CN112779176B - 分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管 - Google Patents

分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管，涉及生物检测技术领域。分离试剂包括第一组分和第二组分，以重量份计，所述第一组分包括10‑30份凝胶；所述第二组分包括2×10‑3‑2.0份溶血剂、(0.01‑0.5)×10‑3份离心梯度调节剂以及缓冲剂，且所述缓冲剂的用量使得所述第二组分的pH为7.2‑7.6。该分离试剂能够良好对增菌血培养后的培养液进行处理，使得细菌和血培养后的培养物中的培养基、血细胞以及活性炭等物质进行分离，快速分离得到纯净的高浓度的细菌，在增菌血培养后可直接进行细菌检测，提升了检测速度，同时，减少了培养基、血细胞以及活性炭等物质对细菌检测的影响。

Description

分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管。
背景技术
血培养是确定病原菌的一种人工培养法。用于菌血症、真菌血症、败血症及脓毒败血症的病因学诊断。特别是，脑膜炎脓毒症胸腔与腹腔等无菌部位感染均属于危重症感染，传统诊断方式为：血培养增菌后再在传代固体培养基，经过次代培养1-2天后再进行定向鉴定，随后进行系统鉴定和药敏试验，往往需要3-4天的时间才能完成检验，出具报告。而99％以上的阳性血培养均为单一细菌，次代培养分离纯化作用不大，而仍需要次代培养是为了增加细菌数量，保证细菌的检测结果准确。同时，血液增菌培养后的培养物中存在含有残留抗生素的培养基、血细胞，特别是活性炭培养瓶中的活性炭影响细菌后续检测，而进行次代培养，通过划线逐级减少残留抗生素，减少血细胞和活性炭，形成单一菌落，保证后续试验的顺利推进。
同时，在重症感染中，每延迟一小时将会增加5-10％的死亡率，故而早期诊断，尽早使用有效的抗生素可以极大程度的挽救生命。在传统血培养诊断过程中，血培养仪增菌培养报阳后传代固体培养基次代培养的24小时几乎很难跨越，这会将使重症患者的死亡风险提升1.2倍。
特别是利用活性炭瓶进行血培养后，其中的活性炭会干扰革兰氏阴性菌和阳性菌的染色镜检，若采用美兰染色进行染色镜检，虽然可以区分活性炭和染色，但是无法鉴定革兰氏阳性菌和阴性菌，也不利于检测。且含有活性炭的血培养液，根本无法进行浊度调节，而药敏试验中，浊度(细菌浓度)是接种效应的直接决定因素，而接种效应又直接影响药敏结果，因而只有去除活性炭才能使直接药敏成为可能。
对于去除活性炭有用的方法主要有离心法与膜过滤法：
首先，离心法最常用的就是差速离心。利用的原理就是液体中不同粒子密度(比重)的不同，从查阅文献我们得知，吸水饱和的粉末状活性炭其密度为1.11-1.35，红细胞为1.09-1.11，粒细胞为1.085-1.095，而淋巴细胞为1.052-1.077，血小板为1.030-1.060，细菌为1.037-1.050，念珠菌密度在1.050-1.095之间。先用500-1000r/min低速去掉大多数的密度大的粗粒活性炭，留下上清液再用1000-1500r/min低速离心去掉更多的细粒活性炭，如此2-3次后，留下上清液采用3000-5000r/min速度将上清液中细菌细胞沉淀下来，从而实现分离。然而这种方法操作繁琐耗时长、且在差速离心中损失的细菌细胞较多，因而收获率较低，目前极少人采用。
其次，膜过滤法在早期的研究中曾被采用，但很快被抛弃，因为活性炭血培养瓶培养基成分复杂，不仅有颗粒大小不同的活性炭，还有破裂的血细胞碎片，以及蛋白胶体，容易堵塞滤膜，也不能够良好的去除活性炭等，也导致细菌检测不准确且耗时长。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供分离试剂、其制备方法、应用、分离细菌的方法和凝胶提取管。该分离试剂能够良好对增菌血培养后的培养液进行处理，使得细菌和血培养后的培养物中的培养基、血细胞以及活性炭等物质进行分离，快速分离得到纯净的高浓度的细菌，在增菌血培养后可直接进行细菌检测，提升了检测速度，同时，减少了培养基、血细胞以及活性炭等物质对细菌检测的影响。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种分离试剂，其包括第一组分和第二组分，以重量份计，所述第一组分包括10-30份凝胶；所述第二组分包括2×10-3-2.0份溶血剂、(0.01-0.5)×10-3份离心梯度调节剂以及缓冲液，且所述缓冲液的用量使得所述第二组分的pH为7.2-7.6。
在可选的实施方式中，每毫升所述第二组分对应添加0.1-0.3克所述第一组分。
在可选的实施方式中，所述第二组分的pH为7.2-7.6，优选为7.4；所述第二组分的比重为1.032-1.037。
在可选的实施方式中，所述凝胶为可网罗活性炭、沉降红细胞碎片以及其他密度较高的成分的凝胶，优选为具有触变性的惰性分离凝胶，优选为疏水惰性高分子凝胶；
优选地，所述凝胶包括有机硅聚合物、烯烃聚合物、树脂、酸-醇聚合物、醇-醛缩合物、卤代烃类化合物中的至少一种；
优选地，烯烃聚合物包括环戊二烯低聚物和聚氧乙烯－聚氧丙烯嵌段共聚物中的至少一种；
优选地，所述树脂包括蒎烯树脂和聚丙烯酸酯树脂中的至少一种；
优选地，所述酸-醇聚合物包括葵二酸与丙二醇的聚合物；
优选地，所述醇-醛缩合物包括山梨糖醇与芳香醛缩合物；
优选地，所述卤代烃类化合物为氯代烃类化合物，进一步优选为氯代烷烃；更优选为氯化十八碳烯；
优选地，所述凝胶的密度为1.042-1.065；
优选地，所述有机硅聚合物包括二亚苄基山梨糖醇与二氧化硅及聚异丁烯形成的共聚物或者二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂聚合形成的聚合物中的至少一种；
更优选地，二氧化硅为经过环硅氧烷、硅氮烷或者二甲基二氯硅烷疏水处理的用于气相色谱柱的超细二氧化硅粉末；
更优选地，硅烷偶联剂包括乙烯基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
在可选的实施方式中，所述，所述溶血剂包括均具有溶血作用的酶类物质、脂类化合物以及表面活性剂中的至少一种；
优选地，具有溶血作用的所述酶类物质包括磷脂酶C和蛇毒溶血酶中的至少一种；
优选地，具有溶血作用的所述脂类化合物包括磷脂质，进一步优选为溶血卵磷脂，更优选为溶血卵磷脂酰胆碱；
优选地，具有溶血作用的所述表面活性剂包括非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂中的任意一种；
优选地，所述非离子表面活性剂包括曲拉通X-100或者皂苷；
优选地，所述阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐类，更优选为十二烷基三甲基氯化铵；
进一步优选地，所述溶血剂为皂苷，最优选，所述皂苷为分子生物级茶皂素。
在可选的实施方式中，所述离心梯度调节剂包括增稠剂和乳化剂中的至少一种；
优选地，所述增稠剂包括多元醇类化合物、纤维素类化合物和烯醇聚合物中的至少一种；
更优选地，所述多元醇类化合物包括甘油，更优选地，所述纤维素类化合物包括羧甲基纤维素；更优选地，所述烯醇聚合物包括聚乙烯醇，最优选为烯醇聚合物1788；
优选地，乳化剂包括油酸酯或者乳化剂Y-30；
更优选地，油酸酯为吐温80；
优选地，所述缓冲液包括缓冲剂和离子调节剂；
优选地，缓冲剂包括生物缓冲剂或tris缓冲剂；
更优选地，所述生物缓冲剂包括PIPES或HEPES；
优选地，离子调节剂包括钠盐和钾盐，优选地，钠盐为氯化钠，钾盐为氯化钾。
第二方面，本发明实施例提供如前述实施方式任一项所述的分离试剂的制备方法，包括：将第一组分和第二组分混合形成所述分离试剂。
优选地，混合包括：将灭菌后的第二组分加入至灭菌后的第一组分上；
优选地，混合之前，包括：分别对所述第一组分和所述第二组分进行灭菌；
优选地，对所述第一组分灭菌包括辐射灭菌或者干热灭菌；
优选地，对所述第二组分灭菌包括高压灭菌或过滤除菌；
优选地，对所述第二组分灭菌前包括：将溶血剂、离心梯度调节剂和缓冲液混合形成所述第二组分；
优选地，对第一组分进行灭菌前包括：将二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂按照质量比为(11-17)：(0.8-3)：(2-5)：(0.2-1)的比例混合后进行交联反应形成有机硅聚合物；
优选地，交联反应的操作步骤为：将二甲基硅油和羟基硅油混合加热至100-120℃后，边搅拌边加入二氧化硅和硅烷偶联剂，而后搅拌8-12小时，反应结束后150-170℃的条件下真空脱泡3-5小时。
第三方面，本发明实施例提供如前述实施方式所述的分离试剂或者前述实施方式所述的制备方法制备得到的分离试剂在血培养后的培养物中细菌的分离中的应用；
优选地，所述血培养为增菌血培养；
优选地，所述血培养为梅里埃活性炭瓶增菌培养。
第四方面，本发明实施例提供一种分离细菌的方法，将前述实施方式所述的分离试剂或者前述实施方式所述的制备方法制备得到的分离试剂与增菌血培养后的培养物进行混合，而后离心并静置分层；
优选地，离心的转速为3000-5000r/min；
优选地，静置分层后收集细菌溶液，细菌溶液的浓度为5×109-5×1011CFU/ml；
优选地，培养物与第二组分的体积比为7:3-9:1。
第四方面，本发明实施例提供一种凝胶提取管，凝胶提取管内含有前述实施方式所述的分离试剂或者前述实施方式所述的制备方法制备得到的分离试剂。
本发明具有以下有益效果：本发明通过溶血剂能够良好的使得血液增菌培养后培养物中的血细胞破裂，同时，利用凝胶、溶血剂、缓冲液和离心梯度调节剂相互作用并控制其用量，使得培养物中的培养基、破裂的血细胞、细菌、活性炭等物质在离心后产生良好的分层，去除上清液培养基而后得到纯净的细菌细胞，可以在血液增菌培养后直接进行涂片、鉴定、药敏或者直接用于质谱分析等检测实验，如此便于简化流程大幅度节省检验时间，降低重症感染病人的死亡率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1提供的检测分层图；
图2为实验例2提供的检测分层图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
首先，现有技术中利用血培养方法确定病原菌，具体方法是：血培养增菌后，进行传代固体培养，虽然现有99％以上的阳性血培养均为单一细菌，次代培养分离纯化作用不大，但是由于血培养增菌后细菌的浓度不高，不能进行良好的检测。且血培养增菌后，培养液中存在粒径极小，不易分离的活性炭，活性炭感染染色镜检和药敏试验。同时，培养液中还含有血细胞、抗生素、蛋白质和抗生素拮抗剂等物质，血细胞有颜色且含大量蛋白质会影响细菌生化反应结果的准确性，而培养基中含有较多的缓冲液和复杂的营养体系，会严重影响生化反应，而其中含有的抗生素拮抗剂/灭火剂以及血液中残留的抗生素也会严重影响药敏试验结果。
同时，这些杂质含量较高会影响细菌的生理生化特征的表达，继而影响细菌的检测。而进行次代培养，通过划线接种可以逐级降低上述杂质的含量，降低杂质对细菌检测的影响，但是进行次代培养增加了细菌检测的时间，不利于患者的救治。
发明人通过付出创造性劳动后，发现利用凝胶、溶血剂、离心梯度调节剂和缓冲液合用能够快速且直接分离活性炭、血细胞、培养基和细菌，直接得到高浓度的纯净的细菌，经过提纯后的约0.2ml细菌细胞浓缩悬液，细菌浓度为5×109-5×1011CFU/ml，可以直接用于检测，节约了鉴定时间。同时，直接分离去除活性炭、血细胞和培养基等杂质，减少上述杂质对细菌生理生化性能的影响，保证细菌检测结果的准确性。
具体地，本发明实施例提供一种分离试剂，其包括第一组分和第二组分，以重量份计，所述第一组分包括10-30份凝胶；所述第二组分包括2×10-3-2.0份溶血剂、(0.01-0.5)×10-3份离心梯度调节剂以及缓冲液，且所述缓冲液的用量使得所述第二组分的pH为7.2-7.6。
其中，凝胶能够网罗活性炭、沉降红细胞碎片以及其他密度较高的成分，有利于活性炭等与细菌分离。而溶血剂能够溶解血细胞、白细胞、血小板等细胞成分，减少对细菌细胞分离的干扰，消除红细胞对检测影响。但是采用的溶血剂可能存在一定的毒性，使得细菌的生理生化性能发生改变或者影响细菌的生长，而加入缓冲液能够减轻溶血剂的副作用，同时，凝胶和缓冲液能够形成亲水/疏水层，有利于细菌的分离。缓冲液还能够调节第二组分的pH，也就是保证分离试剂的pH适宜。同时，离心梯度调节剂可以调节分离试剂的粘度和密度，使得细胞碎片、低粒度活性炭微粒等杂质能够有效沉降分离，有利于分离得到纯净且浓度高的细菌细胞，同时，离心梯度调节剂可以与溶血剂等共同作用，进行良好的溶血。在本发明实施例中第一组分和第二组分互不相溶，理化性质互不影响，只要保证在使用时二者共存于同一试管中即可。
通过上述几种物质，并控制其用量，能够有效使得血液增菌培养后的细菌和活性炭、血细胞、白细胞、蛋白质、抗生素等培养物成分进行良好的分离，得到纯净的细菌，使得血液增菌培养后便可直接进行细菌检测，不用再进行次代培养，进一步缩短了细菌检验时间，降低患者死亡率。
进一步地，所述第二组分的pH为7.2-7.6，优选为7.4，第二组分的比重1.032-1.037，最好为1.035；控制第二组分的pH以及比重，能够保证第二组分与血培养增菌后的培养物充分作用，保证了分离效果。
进一步地，每毫升所述第二组分对应添加0.1-0.3克所述第一组分；采用上述比例，能够进一步保证第一组分和第二组分能够良好的分离活性炭等杂质，保证得到的细胞的纯净度。
进一步地，凝胶为可网罗活性炭、沉降红细胞碎片以及其他密度较高的成分的凝胶，优选为具有触变性的惰性分离凝胶，优选为疏水惰性高分子凝胶；
优选地，所述凝胶包括有机硅聚合物、烯烃聚合物、树脂、酸-醇聚合物、醇-醛缩合物和卤代烃类化合物中的至少一种；
优选地，烯烃聚合物包括环戊二烯低聚物和聚氧乙烯－聚氧丙烯嵌段共聚物中的至少一种；
优选地，所述树脂包括蒎烯树脂和聚丙烯酸酯树脂中的至少一种；
优选地，所述酸-醇聚合物包括葵二酸与丙二醇的聚合物；
优选地，所述醇-醛缩合物包括山梨糖醇与芳香醛缩合物；
优选地，所述卤代烃类化合物为氯代烃类化合物，进一步优选为氯代烷烃；更优选为氯化十八碳烯。
优选地，有机硅聚合物包括二亚苄基山梨糖醇与二氧化硅及聚异丁烯形成的共聚物或者二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂聚合形成的聚合物中的至少一种；
优选地，所述有机硅聚合物的密度为1.042-1.065；
更优选地，二氧化硅为经过环硅氧烷、硅氮烷或者二甲基二氯硅烷疏水处理的用于气相色谱柱的超细二氧化硅粉末；
更优选地，硅烷偶联剂包括乙烯基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
采用上述凝胶更有利于活性炭、红细胞碎片以及其他密度较高与细菌的分离，特别是，凝胶的密度为1.042-1.065，特别是有机硅的密度为1.042-1.065；更优选为1.045-1.050；控制凝胶的密度有利于红细胞、白细胞、活性炭和细菌的分离，若凝胶密度过大则容易导致分离效果差。
进一步地，所述溶血剂包括均具有溶血作用的酶类物质、脂类化合物以及表面活性剂中的至少一种；
优选地，具有溶血作用的所述酶类物质包括磷脂酶C和蛇毒溶血酶中的至少一种；
优选地，具有溶血作用的所述脂类化合物包括磷脂质，进一步优选为溶血卵磷脂，进一步优选为溶血卵磷脂酰胆碱；
优选地，具有溶血作用的所述表面活性剂包括非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂中的任意一种；
优选地，所述非离子表面活性剂包括曲拉通X-100或者皂苷；
优选地，所述阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐类，更优选为十二烷基三甲基氯化铵；
进一步优选地，所述溶血剂为皂苷，最优选，所述皂苷为分子生物级茶皂素。
采用上述溶血剂能够良好的溶解红细胞、白细胞、血小板等细胞成分，同时，保证溶血剂不会对细菌造成影响，对细菌造成影响的溶血剂则不能采用，例如，氰化钠、十二烷基硫酸钠以及冰醋酸等对细菌有害或者会杀死细菌，则不能采用。在上述物质中溶血卵磷脂、磷脂酶C、溶血卵磷脂酰胆碱、蛇毒溶血酶、皂苷为优选方案，其不仅仅进行良好的溶血，同时毒性相对较低。最好选择皂苷，其溶解性良好，热稳定性良好，且造价低廉。
进一步地，优选地，所述缓冲液包括缓冲剂和离子调节剂；
优选地，缓冲剂包括生物缓冲剂或tris缓冲剂；
更优选地，所述生物缓冲剂包括PIPES或HEPES；
优选地，离子调节剂包括钠盐和钾盐，优选地，钠盐为氯化钠，钾盐为氯化钾
最优选，缓冲液使用的是0.025M tris/tris-HCl缓冲液，其中含8％NaCl及0.2％KCl，密度1.035。
发明人发现单纯采用缓冲剂并不能良好的进行分层，而使用了钠盐和钾盐后能够保证分离效果，且对细菌不会造成影响。并且并不是任意的缓冲液均可，采用磷酸盐缓冲液时，在制备过程中产生沉淀，同时溶血效果降低，分离得到的细菌数量不足，不能满足细菌鉴定。
采用的上述溶血剂具有一定毒性，采用缓冲液能够降低毒性，同时，缓冲液可以和凝胶形成亲水/疏水层，有利于细菌细胞层的分离，特别是tris缓冲剂不仅具有上述优点，其中的氯化钠和氯化钾调节离子强度的作用。
进一步地，离心梯度调节剂包括增稠剂和乳化剂中的至少一种；
优选地，所述增稠剂包括多元醇类化合物、纤维素类化合物和烯醇聚合物中的至少一种；
更优选地，所述多元醇类化合物包括甘油，更优选地，所述纤维素类化合物包括羧甲基纤维素；更优选地，所述烯醇聚合物包括聚乙烯醇，最优选为烯醇聚合物1788；
优选地，乳化剂包括油酸酯或者乳化剂Y-30；乳化剂Y-30是含有30％活性硅的水性乳液，是一种非离子型乳化剂。
更优选地，油酸酯为吐温80。若分离试剂的粘度过低，液体中相对离心力差异较小的颗粒会同时沉淀难以分离，过于粘稠又会导致离心分离困难，使血细胞碎片和低粒度活性炭微粒与细菌细胞长时间悬浮于液体中难以分离。而采用上述离心梯度调节剂能够有效调节分离试剂的粘度，保证离心分离效果，继而保证分离试剂与增菌血培养后的培养物作用后，能够分离得到纯净的细菌。
本发明的分离试剂适用于脓毒症、菌血症、骨髓炎、心包炎等血液系统感染性疾病诊断范畴，用于血液/骨髓/心包液等标本增菌培养后细菌细胞的分离纯化，尤其适合于梅里埃活性炭血培养瓶报阳以后血培养液的细菌分离。经过该耗材凝胶提取后的纯化细菌可直接应用于涂片、鉴定、药敏、质谱分析。
本发明实施例还提供一种上述分离试剂的制备方法，包括：
本发明实施例采用的凝胶为自制凝胶，凝胶的合成包括：将二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂按照质量比为(11-17)：(0.8-3)：(2-5)：(0.2-1)的比例混合后进行交联反应形成有机硅聚合物；
优选地，交联反应的操作步骤为：将二甲基硅油和羟基硅油混合加热至100-120℃后，边搅拌边加入二氧化硅和硅烷偶联剂，而后搅拌8-12小时，反应结束后150-170℃的条件下真空脱泡3-5小时。采用上述方法能够保证制备得到的凝胶的密度，保证凝胶的分离效果。
需要说明的是，凝胶也可以购买市面上的凝胶，例如武汉德晟生化科技有限公司，商品名称“抗辐射有机硅血清分离胶”。
而后对凝胶进行灭菌，灭菌包括辐射灭菌或者干热灭菌。
制备第二组分包括：将溶血剂、离心梯度调节剂和缓冲液混合形成所述第二组分，而后进行灭菌，第二组分的灭菌包括高压灭菌或过滤除菌。
上述灭菌采用的具体灭菌方法为现有技术公知的操作和条件，本发明实施例不再进行详述。
而后将第一组分和第二组分混合，具体地，是将第二组分添加加到灭菌后的第一组分上，使得第二组分位于第一组分上方。
本发明实施例还提供一种分离细菌的方法，将上述分离试剂或者制备方法制备得到的分离试剂与增菌血培养后的培养物进行混合，而后离心并静置分层，分离试剂充分与培养物作用，而后离心静置时，培养物中的细菌、红细胞碎片、血培养液、活性炭等进行良好的分层，可以直接得到纯净的细菌。
且静置分层后收集细菌溶液，细菌溶液的浓度为5×109-5×1011CFU/ml，该浓度的细菌浓度可以直接用于检测，且该细菌溶液中不含有活性炭、血细胞、抗生素等杂质，保证细菌检测结果的准确性。
进一步地，培养物与第二组分的体积比为7:3-9:1。采用上述体积比，能够保证分离试剂能够良好地对培养物中的细菌进行分离，进一步保证了后续的检测结果。
本发明实施例还提供一种凝胶提取管，凝胶提取管含有前述实施方式所述的分离试剂或者前述实施方式所述的制备方法制备得到的分离试剂。该凝胶提取管能够良好地分离得到纯净的细菌。
本发明实施例还提供一种前述实施方式所述的分离试剂或者前述实施方式所述的制备方法制备得到的分离试剂在血培养后的培养物中细菌的分离中的应用；
优选地，所述血培养为增菌血培养；
优选地，所述血培养为梅里埃活性炭瓶增菌培养。
该分离试剂能够直接对增菌血培养后的培养物进行分离，得到纯净可直接用于检测的细菌，不用再进行次代培养，缩短了细菌鉴定的时间，同时，该分离试剂能够良好的使得细菌与活性炭、血细胞、抗生素等杂质分离，避免上述杂质对细菌检测的影响，保证检测的准确性。
实施例1-实施例3
以制备100支提取管的重量份计，每支1ml。
实施例1-实施例3的分离试剂中第二组分的配比如下：
Figure BDA0002262041810000101
需要说明的是，表格中没有额外写明单位的数值，其单位为g。
实施例1-实施例3的分离试剂中第一组分均为有机硅聚合物，实施例1-实施例3的分离试剂中第一组分和第二组分的配比如下：
Figure BDA0002262041810000111
实施例1-实施例3的分离试剂中第一组分的有机硅聚合物的原料配比如下：
Figure BDA0002262041810000112
实施例1-实施例6的分离试剂的制备方法相同，包括：
第二组分的制备方法：
将溶血剂、缓冲液和离心梯度调节混合，而后进行灭菌，而后进行的是高压灭菌。
第一组分的制备方法：
将二甲硅油、羟基硅油倒入不锈钢锅内，加热到100-120℃，一边搅拌一边逐渐加入二氧化硅、硅烷偶联剂，持续搅拌8-12小时，150-170℃真空脱泡3-5小时形成有机硅聚合物。而后有机硅聚合物在150℃条件下进行干热灭菌。
需要说明的是，虽然每个例子第一组分的合成方法操作条件有稍微的区别，但是都在上述范围内，且均可以合成得到所需的凝胶材料。
而后将第二组分加入到第一组分上。
实施例1-3还提供一种凝胶提取管，其包括对应实施例的分离试剂。
实施例4：第一组分为武汉德晟生化科技有限公司商品名称为“抗辐射有机硅血清分离胶”的凝胶10克，密度为1.042。
第二组分包括2毫克磷脂酶C(产气荚膜梭菌来源磷脂酶C，CAS:9001-86-9)、0.01×10-3克吐温80以及0.6％PIPES缓冲剂，离子调节剂与实施例1相同，第二组分总量为100毫升，且其pH为7.2。每毫升所述第二组分对应添加0.1克所述第一组分。
实施例4的分离试剂的制备方法，与实施例1的分离试剂的制备方法基本相同。
实施例5：第一组分为环戊二烯低聚物30克，密度为1.065。
第二组分包括0.2克溶血卵磷脂酰胆碱、0.5×10-3克烯醇聚合物1788以及0.025Mtris缓冲剂，离子调节剂与实施例1相同，第二组分总量为100毫升，且其pH为7.6。每毫升所述第二组分对应添加0.3克所述第一组分。
实施例6：第一组分为葵二酸与丙二醇的聚合物15克，密度为1.050。
第二组分包括0.03克十二烷基三甲基氯化铵、0.1×10-3克羧甲基纤维素以及0.025M tris缓冲剂，离子调节剂与实施例1相同，第二组分总量为100毫升，且其pH为7.3。每毫升所述第二组分对应添加0.15克所述第一组分。
供试品：实施例1-3的分离试剂以及对比例1-3的分离试剂
对比例1-3的分离试剂与实施例1的分离组分的区别在于，第二组分的组成不同，具体地，对比例1-3的第二组分的配比如下：
Figure BDA0002262041810000121
实验例1
测定实施例1-3和对比例1-3的分离试剂溶血效果
具体操作方法：
(1)人血2ml+血培养液8ml，混匀后取9ml加入到含1ml供试品的试管内；
需要说明的：供试品1ml意为：供试品为对比例1-3时，量取对比例的第二组分1ml，第一组分0.2克，而供试品为实施例1-3的分离试剂时：量取实施例的第二组分1ml，第一组分0.2克；
(2)将上述混合液颠倒混匀，放置15min；观察溶血效果，记录结果；
(3)3000r/min离心5min后，观察试管底部有无红细胞沉淀；
(4)再利用高倍显微镜观察沉淀物中是否有红细胞。
(5)按照下述标准评价溶血效果。
评价标准：(a)肉眼观测时：静置15分钟内，液体由红色变为棕色，且液体透明；离心后，上层液体完全透明，颜色为棕色，无沉淀；显微镜观察时，无红细胞，则溶血效果为优；
(b)肉眼观测时：静置15分钟内，液体由红色变棕色，溶液轻微浑浊；离心后，上层液体完全透明，颜色为棕色，红色沉淀高度低于3毫米；显微镜高倍镜观察时，红细胞个数小于10个，则溶血效果为良好
(c)肉眼观测时：静置15分钟后，液体颜色为红色，液体浑浊；离心后上层液体为红色，沉淀高大于3毫米；显微镜高倍镜观察时，红细胞个数超过10个，则溶血效果为差。
具体检测结果参见表1。
表1溶血效果
Figure BDA0002262041810000131
根据表1可知，不采用缓冲剂或者更改缓冲剂类型均会导致溶血效果变差，继而导致后续细菌与红细胞等物质不能彻底分离，使得离心后的细菌收获率不足不能直接用于鉴定。
实验例2
测定实施例1-3的分离试剂对细菌的抑制效果
具体操作方法：
对照组操作：直接取对应的细菌接种到平板培养基上，并在35℃，5％CO2环境培养24小时，而后观察其细菌的菌落的情况。
实施例1-3和对比例1-3的操作：人血2ml+血培养液8ml，混匀后取9ml加入到含1ml供试品的试管内，颠倒混匀后备用；
取24小时内流感嗜血杆菌配制0.2McF，脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌配制0.5McF浊度，稀释100倍，吸取0.1ml加入到已经加入培养基的试管中，颠倒混匀，取10μl接种到适当的固体培养基上，35℃，5％CO2环境培养24小时观察细菌的菌落的情况，与对照组的细菌的菌落情况进行对比，若二者对比基本无差异则不存在对细菌的抑制。结果参见表2。
表2
Figure BDA0002262041810000141
根据表2可知，本发明提供的分离试剂不会对细菌的生长造成抑制，可以用于细菌鉴定。
实验例3
测定实施例3的分离试剂对细菌生长的影响程度
采用实验例3模拟真实血培养下观察细菌生长特性，标准操作方法为下列10种标准菌株，接种浓度为10-1000CFU/瓶，无菌羊血5ml/瓶；血培养仪报阳后，卸下瓶子，空针抽吸培养液9ml到提取管中，颠倒混匀，放置15min，3000r/min离心5min，去掉上清液，留下沉淀，加入10ml无菌盐水，颠倒混匀后，再次3000r/min离心5min，挑取沉淀一环，分区划线接种适当的固体培养基，35℃培养24小时观察结果，并记录；与直接划线接种的菌落比较，区别在于：针对的细菌包括ATCC25922大肠埃希菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC49247流感嗜血杆菌、ATCC8750粪产碱杆菌、ATCC19615化脓链球菌、ATCC13090脑膜炎奈瑟氏、ATCC13124产气荚膜梭菌以及ATCC18804白色念珠菌。
最终检测结果为：
ATCC25922大肠埃希菌：生长良好，菌落扁平湿润，不溶血；
ATCC25923金黄色葡萄球菌：生长良好，色素明显，菌落整齐凸起，β溶血；
ATCC27853铜绿假单胞菌：生长良好，色素明显，菌落粗糙蜡状，β溶血；
ATCC29212粪肠球菌：生长良好，菌落微凸，α溶血；
ATCC49247流感嗜血杆菌：生长良好，菌落典型，银灰色湿润，臭味明显；
ATCC8750粪产碱杆菌：生长良好，菌落灰白，弥漫生长；
ATCC19615化脓链球菌：生长良好，菌落饱满湿润，β溶血；
ATCC13090脑膜炎奈瑟氏：生长良好，菌落银灰色水滴状，不溶血；
ATCC13124产气荚膜梭菌：生长良好，菌落无色，弥散生长，边缘不整齐，双溶血环；
ATCC18804白色念珠菌：生长良好，乳白色，有明显酵味；
与直接划线接种菌落比较形态、溶血、气味等特征完全一致。
说明本发明实施例的分离试剂对细菌生长特性基本不会造成影响，细菌均能生长良好。
实验例4
测定实施例3的分离试剂对鉴定药敏的影响
对照品操作方法：
1)选取ATCC29522大肠埃希菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC49247流感嗜血杆菌、ATCC8750粪产碱杆菌、ATCC19615化脓链球菌、ATCC13090脑膜炎奈瑟氏、ATCC13124产气荚膜梭菌以及ATCC18804白色念珠菌的标准菌株复苏到适当固体培养基上，按照血培养行业规范质检操作流程，制备菌悬液、加入羊血、并放到血培养仪中培养，报阳后马上取出培养基备用，不应延迟取瓶；
2)将阳性血培养液传代适当的固体培养基，按照标准流程做鉴定药敏；
3)按照上述步骤进行直接提取，将提取后的细菌，配制到相应鉴定药敏系统所需的浊度后，直接进行鉴定药敏；
实施例3的分离试剂的检测方法：参照实验例3的方法对细菌进行培养，而后将细菌直接进行鉴定药敏
比较各菌株所有生化试验项目与药敏试验项目之间的差异；
具体结果如下：
ATCC29522：采用上述两种方法做测试，生化与药敏结果无差异，药敏结果均在标准范围内。ATCC27853：两种方法做测试，生化结果无差异，药敏结果有CTX、TIM、CPS、MZ有一个梯度差的差异，结果均在标准范围内。ATCC29213、ATCC29212以及ATCC49619：两种方法做测试，生化与药敏结果无差异，药敏结果均在标准范围内。ATCC49247：两种方法做测试，生化结果无差异，药敏结果TET、AMC有一个梯度差，结果均在标准范围内。ATCC35218：两种方法做测试，生化结果无差异，药敏结果仅有AMS有两个梯度差，结果均在标准范围内。ATCC700603：两种方法做测试，生化结果无差异，药敏结果FEP、MRP、CTX/C有一个梯度的差异，FEP有两个梯度的差异，结果均在标准范围内。所有菌株全部在CLSI标准控制范围内。说明利用本发明实施例提供的分离试剂分离得到细菌能够直接进行药敏试验。
实验例5
分取实施例1-3的分离试剂中第一组分0.2克和第二组分1ml，分别加入不同的试管内。而后从医院取梅里埃活性炭做的废弃阳性血培养瓶，空针抽吸培养瓶中的物质混合液体10ml注入到试管内，再次混匀，静止5min后3000r/min离心5min后取出；观察分层情况，并对细菌层进行检测。分层情况相同，参见图1。试管内自下而上分层依次为活性炭←凝胶复合物←细菌细胞层←培养基液体，具体情况如下表：
Figure BDA0002262041810000161
实验例6
取实施例2和3的分离试剂中第一组分0.2克和第二组分1ml，分别加入不同的试管内。而后选择BD荧光树脂血培养瓶，空针抽吸混合培养瓶中的10ml注入到试管内，再次混匀，静止5min后3000r/min离心5min后取出；观察分层情况，并对细菌层进行检测。分层情况相同，参见图2。试管内自下而上分层依次为：红细胞碎片←凝胶复合物←细菌细胞层←培养基液体，具体情况如下表：
Figure BDA0002262041810000162
实验例7
利用实施例3的分离试剂分别与梅里埃活性炭血培养瓶金黄色葡萄球菌、梅里埃活性炭血培养瓶肺炎克雷伯菌、BD血培养树脂瓶屎肠球菌、BD血培养树脂瓶大肠埃希菌以及BD血培养树脂瓶白色念珠菌作用，而后得到细菌，并对细菌进行生化鉴定和药敏试验。需要说明的是，上述血培养均报阳，且操作方法参见实验例4。
利用纯的细菌进行生化鉴定和药敏试验作为对照，操作方法参见实验例6。
结果如下：
梅里埃活性炭血培养瓶金黄色葡萄球菌：生化反应完全一致，药敏试验，所有药物MIC值在±1梯度范围内；
梅里埃活性炭血培养瓶肺炎克雷伯菌：生化反应完全一致，药敏试验，所有药物MIC值在±1梯度范围内；
BD血培养树脂瓶屎肠球菌：生化反应完全一致，药敏试验，所有药物MIC值在±1梯度范围内；
BD血培养树脂瓶大肠埃希菌：生化反应完全一致，药敏试验，所有药物MIC值在±1梯度范围内；
BD血培养树脂瓶白色念珠菌：生化反应完全一致，药敏试验，所有药物MIC值在±1梯度范围内。
综上所述，本发明提供一种分离试剂，其可以在血培养增菌试验后，直接对血培养的培养物进行分离，使得血培养的培养物中的红细胞、白细胞、抗生素、抗生素拮抗以及活性炭等与细菌进行良好的分层，继而实现分离，得到纯净的高浓度的细菌，继而可以直接检测细菌，缩短了血培养细菌鉴定的时间和流程，降低患者死亡概率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种分离试剂，其特征在于，其包括第一组分和第二组分，所述第一组分为凝胶，所述凝胶为由二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂按照质量比为（13-14）：（2~2.4）：（3-4）：（0.6-1）的比例混合后进行交联反应形成的有机硅聚合物；
所述第二组分含有2.6-3g/mL皂苷、0.1mg/mL除泡乳化剂Y-30以及缓冲液，所述缓冲液含有tris和/或tris-HCl缓冲液以及离子调节剂，所述缓冲液的用量使得所述第二组分的pH为7.2-7.6，所述离子调节剂包括钠盐和钾盐；
每毫升所述第二组分对应添加0.1-0.3克所述第一组分。
2.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，所述第二组分的比重为1.032-1.037。
3.根据权利要求1或2所述的分离试剂，其特征在于，所述凝胶的密度为1.043-1.051。
4.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，二氧化硅为经过环硅氧烷、硅氮烷或者二甲基二氯硅烷疏水处理的用于气相色谱柱的超细二氧化硅粉末。
5.根据权利要求4所述的分离试剂，其特征在于，硅烷偶联剂包括乙烯基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
6.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，所述第二组分还含有0.2g/mL溶血卵磷脂。
7.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，所述皂苷为分子生物级茶皂素。
8.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，钠盐为氯化钠，钾盐为氯化钾。
9.根据权利要求1所述的分离试剂，其特征在于，所述缓冲液为0.025M的 tris和/或tris-HCl缓冲液，其中含8wt%NaCl及0.2wt%KCl，密度为1.035。
10.如权利要求1-9任一项所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，包括：将第一组分和第二组分混合形成所述分离试剂。
11.根据权利要求10所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，混合包括：将灭菌后的第二组分加到灭菌后的第一组分上。
12.根据权利要求11所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，混合之前，包括：分别对所述第一组分和所述第二组分进行灭菌。
13.根据权利要求12所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，对所述第一组分灭菌包括辐射灭菌或者干热灭菌；对所述第二组分灭菌包括高压灭菌或过滤除菌。
14.根据权利要求13所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，对所述第二组分灭菌前包括：将皂素、除泡乳化剂Y-30以及缓冲液混合形成所述第二组分。
15.根据权利要求13所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，对第一组分进行灭菌前包括：将二甲基硅油、羟基硅油、二氧化硅和硅烷偶联剂按照质量比为比（13-14）：（2~2.4）：（3-4）：（0.6-1）混合后进行交联反应形成有机硅聚合物。
16.根据权利要求14所述的分离试剂的制备方法，其特征在于，交联反应的操作步骤为：将二甲基硅油和羟基硅油混合加热至100-120℃后，边搅拌边加入二氧化硅和硅烷偶联剂，而后搅拌8-12小时，反应结束后150-170℃的条件下真空脱泡3-5小时。
17.一种凝胶提取管，其特征在于，凝胶提取管内含有权利要求1-9任一项所述的分离试剂或者权利要求10~16任一项所述的制备方法制备得到的分离试剂。
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