molécula de ácido nucleico sustrato frente a la actividad nucleasa es ventajosa en el contexto de los ensayos de la invención. Más específicamente, la incorporación de moléculas de ácido nucleico protegidas en los métodos de la invención mejora la sensibilidad de detección. Puede emplearse cualquier medio adecuado para proteger la molécula de ácido nucleico de la actividad nucleasa. Los ejemplos no limitantes incluyen la incorporación de metilación en la molécula de ácido nucleico, modificación de extremos tales como protección de los extremos 3' y/o 5' e incorporación de nucleótidos sintéticos. En realizaciones específicas, los nucleótidos sintéticos comprenden nucleótidos de fosforotioato y/o nucleótidos de ácido nucleico bloqueados. Preferiblemente, los nucleótidos sintéticos son nucleótidos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, los nucleótidos sintéticos reemplazan al menos uno hasta todos los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico.
Las moléculas de ácido nucleico (sustrato) pueden incluir cualquier ácido nucleico natural y análogos naturales o sintéticos sobre los que se pueda actuar mediante actividad modificadora de ácido nucleico para generar una molécula de ácido nucleico (nueva detectable). El sustrato puede extenderse y/o ligarse en realizaciones específicas. Se pueden emplear combinaciones de moléculas sustrato de ácido nucleico para permitir la detección de la actividad polimerasa y ligasa en algunas realizaciones.
El sustrato de ácido nucleico puede estar presente en exceso, y en particular en un gran exceso molar, con respecto a la actividad modificadora del ácido nucleico (proporcionada por los microorganismos) en la muestra. Debido a que se detecta una nueva molécula de ácido nucleico extendida o ligada, sólo la presencia de esta molécula en la muestra es esencial para que los métodos de detección funcionen eficazmente. Por lo tanto, no es perjudicial para los métodos de la invención si otras moléculas de ácido nucleico están presentes en la muestra, tales como las de los microorganismos que se van a detectar o las de mamíferos u otras fuentes que se pueden encontrar en la muestra que se va a analizar, por ejemplo.
Los inventores han investigado previamente el uso de una molécula de control positivo interno (IPC) en el contexto de sus métodos. Por tanto, de acuerdo con todos los aspectos, la invención puede basarse en la inclusión de una molécula de IPC. En algunas realizaciones, el IPC se incluye con la molécula de ácido nucleico sustrato de modo que el IPC se expone a condiciones idénticas. En algunas realizaciones, la molécula de IPC se modifica previamente para protegerla de la actividad nucleasa, es decir, la molécula de ácido nucleico se modifica para protegerla de la actividad nucleasa antes de agregarla al ensayo. Los inventores han determinado que la protección de la molécula de IPC frente a la actividad nucleasa es ventajosa en el contexto de los ensayos de la invención. Puede emplearse cualquier medio adecuado para proteger la molécula de ácido nucleico de la actividad nucleasa. Los ejemplos no limitantes incluyen la incorporación de metilación en la molécula de ácido nucleico, modificación de extremos tales como protección de los extremos 3' y/o 5' e incorporación de nucleótidos sintéticos. En realizaciones específicas, los nucleótidos sintéticos comprenden nucleótidos de fosforotioato y/o nucleótidos de ácido nucleico bloqueados. Preferiblemente, los nucleótidos sintéticos son nucleótidos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, los nucleótidos sintéticos reemplazan al menos uno hasta todos los nucleótidos en la molécula de IPC. Preferiblemente, el sustrato y las moléculas de IPC se modifican de la misma manera, ya que resulta ventajoso que se comporten de manera similar en los ensayos de la invención.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de control positivo interno (IPC) comprende sitios de unión de cebador idénticos a la molécula de ácido nucleico sustrato de manera que existe competencia por la unión de cebador en una reacción de amplificación de ácido nucleico que contiene tanto la molécula de ácido nucleico como el IPC.
En todos los métodos de la invención, determinar específicamente la ausencia o presencia de la molécula de ácido nucleico modificada puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un paso de amplificación de ácido nucleico. Esto sirve para hacer que los métodos de la invención sean máximamente sensibles. Dichas técnicas de amplificación son bien conocidas en la técnica e incluyen métodos tales como PCR, NASBA (Compton, 1991), 3SR (Fahy et al., 1991), replicación del círculo rodante, amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) Clinical Chemistry 45: 777-784, 1999, los procesos de autoensamblaje de oligómeros de ADN descritos en el documento US6261846, reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barringer et al., 1990), amplificación selectiva de secuencias de polinucleótidos diana (Documento US 6410276), PCR cebada arbitrariamente (Documento WO 90/06995), PCR cebada con secuencia consenso (Documento US 4437975), tecnología invasora, tecnología de desplazamiento de cadenas y amplificación por desplazamiento de mella (Documento WO 2004/067726). La lista anterior no pretende ser exhaustiva. Se puede utilizar cualquier técnica de amplificación de ácidos nucleicos siempre que se amplifique específicamente el producto de ácido nucleico apropiado.
De manera similar, se pueden emplear metodologías basadas en secuenciación en algunas realizaciones para incluir cualquiera de la gama de plataformas de secuenciación de próxima generación, tales como secuenciación mediante síntesis de secuencias amplificadas clonalmente (Illumina), pirosecuenciación, secuenciación 454 (Roche), secuenciación de nanoporos (por ejemplo, Oxford Nanopore), torrente de iones (ThermoFisher) y secuenciación en tiempo real de una sola molécula (S<m>R<t>) (Pacific Biosystems). El hecho de que se genere una nueva molécula de ácido nucleico significa que un enfoque de secuenciación puede confirmar la presencia o no de la molécula de ácido nucleico modificada y también proporcionar la cuantificación de esa molécula.
La amplificación se logra con el uso de cebadores de amplificación específicos para la secuencia de la molécula de ácido nucleico modificada que se va a detectar. Para proporcionar especificidad a las moléculas de ácido nucleico, se pueden seleccionar los sitios de unión del cebador correspondientes a una región adecuada de la secuencia. El lector experto apreciará que las moléculas de ácido nucleico también pueden incluir secuencias distintas de los sitios de unión de cebadores que se requieren para la detección de la nueva molécula de ácido nucleico producida por la actividad modificadora en la muestra, por ejemplo, pueden ser necesarios sitios de unión de<a>R<n>polimerasa o secuencias promotoras para tecnologías de amplificación isotérmica, tal como NASBA, 3SR y TMA.
Uno o más sitios de unión de cebadores pueden unir el límite de ligadura/extensión de la molécula de ácido nucleico sustrato de manera que sólo se genere un producto de amplificación si se ha producido ligadura/extensión, por ejemplo. Alternativamente, los cebadores pueden unirse a cualquier lado del límite de ligadura/extensión y dirigir la amplificación a través del límite de manera que solo se genere un producto de amplificación (exponencialmente) si se forma la molécula de ácido nucleico ligada/extendida. Los cebadores y la(s) molécula(s) de ácido nucleico sustrato pueden diseñarse para evitar la amplificación no específica (por ejemplo, del ADN genómico en la muestra).
Los cebadores pueden incorporar análogos de nucleótidos sintéticos según sea apropiado o pueden estar basados, por ejemplo, en ARN o PNA, o mezclas de los mismos. Los cebadores pueden marcarse, por ejemplo, con marcadores fluorescentes y/o pares FRET, dependiendo del modo de detección empleado.
Se pueden utilizar sondas, que también se pueden etiquetar, según se desee. El método de detección puede requerir el uso de sondas de nucleótidos además de los cebadores o como alternativa a los cebadores. Por ejemplo, en algunas realizaciones se puede emplear un ensayo de ADN ramificado, que no requiere el uso de cebadores.
En ciertos aspectos, los métodos de la invención se llevan a cabo usando técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para detectar la molécula de ácido nucleico modificada producida como resultado directo de la acción de la actividad modificadora de ácidos nucleicos sobre la molécula de ácido nucleico sustrato que indica la presencia de un microorganismo en la muestra. En determinadas realizaciones, la técnica utilizada se selecciona de PCR, NASBA, 3SR, TMA, SDA y autoensamblaje de oligómeros de ADN.
La detección de los productos de amplificación puede realizarse mediante métodos de rutina, tales como, por ejemplo, electroforesis en gel, pero en algunas realizaciones se lleva a cabo utilizando métodos de detección en tiempo real o de punto final.
En la técnica se conocen varias técnicas para la detección en tiempo real o de punto final de los productos de una reacción de amplificación. Estos incluyen el uso de colorantes fluorescentes intercalantes tales como SYBR Green I (Sambrook y Russell, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, tercera edición), que permite estimar el rendimiento de ADN amplificado en función de la cantidad de fluorescencia producida. Muchos de los métodos de detección en tiempo real producen una lectura fluorescente que puede monitorearse continuamente; ejemplos específicos que incluyen balizas moleculares y sondas de transferencia de energía por resonancia fluorescente. Las técnicas en tiempo real y de punto final son ventajosas porque mantienen la reacción en un "tubo único". Esto significa que no hay necesidad de realizar análisis posteriores para obtener resultados, lo que lleva a obtener resultados más rápidamente. Además, mantener la reacción en un entorno de "tubo único" reduce el riesgo de contaminación cruzada y permite un resultado cuantitativo de los métodos de la invención. Esto puede ser particularmente importante en el contexto de la presente invención donde las preocupaciones sobre la salud y la seguridad pueden ser de suma importancia (tal como, por ejemplo, en la detección de una posible infección microbiana en muestras de un paciente).
La cuantificación en tiempo real y de punto final de las reacciones de PCR se puede lograr utilizando TaqMan® sistema (Applied Biosystems), ver Holland et al; Detection of specific polymerase chain reaction product by utilising the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280 (1991), Gelmini et al. Quantitative polymerase chain reaction-based homogeneous assay with flurogenic probes to measure C-Erb-2 oncogene amplification. Clin. Chem. 43, 752-758 (1997) y Livak et al. Towards fully automated genome wide polymorphism screening. Nat. Genet. 9, 341-342 (19995). Este tipo de sonda puede denominarse genéricamente sonda hidrolítica. También se proporcionan sondas hidrolíticas/Taqman adecuadas para uso en tiempo real o detección de punto final. La sonda puede marcarse adecuadamente, por ejemplo, utilizando las etiquetas que se detallan a continuación.
En el sistema Molecular Beacon, véase Tyagi y Kramer. Molecular beacons - probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14, 303-308 (1996) y Tyagi et al. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol.
16, 49-53 (1998), las balizas son sondas en forma de horquilla con un fluoróforo apagado internamente cuya fluorescencia se restablece cuando se une a su objetivo. Estas sondas pueden denominarse sondas de horquilla.
Otro sistema basado en fluorescencia en tiempo real que puede incorporarse en los métodos de la invención es el sistema Scorpion, véase Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence porWhitcombe et al. Nature Biotechnology 17, 804 - 807 (01 de agosto de 1999). Las técnicas adicionales de detección en tiempo real o de punto final que son bien conocidas por los expertos en la técnica y que están disponibles comercialmente incluyen tecnología Lightcycler®, tecnología de cebadores Amplifluor®, cebadores DzyNA (Todd et al., Clinical Chemistry 46:5, 625-630 (2000)), o los sistemas Plexor™ qPCR y qRT-PCR.
Por lo tanto, en aspectos adicionales de la invención los productos de la amplificación de ácidos nucleicos se detectan usando técnicas en tiempo real o de punto final. En realizaciones específicas de la invención la técnica en tiempo real consiste en utilizar cualquiera de las sondas hidrolíticas (el sistema Taqman®), sondas FRET (sistema Lightcycler®), cebadores en horquilla (sistema Amplifluour®), sondas en horquilla (el sistema de balizas moleculares), sondas en horquilla incorporadas en un cebador (el sistema de sonda Scorpion®), cebadores que incorporan la secuencia complementaria de una ADNzima y una ADNzima fluorescente escindible sustrato (DzYNA), Plexor qPCR y sistemas de bloqueo de oligonucleótidos.
Los productos de amplificación pueden cuantificarse para dar una aproximación de la actividad modificadora del ácido nucleico microbiano en la muestra y, por tanto, del nivel de microorganismos en la muestra. Por tanto, "ausencia o presencia" pretende abarcar la cuantificación de los niveles de microorganismos en la muestra.
Los inventores han descubierto además que la temperatura óptima para medir la actividad modificadora del ácido nucleico de los microorganismos puede no ser la misma que la temperatura óptima para la lisis de los microorganismos. Por tanto, en algunas realizaciones, la lisis de los microorganismos se realiza a una temperatura más baja que el paso de incubar el lisado con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. Como ya se analizó, en algunas realizaciones de la invención, la molécula de ácido nucleico sustrato se incluye en el reactivo de lisis usado para lisar los microorganismos. Tales realizaciones son consistentes con las diferentes preferencias de temperatura. Por lo tanto, aunque la molécula de ácido nucleico sustrato puede incluirse en el reactivo de lisis, la temperatura más baja inicial no afecta negativamente a la incubación posterior a una temperatura más alta, en donde el sustrato es modificado por la actividad modificadora del ácido nucleico liberada por los microorganismos. Por consiguiente, en algunas realizaciones el método implica un paso de lisis de los microorganismos en donde el reactivo de lisis contiene una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. Este paso se realiza a una temperatura más baja que el paso posterior de incubar el lisado con la molécula de ácido nucleico sustrato para permitir la actividad de las enzimas liberadas por los microorganismos. Por tanto, el sustrato se expone a la temperatura inicial más baja, seguida de una temperatura más alta bajo la cual se mejora la actividad enzimática.
En algunas realizaciones, la paso de incubar el lisado con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora del ácido nucleico de los microorganismos se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 30°C. La temperatura puede estar opcionalmente entre aproximadamente 30°C y 40°C o entre aproximadamente 32°C y 37°C, tal como aproximadamente 37°C.
En realizaciones adicionales o alternativas, el paso de lisis de los microorganismos se realiza a una temperatura de no más de aproximadamente 30°C, opcionalmente entre aproximadamente 15°C y 30°C o entre aproximadamente 18°C y 25°C, tal como aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25°C. En algunas realizaciones, todos los pasos previos a la incubación del lisado con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora del ácido nucleico de los microorganismos se realizan a una temperatura de no más de aproximadamente 30 °C. La temperatura puede estar opcionalmente entre aproximadamente 15°C y 30°C o entre aproximadamente 18°C y 25°C, tal como aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25°C.
Tal método puede incorporar una cualquiera o más hasta todas las realizaciones descritas en relación con los diversos aspectos de la invención.
En algunas realizaciones, el método se caracteriza además porque la paso de incubar el lisado con una molécula de ácido nucleico sustrato se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 30°C, opcionalmente entre aproximadamente 30°C y 40°C o entre aproximadamente 32°C y 37°C, tal como aproximadamente 37°C.
En realizaciones adicionales o alternativas, cada uno de los pasos antes de incubar el lisado con una molécula de ácido nucleico sustrato se realiza a una temperatura de no más de aproximadamente 30 °C, opcionalmente entre aproximadamente 15 °C y 30 °C o entre aproximadamente 18 °C y 25°C, tal como aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25°C.
Como se introdujo anteriormente, antes del paso de incubar la muestra con partículas magnéticas para formar complejos partícula-microorganismo (es decir, antes del paso (a)), el método puede comprender lisar selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras se retienen los microorganismos intactos presentes en la muestra.
El paso de lisar selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras se retienen los microorganismos intactos presentes en la muestra puede comprender agregar una combinación de un detergente y una o más enzimas a la muestra. La una o más enzimas pueden comprender una proteinasa y/o una ADNasa, opcionalmente en donde la proteinasa es proteinasa K.
El paso de lisis selectiva de células que no son microorganismos en la muestra mientras se retiene intacto cualquier microorganismo presente en la muestra puede prevenir la actividad enzimática de células que no son microorganismos, tales como leucocitos, lo que indica falsamente la presencia de microorganismos en la muestra. Dicha lisis selectiva se puede lograr mediante cualquier medio adecuado como se analiza más detalladamente en el presente documento. Puede utilizarse cualquier reactivo adecuado que lisa no microorganismos, en particular células de mamíferos, presentes en la muestra pero que no lisa microorganismos en la muestra. El reactivo puede incluir un tensioactivo o detergente en algunas realizaciones, tal como un detergente no iónico. Los ejemplos adecuados incluyen monolaurato de polietilenglicol sorbitán (Tween 20), por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. El reactivo puede incluir una saponina, por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. El reactivo puede incluir una sal de haluro metálico, tal como cloruro de sodio, por ejemplo, a 8.5 g/l. El reactivo puede incluir una mezcla de los tres componentes. La muestra se puede mezclar con el reactivo en condiciones adecuadas para asegurar la lisis de células que no son microorganismos, en particular células de mamíferos, si están presentes en la muestra, pero ninguna (o insignificante) lisis de microorganismos si están presentes en la muestra. La muestra puede exponerse al reactivo durante un periodo de entre aproximadamente 5 y 30 minutos, tal como 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos. Este paso se puede realizar a cualquier temperatura adecuada, por ejemplo, entre 15 y 30 grados Celsius o a temperatura ambiente. La lisis selectiva de células que no son microorganismos puede lisar sustancialmente todas las células que no son microorganismos presentes. La lisis selectiva de células que no son microorganismos también puede lisar algunas, pero críticamente no todas, las células de microorganismos presentes en la muestra, particularmente si los microorganismos son frágiles y/o se han expuesto a una alta concentración de antibiótico.
En algunas realizaciones, de acuerdo con todos los aspectos de la invención, la lisis selectiva de células que no son microorganismos en la muestra mientras se retiene intacto cualquier microorganismo presente en la muestra comprende agregar una combinación de un detergente y una o más enzimas a la muestra. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, el detergente permeabiliza selectivamente las membranas celulares que no son de microorganismos, mientras que los microorganismos están protegidos en virtud de su pared celular. Las enzimas son útiles para descomponer el material intracelular liberado y otros desechos celulares y pueden contribuir a prevenir el arrastre de la actividad enzimática liberada. En algunas realizaciones, la una o más enzimas comprenden una proteinasa y/o una nucleasa. Las proteinasas adecuadas incluyen la proteinasa K. Las nucleasas adecuadas incluyen las ADNasas. En una realización, el reactivo usado para lisar selectivamente células que no son microorganismos comprende una combinación de triton X-100 y proteinasa K. Más específicamente, el reactivo de lisis puede comprender 0.25 % de Triton X-100 y 4.8 pg/ml de proteinasa K.
Es importante inactivar cualquier actividad enzimática relevante liberada si se lisan las células que no son microorganismos. Los inventores han ideado métodos en los que se utilizan condiciones de pH elevado para garantizar una inactivación eficaz de la actividad enzimática. Las células microbianas normalmente permanecen intactas, al menos durante parte del tratamiento, y la actividad enzimática intracelular no se ve afectada negativamente de manera significativa por el tratamiento con pH alto. Además, los inventores han demostrado previamente que las enzimas microbianas son más resistentes al tratamiento con pH alto, en cualquier caso.
Por consiguiente, después del paso de lisis selectiva de células que no son microorganismos en la muestra mientras se retiene intacto cualquier microorganismo presente en la muestra, el método puede comprender exponer el lisado a condiciones de pH alto. La duración de la exposición a las condiciones de pH alto es típicamente menor a 20 minutos y puede no ser más de 10, 9, 8, 7, 6 o 5 minutos y puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos. En algunas realizaciones, el tratamiento se lleva a cabo durante entre aproximadamente 2 y 15 minutos, tal como aproximadamente 5 minutos. Por "aproximadamente" en este contexto se entiende más o menos 30 segundos.
Puede utilizarse cualquier reactivo adecuado para proporcionar condiciones de pH alto. En realizaciones particulares, las condiciones de pH alto comprenden poner en contacto la muestra con un álcali o un tampón. En realizaciones particulares, se utiliza NaOH o Na2CO3. En realizaciones específicas, la concentración de NaOH o Na2CO3 es de aproximadamente 5 mm o más. El tampón puede tener un valor de pKa superior a 9. Ejemplos de tampones adecuados incluyen tampones de borato, carbonato y pirofosfato.
Las condiciones de pH alto normalmente inhiben la actividad de las enzimas modificadoras de ácidos nucleicos, incluyendo la ligasa y polimerasas dependientes de ATP de fuentes que no son microorganismos, tales como células de mamíferos, pero no inhiben la actividad de las ligasas o polimerasas microbianas. Esto se debe principalmente a las condiciones de lisis diferenciales empleadas en los métodos para garantizar que sólo las enzimas que no son microorganismos estén expuestas a las condiciones de pH alto. Sin embargo, también puede deberse a la mayor resistencia de las enzimas microbianas a estas condiciones. "PH alto" es generalmente un pH de al menos aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10, 11, 12, 13 o 14. "PH bajo" es generalmente un pH de menos de o igual a aproximadamente 4, tal como aproximadamente 4, 3, 2 o 1. Por "aproximadamente" en este contexto se entiende 0.5 unidades de pH a cada lado del valor indicado. La alteración del pH de la muestra se puede lograr usando cualquier medio adecuado, como apreciará fácilmente un experto en la técnica. Las enzimas microbianas tal como las polimerasas y ligasas pueden ser resistentes a pH extremos, mientras que las enzimas correspondientes de los mamíferos pueden inactivarse en las mismas condiciones de pH. Esto ayuda con la detección selectiva de la actividad enzimática microbiana en una muestra que contiene tanto células de mamíferos como células microbianas. En realizaciones específicas, las condiciones que inhiben la actividad de la actividad modificadora de ácidos nucleicos que no son de microorganismos, tales como la ligasa dependiente de ATP, de células de mamíferos pero que no inhiben la actividad del microorganismo fuente de actividad modificadora de ácidos nucleicos, tales como las ligasas microbianas, comprenden tratar la muestra con hidróxido de sodio (NaOH) o carbonato de sodio (Na2CO3). Dichos agentes se pueden usar fácilmente, como se muestra en el presente documento, para aumentar el pH de la muestra a un pH alto, inactivando así la actividad enzimática que no es de microorganismos mientras se mantienen activas las enzimas microbianas (fúngicas y bacterianas). Un experto puede aplicar concentraciones y volúmenes adecuados del agente apropiado. Sin embargo, en determinadas realizaciones, el NaOH es al menos NaOH aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, la concentración de álcali no es más de 10 mM, tal como 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mM.
En realizaciones adicionales, el pH es de aproximadamente 12 para inactivar la actividad modificadora de ácidos nucleicos de mamíferos (tal como la actividad polimerasa y/o ligasa dependiente de ATP), pero no la actividad modificadora de ácidos nucleicos microbianos (tal como la actividad polimerasa y/o ligasa). En realizaciones específicas, las condiciones de pH pueden aumentarse hasta al menos aproximadamente 11, o al menos 11,2. Este tratamiento puede, después de un cierto período de tiempo, dar como resultado la lisis de los microorganismos en la muestra y, por lo tanto, conducir a la liberación de la actividad modificadora del ácido nucleico (por ejemplo, polimerasa y/o ligasa) en la muestra. Así, en algunas realizaciones, la lisis de microorganismos se logra mediante un tratamiento con pH alto. Esto permite la detección de la actividad modificadora de ácidos nucleicos (por ejemplo, polimerasas y/o ligasas) en la muestra, procedente del microorganismo, sin la necesidad de un paso de lisis celular separada. En estas condiciones, las ligasas de los mamíferos (tal como las ligasas sanguíneas dependientes de ATP) se inactivan. Sin embargo, normalmente los métodos incluyen un paso separado para lisar microorganismos en la muestra, como se analiza con mayor detalle en el presente documento.
En algunas realizaciones, el tratamiento en condiciones de pH alto se detiene añadiendo un reactivo para reducir el pH. Esto se hace antes de que se lisan los microorganismos. Los reactivos adecuados incluyen un tampón y/o un ácido. Por tanto, el pH se puede reducir añadiendo un tampón de neutralización. En realizaciones específicas, el tampón comprende un tampón Tris-HCl (por ejemplo, pH 7.2 u 8). Otros agentes adecuados para reducir el pH incluyen ácidos tal como el ácido clorhídrico (HCl) y el ácido sulfúrico(H2SO4). Estos (y otros) ácidos pueden incorporarse en un tampón como apreciará fácilmente un experto en la técnica. Un reactivo específico útil para tratar la muestra después de que se haya elevado el pH comprende una combinación de sulfato de amonio, sulfato de magnesio heptahidratado, cloruro de potasio y Tris-HCl. Más específicamente, el reactivo puede comprender sulfato de amonio 10 mM, sulfato de magnesio heptahidratado 2 mM, cloruro de potasio 10 mM y Tris-HCl 20 mM [pH 8.0].
Los métodos de la invención pueden usarse para complementar cualquier técnica de diagnóstico ya disponible, potencialmente como un método para confirmar un diagnóstico inicial. Alternativamente, los métodos pueden usarse como método de diagnóstico preliminar por derecho propio, ya que los métodos proporcionan un medio de diagnóstico rápido y conveniente. Además, debido a su sensibilidad inherente, los métodos de la invención requieren sólo una muestra mínima, evitando así una cirugía invasiva innecesaria. Además, también se puede analizar eficazmente una muestra grande pero no concentrada de acuerdo con los métodos de la invención.
Los métodos de la invención pueden implicar identificar la naturaleza de la infección, una vez que se ha detectado la presencia positiva de un microorganismo en la muestra. Se puede emplear cualquier método adecuado para este paso de identificación adicional.
Composiciones y kits (no de acuerdo con la invención)
Las composiciones y kits descritos en el presente documento no están abarcados por la redacción de las reivindicaciones, pero se consideran útiles para comprender la invención. Durante la realización de los métodos de la invención se crean nuevas composiciones (combinaciones de componentes).
Por consiguiente, en el presente documento se describe una composición que comprende: a) una muestra que contiene un agente antimicrobiano y microorganismos viables; y b) partículas recubiertas capaces de formar complejos con los microorganismos viables en la muestra.
De manera similar, en el presente documento se describe una composición que comprende una muestra que contiene un agente antimicrobiano y microorganismos viables formando complejos con partículas recubiertas.
En las composiciones, la muestra es como se define en el presente documento. Por tanto, la muestra que contiene células de microorganismos viables puede comprender además células que no son microorganismos. Las células que no son microorganismos pueden comprender células sanguíneas. Las células sanguíneas pueden comprender glóbulos rojos y/o blancos.
También se describe en el presente documento un kit para realizar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
En el presente documento se describe un kit que comprende: a) un recipiente que contiene partículas recubiertas capaces de formar complejos con microorganismos viables; b) un recipiente que contiene un medio adecuado para incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados usando las partículas recubiertas y que no contiene un agente antimicrobiano y/o un agente capaz de unirse a un agente antimicrobiano; y/o c) un recipiente que contiene un tampón de lavado para lavar partículas recubiertas recuperadas de una muestra, tampón de lavado que no lisa los microorganismos viables.
En los kits, los componentes a), b) y c) pueden estar en recipientes separados. Los recipientes descritos en el presente documento pueden ser cualquier recipiente adecuado para el reactivo relevante, tal como lo entendería un experto en la técnica. Normalmente, los recipientes contienen suficiente cantidad o concentración del reactivo para realizar un método de la invención una vez. Por tanto, el kit puede ser un kit de un solo uso. El recipiente que contiene partículas recubiertas capaces de formar complejos con microorganismos viables es un recipiente de material y volumen adecuado para contener las partículas recubiertas. El recipiente también puede ser de un material y un volumen adecuados para incubar la muestra con las partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo. Esto significa que la muestra se puede agregar simplemente al recipiente que contiene las partículas recubiertas para comenzar el método. El recipiente que contiene el medio es un recipiente de material y volumen adecuado para contener el medio. El recipiente también puede tener un material y un volumen para contener adicionalmente los microorganismos viables recuperados, en particular en forma de complejos de partículas y microorganismos. Por tanto, el recipiente que contiene el medio puede ser adecuado para incubar o cultivar los complejos partículamicroorganismo. Alternativamente, el medio se puede añadir a otro recipiente (normalmente de mayor volumen) que ya contiene los complejos partícula-microorganismo. El recipiente que contiene el tampón de lavado es un recipiente de material y volumen adecuado para contener el tampón de lavado. Normalmente, el tampón de lavado se utiliza para lavar complejos de microorganismos de partículas contenidos en un recipiente separado. Por tanto, el tampón de lavado puede proporcionarse en un recipiente diseñado únicamente para contener el tampón de lavado. Cuando se necesitan varios lavados (por ejemplo, 2 o 3), el kit puede contener varios recipientes individuales, cada uno de los cuales contiene la cantidad adecuada de tampón de lavado para un solo lavado. Alternativamente, se puede proporcionar un único recipiente que contenga suficiente tampón de lavado para múltiples lavados (por ejemplo, 2 o 3).
En el presente documento se describen tampones de lavado adecuados. En los kits, el tampón de lavado puede estar libre de detergente. El tampón de lavado puede comprender Tris y/o cloruro de sodio (las concentraciones adecuadas se describen en los ejemplos del presente documento). Normalmente, el tampón de lavado se utiliza para eliminar células que no son microorganismos en un paso de lavado y, por tanto, el tampón de lavado no lisa las células que no son microorganismos.
Todos los demás medios incluidos en los kits pueden estar contenidos en uno o más recipientes, según corresponda.
El kit puede incluir además medios para detectar y/o caracterizar los microorganismos viables recuperados. Se puede emplear cualquier medio adecuado y puede representar el conjunto completo de reactivos necesarios para detectar y/o caracterizar los microorganismos viables.
Los medios de detección pueden comprender, o es, una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. En el presente documento se describen moléculas de sustrato adecuadas, en moléculas de sustrato de oligonucleótidos de ADN de partículas, cuya discusión se aplicamutatis mutandis.
Los medios de detección pueden comprender o comprender además reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos. Los reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos pueden comprender un par de cebadores y/o al menos una sonda. Esos cebadores y/o sondas pueden hibridarse con una molécula de ácido nucleico de un microorganismo. Por lo tanto, pueden permitir la detección de microorganismos en la muestra detectando la molécula de ácido nucleico del microorganismo amplificada. Alternativamente, los cebadores o sondas se hibridan con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. Dichas moléculas de ácido nucleico se describen con más detalle en el presente documento.
El kit puede comprender: a) partículas recubiertas capaces de formar (selectivamente) complejos con microorganismos (es decir, complejos partícula-microorganismo); y (b) medios de detección para detectar la ausencia o presencia de microorganismos en los complejos partícula-microorganismo. Los medios de detección pueden comprender una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos. La molécula de ácido nucleico puede ser al menos parcialmente bicatenaria y, opcionalmente, puede comprender residuos de uracilo en la cadena complementaria. La cadena complementaria puede comprender una base (por ejemplo, didesoxicitidina) en su extremo 3' que bloquea la extensión de la segunda cadena mediada por la ADN polimerasa. La molécula de ácido nucleico puede ser cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento.
Por consiguiente, los kits pueden comprender, además: a) una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos viables; o b) cebadores y/o una sonda que se hibridan específicamente con un ácido nucleico (extraído) del microorganismo viable.
También se describe en el presente documento un kit que comprende: a) un recipiente que contiene partículas recubiertas capaces de formar complejos con microorganismos viables y b) una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos viables; o cebadores y/o una sonda que se hibridan específicamente con un ácido nucleico del microorganismo viable.
La discusión a continuación se aplicamutatis mutandisa los métodos relacionados.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, el ácido nucleico del microorganismo viable puede ser una molécula de ADN, por ejemplo, un gen, o una molécula de ARN, tal como por ejemplo un ARNm o un ARNmi. Los objetivos preferidos son genes, tales como ILV3 como se analiza en el presente documento. Otros objetivos preferidos son los genes de patogenicidad, tal como los que codifican la toxina Shiga (por ejemplo, en la infección enterohemorrágica porE. coli).
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, las moléculas de ácido nucleico que actúan como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos se describen en otra parte del presente documento. Los sustratos adecuados se analizan con más detalle en el presente documento. Por "sustrato" se entiende una molécula de ácido nucleico sobre la que actúa (directamente) la enzima derivada del microorganismo. Normalmente, dichas moléculas de ácido nucleico son sustratos de oligonucleótidos. Son moléculas de ácido nucleico sintéticas.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, los cebadores y/o una sonda que se hibridan específicamente con un ácido nucleico del microorganismo viable pueden permitir la determinación de si una bacteria u hongo está presente en la muestra y/o si la bacteria u hongo tiene Genes de resistencia a los antimicrobianos. El kit puede comprender una pluralidad de pares de cebadores y/o una pluralidad de sondas para la detección y/o caracterización del microorganismo. La pluralidad de pares de cebadores y/o una pluralidad de sondas pueden permitir la detección y/o caracterización de bacterias y hongos. Los cebadores y/o una sonda pueden permitir la identificación del género y/o especie del microorganismo presente en la muestra.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, significa que los cebadores se hibridan con el ácido nucleico objetivo, pero no se hibridan (ni reaccionan de forma cruzada) con otros ácidos nucleicos. Los cebadores y/o sondas pueden hibridarse con subregiones particulares dentro de un gen. Los cebadores y/o una sonda pueden hibridarse específicamente con el mismo gen en múltiples especies del mismo género para permitir la identificación del género del microorganismo. Alternativamente, los cebadores y/o una sonda pueden hibridarse específicamente con un gen en una única especie de microorganismo para permitir la identificación de la especie de microorganismo.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, como se describe en el documento WO2018189502, el gen ILV3 es particularmente útil para detectar si hay un hongo o una levadura presente en una muestra debido a la falta de identidad de secuencia con el genoma humano.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, para la detección o caracterización de hongos/levaduras, los cebadores pueden comprender:
a. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 de la siguiente especieCandida
i.Candida albicans
ii.Candida dubliniensis
iii.Candida tropicalis
iv.Candida parapsilosis
v. Candida glabrata
vi.Candida krusei
vii.Candida guilliermondii
viii.Candida auris
y opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente;
b. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 de la siguiente especieAspergiloi.Aspergillus fumigatus
ii.Aspergillus niger
iii.Aspergillus flavus
y opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 70 y 71 o SEQ ID NO: 73 y 74 respectivamente;
c. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida albicansy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 y 5 o SEQ ID NO: 6 y 7 respectivamente;
d. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida dubliniensisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9, SEQ ID NO: 10 y 11 o SEQ ID NO: 12 y 13 respectivamente;
e. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida tropicalisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 y 15 o SEQ ID NO: 16 y 17 respectivamente;
f. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida parapsilosisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 y 19 o SEQ ID NO: 20 y 21 respectivamente;
g. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida glabratay opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 y 23, SEQ ID NO: 24 y 25, SEQ ID NO: 26 y 27 o SEQ ID NO: 28 y 29 respectivamente;
h. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida kruseiy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30 y 31, SEQ ID NO: 32 y 33, SEQ ID NO: 34 y 35, SEQ ID NO: 36 y 37 o SEQ ID NO: 38 y 39 respectivamente;
i. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida guilliermondiiy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40 y 41, SEQ ID NO: 42 y 43, SEQ ID NO: 44 y 45 o SEQ ID NO: 46 y 47 respectivamente;
j. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida aurisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y 49, SEQ ID NO: 50 y 51, SEQ ID NO: 52 y 53, SEQ ID NO: 54 y 55, SEQ ID NO: 56 y 57, SEQ ID NO: 58 y 59, SEQ ID NO: 60 y 61, SEQ ID NO: 62 y 63, SEQ ID NO: 64 y 65, SEQ ID NO: 66 y 67 o SEQ ID NO: 68 y 69 respectivamente;
k. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus fumigatusy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 76 y 77, SEQ ID NO: 79 y 80, SEQ ID NO: 82 y 80 o SEQ ID NO: 83 y 84 respectivamente;
l. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus nigery opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 87 y 86;
m. un cebador directo e inverso que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus flavusy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 90 y 89 o SEQ ID NO: 90 y 92 respectivamente; y/o
n. un cebador directo e inverso que se híbrida específicamente con el gen ILV3 deCriptococo neoformansy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 93 y 94, SEQ ID NO: 96 y 97, SEQ ID NO: 99 y 100, SEQ ID NO: 102 y 103 o SEQ ID NO: 105 y 106 respectivamente. De acuerdo con todos los aspectos de la invención, para la detección o caracterización de hongos/levaduras, la sonda puede comprender:
a. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 de la siguiente especieCandida
i.Candida albicans
ii.Candida dubliniensis
iii.Candida tropicalis
iv.Candida parapsilosis
v.Candida glabrata
vi.Candida krusei
vii. Candida guilliermondii
viii.Candida auris
y opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 b. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida albicansy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116 o 117
c. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida dubliniensisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118, 119 o 120
d. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida tropicalisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 121
e. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida parapsilosisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122 o 123
f. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida glabratay opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124, 125, 126 o 127
g. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida kruseiy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128, 129, 130, 131 o 132
h. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida guilliermondiiy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 133, 134 o 135
i. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deCandida aurisy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 o 146
j. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 de la siguiente especieAspergillus
i.Aspergillus fumigatus
ii.Aspergillus niger
iii.Aspergillus flavus
y opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 72 o 75
k. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus fumigatusy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 78, 81 o 85
l. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus nigercomprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 88
m. una sonda que se hibrida específicamente con el gen ILV3 deAspergillus flavusy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 91; y/o
n. una sonda que se híbrida específicamente con el gen ILV3 deCriptococo neoformansy opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 95, 98, 101, 104 o 107.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, para la detección y/o caracterización de bacterias, los cebadores y sondas pueden hibridarse específicamente con partes específicas de la región 16S del ADN bacteriano. Los cebadores pueden amplificar partes específicas de la región 16S del ADN bacteriano. Los cebadores PLK1 (5-TACGGGAGGCAGCAGT-3 - SEQ ID NO: 108) y PLK2 (5-TATTACCGC GGCTGCT-3 - SEQ ID NO: 109) están altamente conservados en diferentes grupos de eubacterias. Estos cebadores sintetizan un fragmento de 187 pb. PLK2 puede marcarse internamente con fluoresceína. Una sonda puede distinguir las bacterias Gram negativas de las Gram positivas. Las sondas de hibridación marcadas con colorante fluorescente ISN2 (5-CCGCAGAATAAG CACCGGCTAACTCCGT-3 - SEQ ID NO: 110) e ISP2 (5-CCT AAC CAG AAA GCC ACG GCT AAC TAC GTG-3 - SEQ ID NO: 111) emiten luz a diferentes longitudes de onda (640 y 705 nm) y pueden usarse para la detección y diferenciación mediante tinción de Gram del ADN bacteriano mediante una señal de fluorescencia. Otros cebadores adecuados pueden comprender la secuencia de nucleótidos CAACGCGAAGAACCTTACC (SEQ ID NO: 112) y ACGTCATCCCCACCTTCC (SEQ ID NO: 113). Una sonda Gram positiva adecuada comprende la secuencia de nucleótidos 5'-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3' (s Eq ID NO: 114). Una sonda Gram negativa adecuada comprende la secuencia de nucleótidos 5'-HEX-ACGACAGCCATGCAGCACCT-TAMRA'3(SEQ ID NO: 115). Aunque estas sondas están marcadas de manera diferente para permitir la detección diferencial, el experto apreciará que se pueden adoptar enfoques alternativos como los descritos en el presente documento para facilitar la detección.
Por consiguiente, el kit puede comprender a) un recipiente que contiene partículas recubiertas capaces de formar complejos con microorganismos viables y b) una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos viables; o cebadores y/o una sonda que se hibridan específicamente con el gen ILV3 en levadura y/o el gen 16S ARNr de bacterias.
El kit puede comprender además un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene intactos los microorganismos presentes en la muestra.
Los kits pueden comprender además i) polianetolsulfonato de sodio; y ii) al menos un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra. Los reactivos adecuados son conocidos en la técnica y se analizan más detalladamente en el presente documento. Como se muestra en el presente documento, el polianetolsulfonato de sodio es útil para la recuperación de microorganismos a partir de muestras que contienen células que no son microorganismos.
Los kits pueden comprender además i) polianetolsulfonato de sodio; y ii) un detergente. Un detergente es un ejemplo de reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene intactos los microorganismos presentes en la muestra.
En vista de la mayor sensibilidad de los microorganismos expuestos al agente antimicrobiano a la lisis, en algunas realizaciones el kit puede no comprender un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos. Debido a que las partículas recubiertas se unen preferentemente a microorganismos, no existe un requisito absoluto para lisar los no microorganismos en la muestra. Sin embargo, puede ser ventajoso realizar uno o más pasos de lavado para eliminar células que no son microorganismos (típicamente células que no son microorganismos intactos) y/o lisado celular de los complejos partícula-microorganismo. Se puede emplear cualquier solución de lavado adecuada; en el presente documento se analizan ejemplos.
El kit puede comprender: a) partículas capaces de formar complejos con microorganismos; b) polianetolsulfonato de sodio; c) al menos un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene intactos los microorganismos presentes en la muestra; y d) medios de detección para detectar la ausencia o presencia de microorganismos en los complejos partícula-microorganismo, en donde los medios de detección comprenden una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora de ácidos nucleicos de los microorganismos, y en donde la molécula de ácido nucleico es al menos parcialmente bicatenario y comprende residuos de uracilo en la cadena complementaria.
La molécula de ácido nucleico (sustrato) puede diseñarse basándose en que la enzima modificadora del ácido nucleico comprende una ADN o ARN polimerasa, preferiblemente una ADN polimerasa dependiente de ADN. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es ADN polimerasa I. En realizaciones adicionales o alternativas, la enzima modificadora de ácidos nucleicos comprende una ligasa, tal como una ligasa dependiente de ATP o NAD.
Los medios de detección pueden comprender además reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, opcionalmente en los que los reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos comprenden un par de cebadores y/o al menos una sonda que se hibrida con la molécula de ácido nucleico.
El kit puede comprender además un reactivo capaz de lisar microorganismos en los complejos partículamicroorganismo, opcionalmente en donde el reactivo capaz de lisar microorganismos en los complejos partículamicroorganismo comprende la molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para la actividad modificadora del ácido nucleico de los microorganismos. Los ejemplos adecuados incluyen monolaurato de polietilenglicol sorbitán (Tween 20), por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%. El reactivo puede incluir una saponina, por ejemplo, del 1 al 5% p/v, preferiblemente aproximadamente 1%.
El kit puede comprender además un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene intactos los microorganismos presentes en la muestra.
El reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra puede comprender una o más enzimas, en donde la una o más enzimas comprenden opcionalmente una proteinasa y/o una ADNasa. En el presente documento se analizan detergentes y enzimas adecuados.
El kit puede comprender además un reactivo de pH alto, por ejemplo, una base o un tampón. Éste puede ser, por ejemplo, NaOH, por ejemplo, NaOH 5 mM. Otros reactivos adecuados se describen en el presente documento.
El kit puede comprender además un tampón de neutralización. El tampón de neutralización puede ser capaz de restaurar el pH de la muestra después del tratamiento con pH alto. En el presente documento se describen reactivos adecuados.
La enzima modificadora de ácidos nucleicos puede comprender: (a) una ADN o ARN polimerasa, opcionalmente en donde la ADN polimerasa es una ADN polimerasa dependiente de ADN tal como la ADN polimerasa I; y/o (b) una ligasa, opcionalmente en donde la ligasa es una ligasa dependiente de ATP y/o NAD.
Características adicionales aplicables a todos los aspectos
Como ya se mencionó, la presente invención es particularmente aplicable a muestras clínicas, en particular muestras tomadas de un sujeto que se sospecha que padece una infección por microorganismos. Por tanto, de acuerdo con todos los aspectos de la invención, el microorganismo que puede recuperarse de la muestra (y detectarse y/o caracterizarse) puede ser un microorganismo patógeno, tal como una bacteria u hongo/levadura patógeno. La bacteria u hongo/levadura puede ser cualquier bacteria u hongo/levadura que sea capaz de causar infección o enfermedad en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. En una realización, la bacteria comprende o consiste esencialmente en o consiste en una cualquiera o más de especies de Staphylococcus, incluyendoStaphylococcus epidermidisyStaphylococcus aureus(y preferiblemente cepas resistentes a meticilina), especies de Enterococcus, especies de Streptococcus incluyendoStreptococcus pneumonia,especies de Pseudomonas, especies de Klebsiella, especies de Mycobacterium, en particularMycobacterium tuberculosis,especies de Vibrio, en particularVibrio cholerae,Salmonella y/oEscherichia colietc. Las bacterias pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en especies de Clostridium y en particular C.difficileen ciertas realizaciones. C.difficilees la principal causa de diarrea y colitis asociadas a los antibióticos, una infección intestinal asociada a la atención sanitaria que afecta principalmente a pacientes de edad avanzada con otras enfermedades subyacentes. Las bacterias pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en especies de Pseudomonas, en particularPseudomonas aeruginosa.Las bacterias pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en especies de Klebsiella, en particular,Klebsiella pneumonia.En una realización, el hongo/levadura comprende o consiste esencialmente en uno cualquiera o más especiesCandida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystisy/oStachybotrys.
El microorganismo puede detectarse a través de su actividad enzimática, como se describe en el presente documento. Por tanto, los métodos proporcionan una indicación de los microorganismos viables recuperados de la muestra que contiene antibióticos. Después de un período de tiempo, si los microorganismos no son viables, la actividad enzimática se perdería de la muestra. Esto representa una ventaja de usar actividad enzimática como indicador de microorganismos en la muestra sobre el uso de moléculas de ácido nucleico, en particular ADN, que pueden persistir durante mucho más tiempo en algunas realizaciones.
Los métodos de la invención pueden implicar identificar la naturaleza de la infección, una vez que se ha detectado la presencia positiva de un microorganismo en la muestra. Se puede emplear cualquier método adecuado para este paso de identificación adicional, como se analiza en el presente documento.
"Agente antimicrobiano" se define en el presente documento para abarcar cualquier agente que mata o inhibe el crecimiento de un microorganismo. El agente antimicrobiano puede ser un agente antibiótico o antifúngico. El antimicrobiano puede ser cualquier agente antimicrobiano que se utilice habitualmente en el tratamiento de infecciones del torrente sanguíneo. El antimicrobiano utilizado para tratar al sujeto será seleccionado por el cuidador basándose en una evaluación clínica del sujeto. Esta información se puede utilizar al realizar la presente invención al considerar qué microorganismo se considera más probable que esté presente en la muestra. Puede contribuir a la selección de condiciones adecuadas, por ejemplo, condiciones adecuadas de lisis selectiva. Por ejemplo, si es probable que la muestra contenga un microorganismo más robusto, se pueden usar detergentes para la lisis selectiva. Por otro lado, si es probable que la muestra contenga un microorganismo más sensible, no se puede emplear ningún detergente y en su lugar se pueden utilizar pasos de lavado. El agente antimicrobiano puede ser de amplio espectro, que puede matar o inhibir una variedad de microorganismos. Los ejemplos no limitantes de agentes antibióticos incluyen: penicilina, meropenem, flucloxacilina, ampicilina, oxacilina, piperacilina-tazobactam, vancomicina, teicoplanina, daptomicina, tigeciclina, quinupristina/dalfopristina, gentamicina, amikacina, linezolid, azitromicina, claritromicina, ciprofloxacina, levofloxacina, esparfloxacina, gatifloxacina, garenoxacina, gemifloxacina, moxifloxacina, doxiciclina, TMP-SMX, polimixina B, cefotaxima, cefotetán, cefamandol, cefuroxima, ceftizoxima, ceftazidima, cefixima, cefoperazona, cefepima, cefazolina, cefoxitina y ceftriaxona. Los ejemplos no limitantes de agentes antifúngicos incluyen: flucitosina, fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol, etoconazol, griseofulvina, anfotericina B, caspofungina, micafungina y anidulafungina. Las cantidades administradas de estos agentes se determinan de acuerdo con procedimientos estándar de atención dependiendo del agente en particular. Esto contribuye a los niveles de agente antimicrobiano presentes en la muestra. El antimicrobiano puede estar presente en la muestra en una concentración de al menos o más de 0.05, 0.5, 5, 10, 25, 50, 75 o 100 pg/ml. El antimicrobiano puede estar presente en la muestra en una concentración de no más de o menos de 100, 250, 500 o 1000 pg/ml. El antimicrobiano puede estar presente en la muestra en una concentración de no más de o menos de 100 pg/ml. El antimicrobiano normalmente puede estar presente en la muestra en una concentración de entre 0.5 y 250 pg/ml. El antimicrobiano puede estar presente en la muestra en una concentración de entre 0.5 y 100 pg/ml.
Como se explica en el presente documento, la invención se aplica en el entorno clínico en donde un sujeto sospechoso de una infección microbiana se trata con un agente antimicrobiano antes de que se pueda tomar una muestra de fluido corporal (especialmente sangre). Por tanto, el agente antimicrobiano administrado a un sujeto como tratamiento puede ser (y debería ser) la única fuente de agente antimicrobiano en la muestra. Por tanto, el agente antimicrobiano normalmente ha sido seleccionado por un cuidador (por ejemplo, un médico o una enfermera) y administrado basándose en los síntomas clínicos actuales demostrados por el sujeto. En la invención, el microorganismo en la muestra es (o se cree que es) susceptible al agente antimicrobiano.
Una "muestra" en el contexto de la presente invención es aquella que contiene, o se sospecha que contiene, un microorganismo, tal como un hongo (por ejemplo, una levadura) y/o una bacteria y también contiene un agente antimicrobiano. Normalmente, la muestra es una muestra líquida. Por tanto, la muestra puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una muestra clínica, tal como una muestra de fluido corporal. Un tipo de muestra preferido es la sangre, que incluye sangre completa, plasma, suero y muestras que contienen sangre, tales como un hemocultivo o caldo de sangre. En algunas realizaciones, la muestra comprende sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido articular, orina o lavado broncoalveolar (BAL). La muestra puede ser una muestra clínica tomada de un sujeto que está recibiendo, o ha recibido, tratamiento utilizando el agente antimicrobiano. La muestra puede comprender una muestra de un paciente que se sospecha que padece una infección o que está siendo examinado para detectarla. La muestra puede tener cualquier volumen adecuado, tal como de 0.2 a 10 ml o de 1 a 10 ml.
La muestra que se utilice dependerá de diversos factores, tal como la disponibilidad, la conveniencia y la condición que se está probando. Las muestras típicas que se pueden usar, pero que no pretenden limitar la invención, incluyen muestras de sangre completa, suero, plasma, plaquetas, líquido articular y orina, etc. tomadas de un paciente, más preferiblemente un paciente humano. Se puede sospechar que el paciente padece una infección del torrente sanguíneo o se le está realizando un examen de detección. El paciente puede ser un paciente hospitalizado. La muestra puede tomarse de un sujeto que comprende más de 5, 10 o 15 millones de glóbulos blancos (WBC) por ml de sangre.
Además de un agente antimicrobiano, la muestra puede comprender además uno o más inhibidores de análisis posteriores. El uno o más inhibidores del análisis posterior se pueden seleccionar de: restos de células sanguíneas, hemoglobina, ADN de leucocitos y plaquetas.
Por tanto, la presente invención también separa los microorganismos de uno o más inhibidores del crecimiento microbiano.
Para evitar dudas, los métodos de la invención representan métodosin vitro.Se llevan a cabo sobre una muestra extraída de un sujeto. Los métodos de la invención se llevan a cabo comenzando con una muestra que ya se ha aislado del paciente en un procedimiento separado. Lo más preferible es que los métodos se lleven a cabo en una muestra de un ser humano, pero los métodos de la invención pueden tener utilidad para muchos animales. Los agentes antimicrobianos se utilizan con frecuencia en la práctica veterinaria y en la agricultura.
La muestra puede comprender células que no sean microorganismos en una concentración de entre 20,000 y 5 millones de células por mililitro. La muestra puede comprender células que no son microorganismos en una concentración de al menos aproximadamente 100,000 células por mililitro. Preferiblemente, la muestra puede comprender células que no son microorganismos en una concentración de al menos aproximadamente 20,000 células por mililitro.
Las partículas utilizadas en la presente invención están recubiertas. El recubrimiento es típicamente un recubrimiento polimérico. Alternativamente, las partículas recubiertas pueden carecer de un recubrimiento polimérico. Las partículas recubiertas pueden estar recubiertas con moléculas tales como citrato, almidón, lectina que se une a manosa o poli-L-lisina. Las moléculas que recubren las partículas recubiertas pueden adsorberse sobre la superficie de las partículas o formar una amalgama con las partículas. Las partículas recubiertas pueden estar total o parcialmente recubiertas.
De este modo se distinguen las partículas recubiertas de las no recubiertas. Las partículas no recubiertas incluyen partículas que consisten en un metal o un compuesto metálico (por ejemplo, óxido metálico) sin otras moléculas adsorbidas en la superficie (por ejemplo, citrato) o amalgamadas con el metal o compuesto metálico. Las partículas recubiertas son capaces de unirse y formar complejos partícula-microorganismo con una variedad de microorganismos diferentes. Por tanto, son "panmicroorganismos" o "universales" en su especificidad de microorganismo. Las partículas recubiertas, que preferentemente son partículas magnéticas, pueden unirse a los microorganismos mediante unión no específica (a diferencia del uso de ligandos específicos objetivo, tal como anticuerpos, etc.). Las partículas recubiertas suelen tener una mayor afinidad por los microorganismos que por las células que no son microorganismos.
Las partículas recubiertas actúan eliminando microorganismos de la muestra, mientras que el agente antimicrobiano no forma parte (significativa) de los complejos formados. Por tanto, las partículas recubiertas no se unen sustancialmente a un agente antimicrobiano.
Las partículas recubiertas normalmente comprenden una superficie exterior polimérica. La superficie polimérica puede ser una superficie polimérica exterior regular, en donde la superficie de la partícula está recubierta (relativamente) uniformemente (dentro de las tolerancias de fabricación habituales). La superficie polimérica puede comprender un polímero a base de carbono. La superficie polimérica puede comprender derivados y copolímeros de poliimidas, poli(etilenglicol), alcohol polivinílico, polietilenimina y polivinilamina, poliacrilatos, poliacrilamidas, poliamidas, poliésteres, policarbonatos, polivinilos, poliestirenos y cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, la superficie polimérica comprende poliestireno y/o poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida. Lo más preferiblemente, la superficie polimérica comprende poliestireno y/o poli(estireno/divinilbenceno).
La superficie polimérica puede comprender derivados y copolímeros de polidimetilsiloxano, poliimida, tereftalato de polietileno, polimetilmetacrilato, poliuretano, cloruro de polivinilo, poliestireno, polisulfona, policarbonato, polimetilpenteno, polipropileno, fluoruro de polivinilidina, polisilicio, politetrafluoroetileno, polisulfona, acrilonitrilo butadieno estireno, poliacrilonitrilo, polibutadieno, poli (tereftalato de butileno), poli(éter sulfona), poli(éter éter cetonas), poli(etilenglicol), resina de estireno-acrilonitrilo, poli(tereftalato de trimetileno), polivinil butiral, polivinilidendifluoruro, poli(vinilpirrolidona) y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la superficie polimérica no está basada en silicio.
En realizaciones específicas de acuerdo con todos los aspectos de la invención, las partículas recubiertas pueden comprender, en la superficie exterior, uno cualquiera o más de: i) grupos de ácido carboxílico; ii) grupos amino, iii) grupos hidrófobos; y iv) estreptavidina. Los inventores han demostrado que estas funcionalidades son útiles en la recuperación universal de microorganismos viables. Tales funcionalidades normalmente forman parte del recubrimiento polimérico y no son suministradas por un ligando de direccionamiento separado. Así, los i) grupos ácido carboxílico, ii) grupos amino; o iii) los grupos hidrófobos pueden no ser parte de un polipéptido o peptidomimético en algunas realizaciones. De manera similar, los i) grupos ácido carboxílico, ii) grupos amino; o iii) los grupos hidrófobos pueden no ser parte de un nucleósido, nucleótido o ácido nucleico. También de manera similar, los i) grupos de ácido carboxílico; ii) grupos amino o iii) grupos hidrófobos no pueden ser parte de un lípido, esteroide, hormona o cofactor.
Las partículas recubiertas pueden ser magnéticas y, de hecho, son típicamente magnéticas. Las perlas magnéticas son paramagnéticas y son atraídas por un campo magnético aplicado externamente. Las perlas magnéticas son bien conocidas y están disponibles comercialmente. Las partículas recubiertas pueden ser superparamagnéticas. Las partículas recubiertas pueden comprender un metal o un compuesto metálico. Las partículas recubiertas pueden comprender óxido de hierro. El óxido de hierro puede comprender magnetita y/o maghemita. El óxido de hierro no puede comprender una relación de 1:1, 2:1, 3:1 o 4:1 de Fe2+ y Fe3+. Preferiblemente, el óxido de hierro está encapsulado mediante un recubrimiento polimérico. Las partículas recubiertas pueden ser una amalgama de óxido de hierro y polímero. Las partículas recubiertas pueden estar parcialmente encapsuladas por una superficie polimérica exterior, aunque esto es menos preferido. Las partículas recubiertas pueden comprender un núcleo y un recubrimiento de polímero. El núcleo puede ser magnético. Las partículas recubiertas pueden comprender óxido de hierro recubierto con citrato, almidón, lectina fijadora de manosa o poli-L-lisina.
Las partículas recubiertas pueden tener un diámetro de entre 0.05 y 20 pm, o entre 0.05 y 1 pm, tal como entre 0.1 y 0.5 pm, o entre 0.2 y 0.3 pm. Preferiblemente, las partículas recubiertas pueden tener un diámetro de entre 0.2 y 0.3 pm. Las partículas recubiertas pueden tener un diámetro de entre 0.1 y 3 pm o 0.1 y 2 pm. Más preferiblemente, las partículas recubiertas tienen un diámetro de entre 0.1 y 1.0 pm.
Las partículas recubiertas pueden comprender:
a) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida);
b) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida) con uno de los siguientes grupos adicionales en la superficie: ácidos carboxílicos, aminas o estreptavidina; o
c) moléculas de citrato, lectina que se une a manosa, almidón o poli-L-lisina adheridas a la superficie.
Las partículas recubiertas pueden ser magnéticas y comprender:
a) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida);
b) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida) con uno de los siguientes grupos adicionales en la superficie: ácidos carboxílicos, aminas o estreptavidina; o
c) moléculas de citrato, lectina que se une a manosa, almidón o poli-L-lisina adheridas a la superficie.
Las partículas recubiertas pueden comprender un metal (tal como hierro) o un compuesto metálico (tal como óxido de hierro) y:
a) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida);
b) un recubrimiento polimérico (tal como poliestireno, poli(estireno/divinilbenceno) o poliacrilamida) con uno de los siguientes grupos adicionales en la superficie: ácidos carboxílicos, aminas o estreptavidina; o
c) moléculas de citrato, lectina que se une a manosa, almidón o poli-L-lisina adheridas a la superficie.
Las partículas recubiertas tienen así una superficie polimérica exterior. En algunas realizaciones, la superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con ninguno de (i) un anticuerpo, (ii) un carbohidrato, (iii) un péptido derivado de la proteína apolipoproteína H, (iv) una proteína lectina de unión a manosa, (v) una poliamina o (vi) un detergente catiónico. La proteína lectina de unión a manosa (MBL) puede ser una proteína modificada genéticamente basada en MBL. Por ejemplo, puede ser una proteína modificada genéticamente que comprende la porción de MBL que se une a patógenos fusionada a una región Fc de una inmunoglobulina (es decir, FcMBL).
La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con ninguno de (i) un anticuerpo, (ii) un carbohidrato o (iii) una proteína del sistema inmunológico innato en algunas realizaciones.
La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con ninguno de (i) un anticuerpo, (ii) un carbohidrato, (iii) un péptido derivado de la proteína apolipoproteína H, (iv) lectina de unión a manosa o (v) un agente floculante (por ejemplo, un agente floculante como se define en el documento WO 03/102184) en algunas realizaciones.
La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con ninguno de (i) un anticuerpo, (ii) un carbohidrato, (iii) una proteína del sistema inmunológico innato o (iv) un agente floculante (por ejemplo, un agente floculante como se define en el documento WO 03/102184) en algunas realizaciones.
La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con polilisina o restos similares a polilisina en algunas realizaciones.
El anticuerpo puede ser un fragmento o derivado de un anticuerpo que conserva la función de unión específica de antígeno. Dichos fragmentos y derivados incluyen fragmentos Fab, ScFv, anticuerpos de dominio único, nanoanticuerpos, anticuerpos de cadena pesada, etc.
El carbohidrato puede ser un monosacárido, un oligosacárido (por ejemplo, un disacárido o un trisacárido), un polisacárido y/o un derivado del mismo.
La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con un ligando. La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con un ligando no específico (por ejemplo, un ligando no específico como se describe en el documento WO01/53525). La superficie exterior de las partículas recubiertas no puede estar recubierta con un ligando no proteico (por ejemplo, un ligando no proteico como se describe en el documento WO01/53525).
La superficie exterior de las partículas recubiertas puede estar carboxilada.
La superficie exterior de las partículas recubiertas puede estar recubierta con estreptavidina. La superficie exterior de las partículas recubiertas puede estar recubierta con estreptavidina y no con un ligando.
De acuerdo con todos los aspectos y realizaciones relevantes de la invención, el término "polianetolsulfonato de sodio" pretende abarcar todos los derivados funcionalmente equivalentes y formas de sal de los mismos (por ejemplo, polianetolsulfonato de potasio, polianetolsulfonato de magnesio, amilosulfato de sodio, etc.).
Como se usa en el presente documento, "recubrimiento" o "recubierto" generalmente se refiere a una capa de moléculas o material formado sobre una capa más externa o expuesta de una partícula. Dado que el recubrimiento puede ser parcial, el recubrimiento no tiene que comprender una capa continua de moléculas sobre una capa más externa o expuesta de una partícula.
A lo largo de esta divulgación, los términos "partículas" y "perlas" pueden usarse indistintamente.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una imagen de placas de agar a T=0 horas (izquierda) y T=2 horas (derecha), las cuales muestran una zona central sin crecimiento debido a la inhibición por el antibiótico de la muestra (véase el Ejemplo 1).
La Figura 2 es una imagen de muestras de sangre y muestra el alcance de la lisis sanguínea para cada conjunto de muestras: E-BUF, UREA, Tris+NaCl, congelación (de izquierda a derecha) (véase el Ejemplo 9).
La Figura 3 es una imagen de los resultados de las muestras finales antes de la configuración de la PCR. La imagen proporciona una demostración visual del beneficio del SPS para el procesamiento de muestras con perlas magnéticas en sangre: El SPS parece permitir una eliminación más completa de los componentes sanguíneos, como lo indican los eluatos menos rojos en presencia de SPS. Tenga en cuenta que el caldo aeróbico BacTec PLUS utilizado para el conjunto de muestras de caldo de sangre también contiene SPS (véase el Ejemplo 10).
La invención se entenderá respecto de los siguientes ejemplos no limitativos:
Sección experimental
Abreviaturas y definiciones:
5to% Cálculo del umbral del quinto percentil para determinar el 5 % de FPR
(fórmula = PERCENTILE.INC(matriz,0.05))
ABX Antibiótico o Antimicrobiano
BO Solo caldo
BB Caldo de sangre
CBA Agar sangre columbia
Cfu Unidad de formación de Colonia
COL Agar base columbia
Un ensayo de PCR múltiple dirigido al ADN microbiano de acuerdo
Confirmar con el estado de Gram (Gram Negativo, Gram Positivo o Candida)
CPD Citrato Fosfato Dextrosa
Ct Valor umbral del ciclo
Valor crítico (cfu): límite teórico de detección basado en el valor de
CV cfu y ACt usando la fórmula: muestra de puede no estar recubierta-2¿Ct
D1.. Punto de dilución (serie de 10 veces)
Dil Dilución
DMBB Tampón de unión microbiana sin detergente
DWB Tampón de lavado sin detergente
E-Buff Tampón de lisis sanguínea
Valor de cfu extrapolado utilizando el punto de dilución con TVC
E*cfu contable más alto en una serie de dilución
ECEscherichia coli
ETGA Generación y amplificación de plantillas enzimáticas
FA+ Frascos de hemocultivo aeróbico con resina, FA más tampón de
unión microbiana suave BioMerieuxGMBB
Control de Procesos Internos: Plantilla de PCR presente en LM para
IPC demostrar el procesamiento correcto de la muestra y verificar la
amplificación por PCR en muestras negativas para ETGA
LAWN Crecimiento microbiano confluente
Mezcla de lisis microbiana que contiene una mezcla de detergentes
LM
y enzimas líticas microbianas.
MM Mezcla maestra
Sin amplificación por encima del umbral de fluorescencia después de
NoCt
50 ciclos
NSC Sin control de picos
O/n Durante la noche
PC Control de picos de polimerasa
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
Pt Umbral de positividad calculado a partir de los resultados de NSC/NC
qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
RT Temperatura ambiente (+19 a 20°C)
SA Frasco estándar para hemocultivo aeróbico, SA BioMerieux
SAB Agar Sabouraud dextrosa
s/n Sobrenadante
SPS Sulfonato de polianetol de sodio
TNTC Demasiados numerosos para contar
TVC Recuento totalmente viable
Tampón de lavado (que contiene Tris-HCl Cloruro de Sodio Igepal
WB Desoxicolato de Sodio Tergitol, a menos que se indique lo
contrario); o sangre entera donde se indique.
ACt<Diferencia entre dos valores de Ct (normalmente NSC>Ct - Ct de
muestra positiva)
Ejemplo 1
Objetivo
Evaluar si los microorganismos de la sangre clínica que contienen antibióticos se pueden "rescatar" y eliminar antes de inocularlos en un medio nuevo para su incubación. Una breve investigación sobre si los organismos rescatados crecen de manera más eficiente en comparación con los organismos que permanecen en la sangre que contiene antibióticos.
Específicamente, nuestro objetivo es mostrar que cuando S.aureusse inocula en sangre que contiene una concentración inhibidora de un antibiótico lítico, piperacilina, y se deja incubar durante dos horas, los organismos pueden crecer capturándolos en perlas de captura magnética y transfiriéndolos a un frasco de hemocultivo sin antibiótico.
Materiales
Composiciones de tampón
Método
Organismo de prueba: S.aureus
Antibiótico: Piperacilina 96ug/ml sangre
Sangre humana: de Cambridge Bioscience, Research Donors, Londres, Reino Unido.
Se preparó un cultivo durante la noche del organismo de prueba en medio sangre/caldo (medio sangre: caldo 50:50 de una frasco de cultivo BioMerieux SA).
Se prepararon diluciones en serie diez veces del cultivo durante la noche en sangre/caldo según fuera necesario. Se añadió antibiótico (abx) a sangre humana completa (en citrato-fosfato-dextrosa, CPD, un anticoagulante) al nivel requerido.
Se utilizó sangre entera como control sin antibióticos.
Se agregaron diluciones de prueba del organismo la sangre+antibiótico o a la sangre solo a razón de 10 μl por ml de sangre (suficiente preparación para los requisitos del experimento).
Se tomaron 100 μl de muestra de recuento en placa (muestra T0).
Las muestras inoculadas se incubaron a 37 °C (estático) durante 2 horas.
Se tomaron 100 μl de muestra de recuento en placa (muestra T2).
Para el control, se agregaron 5 ml de sangre enriquecida abx o solo sangre a frascos de hemocultivo (frasco de cultivo BioMerieux SA) usando un adaptador de vial (West Pharmaceutical Services, Inc. PA, EE. UU.) y se incubaron en el gabinete de hemocultivo automatizado (adaptador retirado).
Para la prueba de "rescate", se trataron 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre con perlas de captura de momento (recubiertas con estreptavidina, perlas de ~300 nm, Bio estapor, Merk Cat# BE-M 08/0.3) como se muestra a continuación:
• Perlas de Captura de Momentum diluidas en tampón de unión microbiana sin detergente (DMBB - Tris+NaCl): 50 μl de perlas: 700 μl de DMBB por limpieza
• 750 μl de perlas diluidas agregadas a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml
• 5 ml de medio caldo añadidos al tubo
• 5 ml de sangre enriquecida+abx o sangre sola añadida al tubo
• Incubar en ITL TherMix (Integrated Technologies Ltd. Kent, Reino Unido), 32.5 °C/30 min/1000 rpm - protocolo de velocidad aumentada
• Magnetizar en el imán V&P (V&P Scientific Inc, CA, EE. UU.) durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante • Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB - Tris+NaCl) del imán y transferirlas a un tubo Eppendorf con tapa abatible de 2 ml en un imán DynaMag-2 (Thermo Fisher Scientific, Life Technologies Ltd. Paisley, Reino Unido)
• Magnetizar durante 5 minutos y luego retirar el sobrenadante
• Resuspender las perlas en 1 ml de DWB fuera del imán y luego reemplazarlas en el imán DynaMag-2
• Magnetizar durante 5 minutos y luego retirar el sobrenadante
• Resuspender las perlas en 1 ml de DWB, agregarlas a un frasco de hemocultivo nuevo y sin usar (frasco de cultivo BioMerieux SA) que contenga medio de crecimiento de hemocultivo estándar usando un adaptador de vial y comenzar la incubación (sin adaptador)
• Los frascos de hemocultivo se incuban en la cabina de hemocultivo automatizada (BacT/ALERT BioMerieux) que registra el tiempo hasta la positividad. El tiempo de "volteo" es cuando un frasco se vuelve positivo según lo determina el gabinete de hemocultivo automatizado
• Se registra el tiempo de "volteo" de cada frasco
• Se registran los recuentos en placa (recuento total de viables TVC)
Resultados
Como se puede observar en la Tabla 1, los organismos recuperados de las muestras 4b y 5b dieron positivo en el cultivo entre las 10 y 15 horas, cuando el hemocultivo de control permaneció negativo a las 120 horas (5 días). Sólo los organismos rescatados continuaron creciendo hasta alcanzar la positividad, mientras que los organismos en el hemocultivo de control fueron destruidos o inhibidos por la presencia del antibiótico. Se produjo crecimiento en ambas muestras que no contenían antibióticos, donde una se trató como control y la otra se procesó con el procedimiento de rescate.
Tabla 1 : Resultados de la recuperación de S. aereus a partir de sangre que contiene antibióticos
I D d e T i p o d e Dilución A n tib ió t ic o : P ip e r a c il in a
O rg a n is m ode picos Fecha deT ie m p o d e T ie m p o d e v o l te o
M u e s t r a m u e s t r ade Organismos96 u g /m l s a n g r eincubaciónv o l te o e n d ía s e n h o r a s /m in u to sTVCT0 TVCT2
4a Control S.aureus 10-3 y 09/08/2019 Negativo a 120h98 2 :
4b<Rescate do sertas>S. aureus : 10-3 Y 09/08/2019 0.57 13h40rm
5a Control S.aureus : io-4 y 09/08/2019 Negativo a 120h0
5b<Rescate de per'as>S.aureus 10-4 y 09/08/2019 0.62 14hS2m
6a Control S.aureus 10-4 « 09/08/2019 034 8b 9m331>1000,
6b ÜASCMO oo portas S. aureus 10-4 N 09/08/2019 045 10b 4&n <3000 TNTC
En conclusión, se ha demostrado que los organismos pueden "rescatar" y extraerse de una muestra de sangre que contiene antibióticos, inocularse en un medio fresco e incubarse hasta que alcancen la positividad. En el experimento discutido aquí, los organismos que no fueron rescatados y que permanecieron en la muestra que contenía antibióticos no crecieron y permanecieron negativos el día 5.
Los siguientes ejemplos demuestran la capacidad de una variedad de partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo en diferentes muestras y bajo diferentes condiciones y así recuperar microorganismos viables. También se ejemplifican diferentes métodos de detección y caracterización posteriores.
Ejemplo 2
En formato manual, dos tipos de perlas (Merck Bio-Estapor (conjugado con estreptavidina) perlas de 300 nm (Producto - BE-M08/03; "Bio-Estapor") y perlas ademtech Bio-Adembeads Streptavidin Plus de 200 nm (Número de producto 03222; "Bio-Ademtech")) se compararon con perlas Peps6 de ApoH Technologies (Referencia - MP20006; "ApoH Peps6").
En el experimento 1A, se comparó la unión de una alícuota de perlas Bio-Estapor (25 ul) y una alícuota de perlas ApoH Pep6 (10 ul). El mayor volumen de Bio-Estapor reflejó la menor cantidad de perlas por ml en el material proporcionado en comparación con el material ApoH.
Se probaron tres organismos:E. coli(Bacteria Gram negativa), S.epidermidis(Bacteria Gram positiva) yC. albicans(levadura). Se expusieron 0.5 ml de suspensión de organismo a las perlas en 0.5 ml de tampón de unión microbiana "TTGB", proporcionado en el kit ApoH Peps6 ("Peps6 Captobac", referencia MP10031-50T).
Después de permitir que el organismo se uniera durante 30 minutos, la muestra de perlas se separó del sobrenadante líquido aplicando un campo magnético para concentrar las perlas y retirando el sobrenadante con una pipeta. Las perlas se lavaron suavemente con tres alícuotas de tampón de lavado (Tris 50 mM, pH 8, Igepal CA-630 al 1 % v/v, NaCl 150 mM, Tergitol 15-S-9 al 0.25 % v/v) y el sobrenadante retenido y las perlas lavadas se analizaron en busca de organismos viables mediante dos métodos; recuentos de colonias en una placa de Agar Petri y detección de ADN microbiano mediante la prueba de generación y amplificación de plantillas enzimáticas (ETGA) (como se describe en Zweitzig et al., 2012. Caracterización de un nuevo ensayo de actividad de la ADN polimerasa que permite la detección sensible, cuantitativa y universal de microbios viables. Nucleic Acids Research 40, 14, e109, 1-12; y en los documentos WO2011/130584, WO2013/103744 yWO2016/005768).
Los recuentos en placa en la Tabla 1A muestran que con las perlas de Bio-Estapor yE. coli,la gran mayoría del crecimiento se encuentra en las perlas (33 CFU) frente al sobrenadante (2 CFU) y esto es similar al resultado de ApoH Peps6. No se encontró crecimiento con S.epidermidisy este organismo no pareció crecer en el caldo original. C.albicansmostró aproximadamente un 10% de CFU en el sobrenadante y un 90% unido, tanto para Bio-Estapor como para ApoH Peps6. Estos resultados indican que las perlas de Bio-Estapor parecen unirse a organismos a una rata equivalente a las perlas de unión a organismos Peps6 disponibles comercialmente en las condiciones de la prueba. La prueba ETGA sensible respalda los resultados, pero indica que S.epidermidispuede unirse a Bio-Estapor mejor que Peps6, como lo muestra el valor de Cq más bajo.
Tabla 1A
E.c. PNC rttf'i...........................................................................1.016-0* cfu/ml E. coli................
jS. e. PNC diT 2 Sin crecimiento tfu/mlStaph aptdermkfis
ÍC. a. O N C difi3.60C-05 rfu/ml Candida albicans... i Recuento de placas Resultados ETGA i Tubo Organismo ApoH_______ Cssapor CEU Cd Perlas de Bio-Estapor
Sio E stjpor en lampón de unión (sobrenadante)
F. cali25 pf.TNo probado Bio-Estapor en lampón de unión (unido) 33 325*
BkvEstapor en tampón de unión (sobrenadante) $.
ÍEplQNo probado B¡o- Estapor en tampón de unión (unido)i!p¡(h'!'rvirí:s037.63
Bio-Estapor en tampón de unión (sobrenadante) 34 No probado OíO Estapor en tampón de unión (unido)C aibicons25 ¡ñ.
24$ 33.34 ApoH Peps$ perlas
ApoH Pspsé en tampón de unión (sobrenadante) i No probado ApoH PepsS en tampón de unión (unido) f ,ctrt>ItiuL
3333,15
ApoH Pepsb en tampón de unión (sobrenadante) 5. No probado ApoH PcpsS en tampón de unión (unido)epIderrrMí20 0
<Ui>0 40.34
ApoH Pepsfe en tampón de unión (sobrenadante) No probadoC. aibkam35
ApoH Pepsb en tampón de unión (unido) ¡tan!
*316 34.01 perlas
Sin perlas 43 No probado Sin perlas 0 No probado Sin perlas *31$ No probado
s/Sin insectos
Sin perlas sin microbios 0 No probado
El experimento 1B demuestra uniónE. colien condiciones similares al Experimento 1A, aunque en 1B se omitieron los pasos de lavado. El experimento 1B muestra que otra perla, Bio-Ademtech, también se une a organismos, aunque a un nivel más bajo (véase la Tabla 1B). Aquí los recuentos en placa indican que aproximadamente un tercio de los recuentos viables se han unido a la perla. El ensayo de ADN polimerasa ETGA, más sensible, indica que la mitad de los organismos permanecen en las perlas, ya que el Cq de las perlas y el sobrenadante son aproximadamente iguales.
Tabla 1B
Ejemplo 3
En el Experimento 3, se compararon ApoH Peps6, Bio-Estapor y perlas de Estapor con una superficie carboxilada (Producto MI-030/40; "Estapor COOH"). El número de organismos que quedan en el sobrenadante después de la unión deE. colia las perlas durante 30 minutos se midió usando un ensayo de ATP fluorescente (ensayo de viabilidad celular microbiana BacTiter-Glo; Promega Corporation, G8230). Aunque esta es una prueba indirecta ya que no detecta directamente la presencia de organismos en la perla, es una prueba comparativa útil para las perlas basadas en ligando (ApoH Peps6) y las perlas sin ligando (Bio-Estapor y Estapor COOH). Después de la unión de 1 ml de 104 CFU/ml de E coli para 30 ml de un tampón de solución salina de fosfato, se analizó el ATP de una alícuota del sobrenadante como medida del contenido de organismos utilizando el ensayo BacTiter-Glo. Los resultados de la Tabla 2 muestran que la reducción de los niveles de organismos en el sobrenadante de las perlas Peps6, Bio-Estapor y Estapor COOH fueron del 33 %, 27 % y 24 % respectivamente cuando se midieron utilizando esta técnica.
Tabla 2
Ejemplo 4 El ejemplo 4 muestra los resultados de las pruebas deE. coli(CE), S.aureus(SA) yC. albicans(CA) en series de diluciones realizadas automatizando el método de separación magnética descrito en el Ejemplo 2. El ensayo utilizó perlas Bio-Estapor de 300 nm de diámetro como medio de captura con un tampón de unión de TTGB que contenía Tergitol al 0.25 %. A medida que se realizaron diluciones de 10 veces de cada uno de los tres organismos, se registró un cambio continuo en el Ct que permitió construir una curva dosis-respuesta.
Los siguientes ejemplos demuestran la captura microbiana universal de microorganismos mediante perlas magnéticas en la prueba Magnitor de Momentum. La prueba Magnitor consiste en dos lecturas de detección microbiana:
• ETGA: Detección de polimerasa microbiana a partir de células microbianas intactas.
• Confirmar: Detección de ADN microbiano de acuerdo con el estado de Gram (Gram Negativa, Gram Positiva o Candida)
Resultados clave:
• Las perlas magnéticas capturan bacterias y hongos a partir de tampones simples y de una variedad de tipos de especímenes biológicos complejos.
• La captura microbiana se produce utilizando una variedad de diferentes tamaños de perlas (perlas de 0.2 a 1.5 |jm de diámetro) y recubrimientos de superficie (por ejemplo, carboxilados, hidrófobos, aminados, etc.)
Ciertos componentes del tampón de unión pueden mejorar la detección microbiana en el ensayo Magnitor, por ejemplo, la lisis de sangre basada en detergente.
Ejemplo 5: La detección de microorganismos depende de la captura mediante perlas magnéticas.
Objetivo:
Se evaluó el rendimiento de unión microbiana paraE. coli, S. aureusyC. albicansen un tampón Tris+NaCl simple (pH tamponado con concentración de sal fisiológica para evitar el choque osmótico microbiano que puede ocurrir solo en agua). En este experimento también se incluyó un conjunto de muestras "sin control de perlas" para demostrar que la detección depende de la presencia de perlas magnéticas para la captura microbiana.
Preparación de perlas magnéticas:
Perlas de Estapor (Merck, Cat# M1-30/40) lavadas 3 x 1 ml en tampón Tris+NaCl 1X: 40 μl de perlas resuspendidas en un volumen final de 400 μl de tampón Tris+NaCl 1X (1 % de contenido sólido)
Protocolo:
• Cultivos líquidos de microorganismos durante la noche (o/n) configurados como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS (inoculación de 3 ml de caldo de una placa de agar). Al día siguiente (aprox. 16 horas después) 1.88 μl de cultivo líquido deE. coli y S. aureusañadido a 3 ml de caldo y 18.75 μl C.albicansse añadió cultivo líquido a 3 ml de caldo; y crecimiento de 2 horas realizado a 37°C, 500 rpm.
• Después de un crecimiento de 2 horas, los precultivos de microorganismos se diluyeron (DF10) en tampón Tris+NaCl 1X (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0] NaCl150 mM) para crear cuatro puntos de dilución por microorganismo.
• 100 μl de TVC realizados para cada dilución microbiana
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se agregaron muestras de 1 ml a tubos de 2 ml que contienen 15 μl de perlas prelavadas - Nótese que no se agregaron 112 μl de tampón Tris+NaCl 1X al tubo con perlas (según el protocolo estándar), porque todas las muestras microbianas se diluyeron en el mismo tampón 1X.
• 30 minutos de agitación (1000 rpm) a 37°C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de tampón de lavado (WB) y los tubos se mezclaron durante 2 minutos @ TA (1000 rpm).
• Magnetización de 3 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de mezcla de lisis (LM) a los tubos fuera del imán (se agregaron 5 μl de control de polimerasa (PC) a cada tubo de muestra de PC)
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
TVC (placas de agar COL/SAB)
*Valores de E cfu/ml derivados de la placa TVC contable más altaETGA Ct
Control Interno de Procesos (IPC) Ct
ETGA ACt (NSC promedio)
Valores críticos basados en NSC promedio (cfu/ml)
Confirmar CT
Umbral de positividad (Pt) < 40 Ct
Análisis:
• Los resultados de Magnitor para las muestras '(+) PERLAS' muestran un ETGA específico de densidad celular muy fuerte y una señal de confirmación para las tres especies de microorganismos, lo que demuestra la unión específica de las perlas de una amplia gama de grupos de microorganismos (GrNeg, GrPos, Candida).
• Nótese que los resultados de Candida podrían haber seguido una mejor tendencia de densidad celular, pero el cultivo líquido tenía bastantes partículas, lo que puede haber afectado la calidad de las diluciones en serie. Alguna evidencia de transferencia de células microbianas en los controles '(-) PERLAS', pero esto es de esperar con un solo paso de lavado.
Ejemplo 6: La captura microbiana de la sangre mediante perlas magnéticas se produce en tampones de lisis sanguínea simples y complejos y permite una detección microbiana comparable a la captura mediante centrifugación.
Objetivo:
Comparar dos tampones de lisis sanguínea diferentes en dos formatos de diluyente diferentes para el desarrollo de una prueba 'Rapid Magnitor' simple y rápida (no se incluye ningún paso de lavado en el protocolo).
Condiciones de la prueba:
• EBB2X 1 ml EBB 2X+ 1 ml Espécimen
• EBB 10X 112 μl 10X EBB 1 ml Espécimen
• B-BUF 2X 1 ml B-BUF 2X 1 ml Espécimen
• B-BUF 10X 112 μl B-BUF 10X 1 ml Espécimen
• EBB 10X: Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Tergitol 2.5 %
• 10X B-BUF: Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de sodio 1.5 M Igepal 10 % Desoxicolato de sodio 5 % Tergitol 2.5 %
Configuración de muestra:
•E. colio/n cultivo líquido dilución 1E-3 añadido al caldo de sangre (6.25 μl o/n por ml: 244 μl o/n 39 ml de caldo de sangre) y crecimiento de 60 minutos realizado en una incubadora con agitación @ 37 °C, 500 rpm • Después de 2 horas de crecimiento, las muestras se produjeron agregando 1 ml de muestra a un tubo de 2 ml que contiene tampón (y 15 μl de perlas BioEstapor (Merck, Cat# BE-M 08/0.3) para el conjunto de muestras Mag Beads): triplicarE. coli(EC) y muestras sin control de picos (NSC) por condición de prueba
• TVC de 100 μl realizadas para NSC yE. coli(incluyendo diluciones de muestra para garantizar placas contables) Protocolo:
Las muestras se configuraron como se indica arriba y progresaron inmediatamente al protocolo Spin o Mag Beads.
• Protocolo de giro
• Muestras centrifugadas durante 3 minutos a 9000 xg (las bisagras del tubo miran hacia afuera para la trazabilidad de la pella)
• Se eliminaron los sobrenadantes
• Se añaden 50 μl de LM a las muestras (aproximadamente 10 mezclas de pipetas para resuspender los sedimentos)
• Las muestras se colocan en una incubadora con agitación a 900 rpm durante 5 minutos y luego a 800 rpm durante 55 minutos (26 °C).
• Centrifugar las muestras a 17000 xg durante 1 minuto antes de configurar la qPCR
Protocolo de perlas magnéticas
• Muestras colocadas en una incubadora con agitación a 900 rpm durante 30 minutos (37 °C)
• Las muestras se colocaron en una rejilla magnética DynaMag-2 durante 5 minutos y luego se retiraron los sobrenadantes.
• Se añaden 50 μl de LM a las muestras (aproximadamente 10 mezclas de pipetas para resuspender los sedimentos)
• Las muestras se colocaron en una incubadora con agitación a 900 rpm durante 5 minutos y luego a 800 rpm durante 55 minutos (26 °C).
• Magnetizar las muestras durante 3 minutos antes de configurar la qPCR
• Configuración manual de qPCR (reacciones de 10 pl) solo para mezcla maestra ETGA
Resultados:
cálculo de cfu
Muestra y diluciones de muestra colocadas en placas COL (100 pl)
Fuente de muestra
ETGA Ct
Datos resumidos
P C
P
P
Análisis:
• La unión microbiana mediante perlas magnéticas se produce en:
° Tampones de lisis sanguínea simples y complejos (EBB = Tris-HCl Tergitol; B-BUF = Tris-HCl Cloruro de sodio Igepal Desoxicolato de sodio Tergitol), pero la señal de prueba derivada de la sangre varía dependiendo de los componentes del tampón de lisis sanguínea.
° Diluido (tampón 2X: 1 parte de tampón de lisis de sangre por 1 parte de espécimen) y concentrado (tampón 10X: 1 parte de tampón de lisis de sangre por 9 partes de muestra) formatos de muestra
Además, la señal de detección microbiana para la captura microbiana mediante perlas magnéticas es comparable a la captura mediante centrifugación.
Ejemplo 7: La captura microbiana de la sangre mediante perlas magnéticas no depende de la lisis de la sangre, pero la detección microbiana posterior mejora cuando se produce la unión microbiana en la sangre lisada.
Objetivo:
Dado el reciente descubrimiento de que múltiples tipos/tamaños de perlas producen resultados Magnitor similares para diluciones en serie microbianas y NSC, se pensó que un componente dentro del tampón de unión de Momentum podría estar mediando/facilitando este carácter de unión microbiana universal observado. Para investigar esta posibilidad, se realizó una serie de diluciones deE. colicomparando el tampón de unión estándar (B-BUF) con un B-BUF sin detergente que consiste solo en Tris-HCl [pH 8.0] NaCl, para probar si los detergentes en general son importantes para la unión microbiana. Se prepararon conjuntos de muestras para caldo de sangre, solo caldo y solo en tampón de unión 1X para comparar resultados para diferentes tipos de muestras.
Preparación:
Se prepararon 100 ml de tampones de unión 10X frescos:
• B-BUF: Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de sodio 1.5 M Igepal 10 % Desoxicolato de sodio 5 % Tergitol 2.5 %
• Tris+NaCl: Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 1.5 M
Perlas de Estapor (Merck, Cat# M1-30/40) lavadas 3 x 1 ml en el respectivo tampón 1X (diluido B-BUF 10X o Tris+NaCl 10X): Se resuspendieron 40 μl de perlas en un volumen final de 400 μl de tampón 1X (1% de contenido sólido)
Protocolo:
• Se configuró cultivo líquido deE. colio/n como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS, luego al día siguiente (aproximadamente 16 horas después) se agregan 1.88 μl o/n a 3 ml de caldo (equivalente a la dilución EC 1E-1 agregada al caldo a 6.25 pl/ml) y crecimiento de 2 horas realizado a 37°C, 500 rpm.
• Después de 2 horas de crecimiento,E. coliprecultivo diluido en serie (DF10) hasta EC 1E-6 en caldo de sangre precalentado (BB), caldo solo (BO) o tampón 1X (B-BUF o Tris NaCl).
• Se realizaron 100 μl TVC para todas las diluciones deE. coliy NSC
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido: • Se agregaron muestras de 1 ml a tubos de 2 ml que contienen 112 μl de tampón de unión (ya sea B-BUF o Tris+NaCI: 10X para conjuntos de muestras BB y BO; y 1X para conjuntos de muestras de tampón) 15 μl de perlas (prelavadas en el tampón respectivo)
• 30 minutos de agitación (1000 rpm) a 37°C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 2 minutos @ TA (1000 rpm)
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos fuera del imán (se agregaron 5 μl de control de polimerasa (PC) a cada tubo de muestra de PC)
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y Confirmar (reacciones de 10 μl)
Observaciones:
• No se observó lisis sanguínea para Tris+ NaCl, como se esperaba
• Perlas más granuladas/agregadas en ausencia de detergentes
Resultados:
*Valores de Cfu/ml extrapolados del TVC ETGA Ct contable más alto
ETGA Ct
IPC Ct
ETGA ACt (NSC promedio)
Valores críticos basados en NSC promedio (cfu/ml)
Confirmar GrNeg Ct
Umbral de positividad (Pt) < 40 Ct; * falsos positivos
Análisis:
• Los detergentes son importantes para producir buenos resultados de ETGA en presencia de sangre (como lo indican los peores resultados de ETGA para 'Tris+ NaCl 10X con BB'), pero la captura/detección microbiana sigue siendo evidente en ausencia de lisis de la sangre (como lo demuestran los resultados del conjunto de muestras 'Tris+NaCl 10X con BB').
• Los buenos resultados de ETGA en ausencia de sangre indican que los detergentes, como componentes del tampón de unión, no son necesarios para la unión deE. colia perlas
• Los buenos resultados de ETGA en el conjunto de muestras 'Tris+NaCl 10X con Tris+NaCl 1X' demuestran que los componentes biológicos en la sangre y/o el caldo no son necesarios para la unión microbiana.
• Curiosamente, el B-BUF parece ser ligeramente inhibidor de la señal de ETGA en B-BUF 10X con conjuntos de muestras de BO y B-BUF 1X, pero trabajos recientes en otros lugares han demostrado que el desoxicolato de sodio podría ser algo inhibidor del ensayo, por lo que esta observación no es inesperada
• Confirmar el mejor rendimiento en el conjunto de muestras 'Tris+NaCl 10X con Tris+NaCl 1X'. Todos los demás conjuntos de muestras similares produjeron resultados similares de Confirmar GrNeg.
• La señal de IPC quedó algo inhibida por la presencia de sangre, como era de esperar.
• Estos resultados demuestran que ni los detergentes ni la muestra biológica son mediadores de la unión microbiana paraE. coli
Ejemplo 8: En ausencia de sangre, la captura microbiana mediante perlas magnéticas se produce independientemente de cualquier amortiguación del pH o estabilización osmótica con sal.
Objetivo:
Para investigar más a fondo la importancia del tampón de unión de Momentum en la mediación de la unión microbiana, se investigó el efecto del tampón de pH y la sal sobre la unión en un sistema limpio (es decir, en ausencia de sangre o caldo).
Preparación de tampón 10X:
25 ml de cada tampón recién preparado:
BUF-1 500 mM Tris-HCl [pH7.4] 1.5 M NaCl
BUF-2500 mM Tris-HCl [pH8.0] 1.5 M NaCl
BUF-3500 mM Tris-HCl [pH8.5] 1.5 M NaCl
BUF-4500 mM Tris-HCl [pH8.0] SOLAMENTE
BUF-5 1.5 M NaCl SOLAMENTE
BUF-6 SÓLO agua
Perlas de estapor (Merck, Cat M1-30/40) lavadas 3 x 1 ml en el respectivo tampón 1X (tampones diluidos 10X): Se resuspendieron 30 μl de perlas en un volumen final de 300 μl de tampón 1X (1% de contenido sólido)
Protocolo:
• Los cultivos líquidos de E. coli o/n se configuran como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS (que contiene SPS) y caldo nutritivo (NB que no contiene SPS), luego, al día siguiente (aproximadamente 16 horas después) se agregan 1.88 μl o/n a 3 ml de caldo (equivalente a la dilución EC 1E-1 añadida al caldo a 6.25 pl/ml) para cada tipo de caldo (NB por la mañana y caldo PLUS por la tarde), e incubaciones de crecimiento de 2 horas realizadas a 37 °C, 500 rpm.
• Para cada experimento (NB y PLUS), 1E-1E. coliprecultivo diluido hastaE. coli1E-6 (DF10) en cada tampón 1X (BUF-1 a BUF-6)
• TVC de 100 μl realizadas utilizando un conjunto de dilución de EC separado realizado en caldo relevante (caldo NB o PLUS) para evitar inconsistencias en la viabilidad de la placa resultantes de diferentes tampones 1X
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se agregaron muestras de 1 ml a tubos de 2 ml que contienen 112 μl del tampón 1X respectivo perlas de 15 pl (prelavadas en el tampón respectivo)
30 minutos de agitación (1000 rpm) a 37°C
Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
Todo s/n eliminado
Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 2 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm) Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
Todo s/n eliminado
Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 pl)
Resultados:
Conjunto de datos NB (es decir Sin SP5) - experimento de la mañana
Todo el tampón (BUF-1 a 6) NC TVCs = 0
Umbral de positividad (Pt) < 40 Ct
Conjunto de datos PLUS (es decir, con SPS) - experimento de la tarde
Todo el tampón (BUF-1 a 6) NC TVCs = 0
Umbral de positividad (Pt) S 40 Ct
Análisis:
• Todas las zonas de tampón, incluyendo sólo el agua, demostraron captura deE. coliigualmente bien (como lo indican resultados similares de ETGA y Confirmar) - sin embargo, hubo algunos indicios de lisis microbiana osmótica en densidades celulares más bajas solo en agua (BUF-6)
• Tanto el caldo PLUS como elE. colicultivado con NB produjeron resultados Magnitor muy similares para todos los tampones analizados, lo que indica que el SPS no desempeña ningún papel obvio en la mediación de la unión microbiana deE. coli.
•Estos resultados indican que ningún componente del tampón es esencial para la unión deE. colia perlas de Estapor (carboxiladas)
Ejemplo 9: La captura microbiana de la sangre mediante perlas magnéticas se puede realizar utilizando una variedad de métodos diferentes de lisis sanguínea.
Objetivo:
Determinar si la captura y detección microbiana puede ocurrir cuando se emplean métodos alternativos de lisis de sangre.
Preparación:
Los tampones de unión se prepararon de la siguiente manera:
• E-BUF = Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de sodio 1.5 M Igepal 10% Tergitol 2.5%
• UREA = Tris-HCl 83 mM [pH 8.0] Urea 10 M
• Tris+NaCl = Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de sodio 1.5 M
Se resuspendieron perlas de BioEstapor (Merck, Cat# BE-M 08/0.3) antes de su uso.
Protocolo:
• La configuración de cultivo líquido S.aureuso/n como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS, luego al día siguiente (aproximadamente 16 horas después) se agregan 3.0 μl o/n a 3 ml de caldo de sangre (dilución 1E-3) y 4 horas crecimiento realizado a 37°C, 500 rpm.
• Después del crecimiento de 4 horas, precultivo de S.aureusse diluyó en serie (DF10) hasta 1E-6 en caldo de sangre precalentado.
• Se realizaron TVC de 100 μl para todas las diluciones S. aureus y NSC
Procesamiento manual de muestras mediante imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido mediante pipeta:
Configuración inicial
• Para muestras que utilizan urea, se añaden muestras de 0.25 ml a tubos de 2 ml que contienen 0.75 ml de UREA 15 μl de perlas.
• Para congelar las muestras, se agregan muestras de 1 ml a tubos de 2 ml y luego se congelan en hielo seco durante 5 minutos. Las muestras se descongelaron a 37 °C durante 5 minutos y luego se agregaron 112 μl de Tris+NaCl 15 μl de perlas.
• Para muestras que utilizan E-BUF o Tris+NaCl, se agregan muestras de 1 ml a tubos de 2 ml que contiene 112 pl de tampón de unión (ya sea E-BUF o Tris+NaCl) 15 μl de perlas
Procesamiento de todas las muestras.
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 3 minutos @ 37 °C (1000 rpm).
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 pl)
Observaciones:
• Lisis sanguínea observada en las muestras congeladas después de la descongelación (véase la Figura 2) • Se observa que la lisis de la sangre es casi instantánea con UREA
• Algunas perlas parecieron perderse durante el procesamiento de las muestras usando UREA.
• No se observó lisis sanguínea aparente para el conjunto de muestras de Tris+NaCl (como se esperaba)
Resultados:
EspécimenTVC *E cfu/ml
*Valores de Cfu/ml extrapolados del TVC contable más altoETGA Ct
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACIÓN
S. aureus1E-4 14.26 34.98 13.90 14.42
S.aureus1E-5 18.50 30.26 17.79 18.99
S.aureus1E-6 22.59 35.96 22.07 22.96
NSC 1 42.11 37.55 32.56 35.14
NSC 2 41.13 36.52 32.72 34.60
NSC 3 43.83 36.71 32.42 34.58
NSC promedio 42.36 36.92 32.57 34.77
ETGA ACt (NSC promedio)
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACIÓN
S.aureus1E-4 28.10 1.94 18.67 20.35
S.aureus1E-5 23.85 6.66 14.78 15.78
S.aureus1E-6 19.77 0.96 10.49 11.82
NSC 1 N/A N/A N/A N/A
NSC 2 N/A N/A N/A N/A
NSC 3 N/A N/A N/A N/A
Valores críticos basados en NSC promedio (cfu/ml)
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACIÓN S.aureus1E-4 0.01 875527.09 S.p6 2.52
S.aureus1E-5 0.02 3313.90 11.96 5.96
S.aureus1E-6 0.04 17241.36 23.34 9.31
NSC 1 N/A N/A N/A N/A
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACION
NSC 2 N/A N/A N/A N/A
NSC 3 N/A N/A N/A N/A
IPC Ct
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACION
S.aureus1E-4 35.68 36.10 37.31 38.12
S.aureus1E-5 34.49 36.18 35.39 35.54
S.aureus1E.6 34.22 35.76 35.12 34.50
NSC 1 34.40 36.51 34.39 34.87
NSC 2 34.18 35.86 34.52 34.09
NSC 3 34.85 36.31 34.25 34.04
Confirmar GrPos Ct
MÉTODO DE LISIS DE SANGRE
EspécimenE-BUF UREA Tris+NaCl CONGELACION
S.aureus1E-4 22.34 23.47 18.74 19.55
S.aureus1E-5 26.03 26.33 21.19 23.03
S.aureus1E-6 27.67 30.92 24.73 26.37
NSC 1 46.59 35.42* NoCt 48.06
NSC 2 40.33 NoCt NoCt NoCt
NSC 3 NoCt NoCt 45.99 41.75
Umbral de positividad (Pt) < 40 Ct; * falsos positivos
La Figura 2 muestra el alcance de la lisis sanguínea para cada conjunto de muestras: E-BUF, UREA, Tris+NaCI, congelación (de izquierda a derecha)
Análisis:
• Captura y detección microbiana de S.aureusmediante perlas magnéticas es comparable con métodos de lisis alternativos y sin lisis de sangre, según lo determinado por Confirmar. Sin embargo, la detección microbiana mediante ETGA mejora en diferentes grados mediante métodos alternativos de lisis sanguínea, debido a los efectos sobre la reducción de la señal de ETGA derivada de la sangre.
Ejemplo 10: Se necesita SPS para un rendimiento óptimo de las perlas, el procesamiento de muestras y la detección microbiana en sangre completa.
Objetivo:
Determinar la concentración óptima de SPS para la prueba Magnitor Rapid utilizando muestras de sangre completa de 1 ml. El objetivo secundario fue evaluar el efecto de SPS sobre la viabilidad microbiana en sangre total determinada por TVC.
Condiciones de la prueba:
2 x 5 ml de sangre completa o caldo de sangre aeróbica BacTec PLUS (relación1:3) en alícuotas para cada conjunto de muestras(E. coliy muestra NSC). Luego SPS agregó lo siguiente:
Conjunto de muestras 10% SPS (pl)
BB Ninguno
WB 0% Ninguno
WB 0.01% 5
WB 0.02% 10
WB 0.04% 20
WB 0.06% 30
WB 0.08% 40
WB 0.10% 50
Luego se agregaron 5 μl de precultivo deE. coli1E-2 a cada tubo de espécimen de 5 ml para recrear la muestra de dilución estándar 1E-5.
Protocolo:
• Se añadieron 1.88 μl puro o/n en caldo nutritivo (NB) a 3 ml de NB; y se incubaron durante 2 horas a 37°C, 500 rpm
• Después de 2 horas, el precultivo deE. colise diluyó 10 veces en NB tibio; y luego se agregan 5 μl a cada tubo de muestra de 5 ml (preparado como se muestra en las condiciones de prueba)
• La prueba Magnitor se inició de inmediato y los TVC se realizaron como se detalla a continuación.
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se precargaron 112 μl de E-BUF (Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 1.5 M Igepal 10% Tergitol 2.5%) 15 μl de perlas (BioEstapor, Merck, Cat# BE-M 08/0.3) en cada tubo de muestra, luego se agregan 1 ml de especímenes a los tubos de muestra
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 3 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm)
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 pl)
Resultados:
Análisis de TVC
• 100 μl en placas COL en tiempo cero
• Muestra bijous, que contiene aproximadamente 2 ml de muestra, dejada a temperatura ambiente (20.4 °C) en una mesa de trabajo (estática)
• TVC realizados en los momentos que se muestran en la tabla: las muestras se mezclaron completamente antes del recubrimiento
WB SPS % (colonias)
BB 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Tiempo EC CERO 263 303 147 96 354 128 322 126
Tiempo EC 2 horas 428 256 498 448 1106 760 491 341 Tiempo EC 4 horas TNTC 790 TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
Tiempo EC 6 horas TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC
Hora CE 21 horas LAWN LAWN LAWN LAWN LAWN LAWN LAWN LAWN Tiempo NSC CERO 0 0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
Tiempo NSC 2 horas 0 0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
Tiempo NSC 4 horas 0 0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A Tiempo NSC 6 horas 0 0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A Tiempo NSC 21 horas 0 0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
INCR. PLEGAMIENTO 0.2hr 1.63 0.84 3.39 4.67 3.12 5.94 1.52 2.71
Prueba rápida Magnitor realizada en el momento CERO
Resultados ETGA
WB SPS%
88 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
EC1 26.94 *28.72 27.90 26.41 29.31 28.70 32.31 33.76 EC 2 27.31 45.22 29.12 25.88 29.43 28.50 31.94 34.37 EC 3 27.34 41.32. 28.14 27.24 29.70 27.62 31.40 34.08 NSC 1 39,08 43.71 3339 33.20 38.93 44.62 50.00 SO,00 NSC 2 39.75 44.30 33.06 33.77 39.93 44.11 50.00 50.00 NSC 3 40.28 46.58 32.81 34.41 3S.54 43.30 50.00 50.00 Promedio EC 27,20* 43.27 r 28.39* 26.51* 29.48* 28.27* 31.88* 34.07 Prom edio NSC’33.70* 44.86* 33.09* 33.79* 39.13* 44.01* 50,00* 50.00 Promedio ACt 12.50 1.59 4.70 7.28 9.65 15.74 18.12 15.93 CV (c fu /m L ) 0.45 .1003.7.7 .36,59 6.16 4.40 0.02 0,01 0.02
Nota: NoCt cambió a 50 Ct para el análisis;<*>Se excluyó el valor atípico debido a la
pérdida sustancial de pellas durante el procesamiento.
Resultados IPC
WB SPS %
E C l34.03 42.50 42.19 40.42 37.87 35.81 38.14 37.05 ECZ34,83 NoCt 39,34 39.01 38.38 35,70 36,80 37,11
EC334.47 NOCÍ 40,43 .37.85 3S.34 36,11 36.80 37.66
NSC 134.15 NoCt 39.75 39.26 36.56 36,10 36.80 37.17
NSC 234.00 NoCt 39.12 38.40 37.81 35.98 37.87 38.60
NSC 334.18 45,91 40,58 37,32 36,90 36.36 38.09 37.46
Promedio NSC<... r> 34,1145.91 *39.81* 38.33 * 37.09* 36.15* 37,59* 37.74
Confirmar resultados de GrNeg
WB SPS%
B8 0 o .o i 0.02 0.04 0.06 0.080.1
ECl 32.33 30.05 27,94 29.15 28.71 31,58 29.20 29.27
EC231.4S 34.24 29.18 28.16 28,75 29.77 29.80 28.65
te i31.71 34.97 28.32 29.75 29.82 29.26 28,87 29.61m eiNoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt 47,82
NSC 243.07 NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt
NSC 347.16 NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt
P r o m e d io E C31.83* 33.08 *' 28.48* 29.02 *' 29.09* 30.20* 29.29* 29.18 Análisis:
• SPS indica un beneficio de proporcionar protección/viabilidad microbiana en sangre completa según el ensayo TVC; pero en general no hay problemas importantes con la viabilidad deE. colien sangre total.
• La incorporación de SPS mejoró la eficacia del procesamiento de muestras y el rendimiento de detección microbiana para las lecturas<e>T<g>A y Confirmar
• El SPS al 0.06% produjo los mejores resultados para la viabilidad basada en TVC; detección de ETGA (mejores resultados teniendo en cuenta Cts de muestras deE. coliy NSC); e inhibición de la PCR como lo indican los valores de IPC Ct. Los resultados de Confirmar GrNeg también mejoraron mediante la adición de SPS a la sangre total, pero la concentración exacta de SPS fue menos crítica.
Ejemplo 11: La captura microbiana de la sangre mediante perlas magnéticas se produce utilizando una variedad de productos de perlas carboxiladas disponibles comercialmente de tamaño similar (~300 nm de diámetro).
Objetivo:
Comparar perlas magnéticas carboxiladas alternativas de tamaño similar utilizando el ensayo Magnitor de Momentum Condiciones de la prueba:
I.D Perla Tamaño (|jm)
A PS-MAG-COOH (micropartículas GmbH #S2003) 0.27
B Partículas magnéticas esferocarboxilo (Spherotech #CM-025-10H) 0.1 -0.4
C Perlas de ácido carboxílico SuperMag (Ocean Nanotech #SC0201) 0.2
D Carboxil-Adembeads (Ademtech #02120) 0.2
E Perlas de carboxilo (Perlas FG #TAS8848N1140) 0.2
G Bio-Estapor (Merck #BE-M08/03) -conjugado con estreptavidina 0.3
Protocolo:
Se configuraron cultivos líquidos deE. coliy S.pyogenes o/ncomo estándar en 3 ml de caldo y caldo de sangre (BacTec PLUS aerobio) respectivamente, e incubados durante 16-20 horas (37°C)
Al día siguiente:
• Se diluyó el cultivo líquido deE. colia 1E-3 en caldo de sangre y luego se añadió al caldo de sangre (6.25 μl por ml de caldo de sangre); y preincubado durante 1 h 30 min (37 °C)
• Se diluyó el cultivo líquido de S.pyogenesa 1E-1 en caldo de sangre y luego se añadió al caldo de sangre (6.25 μl por ml de caldo de sangre); y preincubado durante 2 h 30 min (37 °C)
Experimento deE. colirealizado por la mañana.
• Se diluyó el precultivo deE. coli1E-3 en serie en caldo de sangre para producir 5 puntos de dilución (1E-3 a 1E-7)
• Las muestras se configuraron añadiendo 1 ml de muestra a tubos de 2 ml precargados con 15 μl de perlas sólidas al 1 % 112 μl de tampón de unión; y se realizó prueba Magnitor V4.0: Se probaron 5 puntos de dilución 3 NSC (8 conjuntos de muestras) por tipo de perla con tres tipos de perlas en cada epMotion 5073m
Experimento de S.pyogenesrealizado por la tarde.
• Se diluyó el precultivo de S.pyogenes1E-3 en serie en caldo de sangre para producir 5 puntos de dilución (1E-1 a 1E-5)
• Las muestras se configuraron añadiendo 1 ml de muestra a tubos de 2 ml precargados con 15 μl de perlas sólidas al 1 % 112 μl de tampón de unión; y se realizó prueba Magnitor V4.0: Se probaron 5 puntos de dilución 3 NSC (8 conjuntos de muestras) por tipo de perla con tres tipos de perlas en cada epMotion 5073m
Protocolo Magnitor V4.0 (procesamiento automatizado de muestras en epMotion 5073m)
Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
15 minutos de magnetización
1 ml s/n eliminado
Se añadieron 0.82 ml de WB a los tubos mientras se magnetizan las perlas.
1 ml s/n eliminado
Se agregaron 50 μl de LM a los tubos mientras se magnetizaban las perlas.
La magnetización se apagó y se realizó la reacción ETGA: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
Umbrales de positividad interna (Pt) calculados utilizando NSC (n= 6) para cada tipo de perla: fórmula = PERCENTILE.INC(matriz,0.05)
A B C D E G
NSC1 35.12 37.10 41.11 45.29 43.55 40.33
NSC2 35.00 38.85 42.73 46.18 43.15 40.37
NSC3 34.57 37.02 40.49 50.00 42.32 41.79
NSC4 33.77 38.25 41.20 44.74 43.82 43.80
NSC5 33.72 38.22 40.52 45.25 45.08 44.12
NSC6 35.06 41.19 41.93 44.33 43.32 42.39
Pt (5to%) 33.74 37.04 40.49 44.44 42.53 40.34Nótese que el método Pt (5to%) generará un falso positivo dentro de n=6: resaltado en fuente roja en la tabla principal de resultados a continuación
É.Cotí
$: pieus»!:*
Observaciones:
• La perla B es difícil de resuspender antes de diluirla hasta un 1% de contenido sólido; y apareció visualmente más diluido después de la dilución al 1% de sólido
• Al final del procesamiento, las muestras se colocaron en una rejilla magnética DynaMag-2 y todos los tipos de perlas C-G se magnetizaron de manera similar, excepto: Perla A, que parecía tener bolitas pesadas; y Perla B, que tenía pellas de perlas muy pequeñas.
Análisis:
Todas las perlas magnéticas carboxiladas analizadas aquí demuestran unión microbiana según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar. Sin embargo, la sensibilidad de la detección microbiana varía algo, dependiendo del nivel de señal de ETGA derivada de la sangre y/o de la inhibición del ensayo.
Ejemplo 12: La captura microbiana de la sangre mediante perlas magnéticas se produce utilizando una variedad de diferentes tamaños de perlas y recubrimientos funcionales.
Objetivo:
Comparar el rendimiento de captura microbiana para una variedad de perlas magnéticas disponibles comercialmente de diferente tamaño y recubrimiento funcional utilizando la prueba Magnitor de Momentum (tecnologías ETGA y Confirmar). Se realizaron dos experimentos para demostrar la captura microbiana para el procesamiento de muestras automatizado (Protocolo 1) y manual (Protocolo 2). Es importante destacar que el Protocolo 2 incluyó tres lavados de resuspensión de perlas para demostrar de manera más convincente que la señal ETGA/Confirmar es específica de las células microbianas unidas a las perlas, en lugar del arrastre de muestra (a diferencia del Protocolo 1, que incluía un solo paso de lavado magnetizado con perlas).
Condiciones de la prueba:
Todas las perlas se lavaron en 1 ml de 1X E-BUF (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 150 mM Igepal 1 % Tergitol 0.25 %) y se resuspendieron hasta un 1 % de sólido en 1X E-BUF
Configuración de la muestra (realizada por separado para los Protocolos 1 y 2, que se realizaron en días diferentes):
• Se configuraron cultivos líquidos deE. colio/n como estándar en 3 ml de caldo (BacTec PLUS aeróbico) e incubados durante 16-20 horas (37°C)
• Al día siguiente, el cultivo líquido deE. colise diluyó a 1E-3 en caldo de sangre y se realizó una incubación del crecimiento de 2 horas (37 °C a 500 rpm).
• Después de la incubación del crecimiento de 2 horas, el precultivo deE. coli1E-3 se diluyó en serie en caldo de sangre para producir tres puntos de dilución (EC 1E-6 a 1E-8).
• Especímenes de 1 ml (tres diluciones de E. coli y tres muestras de NSC: conjunto de 6 muestras) agregados a tubos de muestra de 2 ml precargados con 112 μl E-BUF 10X (Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 1.5 M 10 % Igepal Tergitol 2.5 %) 15 pL de perlas (1 % sólido), luego se inicia la prueba Magnitor de acuerdo con el Protocolo 1 o el Protocolo 2 (véase a continuación):
Protocolo 1 (procesamiento automatizado de muestras en epMotion 5073m):
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• 15 minutos de magnetización
1 ml s/n eliminado
Se añadieron 0.82 ml de WB a los tubos mientras se magnetizan las perlas.
1 ml s/n eliminado
Se agregaron 50 μl de LM a los tubos mientras se magnetizaban las perlas.
La magnetización se apagó y se realizó la reacción ETGA: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Protocolo 2 (procesamiento manual de muestras utilizando imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido mediante pipeta):
Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
Todo s/n eliminado
Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 2 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm) Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
Todo s/n eliminado
Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 2 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm) Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
Todo s/n eliminado
Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 2 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm) Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
Todo s/n eliminado
Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
Protocolo 1 (procesamiento automatizado de muestras en epMotion 5073m): realizado el 20190221
ETGA Ct
C o lo n ia s *E cfu/m l COOH-O.2 COOM-l.Q HYDSO-l.ü «82-1.3 V e lo c id a d BíoEsta Püftse
£ col! lE-6TNTC18500 20.97 20.13 21.01 21.36 21.38 21.01 19.85 £ coli 1E-7 *135 1850 25.28 24.23 26.43 24.61 25.06 25.46 26.27 £ cali 1E-S 12 185 27.56 28.64 30.54 27.24 3063 30.53 28,63
NSC 1 0 0 .38.19 36 32 38.73 37.86 33.18 37.34 40.26
NSC 2 0 0 38.33 36.16 39.41 37.13 38.30 39.22 38.82
NSC 3 0 0 34,34 35,78 37,67 36.76 40,05 39.16 39.42
ÍPC Ct
Colonias *£ cfu /m l COQH-O.Z COOH-l.O HYDRO-l.O NH2-1.5 Velocidad 8 ¡o Esta PepsB E.coll 1E-6 TNTC 18500 35.89 35.14 35.72 36.28 36.06 36.07 34.86
£ coli 1E-7 *185 1850 35.98 35.14 34.74 36.15 35.08 35.53 35.63
£ coli 1E-8 12 185 34.56 34,83 34,93 36.15 34.72 35,40 34.82
NSC 1 0 0 34.45 34.83 34.56 35.91 35.55 35.49 34.74
NSC 2 0 0 .34.51 34.71 35.13 36.07 34.92 35.04 34.42
PiSC 3 0 0 35.04 34.85 34.45 35.62 3562 35.34 34.85Protocolo 2 (procesamiento manual de muestras con imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido mediante
Análisis:
Estos resultados demuestran que una variedad de diferentes tamaños de perlas y recubrimientos funcionales producen niveles comparables de unión microbiana según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar.
Ejemplo 13: Se pueden utilizar perlas magnéticas de diferentes tamaños y recubrimientos funcionales para capturar una amplia gama de especies microbianas (Gramnegativas, Grampositivas y Candidas) de la sangre.
Objetivo:
Comparar el rendimiento de captura microbiana para una variedad de perlas magnéticas disponibles comercialmente de diferente tamaño y recubrimiento funcional utilizando la prueba Magnitor de Momentum (tecnologías ETGA y Confirmar).E. colise probó previamente (Tamaño de perla y recubrimiento I: experimento fuente: 20190221 WP7_Bead-Comparison Analysis y 20190228_WP7_Bead-Comparison-3-wash_Analysis): para ampliar este trabajo anterior, se probaron tres especies microbianas adicionales (S.aureus, S. pneumoniaey C.albicans).
Condiciones de la prueba:
Todas las perlas se lavaron en Tris+NaCI 1X 1 ml y se resuspendieron hasta obtener un 1%de sólido en Tris+NaCI 1X.
Protocolo:
Configuración de muestra:
• Se configuraron cultivos líquidos de microorganismos durante la noche (o/n) en caldo aeróbico BacTec PLUS (inoculación de 3 ml de caldo de una placa de agar). Al día siguiente (aproximadamente 16 horas después) se inoculó cultivo líquido de 300 μl de S.neumoníayC. albicansen 3 ml de caldo de sangre (dilución 1E-1) y se inculpó cultivo líquido de 3 μlde S. aureusen 3 ml de caldo de sangre (dilución 1E-3); y se realizó crecimiento de 2 horas a 37°C, 500 rpm.
• Después de 2 horas de crecimiento, los precultivos microbianos se diluyeron (DF10) en caldo de sangre para crear tres puntos de dilución por microorganismo.
• 100 μl de TVC realizados para cada dilución microbiana
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se añadieron muestras de 1 ml (tres diluciones por especie de microorganismo y tres muestras de NSC: 12 conjuntos de muestras) a tubos de muestra de 2 ml precargados con 15 μl de perlas (1 % sólido) y 112 μl de E-BUF (Tris-HCl 500 mM [pH 8.0]+ Cloruro de sodio 1.5 M+, Igepal 10 %+ y Tergitol 2.5 %).
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 3 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm)
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 pl)
Resultados:
U
IP C C t
Colonias *£ c fu /m t COOH-O.2 C Ü O H -l.O HYDRO-l.O NH2-1.5
S. aureus1£*5 TMTC 131,000 33.22 33.19 33.14 34. SO 5,aureus1E-6 TNTC 13,100 33.19 32.55 33.07 34.55S. aureus1E-7 *131 1,310 33.61 32,80 33.05 34.20C. a Ib ¡caris1E-2 Í.AWN 955,000 34.75 34.71 34.80 35.47C. atbícans1E-3 TNTC 95,600 33.59 33.02 33.49 34.54C albícans1E-4 *956 9,560 33.14 33.02 32.81 34.06S. pneumonías1E-2 Í.AWN 732,000 34.02 33.22 33,55 34.17S. pneumonías1E-3 TNTC 73,200 33.29 33,05 33.44 35.28 5.pneumoniae1E-4 “ 732 7,320 33.23 32.84 33.02 33.75
NSC1 0 - 33.1? 33.21 33.50 33.96
NSC 2 0 - 33.38 33.17 33.32 34.50
NSC 3 0 33.55 33.59 33.05 34.20
Análisis:
• Estos resultados demuestran que una variedad de diferentes tamaños de perlas y recubrimientos funcionales producen niveles comparables de unión microbiana según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar. Ejemplo 14: Se pueden utilizar perlas magnéticas de diferentes tamaños y recubrimientos funcionales para capturar una amplia gama de especies microbianas (Gramnegativas, Grampositivas y Candida) desde un simple tampón Tris+NaCl
Objetivo:
Comparar el rendimiento de captura microbiana para una variedad de perlas magnéticas disponibles comercialmente de diferente tamaño y recubrimiento funcional utilizando la prueba Magnitor de Momentum (tecnologías ETGA y Confirmar). Este experimento se realizó utilizando un tampón simple (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0] NaCl 150 mM) como el espécimen y tampón de lavado, es decir, no se utilizaron detergentes hasta la adición de la mezcla de lisis microbiana.
Condiciones de la prueba:
Título Descripción Producto Diámetro % Ferrita (Hm)
COOH-0.2 Nanoesferas Carboxiladas Estapor ® Muy Merck #M1- 0.160-0.240 >50
Pequeñas 020/50
COOH-1.0 Microesferas Carboxiladas Estapor® Merck #M1- 0.700-1.300 35-45
Original 070/40
HYDRO- Microesferas hidrófobas Estapor® Merck #MS- 0.700-1.300 35-50
1.0 originales 070/40
NH2-1.5 Microesferas aminadas Estapor® Merck #M2- 1.000-2.000 35-45
originales (-NH2) 070/40
Todas las perlas se lavaron en 1 ml de Tris+NaCl 1X (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0] NaCl 150 mM) y se resuspendieron hasta 1 % de sólido en Tris+NaCl 1X.
Protocolo:
Configuración de muestra:
• Se configuraron cultivos líquidos de microorganismos durante la noche (o/n) en caldo aeróbico BacTec PLUS (inoculación de 3 ml de caldo de una placa de agar). Al día siguiente (aproximadamente 16 horas después), se inocularon 3 μl de cultivo líquido deE. coliy S.aureusen 3 ml de caldo (dilución 1E-3) y se inocularon 300 μl de cultivo líquido deC. albicansen 3 ml de caldo (dilución 1E-1); y se realizó crecimiento de 2 horas a 37°C, 500 rpm.
• Después de un crecimiento de 2 horas, los precultivos microbianos se diluyeron (DF10) en tampón Tris+NaCl 1X para crear tres puntos de dilución por microorganismo.
• 100 μl de TVC realizados para cada dilución microbiana
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se añadieron muestras de 1 ml (tres diluciones por especie de microorganismo y tres muestras de NSC: 12 muestras) a tubos de muestra de 2 ml precargados con perlas de 15 μl (1 % sólido)
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB (Tris+NaCl 1X) y los tubos se mezclaron durante 3 minutos @ TA (1000 rpm).
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
U
1PC Ct
Colonias *Ecfu /m l COOH-O.2 COOH-l.OlYDfiO-l.O NH2-1.5
f .cali1E-6 *629 6,290 31.24 30.86 30.98 36.67£. cali1E-7 65 629 31.10 30.46 30.27 35.56£. coii1E-8 21 63 31.01 30.25 30.51 37.00S. aureus1E-5 *791 7,910 31.43 31.17 31.02 NoCtS. aureus1E-6 10279130.89 31.11 30.71 37.43S. aureus1E-7 5 79 30.84 30.56 30.69 45.23 C.atbicans1E-2 LAWN 811,000 35.64 33.75 33.48 NoCtC. aibiccms1E-3 TNTC 81,100 32.98 31.94 33.61 40.29C. albicans1E-4 *811 8,110 31.34 31.44 31.74 37.11
NSC 1 0 - 31.03 30.57 30.62 37.31
NSC 2 0 - 31.37 30.55 30.51 35.33
NSC 3 0 - 31.32 30.37 30.75 36.67
Análisis:
• Estos resultados demuestran que en un sistema limpio (es decir, un simple tampón Tris+NaCI en lugar de una muestra biológica) una variedad de diferentes tamaños de perlas y superficies funcionales (carboxiladas e hidrófobas) producen niveles comparables de unión microbiana según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar.
• Curiosamente, las perlas aminadas (NH2-1.5) produjeron resultados Magnitor muy pobres en el tipo de muestra, lo que indica poca o ninguna unión microbiana. Esta observación difiere de la situación en los especímenes de caldo de sangre, donde las perlas aminadas produjeron niveles comparables de captura microbiana a las otras perlas analizadas.
Ejemplo 15: Se pueden utilizar perlas magnéticas de diferentes tamaños y recubrimientos funcionales para capturar una amplia gama de especies microbianas (Gramnegativas, Grampositivas y Candida) de sangre no lisada.
Objetivo:
Comparar el rendimiento de captura microbiana para una variedad de perlas magnéticas disponibles comercialmente de diferentes tamaños y recubrimientos funcionales utilizando la prueba Magnitor de Momentum (tecnologías ETGA y Confirmar) en ausencia de lisis sanguínea, es decir, sin detergentes en el tampón de unión.
Condiciones de la prueba:
Título Descripción Producto Diámetro % Ferrita
(Hm)
COOH-0.2 Nanoesferas Carboxiladas Estapor ® Muy Merck #M1- 0.160-0.240 >50
Pequeñas 020/50
COOH-1.0 Microesferas Carboxiladas Estapor® Merck #M1- 0.700-1.300 35-45
Original 070/40
HYDRO - Microesferas hidrófobas Estapor® Merck #MS- 0.700-1.300 35-50
1,0 originales 070/40
NH2-1.5 Microesferas aminadas Estapor® Merck #M2- 1.000-2.000 35-45
originales (-NH2) 070/40
Todas las perlas se lavaron en 1 ml de Tris+NaCl 1X (Tris-HCl 50 mM [pH 8.0] NaCl 150 mM) y se resuspendieron hasta 1 % de sólido en Tris+NaCl 1X.
Protocolo:
Configuración de muestra:
• Se configuraron cultivos líquidos de microorganismos durante la noche (o/n) en caldo aeróbico BacTec PLUS (inoculación de 3 ml de caldo de una placa de agar). Al día siguiente (aproximadamente 16 horas después), se inocularon 3 μl de cultivo líquido deE. coliy S.aureusen 3 ml de caldo (dilución 1E-3) y se inocularon 300 μl de cultivo líquido deC. albicansen 3 ml de caldo de sangre (dilución 1E-1); y se realizó crecimiento de 2 horas a 37°C, 500 rpm.
• Después de 2 horas de crecimiento, los precultivos microbianos se diluyeron (DF10) en caldo de sangre para crear tres puntos de dilución por microorganismo.
• 100 μl de TVC realizados para cada dilución microbiana
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se añadieron muestras de 1 ml (tres diluciones por especie de microorganismo y tres muestras de NSC: 12 conjuntos de muestras) a tubos de muestra de 2 ml precargados con perlas de 15 μl (1 % sólido) y 112 μl de tampón de unión (Tris-HCl Cloruro de Sodio)
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se añadió 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 3 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm)
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
Confirmar Ct
COOHO.Z COOH-1,0 ÍWDK» t,0 NN2-1.5 Colonias *£ cfu/mt GrN&e GfPos Candida GfNeg Gffos Cedida GrNfcg GrPcs CandidaG*N*$Grfo* Candidaí, cotí,116 5.710WIANo Ct No Cí 30,51 No Cí No Ct 3159 No Ct N a ti " 3047 No Cí NoCtB.COU U.-1 en 3S27<N a tt NoCt 4S.33>No Ct NO Ct NoCt NoCt NoCt 3536 NO Ct NO Ct£. cvfi1C ft 24 6? No a Na Q No Ct NoCí No Ct No Cl NoCt No a No Ct Na Cí NoCt No a 1aurtuts1E-S tntc 27,600 Na Ct 24<.>94<->No Ct NoCt?A.55 NoCt NoCt 24.34 NoCt NoCt 24.24 No Ct 5.aureus2.760 No Ct 27,34 No C; NoCt 2794 48. f 3 No <1 2S.1S NoCí No a 27.37 NoCt $bu reasIE-7 2S 276 No Ct 30.Í9 NoCi NoCt 2972 NoCt NoCt 3112 NoCí NoCt 2965 No CtC QÍbkoniIC‘ 2 LAWÑ 645,000 No Ct 310-65 31-51 4074 NOCÍ Z989 No Ct No Cí 30.24 Na Cí No Ct 28. Tí? Coibkaiute-3 TfáTC 64,900 NoCt NoCt Noc; 42.M No Ct 34AiNoCt NoCt No Ct NoCt NoCt No a Caibknnilf-/¡ vfr!S 5/190 No Ct No Ct NO Ct NoCt No Cí NoCt NO U NoCt No a NoCt no a NoCt NSC 1 c No Ct NoCt NoCí NoCí NoCí NoCt NoCí 45.94 NoCí No a NoCí NoCt NSC 2 0 No Ct Nací NO Ct 4239 No Ct NOCI NOCÍ NoCí No a Na a NoCt Na a nsc aaNo Ct NoCt No Ct NoCt No Cí No Cí NoCt No Cí NoCt NoCí NoCt No Ct Umbral de positividad SPtjs 43 Ct: falsos positivos se muestran en rojo
IPC Ct
Colonias *£ cfu/mt COOH'O.2 COOH-l.O HYDRO-l.G NH2-1.5 E.coií1E-6 *671 6,710 32.7S 32.82 33.21 33.42
E. COÜ 1E-7 69 671 33.02 33.61 32.90 33.81
E.coii1E~8 24 67 34.18 33.17 33.58 33.21 5,a u re us1E-5 INTC 27,600 33.31 33.77 33.86 34.06 5.attreus1E-6 *276 2,760 33.46 33.20 33.74 33.07 5.aureus1E-7 28 276 32.96 33.06 33.93 33.71 C. a Ibkarts1E-2 LAWN 649,000 32.94 33.30 33.81 33.95 C.aíb karts1E-3 TNTC 64,900 33.82 33.25 33.71 34.42 C.atbicans1E-4 *649 6,490 33.58 33.53 33,32 34.25
NSC 1 0 - 34.42 34.62 33.47 33.77
NSC 2 0 - 33.62 33.76 33.61 33.86
NSC 3 0 - 33.83 33,81 33.71 33.33
Análisis:
• Estos resultados demuestran que una variedad de diferentes tamaños de perlas y recubrimientos funcionales producen niveles comparables de unión microbiana de la sangre en ausencia de lisis sanguínea, según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar.
• Sin embargo, la detección microbiana mediante ETGA se reduce sustancialmente por un aumento en la señal de NSC ETGA en ausencia de lisis sanguínea, en comparación con experimentos anteriores con lisis sanguínea durante la unión microbiana.
Ejemplo 16: La captura microbiana mediante perlas magnéticas se produce en una variedad de tipos de muestras biológicas complejas.
Objetivo:
Investigar si la captura microbiana mediante perlas magnéticas es posible para otros fluidos biológicos complejos, además de la sangre.
Condiciones de la prueba:
Tipo de Descripción
espécimen
Tris+NaCl Tampón Tris con NaCl como conjunto de muestras de control no biológico (dos conjuntos de muestras idénticos se procesan en paralelo para los ensayos Magnitor y Rebrote)
Sangre Sangre total con anticoagulantes CPD y SPS.
[p ]
Protocolo:
• Los cultivos líquidos deE. colio/n se configuran como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS, luego, al día siguiente (aproximadamente 16 horas después), se agregan 3 μl o/n a 3 ml de caldo(E. coli1E-3) y se realizaron 2 horas de incubación de crecimiento a 37°C, 500 rpm.
• Después de 2 horas de crecimiento, el precultivo deE. coli1E-3 se diluyó para producir cinco puntos de dilución en serie(E. coli1E-6 a 1E-9) en cada tipo de espécimen. TVC de 100 μl realizados en placas de agar COL.
Simulación manual de Magnitor realizada utilizando el imán DynaMag-2 y transferencias manuales de líquido:
• Se agregaron muestras de 1 ml a tubos de muestra de 2 ml precargados con 112 μl de tampón de unión (Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 1.5 M Igepal 10 % Tergitol 2.5 % Sesoxicolato de Sodio 0.5 %) perlas de 15 μl (perlas BioEstapor); Merck #BE-M08/03 (1% sólido)) - Nota: los tubos de muestra para conjuntos de muestras de Tris+NaCl no están precargados con 112 μl de tampón de unión (para evitar la inclusión de detergentes, que podrían inhibir el crecimiento microbiano para el ensayo de Rebrote).
• 30 minutos de agitación (1000 rpm) a 37°C
• Magnetización de 5 minutos en DynaMag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregó 1 ml de WB y los tubos se mezclaron durante 3 minutos @ TA (1000 rpm) - Nótese a que se agregó 1 ml de tampón Tris+NaCl en lugar de tampón de lavado para los conjuntos de muestras de Tris+NaCl para evitar la inclusión de detergentes, que podrían inhibir el crecimiento microbiano para el ensayo de Rebrote
• Magnetización de 5 minutos en Dynmag-2
• Todo s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos sin imán - Nótese que las perlas se resuspendieron en 100 μl de tampón Tris+NaCl para el ensayo de Rebrote.
• Reacción ETGA realizada: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración manual de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 pl)
Resultados:
TVC (100 ul en placas COL)
Espécimen Colonias
Leche NSC 3
Ensayo de Rebrote en un conjunto de muestras emparejadas de Tris+NaCI
1. 100 μl de especímenes de Tris+NaCI sembradas/inoculadas - 'Espécimen'
2. 100 μl de sobrenadante sembrado/inoculado después del paso de unión microbiana - 'Después de la unión' 3. 100 μl de sobrenadante sembrado/inoculado después del paso de lavado - 'Después del lavado'
4. 50 μl de perlas resuspendidas en 100 μl de tampón Tris+NaCl y sembradas/inoculadas (es decir, 50% de material en placa y 50% de material inoculado en cultivo líquido) - 'Perlas'
Placas y cultivos líquidos incubados durante la noche a 37 °C
Campo de muestra Tris+NaCl
Resultados de Magnitor:
Nótese que no se observa amplificación en el canal Candida para Confirmar
IPC Ct
Colonias *E cfu/ml Tris+NaCl Sangre Saliva Orina Leche
E. coliD1 TNTC 66100 38.08 34.81 NoCt 32.46 36.65
Análisis:
• Estos resultados demuestran que las perlas magnéticas se pueden utilizar para capturar microorganismos de una variedad de tipos de muestras biológicas complejas, según lo determinado por las lecturas ETGA y Confirmar.
• El ensayo de Rebrote demuestra queE. colipuede volver a crecer en agar y cultivo líquido después de unirse a perlas magnéticas, según lo determinado por el crecimiento observable para el conjunto de muestras 'Perlas'.
Ejemplo 17: La captura y detección microbiana es posible a partir de especímenes que no sean de sangre en ausencia de lisis de la muestra.
Objetivo:
Mostrar la captura y detección microbiana en muestras de leche y orina no sanguíneas utilizando un tampón de unión no lisante y un tampón de lavado no lisante.
Preparación:
• Tampón de unión de Tris+NaCl 10X = Tris-HCl 500 mM [pH 8.0] Cloruro de Sodio 1.5 M
• Tampón de lavado Tris+NaCl 1X = dilución 1 en 10 de 10 X tampón de unión Tris+NaCl
• Orina fresca (humana)
• Leche de vaca semidesnatada (pasteurizada)
Se resuspendieron perlas de BioEstapor (Merck, Cat# BE-M 08/0.3) antes de su uso.
Protocolo:
• Se configuraron cultivos líquidos deE. coli, S. aureus, C. albicansy S.pneumoniaeo/n como estándar en caldo aeróbico BacTec PLUS
• Al día siguiente (aproximadamente 16 horas después), se usaron 3 μl de E. coli y S. aureus o/n para inocular 3 ml de cultivos de caldo frescos (diluciones 1E-3) y 300 pL deC. albicansy S.pneumoniaepara inocular 3 ml de cultivos de caldo frescos (diluciones 1E-1); y crecimiento de 2 horas realizado a 37°C, 500 rpm.
• Después de 2 horas de crecimiento, los precultivos microbianos se diluyeron en serie (DF10) en orina fresca y leche fresca precalentadas para producir cinco puntos de dilución:E. coli1E-5 a 1E-9; S.aureus1E-5 a 1E-9;C. albicans1E-2 a 1E-6; y S.pneumoniae1E-2 a 1E-6.
• Se realizaron TVC de 100 μl para cada dilución microbiana analizada en leche y orina; las NSC para leche y orina se sembraron en tres tipos de placas de agar (SAB, COL y CBA).
• Especímenes de 1 ml (cinco diluciones de cada especie microbiana y cuatro muestras de NSC: 24 muestras por tipo de espécimen) se agregaron a tubos de muestra de 2 ml precargados con 112 μl de tampón de unión 15 pl de perlas (1 % sólido) y luego se inició la prueba Magnitor automatizada.
Procesamiento automatizado de muestras en epMotion 5073m:
• Mezcla orbital de 30 minutos (1000 rpm) @ 37 °C
• 15 minutos de magnetización
• 1 ml s/n eliminado
• Se agregaron 0.82 ml de WB (Tris+NaCI 1X) a los tubos mientras se magnetizaban las perlas.
• 1 ml s/n eliminado
• Se agregaron 50 μl de LM a los tubos mientras se magnetizaban las perlas.
• La magnetización se apagó y se realizó la reacción ETGA: 5 minutos a 1000 rpm, luego 55 minutos a 800 rpm @ 26°C
• Configuración de qPCR para ETGA y confirmación (reacciones de 10 μl)
Resultados:
*Valores de Cfu/ml extrapolados del TVC contable más alto
(NB: La orina es una solución no estéril, por lo tanto, las colonias en las placas NSC no son inesperadas)
(NB: la leche pasteurizada contiene microorganismos, por lo tanto, debe haber colonias en las placas NSC)
ETGA Ct fPCCt
Espécimen Orina Leche Espécimen Orina LecheE. ColiÍE 'S 15.80 18.97E. ColiIE '5 32.36 40.12E. Coli1E-6 21.69 21.38E. Coli1E-6 31.64 37.94 f .Coli1E-7 26.06 22.19E. Coli1E-7 32.35 43.03E. Coli1E-8 29.54 22.18E. Coli1E-8 33.06 37.06E. Coli1E-9 30.48 22.51E. Coli1E-9 33.29 41.03S. áureos1E-5 19.57 21.47 S.aureus1E-5 32.37 36.09 5.aureus1E-6 23.73 22.09 S.aureus1E-6 32.41 39.29S. aureus1E-7 27.82 22.44S. aureus1E-7 32.48 38.13S. aureus1E-8 28.88 22.155. aureus1E-8 32.99 36.77S. aureus1E-9 28.95 22.28 S.aureus1E-9 33.11 37.21 C.albicans1E-2 22.46 22.62C albicans1E-2 38.08 46.11 C.albicans1E-3 24.56 22.51C. albicans1E-3 33.72 37.14C. albicans1E-4 28.56 22.17C albicans1E-4 32.20 37.10 C.albicans1E-5 29.82 22.39C. albicans1E-5 32.43 36.26 C.albicans1E-6 29.43 22.00 C.albicans1E-6 32.58 39.70S. pneumoniae1E-2 24.12 23.02 5.pneumoniae1E-2 31.78 39.475. pneumoniae1E-3 2.6.07 22.22S. pneumoniae1E-3 31.45 41.49 5.pneumoniae1E-4 29.00 22.24 S.pneumoniae1E-4 31.96 38.17S. pneumoniae1E-5 30.78 22.06 5.pneumoniae1E-5 32.71 37.635. pneumoniae1E-6 29.27 22.32 5.pneumoniae1E-6 32.90 48.38
NSC 1 29.48 22.15 NSC 1 33.42 42.68
NSC 2 29.51 22.17 NSC 2 33.63 44.35
NSC 3 29.99 22.13 NSC 3 33.53 38.45
NSC 4 29.99 22.48 NSC 4 33.51 37.14
Promedio NSC 29.74 22.23
NB:La leche pasteurizada contiene bacterias, que se manifiestan en forma de un ETGA Ct-22 constante.
Confirmar Ct
C.albicans1E-2 NoCt 41.75 28.06 NoCt 21.59 31.08
C.albicans1E-3 NoCt NoCt 28.61 NoCt 23.00 33.04
C. albicans1E-4 NoCt NoCt 36.26 NoCt 22.09 39.74
C.albicans1E-5 NoCt NoCt NoCt NoCt 36.30 NoCt
C.albicans1E-6 NoCt NoCt NoCt NoCt 22.07 NoCt
S.pneumoniae1E-2 NoCt 27.07 NoCt NoCt 20.58 NoCt
S.pneumoniae1E-3 NoCt 31.78 NoCt NoCt 22.08 NoCt
S.pneumoniae1E-4 NoCt 42.22 NoCt NoCt 22.47 NoCt
S.pneumoniae1E-5 NoCt NoCt NoCt NoCt 23.00 NoCt
S.pneumoniae1E-6 NoCt 36.55 NoCt NoCt 23.29 NoCt
NSC 1 NoCt NoCt 43.91 NoCt 22.18 NoCt
NSC 2 NoCt NoCt NoCt NoCt 22.15 NoCt
NSC 3 NoCt 40.96 NoCt NoCt 21.87 NoCt
NSC 4 NoCt NoCt NoCt NoCt 22.28 NoCt
Umbral de positividad (Pt) < 40 Ct
Análisis:
• Estos resultados demuestran que la captura microbiana mediante perlas magnéticas es posible en muestras alternativas a la sangre (específicamente orina y leche) en ausencia de lisis de la muestra, según lo determinado por las lecturas de ETGA y Confirmar.
• Sin embargo, la presencia de microorganismos comensales en estos tipos de muestras (particularmente leche) afecta el nivel de señal de fondo para las lecturas de ETGA y Confirmar.
Ejemplos 18-25
Objetivo
Evaluar si los microorganismos en la sangre clínica que pueden contener o no antimicrobianos pueden "rescatarse" y eliminarse antes de inocularse en un medio nuevo para su incubación. Una investigación sobre si los organismos rescatados crecen de manera más eficiente en comparación con los organismos que permanecen en la sangre o en la sangre que contiene antibióticos. El uso previsto del método es mejorar la recuperación y detectabilidad de los microbios.
Introducción
Es ampliamente conocido que cuando se toman hemocultivos de pacientes que ya han recibido antibióticos, a menudo no crecen organismos en los hemocultivos, incluso cuando el paciente claramente tiene una infección. En los últimos años, los principales proveedores de hemocultivos han proporcionado frascos que contienen resina absorbente de antibióticos, pero esto sólo ha resuelto el problema en parte. En esta investigación nuestro objetivo es mostrar que cuando se inocula un organismo en sangre que contiene una concentración inhibidora de un antibiótico, los organismos pueden crecer capturándolos, usando nuestras perlas de captura magnética y transfiriéndolos a un frasco de hemocultivo sin antibiótico. Se probaron un panel de organismos y una variedad de antibióticos.
Resultados clave:
• Se observa una diferencia de dos a cuatro horas en los tiempos de inflexión entre la sangre de caballo y la humana, pero los resultados finales son comparables. Por lo tanto, se pueden realizar experimentos posteriores con sangre de caballo, de importancia práctica en esta época en la que no se dispone de sangre humana (debido a la pandemia de COVID-19).
• La incubación de la muestra en presencia de perlas magnéticas no ayudó ni obstaculizó el crecimiento del organismo.
• Tiempos de volteo entre los diferentes reactivos de captura paraE. coliy S.aureusson muy similares mostrando que este método de rescate permite la recuperación del organismo y podría realizarse con o sin agentes lisantes de la sangre.
• En los frascos estándar de aeróbicos (SA) que contienen bacterias en la sangre con un antimicrobiano, el método de rescate siempre daba positivo antes que los controles de Hemocultivo (BC), que eran negativos a los 5 días. ParaC. albicans,los tiempos de volteo del método de rescate fueron hasta 27 horas más rápidos que los controles de BC y para C.neoformansfueron más de 13 horas más rápido.
• Al comparar diferentes tipos de perlas magnéticas para la captura de organismos (Ejemplo 23), todas las muestras de rescate con perlas dieron positivo dentro de las 18 h en comparación con el control de hemocultivo sin rescate, que fue negativo después de 5 días. Esto es cierto para los 5 tipos de perlas probadas y para ambosE. colien sangre que contiene 0.075 mg/l de Ciprofloxacina y S.aureusen sangre que contiene 500 mg/l de Vancomicina.
• Al comparar otros cinco tipos diferentes de perlas magnéticas para la captura de organismos (Ejemplo 24), todas las muestras de rescate de perlas dieron positivo en 17 h para S.aureusen comparación con los controles de hemocultivo sin rescate que fueron negativos. Esto es cierto para los 6 tipos de perlas probadas para S.aureusen sangre que contiene 500 mg/l de vancomicina. ParaE. coli,las muestras de rescate de perlas dieron positivo en 30 h para los 6 tipos de perlas analizadas en sangre que contenían 0.075 mg/l de Ciprofloxacina. Los controles de hemocultivo (sin rescate de perlas) fueron negativos.
• En concentraciones séricas máximas altas de antibiótico en sangre (Ceftriaxona), los frascos de hemocultivo FA+ no recuperan S.pneumoniae,según lo informado por Flayhartet al.2007. Los datos presentados en el presente documento muestran que, utilizando los métodos de la invención, S.pneumoniaese puede recuperar y cultivar con éxito a partir de sangre que contiene altas concentraciones séricas máximas de antibiótico.
• En concentraciones séricas máximas de antibióticos en sangre, los frascos de hemocultivo FA+ no logran recuperar organismos, según lo informado por Chunget al.2019. Los datos presentados en el presente documento muestran que, utilizando los métodos de la invención, los organismos pueden recuperarse y desarrollarse con éxito a partir de concentraciones tan bajas como 180 cfu/ml a partir de sangre que contiene concentraciones séricas máximas altas de antibiótico.
Materiales
Composiciones de tampones y reactivos.
Organismos, antimicrobianos y otros materiales.
• Sangre: Caballo (desfibrinado) de TCS Biosciences Ltd., Buckingham, Reino Unido.
• Organismos de prueba:
° Gram positivas: S.aureusATCC 25923; S.pneumoniaeATCC 49619.
° Gram negativas:E. coliATCC 25922,Klebsiella pneumoniaeATCC 13883,Pseudomonas aeruginosaATCC 27853.
° Hongos/levaduras:Candida albicansATCC 10231,Cryptococcus neoformansNCPF 8281.
• Antibióticos:
° Gram positivas: Vancomicina, Piperacilina, Cefepima, Ceftriaxona para S.pneumoniae
° Gram negativas: Ciprofloxacina, Piperacilina, Meropenem, Cefotaxima y Cefepima.
° Levadura: Anfotericina B.
Ejemplo 18: Rescate de S. aureus de sangre que contiene piperacilina
Objetivo:
El propósito de este experimento repetido es evaluar si la sangre de caballo puede ser un sustituto de la sangre humana durante una época en la que la sangre humana no está disponible.
Protocolo:
Día 1: Preparar un cultivo durante la noche del organismo de prueba en medio sangre/caldo (50:50 sangre:caldo) e incubar a 37°C en una incubadora con agitación.
Día 2: Prepare una dilución en serie diez veces mayor del cultivo durante la noche en sangre/caldo según sea necesario
• Antibiótico añadido a sangre total (sangre de caballo desfibrinada) al nivel requerido
• Sangre total como control sin antibióticos
• Diluciones de prueba de organismo agregado a sangre antibiótico o sangre solo a 10 μl por ml de sangre(suficiente preparación para los requisitos del experimento)
• Se tomó una muestra de recuento en placa de 100 μl (muestra T0)
• Incubación de 2 horas a 37 °C (estática), para imitar la exposición del organismo a los antimicrobianos en el paciente
• Se tomó una muestra de recuento en placa de 100 μl (muestra T2)
• Se agregan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre al frasco de hemocultivo (usando el adaptador del vial) y se inicia la incubación (se retira el adaptador)
• Se tratan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre (de la misma fuente) tratada con Perlas de Captura de Momentum como se muestra a continuación:
1. Perlas de captura Momentum diluidas en tampón de unión microbiana sin detergente (DMBB): 50 μl de perlas: 700 μl de DMBB por limpieza
2. 750 μl de perlas diluidas agregadas a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
3. Se añaden 5 ml de medio de transferencia al tubo.
4. 5 ml de sangre enriquecida+abx o sangre sola añadida al tubo
5. Incubar en ITL TherMix (Integrated Technologies Ltd. Kent, Reino Unido), 32.5 °C/30 min/1000 rpm - protocolo de velocidad aumentada
6. Magnetizar en el imán V&P (V&P Scientific Inc, CA, EE. UU.) durante 10 minutos y luego eliminar el sobrenadante 7. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y transferirlas a un tubo abatible Eppendorf de 2 ml en un imán DynaMag-2 (Thermo Fisher Scientific, Life Technologies Ltd. Paisley, Reino Unido).
8. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
9. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y luego reemplazarlas en el imán DynaMag-2.
10. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
11. Resuspender las perlas en 1 ml de DWB, agregarlas a un nuevo frasco de hemocultivo (usando el adaptador del vial) e iniciar la incubación (sin el adaptador).
Día 3: Se registraron los recuentos de placas.
Registrar el tiempo de "volteo" de cada frasco o resultado del frasco al final de los 5 días de incubación. El tiempo de "Volteo" es cuando un frasco se vuelve positivo según lo determina el gabinete de hemocultivo automatizado, que registra el tiempo hasta la positividad.
Resultados:
Comentarios:
• Se observa una diferencia de dos a cuatro horas en los tiempos de inflexión entre la sangre de caballo y la humana, pero los resultados finales son comparables.
• Por lo tanto, se pueden realizar experimentos posteriores utilizando sangre de caballo durante este tiempo en el que no hay sangre humana disponible.
Ejemplo 19: Detalle del experimento de punto de interrupción
Objetivo:
Determinar un punto de partida en términos de concentración de antibióticos y carga microbiana para experimentos posteriores. Se probaron intervalos de concentración de antibióticos para encontrar puntos de interrupción apropiados para su uso en experimentos. Se probaron una variedad de concentraciones de antibióticos frente a una carga microbiana determinada para determinar la concentración a la que se inhibía el crecimiento, pero no se mataban los microorganismos. Esto se determinó mediante recuentos en placa a intervalos de 0, 2.5 y 5 horas.
Protocolo:
1. Día 1: Preparar un cultivo durante la noche del organismo de prueba en 3 ml de solución de sangre/caldo (1.5 ml de sangre de caballo desfibrinada: Medio de transferencia de 1.5 ml).
2. Día 2: Disolver el antibiótico en el diluyente requerido para preparar una solución madre adecuada y preparar una serie de diluciones en agua libre de nucleasas para cubrir un intervalo de concentración final de 100 a 0.001 y 0 mg/l.
3. Diluir el cultivo durante la noche del microorganismo hasta el punto requerido en una solución de sangre/caldo precalentada. Esto puede requerir una determinación para cada combinación de organismo/antibiótico, pero se utilizará como dilución inicial 10-4 (dando una concentración final en la muestra de 10-5).
4. Alícuota de 980 μl de sangre de caballo desfibrinada precalentada en la cantidad requerida de tubo abatible de 2 ml.
5. Agregar 10 μl de antibiótico diluido al tubo correspondiente y 10 μl de diluyente al último tubo como control. Mezcla.
6. Agregar 10 μl de la dilución requerida del cultivo de microorganismos durante la noche. Mezcla
7. Tomar una muestra de 100 μl de cada tubo y colocarlo en una placa con base de agar sangre Columbia para el recuento del tiempo 0.
8. Colocar en placas 100 μl del cultivo diluido durante la noche como control de crecimiento/sin crecimiento.
9. Incubar las muestras a 37°C en una incubadora con agitación (450 rpm) y tomar 100 μl de muestra para el recuento en placa a intervalos de 2.5 y 5 horas.
10. Incubar las placas durante la noche a 37°C.
11. Día 3: Contar las placas y tabular los resultados. Determinar la concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento sin la muerte total de los microorganismos.
Las concentraciones determinadas por este protocolo se usaron en los siguientes ejemplos a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 20: Crecimiento de organismos con y sin perlas magnéticas y/o antibióticos. Objetivo:
El propósito de este experimento es evaluar si la presencia de perlas magnéticas permite que los organismos crezcan más rápido porque se unen a las perlas y les gusta un sustrato sólido sobre el que crecer. Este experimento analiza la tasa relativa de crecimiento de organismos en caldo de sangre, con y sin antibiótico, con y sin perlas magnéticas (sin transferencia de perlas).
Protocolo:
Día 1: Preparar un cultivo durante la noche del organismo de prueba en medio sangre/caldo (50:50 sangre:caldo) e incubar a 37°C en una incubadora con agitación.
Día 2: Preparar una dilución en serie diez veces del cultivo durante la noche en sangre/caldo según sea necesario e incubar a 37 °C durante 2 h para que crezca.
En el conjunto de muestras 1, las diluciones del organismo de prueba en sangre contendrán perlas, un conjunto duplicado de muestras (conjunto 2) no contendrá perlas. Ninguno de estos conjuntos contiene antibióticos.
En el conjunto de muestras 3, las diluciones del organismo de prueba en sangre contendrán antibióticos y perlas; un conjunto duplicado de muestras (conjunto 4) no contendrá las perlas. Ambos conjuntos contienen antibióticos.
Antibiótico añadido a sangre total (sangre de caballo desfibrinada) al nivel requerido.
Sangre total como control sin antibióticos.
Usando 10 ml de sangre completa precalentada por muestra, agregar la(s) dilución(es) de prueba del organismo a 10 pl por ml de sangre. En un juego duplicado, agregar el antimicrobiano relevante a cada uno de los 3 tubos.
Placa de 100 μl de estas muestras para T0 TVC.
Retirar 5 ml de las muestras de 10 ml para crear el conjunto 1 y el conjunto 3.
Agregar 50 μl de perlas magnéticas sin procesar por cada 5 ml de sangre al conjunto 1 y establezca 3 tubos de muestra, dejando el conjunto 2 y el conjunto 4 sin perlas.
Agregar 5 ml de sangre enriquecida+perlas (conjunto 1) y 5 ml de sangre enriquecida/Abx+perlas (conjunto 3) a los frascos de hemocultivo (frasco de cultivo BioMerieux SA) utilizando un adaptador de vial (West Pharmaceutical Services, Inc. PA, EE. UU.).
Luego agregar 5 ml de sangre enriquecida (de la misma fuente), control sin perlas (conjunto 2 y conjunto 4) a los frascos de hemocultivo.
Retirar el adaptador e incubar los frascos de hemocultivo en el gabinete de hemocultivo automatizado (BacT/ALERT BioMerieux) durante un máximo de 5 días.
Día 3: Contar las placas TVC y registrarlas.
Registrar el tiempo de "volteo" de cada frasco o resultado del frasco al final de los 5 días de incubación. El tiempo de "Volteo" es cuando un frasco se vuelve positivo según lo determina el gabinete de hemocultivo automatizado, que registra el tiempo hasta la positividad.
Resultados:
Comentarios:
La incubación de la muestra en presencia de perlas magnéticas no ayudó ni obstaculizó el crecimiento del organismo.
Protocolo para experimentos de rescate de organismos (Ejemplos 21 - Ejemplo 24)
Día 1: Preparar un cultivo durante la noche del organismo de prueba en medio sangre/caldo (50:50 sangre:caldo) e incubar a 37°C (o 30°C para C. neoformans) en una incubadora con agitación.
Día 2: En la sala limpia, preparar volúmenes adecuados de antibióticos para su uso en el experimento.
Preparar soluciones madre usando la fórmula 1000/P * V * C = W
donde P = potencia dada por el fabricante (pg/mg), V = volumen requerido (ml), C = concentración final de la solución (múltiplos de 1000) (mg/L) y W = peso del antibiótico en mg a disolver en volumen V (ml).
Preparar una dilución en serie diez veces del cultivo durante la noche en sangre/caldo según sea necesario e incubar a 37 °C (o 30 °C paraC. neoformans)durante 2 h para que crezca.
Antibiótico añadido a sangre total (sangre de caballo desfibrinada) al nivel requerido
Sangre total como control sin antibióticos
Diluciones de prueba del organismo agregado a sangre antibiótico o sangre solo a 10 μl por ml de sangre (suficiente preparación para los requisitos del experimento)
Se tomó una muestra de recuento en placa de 100 μl (muestra T0)
Incubación de 2 horas (estática) a 37 °C (o 30 °C para C.neoformans)
Se tomó una muestra de recuento en placa de 100 μl (muestra T2)
Se agregan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre al frasco de hemocultivo (usando el adaptador del vial) y se inicia la incubación (se retira el adaptador)
• Se tratan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre (de la misma fuente) tratada con Perlas de Captura de Momentum como se muestra a continuación:
1. Perlas de captura diluidas en el reactivo de captura correspondiente - 50 μl de perlas: 700 μl de reactivo de captura por limpieza
2. 750 μl de perlas diluidas agregadas a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
3. Se añaden 5 ml de medio de transferencia al tubo.
4. 5 ml de sangre enriquecida+abx o sangre sola añadida al tubo
5. Incubar en ITL TherMix (32.5 °C/30 min/1000 rpm - protocolo de velocidad aumentada)
6. Magnetizar en el imán V&P durante 10 minutos y luego retirar el sobrenadante.
7. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y transferirlas a un tubo Eppendorf con tapa abatible de 2 ml en el imán DynaMag-2.
8. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
9. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y luego reemplazarlas en el imán DynaMag-2.
10. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
11. Resuspender las perlas en 1 ml de DWB, agregarlas a un nuevo frasco de hemocultivo (usando el adaptador del vial) e iniciar la incubación (sin el adaptador).
Día 3: Se registraron los recuentos de placas.
Registrar el tiempo de "volteo" de cada frasco o resultado del frasco al final de los 5 días de incubación. El tiempo de "Volteo" es cuando un frasco se vuelve positivo según lo determina el gabinete de hemocultivo automatizado, que registra el tiempo hasta la positividad.
Ejemplo 21: Comparación del rescate de organismos cuando se utilizan tampones de captura sin detergente o que lisan la sangre.
Objetivo:
Comparar tampones de captura libres de detergentes o lisantes de la sangre al realizar el método de rescate de organismos. ¿Los diferentes tampones de captura tienen algún efecto sobre el éxito del rescate de organismos? Comparar DMBB, E-Buff y GMb B como reactivos de captura en la recuperación deE. co liy S.aureusy usando DWB para todos los lavados.
Resultados:
Comentarios:
Tiempos de cambio entre los diferentes reactivos de captura paraE. coliy S.aureusson muy similares mostrando que este método de rescate permite la recuperación del organismo y podría realizarse con o sin agentes lisantes de la sangre.
Ejemplo 22: Aplicación del rescate de organismos a otros microorganismos y agentes antimicrobianos.
Objetivo:
Demostrar que el método de rescate es aplicable a una amplia variedad de microorganismos y agentes antimicrobianos.
Preparación de Vancomicina:
Para vancomicina (Lot# 058M4009V) con una potencia de 1008 pg/mg, utilizar la siguiente ecuación para encontrar el peso necesario para preparar 1 ml de una solución madre de 10,000 mg/ml: Las soluciones madre de vancomicina se prepararon usando la fórmula 1000/P * V * C = W donde P = potencia dada por el fabricante (pg/mg), V = volumen requerido (ml), C = concentración final de la solución (múltiplos de 1000) (mg/l), y W = peso del antibiótico en mg que se va a disolver en el volumen V (ml).
Entonces,
1000 /1008 x 10 m L x 10 = W
0.992 x 10 x 10 =W
W = 99.2 mg en 10 ml de solución salina (0.9%) para una solución madre de 10,000 mg/ml.
Dos cepas diferentes deS. aureuscrecieron en cada dilución de vancomicina en cada momento. Se tomó la decisión de utilizar una concentración final de 500 mg/l para experimentos posteriores, dado que el fármaco tiene una acción relativamente lenta y la duración del experimento debía mantenerse dentro de plazos razonables.
Resultados:
empo de Volteo Organismo Org cfu/5ml sangre Antibiótico [Antibiótico] Controlar el Ti
mg/L sangre Tiempo de Volteo de Rescate de en Días Perlas en Dias
Comentarios:
Para el control sin antimicrobianos, el hemocultivo siempre dio positivo antes del método de rescate.
En los frascos estándar de SA que contenían bacterias en sangre con un antimicrobiano, el método de rescate siempre daba positivo antes que los controles de BC, que eran negativos a los 5 días. ParaC. albicans,los tiempos de volteo del método de rescate fueron hasta 27 horas más rápidos que los controles de BC y para C.neoformansfueron más de 13 horas más rápido.
Ejemplo 23: Comparación del rescate de organismos utilizando diferentes tipos de perlas magnéticas I Objetivos:
Realizar el método de rescate utilizando cinco tipos diferentes de perlas; hidrófobos, aminados, carboxilados, SpeedBeads y recubiertos con estreptavidina y comparando la eficiencia de captura y recuperación.
P artícu las M odificadas
G íH ealth ;:*» '*
C arb o x ilad as
$P S p ee d m a g n étic a s (dos capas $ $ $ 152105050250 , 1.000 40 P o lie s tire n o l í i
d e m ag n etita ) « 0651U S
S p e e d b e a d s fM
N a n o e s fe ra s
c a rb o x ila d a s E s to p o r®
a m ,
M8iO Í:St» pequeñas recubiertasM t K K m - t A i
0 .2 $ 1 -0 -400 40 * 60 P o lie s tire n o I X d e e s tre p ta d iv in a M 8 L « S E C O S
( - C O O H ) . .
Resultados:
Comentarios:
Todas las muestras de rescate de perlas dieron positivo dentro de las 24 horas (dentro de las 18 horas para S.aureus)en comparación con el control de hemocultivo sin rescate, que fue negativo después de 5 días.
Esto es cierto para los 5 tipos de perlas probados, porE. colien sangre que contiene 0.075 mg/l de Ciprofloxacina y S.aureusen sangre que contiene 500 mg/l de Vancomicina.
Ejemplo 24: Comparación del rescate de organismos utilizando diferentes tipos de perlas magnéticas II Objetivo:
Para realizar el método de rescate utilizando otros cinco tipos diferentes de perlas; lectina y polilisina unidas a manosa, poliacrilamida, recubiertas con citrato, recubiertas con almidón, y comparando la eficiencia de captura y recuperación.
ID del estudio Tipo de cuenta # de Producto Diámetro ( p m ) % Sólido Nanoimanes, 250 nm N a n o p s r í z A M 1 - 2 S G -Fe crudo citrato tapado citrato tapado, 2.5 mg, 1 mi 0 .2 5 154
Agua DI C I T - D i H - 2 .5 - 1
Nanoimanes, 250 nm N a n o p a r U C 841 - 2 50 -C H O almidón tapado almidón tapado, 2.5 mg, 1 mi 0 .2 51 %
Agua DI S T C - O I H - 2 5 - 1
N a n o im an e s . 250 nm
poliacrilamida crilam ida ta p a d a . 2 .5 m g . 1 N a n o p a r w C M 1 - 2 5 0 -Polímero alt polia
tapada 0 .2 51 %
A g u a D I P t A C - O I H - 2 .5 - 1
mañosa que une
M8L lectina 0 .2 5 154
Poli-l-lisina N a n o im a n e s , 250 n m
N a n o p a r t z C V : 1 * 250 -P - l y P o li- l- l is in a ta p a d a . 2 .5 m g . 1
tapada 0 .2 51 %
m ^A g u a DI P U O I H - 2 5 1
N a n o e sfera s carboxiladas
de E s tap o r® peq u eñ as V ! (? - c k # 3 E M G 8 / 0 3 ,
B E B io E s t o recubiertas con estrep tav id ina 0 .2 5 1 - 0 .4 0 01 %
(-C O O H ) M 8 l # B E - 0 0 6
Resultados:
Comentarios:
Todas las muestras de rescate de perlas dieron positivo en 17 horas para S.aureusen comparación con los controles de hemocultivo sin rescate, que fueron negativos. Esto es cierto para los 6 tipos de perlas probadas para S.aureusen sangre que contiene 500 mg/l de vancomicina.
ParaE. coli,las muestras de rescate de perlas dieron positivo en 30 horas para los 6 tipos de perlas analizadas en sangre que contenía 0.075 mg/l de Ciprofloxacina. Los controles de hemocultivo (sin rescate de perlas) fueron negativos.
Ejemplo 25: Comparación del rescate de organismos de microbios que no se recuperan en frascos de hemocultivo FA más BacT/ALERT en presencia de antibióticos
Protocolo para la reproducción de la obra de Flayhart et al. y Chung et al.
Día 1: Preparar un cultivo durante la noche del organismo de prueba en medio sangre/caldo (50:50 sangre:caldo) e incubar a 37°C en una incubadora con agitación.
Día 2: En la sala limpia, preparar volúmenes adecuados de antibióticos para su uso en el experimento.
Preparar soluciones madre usando la fórmula 1000/P * V * C = W
donde P = potencia dada por el fabricante (|jg/mg), V = volumen requerido (ml), C = concentración final de la solución (múltiplos de 1000) (mg/L) y W = peso del antibiótico en mg a disolver en volumen V (ml).
Preparar una dilución en serie diez veces del cultivo durante la noche en sangre/caldo según sea necesario e incubar a 37 °C durante 2 h para que crezca.
Antibiótico añadido a sangre total (sangre de caballo desfibrinada) al nivel requerido
Sangre total como control sin antibióticos
Diluciones de prueba del organismo agregado a sangre antibiótico o sangre solo a 10 μl por ml de sangre (suficiente preparación para los requisitos del experimento)
Se tomó una muestra de recuento en placa de 100 μl (muestra T0)
Se agregan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre al frasco de hemocultivo (frasco de cultivo BioMerieux FA+), usando el adaptador del vial y se inicia la incubación (se retira el adaptador)
• Se tratan 5 ml de sangre enriquecida+abx o solo sangre (de la misma fuente) tratada con Perlas de Captura de Momentum como se muestra a continuación:
1. Perlas de captura Momentum diluidas en el reactivo de captura correspondiente -50 μl de perlas: 700 μl de reactivo de captura por limpieza
2. 750 μl de perlas diluidas agregadas a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
3. Se añaden 5 ml de medio de transferencia al tubo.
4. 5 ml de sangre enriquecida+abx o sangre sola añadida al tubo
5. Incubar en ITL TherMix (32,5 °C/30 min/1000 rpm - protocolo de velocidad aumentada)
6. Magnetizar en el imán V&P durante 10 minutos y luego retirar el sobrenadante.
7. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y transferirlas a un tubo Eppendorf con tapa abatible de 2 ml en el imán DynaMag-2.
8. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
9. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado sin detergente (DWB) del imán y luego reemplazarlas en el imán DynaMag-2.
10. Magnetizar durante 3 minutos y luego retirar el sobrenadante.
11. Resuspender las perlas en 1 ml de DWB, agregarlas a un frasco de hemocultivo no utilizado (frasco de cultivo BioMerieux FA+) usando el adaptador de vial y comenzar la incubación (sin adaptador).
Día 3: Se registraron los recuentos de placas.
Registrar el tiempo de "volteo" de cada frasco o resultado del frasco al final de los 5 días de incubación. El tiempo de "Volteo" es cuando un frasco se vuelve positivo según lo determina el gabinete de hemocultivo automatizado, que registra el tiempo hasta la positividad.
Reproducción del experimento de Flayhart et al. 2007
Objetivo:
Comparar la captura y el rescate de organismos de frascos de FA plus, en S.pneumoniaeen Ceftriaxona. Reproducir el experimento de Flayhartet al.2007 probando concentraciones de antibióticos de 250, 125 y 94 mg/l y también se incluyen concentraciones de 50 y 10 mg/l.
Resultados:
En la siguiente tabla, "control" representa muestras procesadas usando frascos FA plus (también denominados "BC" en la columna final) y "rescate de perlas" se refiere a muestras procesadas de acuerdo con los métodos de la invención.
Comentarios:
En concentraciones séricas máximas altas de antibiótico en sangre (Ceftriaxona), los frascos de hemocultivo FA+ no logran recuperar S.pneumoniae,como informaronFlayhart et al.2007. Estos datos muestran que, usando los métodos de la invención, S.pneumoniaese puede recuperar y cultivar con éxito a partir de sangre que contiene altas concentraciones séricas máximas de antibiótico. Este experimento muestra que los métodos de la invención son una mejora con respecto a las frascos FA plus según lo probado por Flayhart.
Reproducción del experimento de Chung et al. 2019
Objetivo:
Comparar la captura y el rescate de organismos de los frascos de FA plus, en los organismos de la siguiente tabla con sus respectivos antibióticos. Como informó en el artículo Chunget al.En 2019, se probaron más concentraciones de antibióticos (164 mg/l, 100 mg/l y 49 mg/l para Cefepima, Cefotaxima y Meropenem respectivamente).
Fármaco MIC (mg/L)
S.aureus C. coli K. pneumoniae P aeruginosaConcentración de prueba. mg/L
Cefepima <4 <1 <1 <1 164
Cefotaxima <1 100
Meropenem <1 <1 <1 49
Resultados:
En la siguiente tabla, "control" representa muestras procesadas usando frascos FA plus (también denominados "BC" en la columna final) y "rescate de perlas" se refiere a muestras procesadas de acuerdo con los métodos de la invención.
C o n tro l S -c u r r u s125000 0 0318 C Rescate de potes S. oca p u s125000Nrvjuno0 0398 C
C o n tro l K. p n e u m o n ía * 125000 C e te p im a 164 M í * R e sc a te Rescate de pe*tse K p n e u m o n ía * 125000 C e te p im a 164 0 44 R e sc a to
C o n tro l K. p n c u m o ru o c 12 SCO C e te p im a 164 R e s c a te R e v o to de pe tes K p n e u m o c u o e 12 SCO C e íe p im n 164 0 4 9 R e s c a te
C o n tro lK p n e u m o n ía *12500Ninguno0 026e c
Róscate do perasK p n e u m o n ía * 12500 034BC
C o n tro l P « e ru g in o s o is n o r o o 0 79 R ó s c ate Rescate de p eras P. o c ro g m o s o 1S30COO C c fo p im n 164 0 32 R e sc a te
C o n tro l P. o r ru g m o s o ISOOOO C e te p im a 164 0 8 3 R ó s c a la Róscate do peras P. o e ru g ln o s o 150000 C e te p im a 164 0.41 R e s c a te
C o n tro l P . o r r u g tn o ia ISOOOO U n g ir é00 .37 BC Rescate de pe tesP. o r r u g m o s oISOOOO Nnguno 0 0 .4 BC
C o n tro lP. o e r u g in o s o1250 C e fe p im a 164 M eg R ó s c a le Rescato do partasP. o c ro g m o s o1250 C e fe p im a 164 0 5 8 R e s c a te
C o n tro lP . o c r o g m o s o1250Nlrs^aro 00.61BC
R lU C 4 * dM (MflMfcP . o c ro g m o s o 1250 0.79 BC
C o n tro lE .c o H1250C O 0 M ee R e sc a to
Rescate de peras E . co tí 1250 C 00 C e f e p m a 164 0 38 R e s c a te
C o n tro lE. c o tí125000 C e fe p im a 164 M e * R e s c a te Rescate de pe tes E .c o H 125000 C c f e p r r . t 164 0 47 R e sc a te C o n tro lE c o h125000Nnguno 0029BC Ráscalo do portasE. C o li125000 00.35BC
C o n tro lE .c o H508000 C e ío t& x m a 100 M e * R ó s c ate Rescate de pedasE .c o H508000 C e lo ta x jm a 100 0 31 R e s c a le
C o n tro lE.co i iSOSCO C e to ta x im a 100 M e * R e s c a le Róscate do pedasE COü50800 C c fo t a x m a 100 0 3 9 R e sc a to C o n tro lE .o o HSOSCO Ninguno 0031BC Rescate de pedasE . c o i isoscoH n Q iro 00.37BC
C o n tro l E .t o H 150OCOO M e r o p en en » 49 M ee R e sc a te Róscate da podas E .c o H 1SDOCOO M c ro p e rs c rn 49 0.43 R e sc a te C o n tro l E. c o ii 150000 M e r o p en en » 49 M e * R e s c a te R e te * » de podas E.C O H ISOOOO M p r n p p r v m 49 0 46 R e a c a te
f COii1500000 0 2 ? BC
Rescate de pedasE c o i i150000Ninguno 00.31BC
C o n tro l E.C OH 900 M e r o p e nen» 49 M ee R ó scate R éstete de p eras E .c o H 900 M e r o p r n r m 49 0 5 6 R e s c a te C o n tro lE . C o ii900Nnguno 00 39BC Rescate de perasE. c o i i900Ninguno 0 O.S BC
C o n tro lK p n e u m o n ía *12S 0C O 0 M e r o p e nen» 49 M ee R e s c a te Ráscalo do portasK. p n e u m o n ía *12SOCOO M e r o p e o e r n 49 0 38 R e s c a te
C o n tro l K p n e u m o n io e 125000 M e r o p e non» 49 M ee R e sc a to R w cate de pedos K p n e u m o n ía * 125000 M a r o p o n o m 49 0 .43 R e sc a te C o n tro lK p n e u m o n ía *125000Mn^aTO 00.25R e sc a te
Rescato de portasK p n e u m o n ía * 125000 024
C o n tro l P. o e ru Q tn o w 2O0OCOO M n m p o n o m 49 081 R e sc a to Róscalo do portas P. o r ru g m o s o 2000C O O M e r o p e ríe rn 49 0 46 R e s c a te C o n tro l P. o r ru g m o s o 200000 M e r o p e n e m 49 0 .9 R e sc a to Rescate de peras P. o r ru g m o s o 200000 M e r o p e ríe nrv 49 0 5 4 R e sc a te
C o n tro l P. o r ru g m o s o200000N rg u n o00.33 BC Róscala do (artesP. u tr ru g . ru /y a200000Ninguno0 034BC
C o n tro l P. o r ru g m o s o 1250 M e r o p e nen» 49 M ee R e s c a te Róscate do podas P . o e ru g in o s a 1250 M e ro p e rs e rn 49 0.81 R e sc a to
C o n tro lP . o c r u g .n o s o1250N inyjn o00 .59 BC
Comentarios:
En concentraciones séricas máximas de antibióticos en sangre, los frascos de hemocultivo de FA+ no logran recuperar organismos, según lo informado por Chunget al.2019. Estos datos muestran que, utilizando los métodos de la invención, se pueden recuperar organismos y cultivarlos exitosamente a partir de sangre que contiene altas concentraciones séricas máximas de antibiótico. Este experimento muestra que los métodos de la invención son una mejora con respecto a las frascos FA plus según lo probado por Chung.
Referencias:
Flayhart D, Borek AP, Wakefield T, Dick J, Carroll KC. Comparison of BACTEC PLUS blood culture media to BacT/Alert FA blood culture media for detection of bacterial pathogens in samples containing therapeutic levels of antibiotics. J Clin Microbiol. 2007 Mar;45(3):816-21. doi: 10.1128/JCM.02064-06. Epub 2006 Dic 13. PMI: 17166960; PMCID: PMC1829095.
Chung Y, Kim IH, Han M, Kim HS, Kim HS, Song W, Kim JS. A comparative evaluation of BACT/ALERT FA PLUS and FN PLUS blood culture bottles and BD BACTEC Plus Aerobic and Anaerobic blood culture bottles for antimicrobial neutralization. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019 Dic;38(12):2229-2233. doi: 10.1007/s10096-019-03663-3. Epub 2019 Ago 2. PMI: 31375943.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para recuperar microorganismos viables a partir de una muestra que comprende células de microorganismos y un agente antimicrobiano, comprendiendo el método:
a) incubar la muestra con partículas recubiertas para formar complejos partícula-microorganismo; y
b) separar los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano; recuperando así microorganismos viables de la muestra; y
c) incubar y/o cultivar los microorganismos viables recuperados en el paso b),
en donde la muestra proviene de un sujeto que se ha tratado con el agente antimicrobiano, en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano y en donde la muestra comprende un fluido corporal.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además detectar y/o caracterizar los microorganismos viables recuperados.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el método es un método para detectar la ausencia o presencia de un microorganismo viable en una muestra que comprende un agente antimicrobiano y que se sospecha que contiene un microorganismo, comprendiendo además el método:
d) detectar la ausencia o presencia de los microorganismos recuperados, en donde la muestra proviene de un sujeto que se ha tratado con el agente antimicrobiano, y en donde los microorganismos en la muestra son o se cree que son susceptibles al agente antimicrobiano.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra también comprende células que no son microorganismos y el paso b) separa los complejos partícula-microorganismo del agente antimicrobiano y las células que no son microorganismos; opcionalmente en el que las células que no son microorganismos comprenden células sanguíneas.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el paso b) se realiza en ausencia de un detergente.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el paso b) se realiza en presencia de polianetolsulfonato de sodio y/o un reactivo que lisa selectivamente células que no son microorganismos en la muestra mientras retiene los microorganismos intactos presentes en la muestra.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el paso b) comprende lavar los complejos de partículas-microorganismo separados; opcionalmente en el que los complejos de partículas-microorganismo separados se lavan con una solución que no contiene detergente.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el paso b) comprende usar un campo magnético o centrifugación.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el microorganismo es una bacteria u hongo.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el agente antimicrobiano es un antibiótico o antifúngico.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la muestra se selecciona de sangre, líquido cefalorraquídeo (CSF), líquido articular, orina y lavado broncoalveolar (BAL).
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la muestra comprende sangre o una muestra de hemocultivo; opcionalmente en el que la muestra comprende sangre completa.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las partículas recubiertas son magnéticas.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las partículas recubiertas comprenden una superficie polimérica; opcionalmente en donde la superficie polimérica comprende un polímero a base de carbono.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las partículas recubiertas comprenden, en la superficie exterior, uno cualquiera o más de:
i) grupos de ácido carboxílico
ii) grupos amino
iii) grupos hidrofóbicos; y
iv) estreptavidina.
ES20793076T 2019-10-08 2020-10-08 Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos Active ES2966701T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201914538A GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-10-08 Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
PCT/GB2020/052498 WO2021069903A1 (en) 2019-10-08 2020-10-08 Microorganism capture from antimicrobial-containing solution

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2966701T3 true ES2966701T3 (es) 2024-04-23

Family

ID=68541254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20793076T Active ES2966701T3 (es) 2019-10-08 2020-10-08 Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos

Country Status (11)

Country Link
EP (2) EP4041908B1 (es)
JP (1) JP2022552115A (es)
KR (1) KR20220077926A (es)
CN (1) CN114514426A (es)
AU (1) AU2020364110A1 (es)
CA (1) CA3155994A1 (es)
ES (1) ES2966701T3 (es)
GB (1) GB201914538D0 (es)
IL (1) IL292077A (es)
PL (1) PL4041908T3 (es)
WO (1) WO2021069903A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694472A (zh) * 2023-07-18 2023-09-05 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种微生物裂解液、裂解方法及试剂盒

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4437975A (en) 1977-07-20 1984-03-20 Mobil Oil Corporation Manufacture of lube base stock oil
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
HU216105B (hu) 1988-12-16 1999-04-28 Akzo Nobel N.V. Amplifikációs eljárás önfenntartó szekvenciareplikációs rendszerrel
JP3267576B2 (ja) 1998-11-09 2002-03-18 三光純薬株式会社 プローブ高分子の形成方法
EP1118676A2 (en) 2000-01-21 2001-07-25 Chemagen AG Cell isolation method
GB0001450D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Genpoint As Cell isolation method
GB0212825D0 (en) 2002-05-31 2002-07-10 Dna Res Innovations Ltd Methods compositions and kits for cell separation
WO2004067726A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Keck Graduate Institute Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides
AU2006248724B2 (en) 2005-05-18 2011-07-21 Iseao Technologies Limited Improved methods and kits for detecting an enzyme capable of modifying a nucleic acid
CA2692800A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Christopher John Stanley Detection of micro-organisms based on their nad-dependent dna ligase activity
GB0906643D0 (en) 2009-04-17 2009-06-03 Wilson Stuart M Detection of bacteria and fungi
EP2333105A1 (en) 2009-12-08 2011-06-15 Koninklijke Philips Electronics N.V. Selective lysis of cells
CN103328652B (zh) 2010-04-16 2016-12-28 宙斯科学有限公司 测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法
CN104066853B (zh) 2012-01-05 2019-05-31 动量生物科学有限公司 改进的dna聚合酶活性测定和允许检测活微生物的方法
GB201412316D0 (en) 2014-07-10 2014-08-27 Momentum Bioscience Ltd Detecting the absence of micro-organisms
WO2017182775A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Momentum Bioscience Limited Microorganism detection involving filtration
US20210164970A1 (en) 2016-08-31 2021-06-03 Board Of Trustees Of Michigan State Universtiy Functionalized magnetic particle compositions and related methods
US20220162712A1 (en) 2017-04-12 2022-05-26 Momentum Bioscience Limited Detection and delineation of microorganisms
CN109741896B (zh) 2019-01-07 2021-06-04 北京大学 用于细菌广谱性捕获和活菌释放的功能化磁纳米颗粒
CN109929763A (zh) 2019-02-01 2019-06-25 浙江和谱生物科技有限公司 基于非免疫作用磁性材料的微生物捕获方法及分离方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP4283300A3 (en) 2024-05-22
KR20220077926A (ko) 2022-06-09
CN114514426A (zh) 2022-05-17
JP2022552115A (ja) 2022-12-15
WO2021069903A1 (en) 2021-04-15
IL292077A (en) 2022-06-01
GB201914538D0 (en) 2019-11-20
AU2020364110A1 (en) 2022-04-21
EP4041908A1 (en) 2022-08-17
CA3155994A1 (en) 2021-04-15
EP4041908B1 (en) 2023-09-20
PL4041908T3 (pl) 2024-03-18
EP4283300A2 (en) 2023-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6853283B2 (ja) 微生物細胞を抽出するための装置及び方法
US20210024877A1 (en) Microorganism separation and detection
CA2950419C (en) Composition and method for stabilizing and maintaining the viability of hardy microorganisms
US11746389B2 (en) Method and kit of detecting the absence of micro-organisms
US20100062421A1 (en) Compositions, methods, and devices for isolating biological materials
JP6785249B2 (ja) 核酸増幅の阻害を低減するための組成物
ES2396820B1 (es) Método para evaluar la integridad de la pared celular bacteriana.
JP6466437B2 (ja) 微生物を複雑な試料から単離する方法
US20230416722A1 (en) Apparatus and method for pretreatment of microbial samples
JP2010532986A (ja) 改良された微生物の検出
JP2016192967A (ja) 血液試料の微生物特異的フィルタ・インサイチュ分析の方法
US9707555B2 (en) Method for pretreatment of microbial samples
ES2966701T3 (es) Captura de microorganismos a partir de una solución que contiene antimicrobianos
EP2888364B1 (en) Method for efficient isolation of microbial dna from blood
JP2014502510A5 (es)
CN107636164B (zh) 用柠康酸酐灭活微生物的方法
Class et al. Patent application title: Methods for Detection of Micro-Organisms Inventors: Christopher John Stanley (Cambridge, GB) Stuart Wilson (London, GB) Assignees: MICROSEN MEDTECH LIMITED