CN107629960A - 从阳性血分离细菌的试剂和方法及细菌鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从阳性血中分离细菌的试剂，包括用于溶解来自血液培养物的血液样品中的血细胞的A剂，还包括用作清洗剂的B剂和用于破碎病原菌细胞壁、促进细胞中的蛋白释放的C剂；所述A剂为皂素溶液和SDS中至少一种或其它能裂解血细胞的表面活性剂。本发明还提供从阳性血中分离细菌的方法及细菌鉴定方法，先用A剂裂解血细胞，然后B剂洗去细胞碎片和杂质，最后C剂破碎病原菌细胞壁，让细菌的蛋白质释放出来并取含有细菌蛋白质的上清液坐位后续鉴定的样品；将用于鉴定的样品点样到靶板的空位上，室温干燥后覆盖基质于样品上，室温干燥，然后上机检测。可实现快速鉴定细菌，半小时内即可结果，且检测结果可靠性高，干扰小。
Description
技术领域
本发明属于血液中细菌分离及鉴定领域，具体地，本发明提供从阳性血中分离细菌的试剂和方法及细菌鉴定方法。
背景技术
败血症(septicemia)是指致病菌或条件致病菌侵入血循环，并在血中生长繁殖，产生毒素而发生的急性全身性感染。对于败血症的诊断及治疗，需要将患者的血液进行细菌培养，然后进行细菌鉴定，才能根据鉴定结果给患者给药治疗。
常见的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌或肺炎克雷伯菌等，小儿及免疫功能低下者的致病菌可以是表皮葡萄球菌。
现有的细菌鉴定试剂及方法，通常需要等到第二天，甚至需要等待2-3天才能得到鉴定结果，然后才能进行后续的质谱鉴定及给病人给药等。鉴定所需时间长，病人得到治疗的时间延长，可能耽误治疗，医院工作效率有待提高。
公布号为CN102471798A的中国发明专利申请文件公开了主要涉及利用对来自血流感染(败血症)的血培养物中病原体的质谱鉴定。提供了一种方法，先用表面活性剂(SDS)溶解血液中的血细胞，然后离心或沉淀微生物，最后利用飞行之间质谱仪进行检测。溶解血细胞后，还可清洗、离心，然后离心或沉淀微生物。进一步指出，可用含有甲酸或三氟乙酸和乙腈的溶液分解微生物。用所述方法可以微生物病原体和人体血细胞分离，且通过对微生物的蛋白质谱的质谱测量直接进行鉴定。可实现快速鉴定。
但是，以上现有技术中，血液中细菌鉴定准确率有待进一步提高。
发明内容
为了克服以上现有技术中血液中细菌的鉴定的准确率有待进一步提高的问题，本发明提供从阳性血(含有细菌的血液)中分离细菌的试剂和血液中分离细菌的方法及细菌鉴定方法，细菌鉴定准确率高。
第一方面，本发明提供从阳性血中分离细菌的试剂，包括用于溶解来自血液培养物的血液样品中的血细胞(如红细胞、白细胞和血小板)的A剂，还包括用作清洗剂的B剂和用于破碎病原菌细胞壁，或，和促进细胞中的蛋白释放的C剂；所述A剂为皂素溶液和SDS中至少一种或其它可以裂解血细胞的表面活性剂。
优选的是，按与血液样品的体积比，A剂为5％以上，和/或，C剂为5％以上。
上述任一方案优选的是，按与血液样品的体积比，A剂为20％以上，和/或，C剂为20％以上。
上述任一方案优选的是，按与血液样品的体积比，A剂为30％以上，和/或，C剂为30％以上。
上述任一方案优选的是，按与血液样品的体积比，A剂为40％以上，和/或，C剂为40％以上。
上述任一方案优选的是，所述皂素溶液的浓度为1％以上。
上述任一方案优选的是，所述皂素溶液的浓度为5％以上。
上述任一方案优选的是，所述皂素为茶皂素、黄姜皂素、薯蓣皂素中至少一种。
上述任一方案优选的是，所述C剂包括甲酸和乙腈。
上述任一方案优选的是，所述甲酸和乙腈的用量相同。
上述任一方案优选的是，所述甲酸浓度为30％以上。
上述任一方案优选的是，所述乙腈的浓度99.8％。
上述任一方案优选的是，将所述试剂做成试剂盒。
上述任一方案优选的是，所述试剂还包括D剂，所述D剂为80-100％的甲酸。
上述任一方案优选的是，所述B剂为去离子水。
第二方面，采用第一方面所述的试剂从阳性血中分离细菌的方法，按实施顺序，包括以下步骤：
(1)向阳性血中加A剂混匀，室温静置5min以上；
(2)加入清洗剂B剂，混匀后离心；
(3)取上清液移到一新的离心管中，沉淀细菌,弃上清液；
(4)再次加入清洗剂B剂，洗涤后，取沉淀用于生化鉴定或彻底去除上清液并进行步骤(5)；
(5)加入C剂，机械振荡，短暂离心；
(6)取上清液作为用于质谱鉴定的样品。
优选的是，在步骤(1)之前，制备或获取第一方面所述的试剂。
上述任一方案优选的是，步骤(2)中，离心条件为@100-1000g，1分钟以上。
上述任一方案优选的是，步骤(3)中，沉淀细菌，弃上清液的操作为：@10000-15000g离心1分钟以上沉淀细菌，弃上清液。
上述任一方案优选的是，步骤(4)中，洗涤后，在@10000-20000g离心1分钟以上时间后彻底去除上清液。
上述任一方案优选的是，步骤(5)中，所述短暂离心是在@10000-20000g离心1分钟以上，得上清液。
上述任一方案优选的是，在步骤(5)之后，步骤(6)之前，向步骤(5)中得到的上清液中加入D剂，并再次机械振荡、短暂离心，然后实施步骤(6)：上清液作为用于质谱鉴定的样品。
第三方面，本发明还提供采用上述试剂进行血液中细菌鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)采用第二方面所述的分离方法，制备用于质谱鉴定的样品；
(2)取样品点样到飞行质谱仪的靶板的孔位上，室温干燥；
(3)覆盖基质于样品上，室温干燥；
(4)采用飞行时间质谱仪进行检测，得到图谱数据；或，和
(5)数据分析：对图谱数据进行分析，得出鉴定结果。
上述任一方案优选的是，步骤(6)中，室温干燥后再次加入80-100％甲酸，并再次室温干燥。
上述任一方案优选的是，按体积百分比计，所述基质包括：40-55％乙腈、1-8％三氟乙酸和40-55％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
上述任一方案优选的是，在步骤(3)之后，再次加入80％甲酸，并再次室温干燥1分钟以上，可干燥1-5分钟，然后再进行步骤(4)。
本发明提供的试剂，也可用于从阳性血中分离细菌的试剂。本发明提供的鉴定方法，一方面可实现快速鉴定细菌，半小时内即可得到结果，甚至在15分钟内就可得到鉴定结果，为后续的诊断、给药等提供及时支撑，大大提高了医院工作效率，缩短了病人耗费的时间，治疗及时，病人得到救治及时，可用于非诊断或非治疗目的情况；本发明的分离方法，采用差速离心配合多次清洗，得到的产物用于质谱鉴定或生化鉴定，人类蛋白的干扰小，鉴定准确率高，可达到90％以上，甚至高达95％以上。
具体实施方式
为了更加清楚、正确地理解本发明的发明内容，下面结合具体实施例进一步说明。以下实施例仅用于解释本发明的内容，而不对其内容构成限定。
以下所有实施例中，在无菌血中添加细菌的量均在10-100个，且得到的鉴定准确率是在不同剂量下均进行10次重复实验，并对结果进行四舍五入只保留整数得到的数据。
实施例1
从阳性血中分离细菌的试剂，其组分为：皂素溶液(A剂)、清洗液(B剂)、甲酸和乙腈(C剂)。
其中，皂素溶液用的浓度5％(100mL水中加入5克皂素，混合均匀即可)，用量40微升；清洗液是去离子水，用量1000微升；甲酸的浓度100％，乙腈浓度99.8％，用量各20微升。用量是基于200微升样本。
以上试剂中的各成分，也可以是多个单独的存储空间来存放，可以加工生产成试剂盒，在试剂盒中分多个存储空间来存放各组分。本实施例中，将试剂做成试剂盒。试剂盒中有B剂2000微升，可以将这2000微升B剂分别存放在两个空间或者存放在一个存放空间，使用的时候量取使用。
本实施例中，皂素是茶皂素，用于溶解血液中的血细胞(白细胞、红细胞和血小板)；B剂是去离子水，用于将细胞碎片和杂质洗去，用量以清洗干净为准，因此，用量可不做限定，但优选每次清洗的时候500％的量，既能冲洗干净又能节约资源；C剂是用于破碎细菌的细胞壁，促进细菌细胞中的蛋白释放出来，从而直接对细菌的蛋白进行质谱检测。
本试剂盒用于将血培养报阳后的病原菌从培养液中分离，供后续飞行时间质谱系统鉴定病原菌使用。适用于临床上各种血培养瓶。
【产品性能指标】
1、试剂盒外观整洁，包装完整无缺损，组分齐全，标识清楚明确。A剂、B剂均为无色澄清溶液，C剂为无色澄清溶液，可能出现亮黄色的微量沉淀。
2、试剂净含量不少于表示值。
3、对标准菌株平行处理10次，经检测均能正确鉴定。
4、用3个批次的试剂盒对标准菌株进行处理，每批处理3次，经检测均能正确鉴定。
【储存条件及有效期】
2-8℃避光保存，有效期为12-48个月。
试剂开瓶后，2-8℃避光保存，有效期为2-4周。
为了便于对比并评估鉴定准确率，采用阳性血培养瓶。进行血培养时，选用无菌血，外加已知菌种进行培养。血培养报阳后2小时之内采用本实施例中的试剂和方法进行鉴定。
本实施例中的试剂，也可直接用做血液中细菌鉴定的试剂。
从阳性血中分离细菌的方法，按照实施顺序，操作步骤如下：
(1)从阳性血培养瓶抽取样本200μL，转移到Eppendorf离心管,然后加40μLA剂混匀，室温放置5-8分钟；
(2)加去离子水1000μL混匀后离心@100-1000g 5分钟；
(3)取上清移到一新的1.5mL离心管中，@13000g离心5分钟沉淀细菌,弃上清；
(4)加入1000μL B剂，洗涤后，13000g离心5分钟，彻底去除上清；
(5)加入40μL C剂，甲酸和乙腈各20微升，机械振荡使其混匀后，静置5分钟(可选择地进行)，短暂离心(@13000g离心1分钟)；
(6)取2μL上清液作为后续质谱鉴定的样品。
血液中细菌鉴定方法，按照实施顺序，操作步骤如下：
(1)按照上述分离方法，制备用于质谱鉴定的样品；
(2)取2μL样品点样到靶板的孔位上，室温干燥；
(3)覆盖1微升左右的基质于样品上，室温干燥；
(4)采用飞行时间质谱仪进行检测，获得质谱图；
(5)根据菌种的质谱图库，对质谱图进行分析，得到鉴定结果。可是用配套的鉴定软件，将菌种的信息上传至鉴定软件配套的数据库中，然后这步便可实现自动鉴定，操作人员只需查看鉴定结果即可。
其中，基质包括：45％乙腈、5％三氟乙酸和50％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
检验结果的解释
用于鉴定细菌的仪器包括进口布鲁克和梅里埃的获得cFDA用于临床细菌鉴定的仪器。
该试剂及鉴定方法在半小时内即可看到细菌检测结果，速度快，给临床后续诊断及给药提供快速、及时的参考，病人更方便、更及时，且菌种鉴定结果可靠性高。
本实施例中，分别在无菌血中添加10-100个大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养且显阳性后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
鉴定方法的鉴定结果证明了分离方法的有效性，证明了的确从血液中分离出来了细菌，并且分离效果较好。
当所述制剂中不含C剂时，即，不加甲酸和乙腈，分离得到的产物可用于生化鉴定，即，分离方法实施完步骤(4)即取沉淀进行生化鉴定，鉴定准确率能达到90％。
其中的从阳性血中分离细菌的方法及鉴定方法，还可用于非诊断或非治疗目的的场情况，如进行科研：在血液中加入各种成分，采用血液培养细菌，进而分离细菌，研究添加的成分对细菌的生长的影响，从而研发新药物等等；或者对库存血液进行检验等等，或者对获得的血液进行检验等等。
实施例2.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，将裂解血细胞的A剂为SDS和皂素溶液的混合物。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
实施例2.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，将裂解血细胞的A剂为SDS和皂素溶液。进行操作的时候，先以其中一种先进行血细胞裂解，然后再用另一种再一次裂解血细胞。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
实施例2.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，将裂解血细胞的A剂为SDS。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为90％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为90％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为90％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为90％以上。
其中，A剂除了以上列举的，还可以用其它能裂解血细胞的表面活性剂。
实施例3.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用A剂的量为20微升，与样本的体积比为0.1，即10％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
实施例3.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用A剂的量为60微升，与样本的体积比为0.3，即30％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％以上。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％以上。
实施例3.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用A剂的量为80微升，与样本的体积比为0.4，即40％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例3.4
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用A剂的量为100微升，与样本的体积比为0.5，即50％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例3.5
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用A剂的量为10微升，与样本的体积比为0.05，即5％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例4.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用C剂的量为20微升，与样本的体积比为0.1，即10％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例4.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用C剂的量为60微升，与样本的体积比为0.3，即30％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例4.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用C剂的量为80微升，与样本的体积比为0.4，即40％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例4.4
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用C剂的量为100微升，与样本的体积比为0.5，即50％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例4.5
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，所用C剂的量为10微升，与样本的体积比为0.05，即5％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
当然，A剂和C剂的用量也可以是其他数值，只要在5％以上即可，而类似的改变，仍然在本发明的保护范围内，在此不做赘述。而清洗液B剂的用量，以清洗干净为准，因此，对用量不做限制，但是在做成试剂盒的时候，B剂的用量可以是样品体积的5倍，如第一个实施例中，样品为200微升，则B剂的体积可以是1000微升，也可以是500微升，1500微升，2000微升等等。
实施例5.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素的浓度是3％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例5.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素的浓度是8％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例5.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素的浓度是10％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例5.4
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素的浓度是15％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例6.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素溶液为黄姜皂素。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例6.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素溶液为薯蓣皂素。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例6.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素溶液为20微升茶皂素和20微升黄姜皂素，浓度都是5％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例6.4
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素溶液为20微升薯蓣皂素和20微升黄姜皂素，浓度都是5％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例6.5
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，皂素溶液为20微升茶皂素、10微升黄姜皂素和10微升薯蓣皂素，浓度均为5％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例7.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，甲酸的浓度为50％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例7.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，甲酸的浓度为70％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例7.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，甲酸的浓度为90％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例7.4
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，甲酸的浓度为30％。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例8.1
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例1不同的是，还包括D剂，D剂是80％的甲酸。
对于鉴定方法，与实施例1不同的是，采用分离方法得到样品后，在鉴定的过程中，在步骤(3)之后，再次加入80％甲酸，并再次室温干燥1分钟以上，可干燥1-5分钟，然后再进行步骤(4)。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例8.2
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例9.1不同的是，D剂是90％的甲酸。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例8.3
从阳性血中分离细菌的试剂，与实施例9.1不同的是，D剂是100％的甲酸。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
以上实施例提供的试剂，均采用实施例1中的鉴定方法对已知菌种进行鉴定。
实施例9.1
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，离心条件为@100-1000g，3分钟。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为94％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为94％左右。
实施例9.2
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，离心条件为@100-1000g，10分钟。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例9.3
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(3)中，沉淀细菌，弃上清液的操作为：@15000g离心5分钟，沉淀细菌，弃上清液。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例9.4
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(4)中，@15000g离心10分钟后彻底去除上清液。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例9.5
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(4)中，@20000g离心1分钟后彻底去除上清液。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例9.6
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(5)中，所述短暂离心是在@15000g离心10分钟，得上清液。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例9.7
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(5)中，所述短暂离心是在@20000g离心3分钟，得上清液。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例10.1
血液中细菌鉴定的方法，与实施例1不同的是，其中基质的组成为：50％乙腈、5％三氟乙酸和45％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例10.2
血液中细菌鉴定的方法，与实施例1不同的是，其中基质的组成为：55％乙腈、5％三氟乙酸和40％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例10.3
血液中细菌鉴定的方法，与实施例1不同的是，其中基质的组成为：50％乙腈、8％三氟乙酸和42％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例10.4
血液中细菌鉴定的方法，与实施例1不同的是，其中基质的组成为：55％乙腈、1％三氟乙酸和44％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例10.5
血液中细菌鉴定的方法，与实施例1不同的是，其中基质的组成为：52.5％乙腈、2.5％三氟乙酸和45％去离子水，并加入α-氰基-4-羟基肉桂酸至饱和。
本实施例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为95％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为95％左右。
实施例11.1
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，加入去离子水后，在@200-800g下离心。采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在95％左右。
实施例11.2
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，加入去离子水后，在@200-500g下离心。采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在95％左右。
实施例11.3
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，加入去离子水后，在@200g下离心。采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在95％左右。
实施例11.4
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，加入去离子水后，在@500g下离心。采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在95％左右。
实施例11.5
从阳性血中分离细菌的方法，与实施例1不同的是，步骤(2)中，加入去离子水后，在@300g下离心。采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在95％左右。
实施例12
对于从阳性血中分离细菌的方法，与实施例8.1中的分离方法不同的是，在步骤(5)之后，步骤(6)之前，向步骤(5)中得到的上清液中加入D剂，并再次机械振荡、短暂离心，然后实施步骤(6)：上清液作为用于质谱鉴定的样品。
将分离得到的样品采用与实施例9.1相同的方法进行鉴定，并采用与实施例1相同的方法，对细菌鉴定准确率进行统计，均在96％左右。
以上实施例中，未指明分离方法及鉴定方法的，均采用实施例1中的试剂对已知菌种进行鉴定。
对比例1
与实施例1不同的是，从阳性血中分离细菌的方法中，所有离心均采用@13000g下进行，其他不变。
本对比例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为88％左右。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为87％。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为87％。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为86％。
对比例2
公开号为CN102471798A的中国发明申请中公开的方案：首先将近1ml的血液添加到几支专用离心管的每一支内，加入表面活性剂溶液，然后混合均匀。且100μl的10％的SDS溶液作为表面活性剂以溶液形式添加，并在SDS溶液中添加泡沫抑制剂(消泡剂)。在振荡器中混合10到30秒后，将离心管内的血液样品以10,000g离心两分钟。利用例如带有可移除吸头的常规移液管将深红色上清液移除。这时取出微生物沉淀物并用蒸馏水清洗；在再次离心后，剩下分离的微生物的沉淀物，如果可见则为纯白色。只有严重的病例才需要重复清洗步骤以便排除所有的微量人类蛋白质；在最后一次清除上清液后，通过加入大约几微升的70％甲酸来进行，甲酸会猛烈攻击所述微生物细胞壁的肽聚糖(胞壁质)并破坏细胞结构，从而提取微生物的可溶性蛋白质。为了尽量溶解更多蛋白质添加了等量的乙腈。为了使固体组成(如细胞壁碎片)沉淀，将可溶性蛋白质溶液离心，然后把约1μl的各上清液利用移液管移到MALDI样品载板的样品点上。在干燥以后，把约1μl的基质物质溶液(带有少量三氟乙酸的乙腈)添加到每个样品制剂中。在干燥后，样品载板上的样品制剂用于获取质谱。
本对比例中，分别在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或表皮葡萄球菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，对于每种菌，鉴定准确率平均都为60％。
在无菌血中添加鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为70％。
在无菌血中添加粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为70％。
在无菌血中添加大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，培养后进行鉴定，重复进行10次重复实验，鉴定准确率平均为60％。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.从阳性血中分离细菌的试剂，包括用于溶解来自血液培养物的血液样品中的血细胞的A剂和用于破碎病原菌细胞壁，或，和促进细胞中的蛋白释放的C剂，其特征在于：所述试剂还包括用作清洗剂的B剂；所述A剂为皂素溶液和SDS中至少一种或其它能裂解血细胞的表面活性剂。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：按与血液样品的体积比，A剂为5％以上，和/或，C剂为5％以上。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述C剂包括甲酸和乙腈。
4.如权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述甲酸和乙腈的用量相同。
5.如权利要求1-4中任一项所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括D剂，所述D剂为80-100％的甲酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的试剂，其特征在于：将所述试剂做成试剂盒。
7.采用如权利要求1-6中任一项所述的试剂从阳性血中分离细菌的方法，按实施顺序，包括以下步骤：
(1)向阳性血中加A剂混匀，室温静置5min以上；
(2)加入清洗剂B剂，混匀后离心；
(3)取上清液移到一新的离心管中，沉淀细菌,弃上清液；
(4)再次加入清洗剂B剂，洗涤后，取沉淀用于生化鉴定或彻底去除上清液并进行步骤(5)；
(5)加入C剂，机械振荡，短暂离心；
(6)取上清液作为用于质谱鉴定的样品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，离心条件为@100-1000g，1分钟以上。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，沉淀细菌，弃上清液的操作为：@10000-15000g离心1分钟以上沉淀细菌，弃上清液；步骤(4)中，洗涤后，在@10000-20000g离心1分钟以上时间后彻底去除上清液；步骤(5)中，所述短暂离心是在@10000-20000g离心1分钟以上，得上清液。
10.采用如权利要求1-6中任一项所述的试剂进行血液中细菌鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)按照如权利要求7-9中任一项所述的方法，制备用于质谱鉴定的样品；
(2)取样品点样到飞行质谱仪的靶板的孔位上，室温干燥；
(3)覆盖基质于样品上，室温干燥；
(4)采用飞行时间质谱仪进行检测，得到图谱数据；
(5)数据分析：对图谱数据进行分析，得出鉴定结果。
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