CN116694472A - 一种微生物裂解液、裂解方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物基因组检测技术领域，尤其涉及一种微生物裂解液、裂解方法及试剂盒，所述裂解液的制备原料包括：复合酶、表面活性剂、牛血清白蛋白、引物、裂解缓冲液、裂解酶、水。本发明采用多种生物酶共同裂解的方法，操作简单，仅在PCR仪上便能完成微生物裂解，且裂解所需样本量少，通量高，可同时对多个样本同时裂解，并且能通过染色迅速检测裂解效果，使用于快速检测大量样本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物基因组检测技术领域，尤其涉及一种微生物裂解液、裂解方法及试剂盒。
背景技术
近年来，随着二代测序的发展，人们对生物的认知进一步提高，微生物NGS测序也越来越受到各界广泛关注。微生物宏基因组二代测序，不仅能帮助人类探究未知生物的遗传信息，也能帮助人类快速得到已知微生物信息。在临床应用上，可帮助医生迅速找到患者感染病原体，便于医生针对该病原体进行及时、准确地治疗；在科研上，可帮助研究人员探索各种微生物，例如古细菌等微生物的遗传信息及方式，使人们进一步提升对微生物的理解。
现有的物理裂解和化学裂解具有以下缺点：1.物理裂解操作方法复杂且需要样本量大，对许多样本量较少的珍贵样品不适用；2.化学裂解对于许多厚壁微生物往往裂解效果不佳，且需要较长时间。可见现有技术中对于微生物的裂解方法仍存在诸多缺点，因此，开发一种所需样本量少、通量高、可同时对多个样本同时裂解的方法十分具有应用前景。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种微生物裂解液，所述裂解液的制备原料包括：复合酶、表面活性剂、牛血清白蛋白、引物、裂解缓冲液、裂解酶、水。
在一些实施方式中，按重量份，所述裂解液的制备原料包括：复合酶1-5份、表面活性剂1-5份、牛血清白蛋白1-5份、引物0.5-3份、裂解缓冲液8-15份、裂解酶0.5-3份、水50-70份。
进一步地，按重量份，所述裂解液的制备原料包括：复合酶1-2份、表面活性剂1-3份、牛血清白蛋白1-3份、引物0.5-2份、裂解缓冲液8-12份、裂解酶0.5-2份、水55-65份。
更进一步地，按重量份，所述裂解液的制备原料包括：复合酶2份、表面活性剂2份、牛血清白蛋白2份、引物1份、裂解缓冲液10份、裂解酶1份、水62份。
在一些实施方式中，复合酶包括溶菌酶、溶葡球菌酶、蜗牛酶、溶壁酶中的至少一种。
在一些实施方式中，所述复合酶为溶菌酶和溶葡球菌酶，重量比为(1-3)：(1-3)，优选地，重量比为1：1。
申请人在探究中发现，选用溶菌酶和溶葡球菌酶能够更好的裂解革兰氏阴性/阳性菌的同时裂解葡萄球菌，尤其是当二者的重量比为(1-3)：(1-3)优选为1：1时，裂解效果更好，这可能是因为在该比例下两种酶相互影响较小，能发挥各自最大的活性。
在一些实施方式中，所述引物的序列为5’d(NNNNNN)-3’-P。
在一些实施方式中，所述表面活性剂包括吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的至少一种。
在一些实施方式中，所述表面活性剂为吐温-20。
申请人还发现，在本体系内选择吐温-20作为表面活性剂相对于其他类型的表活能够更好的保持液滴稳定性，这可能是因为吐温-20与裂解试剂的兼容性更强。
本发明的第二个方面提供了一种微生物的裂解方法，所述方法包括如下步骤：
S1.制备微生物悬液；
S2.制备微生物裂解液；
S3.PCR反应程序进行微生物裂解；
S4.染色，观察微生物裂解效果。
在一些实施方式中，所述染色所用的染料包括SYTO9/PI染料、DMAO/EthD-III染料、MycoLightGreenJJ98、MycoLightRedJJ94、Calcein-AM染料中的至少一种。
本发明的第三个方面提供了一种用于裂解微生物的试剂盒，所述试剂盒包括所述的微生物裂解液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用多种生物酶共同裂解的方法，操作简单，仅在PCR仪上便能完成微生物裂解，且裂解所需样本量少，一次实验仅需10μL，通量高，一次可裂解3千万个细菌，可同时对多个样本同时裂解，并且能通过染色迅速检测裂解效果，使用于快速检测大量样本。
2.本发明通过PCR仪进行酶裂解微生物，可同时裂解大部分革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳链球菌等，操作简单，所需步骤方便，成本低，裂解微生物效率高，是一种良好的微生物裂解方式。
附图说明
图1为本发明微生物的裂解方法的流程图；
图2为实施例1中大肠杆菌/枯草芽孢杆菌裂解前荧光图；
图3为实施例1中大肠杆菌/枯草芽孢杆菌裂解后荧光图；
图4为实施例2中根际土裂解前荧光图；
图5为实施例2中根际土裂解后荧光图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中原料信息如下：
溶菌酶、裂解缓冲液、裂解酶均来自裂解酶Bacteria
溶葡球菌酶来自Sigma
牛血清白蛋白、引物均来自Thermofisher
实施例1
本实施例提供了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌混合微生物的裂解。
1.大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的培养。
分别用接种环取大肠杆菌菌株及枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上进行划线培养，培养温度及时间为37℃，10h。培养好后，每种细菌挑选一个菌落在LB液体培养基中进行单克隆培养，培养时间为37℃，12h，转速为150r/min。
2.大肠杆菌及枯草芽孢杆菌混合微生物悬液制备。
将培养好的单克隆大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各取500μL，1:1(V/V)混匀，10000g，4℃离心5min。离心完成后，弃900μL上清，加入900μLPBS缓冲液清洗培养基，并轻轻用枪头将微生物吹打混匀，再次10000g，4℃离心5min。重复上述清洗步骤2次，结束后弃900μL上清，加入900μLPBS缓冲液清洗培养基，并轻轻用枪头将微生物吹打混匀。取850μL清洗完成的微生物混合溶液，加入150μL微生物悬浮液添加剂(密度梯度培养基)，用枪头吹打混匀，制备完成微生物悬浮液，保存于4℃冰盒上。
3.微生物裂解液的配制。
所述裂解液的制备原料包括：复合酶2μL、吐温-20 2μL、牛血清白蛋白2μL、引物(NNNNNN)1μL、裂解缓冲液10μL、裂解酶(microgem)1μL、水62μL，制备原料混匀即得微生物裂解液。
所述复合酶为溶菌酶和溶葡球菌酶，重量比为1：1。
4.微生物及裂解液混合反应体系制备。
将制备好的微生物悬液4℃解冻后震荡混匀，并瞬时离心，加入微生物裂解液，微生物悬液与裂解液1:4(V/V)混合，用移液枪吹打混匀，装入0.2mLPCR反应管中，每个反应管中的体积不超过50μL。
5.PCR反应程序裂解微生物，释放遗传信息。
将步骤4中分装好的混合反应体系置于PCR仪上进行裂解，裂解反应程序为37℃，30min；75℃，10min，95℃5min；4℃，+∞。
6.裂解前后微生物染色，微生物裂解效果检测。
取10μL混合后微生物悬液，加入990μLPBS缓冲液，用枪头轻轻吹打混匀，置于4℃冰盒上保存；
取50μL裂解后微生物反应液，加入950μLPBS缓冲液，用枪头轻轻吹打混匀，置于4℃冰盒上保存；
向制备好的两个液体中分别加入3μLSYTO9染色液，同时用枪头将染料吹打混匀，并在暗室中孵育15min。
在荧光显微镜下对比裂解前后微生物荧光比例，检测裂解效果，具体参见图2-3。
裂解后Qubit浓度上升，表明微生物DNA被释放。
实施例2
本实施例提供了根际土微生物的裂解。
1.根际土微生物悬液制备
称取5g根际土，加入20mLPBS震荡10min，置于冰上，过40um滤网；将过滤后的样本浆液900rpm离心5min，上清转移至0.22um超滤管中，同时，向样本沉淀中加入20mLPBS缓冲液，800rpm离心5min，转移上清至0.22um超滤管中；将两个超滤管放入离心机，7000rcf离心5min，去除滤液；用2-3mLPBS缓冲液重悬回收菌体沉淀，转移至1.5mL无菌离心管中，900rpm离心5min，取上清；将上清过10um滤网，得到微生物悬液。
2.微生物裂解液的配制。
所述裂解液的制备原料包括：复合酶2μL、吐温-20 2μL、牛血清白蛋白2μL、引物(NNNNNN)1μL、裂解缓冲液10μL、裂解酶(microgem)1μL、水62μL，制备原料混匀即得微生物裂解液。
所述复合酶为溶菌酶和溶葡球菌酶，重量比为1：1。
3.微生物及裂解液混合反应体系制备。
将制备好的微生物悬液及微生物裂解液1:4(V/V)混合，用移液枪吹打混匀，装入0.2mLPCR反应管中，每个反应管中的体积不超过50μL。
4.PCR反应程序裂解微生物，释放遗传信息。
将步骤3中分装好的混合反应体系置于PCR仪上进行裂解，裂解反应程序为37℃，30min；75℃，10min，95℃5min；4℃，+∞。
5.裂解前后微生物染色，微生物裂解效果检测
取10μL混合后微生物悬液，加入990μLPBS缓冲液，用枪头轻轻吹打混匀，置于4℃冰盒上保存；
取50μL裂解后微生物反应液，加入950μLPBS缓冲液，用枪头轻轻吹打混匀，置于4℃冰盒上保存；
向制备好的两个液体中分别加入3μLSYTO9染色液，同时用枪头将染料吹打混匀，并在暗室中孵育15min。
在荧光显微镜下对比裂解前后微生物荧光比例，检测裂解效果。
裂解后Qubit浓度上升，表明微生物DNA被释放。
对比例1
本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，采用煮沸法进行裂解，具体操作如下：
取10μL实施例1制备的微生物悬液，加入40μL PBS煮沸15min。
对比例2
本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，采用碱裂解法进行裂解，具体操作如下：
取10μL实施例1制备的微生物悬液，加入40μL碱裂解试剂(400mM KOH，10mM EDTA，100mM DTT)，室温孵育30min。
通过(1)和(2)其他裂解方法的比对分析，本发明相较于其他裂解方法(煮沸法、碱裂解法)更优，裂解前后浓度倍数增长更大。
对比例3
本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，采用吐温-60替换吐温-20。
对比例4
本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述复合酶为溶菌酶和溶葡球菌酶，重量比为1：3。
对比例5
本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述复合酶为溶菌酶和溶壁酶，重量比为1：1。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种微生物裂解液，其特征在于，所述裂解液的制备原料包括：复合酶、表面活性剂、牛血清白蛋白、引物、裂解缓冲液、裂解酶、水。
2.根据权利要求1所述的微生物裂解液，其特征在于，按重量份，所述裂解液的制备原料包括：复合酶1-5份、表面活性剂1-5份、牛血清白蛋白1-5份、引物0.5-3份、裂解缓冲液8-15份、裂解酶0.5-3份、水50-70份。
3.根据权利要求2所述的微生物裂解液，其特征在于，复合酶包括溶菌酶、溶葡球菌酶、蜗牛酶、溶壁酶中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的微生物裂解液，其特征在于，所述复合酶为溶菌酶和溶葡球菌酶，重量比为(1-3)：(1-3)。
5.根据权利要求3所述的微生物裂解液，其特征在于，所述引物的序列为5’d(NNNNNN)-3’-P。
6.根据权利要求1所述的微生物裂解液，其特征在于，所述表面活性剂包括吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的微生物裂解液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-20。
8.一种微生物的裂解方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.制备微生物悬液；
S2.制备如权利要求1-7任一项所述的微生物裂解液；
S3.PCR反应程序进行微生物裂解；
S4.染色，观察微生物裂解效果。
9.根据权利要求8所述的裂解方法，其特征在于，所述染色所用的染料包括SYTO9/PI染料、DMAO/EthD-III染料、MycoLightGreenJJ98、MycoLightRedJJ94、Calcein-AM染料中的至少一种。
10.一种用于裂解微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任一项所述的微生物裂解液。
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2023
- 2023-07-18 CN CN202310879380.XA patent/CN116694472A/zh active Pending
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