JP6853283B2 - 微生物細胞を抽出するための装置及び方法 - Google Patents
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Description
本願は、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる2012年11月30日出願の米国特許仮出願第61/731,809号、表題「APPARATUS AND METHOD FOR PRE-TREATMENT OF MICROBIAL SAMPLES」、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる2013年1月8日出願の米国特許仮出願第61/750,242号、表題「APPARATUS AND METHOD FOR PRE-TREATMENT OF MICROBIAL SAMPLES」、及びその全内容が参照によって本明細書に組み込まれる、2013年3月15日出願の米国特許出願第13/833,872号、表題「APPARATUS AND METHOD FOR PRE-TREATMENT OF MICROBIAL SAMPLES」に基づく優先権を主張する。
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む。
内部体積を規定する容器本体及び容器本体を密封するための閉鎖機構であり、ここで容器本体は、遠心分離デバイス中で使用されるように設計されている、容器本体及び閉鎖機構
を含み、
ここで容器本体は:
血球溶解試薬を含む前処理混合物、及び
全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体であり、ここで緩衝用液体は、全血サンプル内の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集されるように、前記容器本体の遠心分離の際に上清の下に液体界面を形成する、疎水性緩衝用液体
を含み、
前記容器本体の遠位部分は、円錐形の形状である。
液体サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、液体サンプルの密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで液体サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む。
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は血球溶解試薬を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
少なくとも1つの一連の洗浄ステップを実施するステップであり、ここで各一連の洗浄ステップは:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
を含む、ステップ、及び
前処理容器の内容物を撹拌して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、並びに 該懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む。
微生物細胞を含むサンプルを前処理して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、
該懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、並びに
溶解物に対して多重化された分子アッセイのセットを実施するステップであり、ここで多重化された分子アッセイのセットが:
サンプル中に存在する微生物細胞の界を同定するための少なくとも1つの一次rRNAベースの分子アッセイ、
サンプル中に存在する微生物細胞のグラム状況を同定するための少なくとも1つの二次rRNAベースの分子アッセイ、及び
真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての属、種レベルにおける少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイ
を含む、ステップ
を含む方法が提供され、
ここで真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイは、その結果に基づく抗微生物治療の段階的縮小に適切である。
モーター、
モーターによって駆動されるローターであり、ここでローターは、前記ローターの回転中に前処理容器の内容物に遠心力が適用されるように前処理容器を支持するように設計されており、モーターは、懸濁物から微生物細胞を取り出し、前処理容器の遠位表面近傍で微生物細胞を収集するのに十分な速度でローターを回転させるように設計されている、ローター、
回転部分及び非回転部分を含む回転ユニオンであり、ここで前記回転部分は、前記ローターと調和して回転する、回転ユニオン、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前処理容器上に提供されたキャップを介して前処理容器中に延びる吸引管であり、ここで前記吸引管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位吸引オリフィスを有する、吸引管、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前記キャップを介して前処理容器中に延びる分配管であり、ここで前記分配管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位分配オリフィスを有する、分配管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定入口管であり、ここで前記固定入口管は、前記ローターの回転中に前記分配管と流体連絡するようになっている、固定入口管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定出口管であり、ここで前記固定出口管は、前記ローターの回転中に前記吸引管と流体連絡するようになっている、固定出口管、並びに
流体を分配及び吸引するために、前記固定入口管及び前記固定出口管と流体連絡した、ポンプ機構
を含む。
培養及び検出の目的のために血液サンプルを溶解させ、微生物病原体を濃縮するための方法は、例えば、米国特許第5,070,014号、米国特許第4,131,512号、米国特許第4,212,948号、米国特許第4,693,972号及び米国特許第5,108,927号において、Dornによって開示された。Dornは、サポニン及びポリアネトールスルホン酸ナトリウム(SPS)を含む血液溶解剤、並びに高密度液体フッ素化炭化水素などの緩衝用液体を含む、サンプル収集管の使用を教示している。所定体積の全血がサンプル収集管に添加され、サポニンが、サンプル中の血球を溶解させる。緩衝用液体は、サンプル収集管の底部において明瞭な液体層を形成し、管が遠心分離される場合にその液体界面において微生物細胞を収集するために提供され、得られたペレットにおける衝撃又は圧縮力によって他の方式で損傷され得る微生物細胞の生存度を保持する。上清の大部分の除去後、Dornは、任意の残留上清及び全ての緩衝用液体を含む、管中の残留液体の全ての取り出しを教示している。
先行する方法及びデバイスは、緩衝用液体を含む前処理容器の使用を採用している。緩衝用液体は、前処理容器の壁への微生物細胞の接着に起因して(緩衝用液体の非存在下で)他の方式で発生する、細胞回収(又は下流の分子アッセイの場合にはアッセイシグナル)における喪失を防止する。
いくつかの実施形態では、上に開示されたサンプル前処理プロセス(緩衝用液体を用いる又は用いない)又はそれらの改変法は、操作者の関与を低減させるため、並びに細胞の収集及び洗浄の有効性を改善するために、自動化され得る。例えば、自動化洗浄ステップを実施する能力を有するように設計された遠心分離機が、この目的のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、先行する実施形態は、微生物細胞の初期抽出及び濃縮のために使用され得、その後に、逆転写-PCR(RT-PCR)(相補的DNA(cDNA)へのrRNAの逆転写と、その後のPCRによるcDNAの増幅及び検出)を使用して微生物細胞を同定するための下流の方法が続く。cDNAの増幅は、任意選択で、ゲノムDNAの増幅と同時に又は連続的に実施され得、このとき、cDNA及びgDNAは、微生物細胞の異なる遺伝子型分類群を同定するために使用される。gDNAは、rRNAと同じ溶解物から取得され得る。
いくつかの実施形態では、rRNA試験のパネルが、1種以上の広域スペクトルの抗生物質から1種以上の狭域スペクトルの抗生物質への抗生物質治療の迅速な段階的縮小を可能にするために選択され得る。狭域スペクトルの抗微生物薬物を使用することは、費用低減の観点から利益を提供するだけでなく、薬物耐性微生物の重複感染及び発生などの有害作用の可能性もまた制限する。上記のように、この実施形態は、医療専門家の意思決定プロセスを改善し得、より早い時点で狭域スペクトルの抗微生物薬物を医療専門家が投与することを助け得る、感染性因子の迅速な検出及び/又は同定を可能にする。これは、耐性の発生を予防し得、毒性を低減させ得、医療費用を実質的に低減させ得る。
(a)生物が細菌であるか真菌生物であるかを決定するための、界レベルにおける1つ以上の一次rRNA試験、
(b)細菌である場合、生物のグラム状況を同定するための、1つ以上の二次試験、並びに (c)生物の少なくとも1つの属又は種を同定するための、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての1つ以上の三次rRNA試験であって、この三次試験の結果は、適切な狭域スペクトルの抗生物質を選択するのに適切である。
蛍光シグナルによるアンプリコン検出に対する溶解させた血液中のデブリの消光作用の低減に対する洗浄の影響
この実施例に示す実験を、前処理及び増幅の例示的方法に従って実施して、溶解させた血液中のデブリの蛍光シグナルに対する消光作用を低減させ、効率的なリアルタイムRT-PCRアッセイを可能にする、洗浄サイクルの影響を決定した。
分子アッセイに対する希釈ベースの洗浄ステップ及び微生物細胞溶解方法の影響
この実施例に示す実験を実施して、洗浄ステップの数及び微生物細胞溶解方法が、下流の分子アッセイに対する溶解させた血液中のデブリの阻害作用に如何にして影響を与えるかを実証した。
分子アッセイに対する溶解させた血液中のデブリの阻害作用を低減させることに対する、例示的なサンプル前処理手順の間の洗浄の影響
この実施例に示す実験を実施して、洗浄サイクル及び電気的処理が下流の分子アッセイに対する溶解させた血液中のデブリの阻害作用を如何にして低減させるかを実証した。例示的なサンプル前処理の間の洗浄サイクルの数に対する典型的RT-PCRアッセイの依存性を試験した。
血液溶解試薬の組成及び前処理容器の内部表面に対する検出効率の依存性
以下の実施例に示す実験を実施して、全血サンプル中の微生物細胞が前処理サンプル中に回収される効率、及び分子アッセイ阻害化合物が除去又は不活性化されることを実証した。上述のように、このような方法は、核酸抽出/精製及び/又は培地バランスのさらなるステップを必要とすることなく、下流の試薬なしの微生物細胞溶解とその後の核酸アッセイとのために、適用可能であり得る。血球溶解試薬の組成、緩衝用液体の体積及びサンプル前処理容器の内部表面特性に対する微生物細胞回収の依存性を検証した。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対するサポニン濃度の濃度におけるバリエーション
600CFU/mLの緑膿菌にスパイクしたヒト全血1mLを、2mLのシリコン処理微小遠心管中に、10μLのFluorinert(商標)FC-40、4.5〜240mg/mLのサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含む0.5mLの前処理混合物に添加した。混合物中の構成要素の最終濃度は、1.5〜80mg/mLのサポニン、5mg/mL SPS及び0.33%PPGであった。サンプル前処理手順を実施し、前処理サンプル及び陽性対照を電気的に溶解させた。サンプル前処理後に全血から回収された前処理サンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルを図12(a)に示す。およそ25mg/mLのサポニンの最終濃度が、この実験条件にとって最も有効な濃度であるように見える。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対するSPSの濃度におけるバリエーション
600CFU/mLの緑膿菌でスパイクしたヒト全血1mLを、2mLのシリコン処理微小遠心管中に、10μLのFluorinert(商標)FC-40、75mg/mLのサポニン、0.5〜20mg/mLの範囲内のSPS及び1%PPGを含む0.5mLの前処理混合物に添加した。混合物中の構成要素の最終濃度は、25mg/mLサポニン、0.5〜20mg/mLのSPS及び0.33%PPGであった。サンプル前処理後に全血から回収された前処理サンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルを図12(b)に示す。およそ5mg/mLのSPSの最終濃度が、この実験条件にとって最も有効な濃度であるように見える。
血液のために使用される抗凝固剤の型及びリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対する前処理混合物の組成調整におけるバリエーション
異なる抗凝固剤を含むBD Vacutainer収集管中に引き出されたヒト全血。使用した収集管に、緩衝化クエン酸ナトリウム(BD366415、通常は凝固試験に使用される)、K2 EDTA(BD367863、通常は血液学試験に使用される)、ナトリウムヘパリン(BD367871、通常は化学試験に使用される)並びに1.7mLの0.35%SPS及び0.85%塩化ナトリウムを含むSPSを供給した(BD364960、通常は血液培養標本収集に使用される専門管)。製造業者によって特定された血液の標準的な体積を、各管中に引き出した。600CFU/mLの緑膿菌でスパイクした、各々1mLの、クエン酸塩、EDTA及びヘパリンの管中に収集したヒト全血を、2mL(T-3531、Sigma)シリコン処理微小遠心管中に、10μLのFluorinert(商標)FC-40、75mg/mLサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含む0.5mLの前処理混合物に添加した。混合物中の構成要素の最終濃度は、25mg/mLサポニン、5mg/mL SPS及び0.33%PPGであった。SPS管中に収集した血液について、この管中の抗凝固剤溶液中のさらなるSPSの存在に起因して、前処理混合物を、10μLのFluorinert(商標)FC-40、112.5mg/mLサポニン、7.5mg/mL SPS及び1%PPGを含む0.5mLの混合物として調整した。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対するFluorinert(商標)の体積におけるバリエーション
600CFU/mLの緑膿菌でスパイクしたヒト全血1mLを、異なる体積のFluorinert(商標)FC-40、75mg/mLサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含む0.5mLの前処理混合物に添加した。さらに、Fluorinert(商標)の体積におけるバリエーションの影響を、異なる管底部形状を有する2つの異なるシリコン処理微小遠心管、2mL管(T-3531、Sigma)及び1.7mL管(T-3406、Sigma)において試験した。混合物中の構成要素の最終濃度は、25mg/mLサポニン、5mg/mL SPS及び0.33%PPGであった。前処理手順を実施し、サンプルを電気的に溶解させた。サンプル前処理後に全血から回収された前処理サンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルを、図14(a)及び(b)に示し、(a)は、2ml管についてのアッセイシグナルを示し、(b)は、1.7ml管についてのアッセイシグナルを示す。この実験条件について、Fluorinert(商標)の体積は、両方の型の管について、およそ2.5μLよりも大きくかつおよそ100μL未満であるべきことが実証された。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対する前処理容器の内部表面特性におけるバリエーション
600CFU/mLの緑膿菌でスパイクしたヒト全血1mLを、内部表面処理あり又はなしの2mL微小遠心管中に、10μLのFluorinert(商標)FC-40、75mg/mLサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含む0.5mLの前処理混合物に添加した。一方の群では、通常の2mLのポリプロピレン微小遠心管(B71420、Bioplastics)を使用した。他方の群では、2mLのシリコン処理微小遠心管(T-3531、Sigma)を使用した。混合物中の構成要素の最終濃度は、25mg/mLサポニン、5mg/mL SPS及び0.33%PPGであった。サンプル前処理後の全血から回収された前処理サンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナル対サイクル数を、図15に示す。通常の管についてのCT値は、シリコン処理管の場合よりも約4サイクル遅く、これは、前処理プロセス中のより効率的な細胞回収を示している。従って、内部表面のシリコン処理が、全血からの細菌細胞のより効率的な回収のために使用され得る。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対する血球溶解試薬の型におけるバリエーション 600CFU/mLの緑膿菌でスパイクしたヒト全血1mLを、2mLの微小遠心管中に10μLのFluorinert(商標)FC-40を含む前処理混合物に添加した。この実施例で使用した前処理試薬は、(a)75mg/mLサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含む500μLのサポニン混合物、並びに(b)1mLの、炭酸ナトリウム緩衝液pH10中1%のTriton X-100、であった。遠心分離後、細胞溶解ステップの後に、上清を除去し、150μLの液体上清、Fluorinert(商標)及び沈降した微生物細胞を残した。前処理手順の5回の洗浄サイクルを実施し、サンプルを電気的に溶解させた。全血から回収された処理されたサンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルは、2つの血球溶解試薬編成のCt値が1サイクル以内で類似であったことを示した。
リアルタイムRT-PCRアッセイシグナルに対する血球溶解試薬の型におけるバリエーション 600CFU/mLの緑膿菌でスパイクしたヒト全血1mLを、2mLの微小遠心管中に10μLのFluorinert(商標)FC-40を含む前処理混合物に添加した。この実施例で使用した500μLの前処理試薬は、(a)75mg/mLサポニン、15mg/mL SPS及び1%PPGを含むサポニン混合物、(b)リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中1.5%のTriton X-100及び18.75mg/mLのSPS、(c)リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中1.5%のTriton X-100及び22.5mg/mLのSPS、(d)リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中4.5%のTriton X-100及び15mg/mLのSPS、並びに(e)リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中3%のTriton X-100及び22.5mg/mLのSPS、であった。遠心分離後、細胞溶解ステップの後に、上清を除去し、150μLの液体上清、Fluorinert(商標)及び沈降した微生物細胞を残した。前処理手順の5回の洗浄サイクルを実施し、サンプルを電気的に溶解させた。全血から回収された処理されたサンプル中の細菌のリアルタイムRT-PCRアッセイシグナルは、これらの血球溶解試薬のCt値が1〜2サイクル以内で類似であったことを示した。
ヒト全血におけるスパイクされた微生物の検出限界
このセクションに示す3つの実施例は、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌について1mL当たり1〜10細胞の範囲内の検出限界でヒト全血中の微生物細胞を検出するデバイスの能力を実証する。
ヒト全血中のスパイクされた真菌の検出
カンジダ・アルビカンスでスパイクしたサンプルを調製し、RT-PCRアッセイについて上記したように処理した。1ステップRT-PCRプロトコールは、UFF3フォワードプライマー(5'-AACGAAAGTTAGGGGATCGAAG-3')(配列番号15)及びUFR3リバースプライマー(5'-CTTTAAGTTTCAGCCTTGCGA-3')(配列番号16)を使用した。全ての真菌種の高頻度可変性領域における167塩基対の18S rRNA遺伝子断片(参照としてカンジダ・アルビカンスAB013586を使用し、ヌクレオチド940〜1107)を増幅した。
ヒト全血中のスパイクされたグラム陽性細菌の検出
肺炎連鎖球菌でスパイクしたサンプルを調製し、RT-PCRアッセイについて上記したように処理した。1ステップRT-PCRプロトコールは、Ubeaプライマー対(UbeaFフォワードプライマー、5'-GACAGGTGGTGCATGGTTGTC-3'(配列番号18)及びUbeaRリバースプライマー、5'-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3')(配列番号19)並びにGP1プライマー対(GP1Fフォワードプライマー、5'-ATGCATAGCCGACCTGAGAG-3'(配列番号11)及びGP1Rリバースプライマー、5'-AGTTAGCCGTSSCTTTCTG-3')(配列番号12)を使用した。全ての細菌種の高頻度可変性領域における170塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照として肺炎連鎖球菌G54を使用し、ヌクレオチド1035〜1185)を、ユニバーサル細菌Ubeaプライマー対によって増幅し、全てのグラム陽性細菌種の高頻度可変性領域における230塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照として黄色ブドウ球菌NR037007を使用し、ヌクレオチド290〜520)を、グラム陽性特異的GP1プライマー対によって増幅した。
ヒト全血中のスパイクされたグラム陰性細菌の検出
大腸菌でスパイクしたサンプルを調製し、RT-PCRアッセイについて上記したように処理した。1ステップRT-PCRプロトコールは、UBプライマー対(UBF8フォワードプライマー、5'-CGGCTAACTCCGTGCCAGCAG-3'(配列番号12)及びUBRsリバースプライマー、5'-ATCTCTACGCATTTCACCGCTACAC-3')(配列番号2)並びに全てのグラム陰性細菌種を標的化するGN1プライマー対(GN1Fフォワードプライマー、5'-GTTACCCGCAGAAGAAGCAC-3'(配列番号13)及びGN1Rリバースプライマー、5'-ACCTGAGCGTCAGTCTTCGT-3'(配列番号14)を使用した。全ての細菌種の高頻度可変性領域における203塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照として大腸菌O104:H4 str. 2011C-3493を使用し、ヌクレオチド504〜707)を、ユニバーサル細菌UBプライマー対によって増幅し、全てのグラム陰性細菌種の高頻度可変性領域における278塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照として大腸菌NR 024570.1を使用し、ヌクレオチド475〜753)を、グラム陰性特異的GN1プライマー対によって増幅した。
リアルタイムRT-PCRを使用して測定される、検出方法の再現性
この実施例は、30分間の合計実施時間内での、1mLのヒト全血サンプル中の微生物細胞の検出の再現性を実証する。最終目的は多重化検出スキームであるが、この実施例は、個々のRT-PCRアッセイによる各々の種の検出である。
生ヒト全血におけるグラム陽性細菌の迅速な検出
5つの病原性種を試験した:EF(大便連鎖球菌)、SS(サンギス菌(Streptococcus sanguis))、SP(肺炎連鎖球菌)、SA(黄色ブドウ球菌)及びSPy(化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes))。スパイクされた血液サンプル並びに陽性対照及び陰性対照を調製し、上記のように電気的溶解に供した。RT-PCRプロトコールは、GPF8フォワードプライマー、5'-GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG-3'(配列番号21)及びGPR8リバースプライマー、5'-CAGGTCATAAGGGGCATGATGAT-3'(配列番号22)を使用した。全てのグラム陽性細菌種の高頻度可変性領域における151塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照としてブドウ球菌種LS255を使用し、ヌクレオチド1069〜1220)を増幅した。
生ヒト全血におけるグラム陰性細菌の迅速な検出
5つの病原性種を試験した:KP(肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae))、PA(緑膿菌)、EC(大腸菌)、ECL(エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae))及びAB(アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii))。スパイクされた血液サンプル並びに陽性対照及び陰性対照を調製し、上記のように電気的溶解に供した。RT-PCRプロトコールは、GNF8フォワードプライマー、5'-GTTACCCGCAGAAGAAGCACCG-3'(配列番号23)及びGNR8リバースプライマー、5'-ATGCAGTTCCCAGGTTGAGCC-3'(配列番号24)を使用した。全てのグラム陰性細菌種の高頻度可変性領域における151塩基対の16S rRNA遺伝子断片(参照として大腸菌IaI1を使用し、ヌクレオチド484〜635)を増幅した。5つの独立した実施にわたり異なる種について得られたCT値を、図26に示す。上記のとおりの検出限界基準が、全てのグラム陰性種について満たされた。
生ヒト全血における真菌の迅速な検出
5つの病原性種を試験した:CA(カンジダ・アルビカンス)、CrN(クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans))、CG(カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata))、CK(カンジダ・クルセイ(Candida krusei))及びAF(アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus))。スパイクされた血液サンプル並びに陽性対照及び陰性対照を調製し、上記のように電気的溶解に供した。RT-PCRプロトコールは、UFF2フォワードプライマー、5'-ACGGGGAGGTAGTGACAATAAAT-3'(配列番号9)及びUFR2リバースプライマー、5'-CCCAAGGTTCAACTACGAGCTT-3'(配列番号10)を使用した。全ての真菌種の高頻度可変性領域における190塩基対の18S rRNA遺伝子断片(参照としてカンジダ・アルビカンスAB013586を使用し、ヌクレオチド434〜624)を増幅した。5つの独立した実施にわたり異なる種について得られたCT値を、図27に示す。上記のとおりの検出限界基準が、全ての真菌種について満たされた。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(2)抽出懸濁物が、緩衝用液体を実質的に含まない、(1)に記載の方法。
(3)前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、(3)に記載の方法。
(5)遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、(1)〜(4)のいずれか一に記載の方法。
(6)緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(1)〜(5)のいずれか一に記載の方法。
(7)緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(1)〜(5)のいずれか一に記載の方法。
(8)緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(1)〜(5)のいずれか一に記載の方法。
(9)緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(1)〜(5)のいずれか一に記載の方法。
(10)血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ1.5mg/mlから80mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ0.5mg/mlから20mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれか一に記載の方法。
(11)血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ10mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ2.5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれか一に記載の方法。
(12)血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ0.05%から2.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(1)〜(9)のいずれか一に記載の方法。
(13)血球溶解試薬のpHが、およそ5から11の間である、(12)に記載の方法。
(14)血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、(12)に記載の方法。
(15)Triton X-100が、およそ0.5%から1.5%の間の範囲の量で提供される、(12)〜(14)のいずれか一に記載の方法。
(16)血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(10)〜(15)のいずれか一に記載の方法。
(17)消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(16)に記載の方法。
(18)抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(1)〜(17)のいずれか一に記載の方法。
(19)微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(18)に記載の方法。
(20)電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(19)に記載の方法。
(21)抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(20)に記載の方法。
(22)電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(20)又は(21)に記載の方法。
(23)適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(19)〜(22)のいずれか一に記載の方法。
(24)アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(18)〜(23)のいずれか一に記載の方法。
(25)アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(18)〜(24)のいずれか一に記載の方法。
(26)分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(18)〜(25)のいずれか一に記載の方法。
(27)微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(1)〜(26)のいずれか一に記載の方法。
(28)全血サンプルから微生物細胞を抽出するための前処理容器であって、前処理容器は:
内部体積を規定する容器本体及び容器本体を密封するための閉鎖機構であり、ここで容器本体は、遠心分離デバイス中で使用されるように設計されている、容器本体及び閉鎖機構
を含み、
ここで容器本体は:
血球溶解試薬を含む前処理混合物、及び
全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体であり、ここで緩衝用液体は、全血サンプル内の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集されるように、前記容器本体の遠心分離の際に上清の下に液体界面を形成する、疎水性緩衝用液体
を含み、
前記容器本体の遠位部分は、円錐形の形状である、前処理容器。
(29)緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(28)に記載の前処理容器。
(30)緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(28)に記載の前処理容器。
(31)緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(28)に記載の前処理容器。
(32)遠心分離下で、緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(28)に記載の前処理容器。
(33)前記容器本体の内部表面が疎水性である、(28)〜(32)のいずれか一に記載の前処理容器。
(34)前記容器本体の内部表面がシリコン処理されている、(28)〜(32)のいずれか一に記載の前処理容器。
(35)前記容器本体の遠位部分が、底部が丸形末端になっている円錐形形状を有する、(28)〜(34)のいずれか一に記載の前処理容器。
(36)前記丸形末端が半球形末端である、(35)に記載の前処理容器。
(37)予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ1.5mg/mlから80mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ0.5mg/mlから20mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれか一に記載の前処理容器。
(38)予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ10mg/mlから30mg/mlの間の範囲の量のサポニン及びおよそ2.5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれか一に記載の前処理容器。
(39)予め選択されたサンプル体積の全血を処理するように設計されており、血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物に関して表して、およそ0.05%から2.5%の間の範囲の量のTriton X-100及びおよそ5mg/mlから10mg/mlの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む水溶液である、(28)〜(36)のいずれか一に記載の方法。
(40)血球溶解試薬のpHが、およそ5から11の間である、(39)に記載の前処理容器。
(41)血球溶解試薬のpHが、およそ9から11の間である、(39)に記載の前処理容器。
(42)Triton X-100が、およそ0.5%から1.5%の間の範囲の量で提供される、(39)〜(41)のいずれか一に記載の前処理容器。
(43)血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(37)〜(42)のいずれか一に記載の前処理容器。
(44)消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(43)に記載の前処理容器。
(45)液体サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
液体サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は、液体サンプルの密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで液体サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、並びに
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(46)前処理容器が、液体サンプルが添加される緩衝液をさらに含む、(45)に記載の方法。
(47)緩衝液が、液体サンプル内の1種以上の非微生物学細胞の溶解のために有効な試薬を含む、(46)に記載の方法。
(48)液体サンプルが、痰サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプル及び均質化された便サンプルからなる群より選択される、(45)〜(47)のいずれか一に記載の方法。
(49)液体サンプルが、食品サンプル及び均質化された食品サンプルのうち1種である、(45)〜(47)のいずれか一に記載の方法。
(50)液体サンプルが環境サンプルである、(45)〜(47)のいずれか一に記載の方法。
(51)緩衝用液体の体積が、およそ2.5マイクロリットルから100マイクロリットルの間である、(45)〜(50)のいずれか一に記載の方法。
(52)緩衝用液体の体積が、およそ5マイクロリットルから15マイクロリットルの間である、(45)〜(50)のいずれか一に記載の方法。
(53)緩衝用液体の体積が、前処理容器の体積のおよそ0.1%から10%の間である、(45)〜(50)のいずれか一に記載の方法。
(54)緩衝用液体によって湿潤した前処理容器の表面が、少なくとも、緩衝用液体の非存在下で遠心分離下により微生物細胞が沈降すると予想される前処理容器表面の領域を覆うように、緩衝用液体の体積が提供される、(45)〜(50)のいずれか一に記載の方法。
(55)前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップの前に、以下の洗浄ステップ:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
が実施される、(45)〜(54)のいずれか一に記載の方法。
(56)洗浄ステップを追加で1回以上実施するステップをさらに含む、(55)に記載の方法。
(57)遠心分離後、前処理容器の側方部分上に液体界面が形成され、ここで該方法は、液体界面が実質的に水平になるように前処理容器を再度方向合わせするステップをさらに含み、前処理容器の再度方向合わせは、実質的な量の微生物細胞が液体界面に収集された状態を保つように実施される、(45)〜(56)のいずれか一に記載の方法。
(58)抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(45)〜(57)のいずれか一に記載の方法。
(59)微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(58)に記載の方法。
(60)電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(59)に記載の方法。
(61)抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(60)に記載の方法。
(62)電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(60)又は(61)に記載の方法。
(63)適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(60)〜(62)のいずれか一に記載の方法。
(64)アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(58)〜(63)のいずれか一に記載の方法。
(65)アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(58)〜(64)のいずれか一に記載の方法。
(66)分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(58)〜(65)のいずれか一に記載の方法。
(67)微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(58)〜(66)のいずれか一に記載の方法。
(68)全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、前処理混合物は血球溶解試薬を含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
少なくとも1つの一連の洗浄ステップを実施するステップであり、ここで各一連の洗浄ステップは:
前処理容器に所定体積の洗浄緩衝液を添加するステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
微生物細胞が懸濁物から取り出されて前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前処理容器を遠心分離するステップ、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、実質的な量の上清を引き出すステップ
を含む、ステップ、及び
前処理容器の内容物を撹拌して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、並びに
該懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(69)血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物1ミリリットル当たりおよそ1.5ミリグラムから80ミリグラムの間の範囲の量のサポニンを含む水溶液である、(68)に記載の方法。
(70)血球溶解試薬が、全血及び血球溶解試薬の混合物1ミリリットル当たりおよそ0.5mgから20mgの間の範囲の量のポリアネトールスルホン酸ナトリウムをさらに含む、(69)に記載の方法。
(71)血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、(70)に記載の方法。
(72)消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、(71)に記載の方法。
(73)抽出懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、及び
少なくとも1つのアッセイを実施して、溶解物中に存在し得る少なくとも1種の分析物を検出するステップ
をさらに含む、(68)〜(72)のいずれか一に記載の方法。
(74)微生物細胞を溶解させるステップが、電気的に実施される、(73)に記載の方法。
(75)電気的溶解が:
マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、マイクロ流体デバイスは:
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミリメートル未満の尺度の厚さを有する流体チャネル、
上部チャネル表面上の上部電極、並びに
下部チャネル表面上の下部電極
を含み、ここで該チャネルは、該電極への電圧パルス適用下で、抽出懸濁物の急速加熱を支持するように適合されている、ステップ、
抽出懸濁物を、該チャネル中に流すステップ、並びに
上部電極と下部電極との間に一連のバイポーラ電圧パルスを適用するステップであり、ここで該電圧パルスの振幅、パルス幅及び持続時間が、抽出懸濁物を急速加熱して微生物細胞を溶解させることによって微生物細胞から巨大分子を放出させるのに十分である、ステップ
に従って実施される、(74)に記載の方法。
(76)抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ250度/秒の速度で発生するように、電圧パルスが適用される、(75)に記載の方法。
(77)電圧パルス適用下で、抽出懸濁物が、チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、(75)又は(76)に記載の方法。
(78)適用された電圧パルスに応答して、抽出懸濁物のジュール加熱が少なくともおよそ2000度/秒の速度で発生するように、チャネル表面の熱特性が選択される、(74)〜(77)のいずれか一に記載の方法。
(79)アッセイのうち少なくとも1つが、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(73)〜(78)のいずれか一に記載の方法。
(80)アッセイのうち少なくとも1つが、少なくとも部分的に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、(73)〜(79)のいずれか一に記載の方法。
(81)分析物のうち少なくとも1種がrRNAである、(73)〜(80)のいずれか一に記載の方法。
(82)微生物細胞が、細菌細胞及び/又は真菌細胞である、(68)〜(81)のいずれか一に記載の方法。
(83)微生物細胞を含むサンプルを前処理して、微生物細胞を含む懸濁物を取得するステップ、
該懸濁物中の微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップ、並びに
溶解物に対して多重化された分子アッセイのセットを実施するステップであり、ここで多重化された分子アッセイのセットが:
サンプル中に存在する微生物細胞の界を同定するための少なくとも1つの一次rRNAベースの分子アッセイ、
サンプル中に存在する微生物細胞のグラム状況を同定するための少なくとも1つの二次rRNAベースの分子アッセイ、及び
真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての属、種レベルにおける少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイ
を含む、ステップ
を含む方法であって、
ここで真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイは、その結果に基づく抗微生物治療の段階的縮小に適切である、方法。
(84)真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての少なくとも1つの三次rRNAベースの分子アッセイが、耐性記録に基づいて選択される、(83)に記載の方法。
(85)多重化された分子アッセイのセットが、追加で少なくとも1つの、株レベルにおけるgDNAベースの分子アッセイをさらに含む、(83)又は(84)に記載の方法。
(86)多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のうち1つ以上についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、(83)〜(85)のいずれか一に記載の方法。
(87)多重化された分子アッセイのセットが、真菌、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の各々についての単一の三次rRNAベースの分子アッセイを含む、(83)〜(85)のいずれか一に記載の方法。
(88)サンプルが未培養のサンプルである、(83)〜(87)のいずれか一に記載の方法。
(89)サンプルが全血サンプルである、(88)に記載の方法。
(90)サンプルが、陽性血液培養サンプルである、(83)〜(87)のいずれか一に記載の方法。
(91)多重化された分子アッセイのセットが、事前に核酸抽出ステップを行わずに実施される、(83)〜(90)のいずれか一に記載の方法。
(92)抗生物質と、多重化された分子アッセイのセットで得られた結果とを関連付けるステップをさらに含む、(83)〜(90)のいずれか一に記載の方法。
(93)グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、連鎖球菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(92)のいずれか一に記載の方法。
(94)グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、肺炎連鎖球菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(93)に記載の方法。
(95)グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、ブドウ球菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(94)のいずれか一に記載の方法。
(96)グラム陽性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、黄色ブドウ球菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(95)に記載の方法。
(97)真菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、カンジダ属(Candida)及び/又はアスペルギルス属についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(96)のいずれか一に記載の方法。
(98)グラム陰性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、腸内細菌についての属レベルのrRNAアッセイを含む、(83)〜(97)のいずれか一に記載の方法。
(99)グラム陰性細菌についての属、種又は株レベルにおける少なくとも1つのrRNAベースの分子アッセイが、緑膿菌についての種レベルのrRNAアッセイをさらに含む、(98)に記載の方法。
(100)サンプルから微生物細胞を抽出するための装置であって、該装置は:
モーター、
モーターによって駆動されるローターであり、ここでローターは、前記ローターの回転中に前処理容器の内容物に遠心力が適用されるように前処理容器を支持するように設計されており、モーターは、懸濁物から微生物細胞を取り出し、前処理容器の遠位表面近傍で微生物細胞を収集するのに十分な速度でローターを回転させるように設計されている、ローター、
回転部分及び非回転部分を含む回転ユニオンであり、ここで前記回転部分は、前記ローターと調和して回転する、回転ユニオン、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前処理容器上に提供されたキャップを介して前処理容器中に延びる吸引管であり、ここで前記吸引管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位吸引オリフィスを有する、吸引管、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前記キャップを介して前処理容器中に延びる分配管であり、ここで前記分配管は、前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位分配オリフィスを有する、分配管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定入口管であり、ここで前記固定入口管は、前記ローターの回転中に前記分配管と流体連絡するようになっている、固定入口管、
前記回転ユニオンの前記非回転部分に接続された固定出口管であり、ここで前記固定出口管は、前記ローターの回転中に前記吸引管と流体連絡するようになっている、固定出口管、並びに
流体を分配及び吸引するために、前記固定入口管及び前記固定出口管と流体連絡した、ポンプ機構
を含む、装置。
(101)前処理容器内で沈降物を再懸濁し、流体を混合するのに十分な振動力が適用されるように設計された振動機構をさらに含む、(100)に記載の装置。
(102)前記遠位吸引オリフィスが、前記遠位分配オリフィスよりも、前記前処理容器の遠位表面により接近して配置される、(100)に記載の装置。
(103)前記遠位吸引オリフィスが、前処理容器の遠心分離中に上清と緩衝用液体との液体界面に収集される微生物細胞の撹乱を回避するように配置される、(100)〜(102)のいずれか一に記載の装置。
(104)処理ハードウェアをさらに含み、処理ハードウェアは:
前処理容器を撹拌するように設計されており、ここで前処理容器は、全血サンプル及び前処理混合物を含み、前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含み、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集され、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、及び
実質的な部分の緩衝用液体を抽出することなく、吸引管を介して懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物が取得されるように、前記ポンプ機構を制御するように設計されている、(100)〜(103)のいずれか一に記載の装置。
(105)前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させる前に、前記処理ハードウェアが、さらに、
前記分配管を介して、所定体積の洗浄緩衝液を前処理容器に添加するようにポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌するように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成し、微生物細胞が液体界面に輸送されそこで収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されている
ことによって一連の洗浄ステップが実施される、(104)に記載の装置。
(106)前記処理ハードウェアが、洗浄ステップを追加で1回以上実施するようにさらに設計されている、(105)に記載の方法。
(107)処理ハードウェアをさらに含み、処理ハードウェアは:
前処理容器を撹拌するように設計されており、ここで前処理容器は、全血サンプル及び前処理混合物を含み、前処理混合物は血球溶解試薬を含み、
前記全血サンプル由来の前記微生物細胞を懸濁物から取り出し、前処理容器の遠位表面に隣接して収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を再懸濁するようにモーター又は振動機構を制御するように設計されており、及び
前記吸引管を介して懸濁物の少なくとも一部分を抽出することによって微生物細胞を含む抽出懸濁物が取得されるように、ポンプ機構を制御するように設計されている、(100)〜(103)のいずれか一に記載の装置。
(108)前処理容器の内容物を撹拌して微生物細胞を再懸濁する前に、前記処理ハードウェアがさらに、
前記分配管を介して、所定体積の洗浄緩衝液を前処理容器に添加するように前記ポンプ機構を制御するように設計されており、
前処理容器の内容物を撹拌するように前記モーター又は振動機構を制御するように設計されており、
微生物細胞が前処理容器の遠位表面に輸送されその近傍で収集されるように、前記ローターを回転させ、前処理容器を遠心分離するように前記モーターを制御するように設計されており、及び
収集された微生物細胞を抽出することなく、前記吸引管を介して実質的な量の上清を引き出すように前記ポンプ機構を制御するように設計されている
ことによって一連の洗浄ステップが実施される、(107)に記載の装置。
(109)前記処理ハードウェアが、洗浄ステップを追加で1回以上実施するようにさらに設計されている、(108)に記載の装置。
(110)前記ローターが、1つ以上の追加の前処理容器を支持するように設計されており、前記装置は、追加の前処理容器ごとに:
前記回転ユニオンの前記回転部分から追加の前処理容器上に提供されるキャップを介して追加の前処理容器中に延びる追加の吸引管であり、ここで前記追加の吸引管は、追加の前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位吸引オリフィスを有する、追加の吸引管、
前記回転ユニオンの前記回転部分から前記キャップを介して追加の前処理容器中に延びる追加の分配管であり、ここで前記追加の分配管は、追加の前処理容器の遠位表面近傍に配置された遠位分配オリフィスを有する、追加の分配管、
をさらに含み、
ここで前記回転ユニオンの回転部分は、前記ローターの回転中に、各吸引管を前記固定出口管と流体連絡させるように設計され、各分配管を前記固定入口管と流体連絡させるように設計されたマニホルドを含む、(100)〜(109)のいずれか一に記載の装置。
(111)全血サンプルから微生物細胞を抽出する方法であって、該方法は:
全血サンプルを前処理容器に添加するステップであり、ここで前処理容器は前処理混合物を含み、該前処理混合物は、血球溶解試薬と、全血サンプル及び血球溶解試薬の密度よりも高い密度を有する疎水性緩衝用液体とを含む、ステップ、
前処理容器の内容物を撹拌するステップ、
緩衝用液体が上清の下に液体界面を形成するように前処理容器を遠心分離するステップであり、ここで全血サンプル由来の微生物細胞が懸濁物から取り出されて液体界面に隣接して収集される、ステップ、
収集された微生物細胞を取り出すことなく、実質的な量の上清を引き出すステップ、
前処理容器の内容物を撹拌し、微生物細胞を含む懸濁物の下に緩衝用液体によって液体界面を再度確立させるステップ、及び
懸濁物及び緩衝用液体を抽出するステップ、及び
懸濁物を緩衝用液体から外的に分離することによって、微生物細胞を含む抽出懸濁物を取得するステップ
を含む、方法。
(112)懸濁物及び緩衝用液体の抽出、並びに外的分離が:
吸引容器を使用して懸濁物及び緩衝用液体を吸引するステップ、
緩衝用液体を、吸引容器の下部オリフィスに隣接して沈降させるステップ、並びに
吸引容器から緩衝用液体を分配するステップ
によって実施される、(111)に記載の方法。
(113)吸引容器がピペットチップである、(112)に記載の方法。
Claims (15)
- 血球含有サンプルから微生物細胞を分離する方法であって、
前記サンプルと、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及びポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルを含むアルカリ性血液溶解試薬とを混合し、5〜10 mg/mlの濃度のポリアネトールスルホン酸ナトリウム、0.05〜2.5%の濃度のポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル及び9〜11のpHを有する混合物を得るステップと、
前記混合物から微生物細胞を分離するステップと、
を含む、前記方法。 - ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルを、およそ0.5〜1.5%の範囲の量で提供する、請求項1記載の方法。
- 血球溶解試薬が消泡剤をさらに含む、請求項1又は2記載の方法。
- 消泡剤がポリ(プロピレングリコール)である、請求項3記載の方法。
- 微生物細胞を、遠心分離により分離する、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記分離を、緩衝用液体の不在下で行う、請求項5記載の方法。
- 微生物細胞を、濾過により分離する、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 分離した微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップと、
少なくとも1つのアッセイを実施して、前記溶解物中に存在し得る少なくとも1つの分析物を検出するステップと、
をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。 - 微生物細胞を、自動化機器を用いて分離する、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 血球含有サンプルから微生物細胞を分離する方法であって、
前記サンプルと、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び非イオン性界面活性剤を含むアルカリ性血液溶解試薬とを混合し、5〜10 mg/mlの濃度のポリアネトールスルホン酸ナトリウム、0.05〜2.5%の濃度の非イオン性界面活性剤及び9〜11のpHを有する混合物を得るステップと、
前記混合物から微生物細胞を分離するステップと、
を含む、前記方法。 - 微生物細胞を、遠心分離により分離する、請求項10記載の方法。
- 前記分離を、緩衝用液体の不在下で行う、請求項11記載の方法。
- 微生物細胞を、濾過により分離する、請求項10記載の方法。
- 分離した微生物細胞を溶解させて、溶解物を取得するステップと、
少なくとも1つのアッセイを実施して、前記溶解物中に存在し得る少なくとも1つの分析物を検出するステップと、
をさらに含む、請求項10〜13のいずれか1項記載の方法。 - 微生物細胞を、自動化機器を用いて分離する、請求項10〜14のいずれか1項記載の方法。
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