MX2011004106A - Métodos para la separación, caracterización, y/o identificación de microorganismos usando espectroscopia raman. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para separar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra de prueba. El método de la invención comprende un paso opcional de lisis para lisar las células no de microorganismo que pueden estar presentes en una muestra de prueba, seguido por un paso subsiguiente de separación. El método puede ser útil para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos de muestras complejas tal como medio de cultivo que contiene sangre. La invención proporciona además interrogación espectroscópica Raman de la muestra separada de microorganismo para producir mediciones del microorganismo y caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra usando mediciones espectroscópicas Raman.

Description

i MÉTODOS PARA LA SEPARACIÓN, CARACTERI ACIÓN, Y/O IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS USANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y sistemas para detectar, aislar y/o identificar microorganismos en una muestra. En particular, la presente invención se refiere a un método para la caracterización y/o identificación rápida de un microorganismo usando técnicas espectroscópicas Raman.

Antecedentes de la Invención La detección de microorganismos patógenos en fluidos biológicos se debe realizar en el más corto tiempo posible, en particular en el caso de septicemia para la cual la mortalidad permanece alta a pesar de la amplia variedad de antibióticos que están disponibles a los doctores. La presencia de agentes biológicamente activos tal como un microorganismo en el fluido corporal de un paciente, especialmente sangre, se determina en general usando botellas de cultivo de sangre. Las infecciones de la corriente sanguínea se asocian con alta morbilidad y mortalidad, aún los actuales métodos de diagnóstico, de cultivo seguido por identificación bioquímica y prueba de susceptibilidad a antibióticos, pueden tomar varios días en realizarse. Típicamente, se inicia la terapia empírica en base a los síntomas clínicos, y los resultados de la prueba impactan sólo decisiones clínicas cuando falla la terapia inicial. La capacidad para caracterizar infecciones de la corriente sanguínea en el espacio de las primeras pocas horas, de manera preferente en el espacio de una hora después de un resultado positivo de cultivo sanguíneo reforzará significativamente la pertinencia clínica de la información diagnóstica proporcionada. Se han propuesto métodos de amplificación molecular para cumplir con esta necesidad, pero permanecen serios retos a este planteamiento. El caldo de cultivo sanguíneo positivo representa en sí mismo una población naturalmente amplificada de microorganismos con potencial de uso en una variedad de pruebas rápidas de identificación (ID) .

Las pruebas de ID, fenotípicas, automatizadas, tradicionales, tal como los sistemas VitekMR, PhoenixMR y MicroscanMR, o pruebas fenotípicas manuales tal como API requieren que los microorganismos estén en una fase apropiada de crecimiento y libres de medios de interferencia y productos sanguíneos a fin de proporcionar resultados contundentes. Estos sistemas usan colonias cultivadas del caldo positivo durante 16-24 horas en medio colocado en placa. Sin embargo, en un esfuerzo para obtener resultados más rápidos, algunos laboratorios han reportado el uso de estos sistemas con microorganismos aislados de botellas de cultivo sanguíneo positivo. Estas pruebas directas de la botella no son apropiadas para todos los microorganismos (por ejemplo, cocos Gran-positivos) , no se validan por los productores de pruebas, y en general toman 3-8 horas en proporcionar resultados. Se necesitan urgentemente pruebas más rápidas y más ampliamente específicas a fin de proporcionar al facultativo con resultados clínicamente pertinentes en el espacio de las primeras pocas horas, de manera preferente en el espacio de una hora después de un resultado de cultivo, positivo.

La espectroscopia Raman tiene el potencial de permitir la identificación de microorganismos muy rápidamente, pero puede encontrar interferencia de los muchos compuestos altamente fluorescentes y absorbentes presentes en los medios líquidos de cultivo microbiológico y en muestras clínicas tal como sangre o combinaciones de los mismos. Los métodos más comúnmente empleados para recuperar microorganismos directamente del caldo de cultivo sanguíneo positivo son centrifugación diferencial de dos pasos y centrifugación en un tubo separador de suero.

Se han descrito otros métodos de separación, caracterización y/o identificación de microorganismos, que incluyen: La patente de los Estados Unidos No. 4,847,198 describe un método para la identificación de microorganismos usando espectroscopia Raman excitada por UV. De acuerdo a la patente '198, se pone en contacto una suspensión bacteriana por una longitud de ondas individual en el intervalo ultravioleta. Se absorbe una porción de la energía luminosa usada y se emite una porción de la energía luminosa. La energía luminosa emitida, la dispersión Raman mejorada por resonancia, se mide como energía retrodispersada . La energía se procesa para producir espectros que son característicos de las bacterias.

La patente de los Estados Unidos No. 5,938,617 de Vo-Dinh se refiere a un sistema que identifica patógenos biológicos en una muestra al excitar una muestra con luz a varias longitudes de onda y al muestrear de manera sincrónica las intensidades de emisión. El sistema incluye mecanismos para exponer la muestra a radiación de excitación y generar de este modo una radiación de emisión. Los patógenos biológicos pueden ser virus o bacterias.

La patente de los Estados Unidos No. 6,177,266 describe un método para la clasificación quimiotaxonómica de bacterias con géneros, especies y biomarcadores específicos de la cepa generados por análisis de espectrometría de masa de tiempo de vuelo con ionización por desorpción láser asistida con matriz (MALDI-TOF-MS) de ya sea extractos de proteína celular o de células enteras.

En la patente de los Estados Unidos No. 7,070,739 se presenta un método para extraer, separar y purificar microbios incluyendo virus por ultracentrifugación bidimensional directamente de fluidos corporales o tejido homogeneizado . En un primer paso de centrifugación, se remueven todas las partículas que tienen una velocidad de sedimentación mayor que aquella de los microbios que se van a identificar. En el segundo paso de ultracentrifugación, se usa el bandeo isopícnico en líquidos rellenos para formar un gradiente de densidad de intervalo amplio, usando tubos de centrífuga, aserrados, especiales. De acuerdo a la patente, la técnica de separación se puede usar para detectar partículas bandeadas por dispersión de luz o fluorescencia usando tintes específicos de ácido nucleico, y para recuperar las partículas bandeadas en volúmenes muy pequeños para la caracterización por espectrometría de masa de subunidades de proteína viral y partículas virales intactas, y por determinación citométrica de flujo de fluorescencia tanto de la masa de ácido nucleico como de las masas de fragmentos producidos por enzimas de restricción.

La Publicación de Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0037135 describe un sistema para la identificación y cuantificación de una muestra biológica suspendida en un líquido. El sistema incluye un módulo de excitación de fluorescencia con al menos una fuente de luz de excitación; un módulo de interfaz de muestra acoplado ópticamente al módulo de excitación de fluorescencia para colocar una muestra biológica para recibir luz de excitación de la por lo menos una fuente de luz de excitación; un módulo de emisión de fluorescencia acoplado ópticamente al módulo de interfaz de muestra y que comprende al menos un dispositivo de detección para detectar matrices de excitación-emisión de fluorescencia de la muestra biológica; y un módulo de computadora acoplado operativamente al módulo de emisión de fluorescencia. El módulo de computadora realiza análisis multivariables en las matrices de excitación-emisión de fluorescencia de la muestra biológica para identificar y cuantificar la muestra biológica. Sin embargo, la solicitud x 135 no analiza la identificación y cuantificación de microorganismos para muestras biológicas complejas, tal como sangre.

La Publicación de Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0175278 describe el uso de un medio de cultivo liquido para cultivar una muestra de interés, que incluye por ejemplo sangre, orina, heces, catéteres intravenosos, etc., líneas de producción industrial, sistemas de agua, un producto alimenticio, un producto cosmético, un producto farmacéutico y una muestra forense. De manera subsiguiente, los microorganismos se pueden recolectar del medio líquido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por centrifugación. Los microorganismos concentrados entonces se pueden transferir al material portador, opcionalmente después del secado, para obtener un espectro vibracional. La solicitud de patente analiza varios métodos para identificar y clasificar microorganismos, incluyendo espectroscopia vibracional, tal como espectroscopia Raman.

Sin embargo, estos métodos tienen varias desventajas cuando se intenta separar y caracterizar microorganismos de muestras complejas tal como medios de cultivo que contienen sangre. Las preparaciones microbianas resultantes contienen frecuentemente células sanguíneas rojas contaminantes, plaquetas, partículas de lípidos, enzimas de plasma y desechos celulares, que pueden provocar resultados pobres. Estos métodos también son muy intensivos de labor e inseguros debido a los pasos que pueden dar por resultado exposición a aerosol de patógenos potencialmente peligrosos al usuario. Se necesitan métodos simples, seguros y confiables para aislar microorganismos de muestras clínicas (por ejemplo, caldo de cultivo sanguíneo) y otras muestras complejas que están libres de estos materiales de interferencia y son compatibles con las rápidas tecnologías de identificación.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos para aislar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra. Los métodos permiten la caracterización y/o identificación de microorganismos más rápidamente que las técnicas anteriores, dando por resultado diagnósticos más rápidos (por ejemplo, en un sujeto que tiene o se sospeche que tiene septicemia) e identificación de materiales contaminados (por ejemplo, materias alimenticias y productos farmacéuticos) . Los pasos comprendidos en los métodos de la invención, de obtener una muestra a la caracterización y/o identificación de microorganismos, se pueden llevar a cabo en un cuadro de tiempo muy corto para producir información accionable clínicamente pertinente, por ejemplo, en menos de aproximadamente 120 minutos. Adicionalmente , los métodos de la invención se pueden automatizar completamente, reduciendo de este modo el riesgo de manejar materiales infecciosos y/o contaminar las muestras.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar de forma selectiva las células que no son de microorganismos en la muestra de prueba para producir una muestra lisada; (c) separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar a los microorganismos aislados usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscopicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscopicas con mediciones espectroscopicas tomadas, o propiedades espectroscopicas previstas, de microorganismos conocidos .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o para identificar un microorganismo de un cultivo sanguíneo, que comprende: (a) obtener una muestra un cultivo sanguíneo que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente las células no de microorganismo en la muestra para producir una muestra lisada; (c) estratificar la muestra lisada en un cojín de densidad en un recipiente sellado; (d) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra y para formar un sedimento de microorganismo; (e) interrogar espectroscópicamente los microorganismos aislados in situ usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscópicas de los microorganismos; y (f) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscópicas con mediciones espectroscópicas tomadas, o propiedades espectroscópicas previstas, de microorganismos conocidos .

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) colocar la muestra de prueba en un recipiente sellado; (c) separar los microorganismos in situ de los otros componentes de la muestra de prueba para formar una muestra aislada de microorganismos en el recipiente sellado; (d) interrogar espectroscópicamente los microorganismos aislados in situ usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscópicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscópicas con mediciones espectroscópicas tomadas, o propiedades espectroscópicas previstas, de microorganismos conocidos .

En una modalidad, la separación se lleva a cabo al estratificar la muestra de prueba sobre un cojín de densidad en un recipiente y al centrifugar el recipiente para sedimentar los microorganismos en tanto que el medio de muestra permanece en la parte superior del cojín de densidad. En otra modalidad, el recipiente tiene una ventana óptica en el fondo y/o lados de modo que el sedimento de microorganismo se puede interrogar de manera espectroscópica . Los microorganismos se pueden identificar al comparar el espectro del sedimento a un espectro o espectros, o a propiedades espectroscópicas previstas, de microorganismos conocidos. La capacidad para identificar microorganismos directamente en el sedimento sin manejo adicional mejora la seguridad de identificación microbiana.

En una modalidad, la interrogación espectroscópica se basa en la interrogación de la estructura vibracional de las moléculas constituyentes que comprende los microorganismos. En otras modalidades, la interrogación espectroscópica se basa en parte en señales obtenidas de agentes adicionales que se adicionan durante los métodos de la invención e interactúan con microorganismos específicos o grupos de microorganismos.

En otra modalidad, los métodos comprenden además un paso de recuperar el sedimento de microorganismo, resuspender el microorganismo y realizar pruebas adicionales de identificación o caracterización (por ejemplo, resistencia a fármacos, factores de virulencia, antibiogramas) .

La presente invención se explica en mayor detalle en las figuras de la presente y la descripción expuesta más adelante .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los espectros Raman de varios microorganismos procesados y recuperados de cultivo sanguíneo .

La Figura 2 muestra los espectros Raman de 13 aislados de S. aureus recuperados directamente de caldo de cultivo sanguíneo.

La Figura 3 muestra los espectros Raman leídos a través de un dispositivo de separación sellado, con y sin microorganismos presentes.

La Figura 4 muestra los espectros Raman de un sedimento de microorganismo derivado de cultivo sanguíneo leído a través del dispositivo de separación, sellado, sustraído del fondo.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se puede incorporar en diferentes formas y no se debe considerar como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción será cabal y completa, y dará a conocer completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una modalidad se pueden incorporar en otras modalidades, y las características ilustradas con respecto a una modalidad particular se pueden suprimir de esa modalidad. Además, serán evidentes para los expertos en la técnica numerosas variaciones y adiciones a las modalidades sugeridas en la presente en vista de la presente descripción, que no se aparten de la presente invención.

A menos que se definan de otro modo todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por el experto en la técnica a la cual corresponde esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención de la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no se propone que sea limitante de la invención.

Definiciones Como se usa en la presente, "un", "una", o "el", "la" puede significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una célula individual o una multiplicidad de células.

También como se usa en la presente, "y/o" se refiere a, y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los puntos listados, asociados, así como la carencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o") .

Adicionalmente, el término "aproximadamente", como se usa en la presente cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de un compuesto o agente de esta invención, dosis, tiempo, temperatura, y similares, se propone que abarque variaciones de 20 %, ± 10 %, + 5 %, + 1 %, ± 0.5 %, o aún + 0.1 ¾ de la cantidad especificada.

Como se usa en la presente, el término "microorganismo" se propone que abarque organismos que en general son unicelulares, que se pueden multiplicar o manejar en el laboratorio, incluyendo pero no limitado a, bacterias Gram-positivas o Gram-negativas , levaduras, mohos, parásitos y mollicutes. Los ejemplos no limitantes de bacterias Gram-negativas de esta invención incluyen bacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas , Escherichia , Salmonella , Shigella , Enterobacter, Klebsiella , Serratia , Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella , Vibrio, Yersinia , Acinetobacter, Stenotrophomonas , Brevundimonas , Ralstonia , Achromobacter, Fusobacterium , Prevotella , Branhamella , Neisseria , Burkholderia , Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella , Aeromonas , Moraxella , Brucella, Pasteurella, Providencia, y Legionella. Los ejemplos no limitantes de bacterias Gram-positivas de esta invención incluyen bacterias de los siguientes géneros: Enterococcus , Streptococcus , Staphylococcus , Bacillus , Paenibacillus , Lactobacillus , Listeria , Peptostreptococcus , Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella , Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus , Mycobacteria y Corynebacteria . Los ejemplos no limitantes de levaduras y mohos de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Candida, Cryptococcus , Nocardia, Penicillium, Alternaría , Rhodotorula , Aspergillus , Fusarium, Saccharomyces y Trichosporon . Los ejemplos no limitantes de parásitos de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Trypanosoma , Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca , y Naegleria. Los ejemplos no limitantes de mollicutes de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Mycoplasma y Ureaplasma .

En una modalidad, como se describe adicionalmente en detalle en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden separar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "separar" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se haya recuperado, concentrado o de otro modo separado de su estado original o de un medio de cultivo o de crecimiento. Por ejemplo, de acuerdo con esta invención, se pueden separar microorganismos (por ejemplo, como una muestra separada) de un no microorganismo o componentes de no microorganismo que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. El término puede incluir una capa de microorganismos intercalados entre dos capas diferentes, por ejemplo, microorganismos recolectados en la parte superior de un cojín de alta densidad después de la centrifugación, o una capa de microorganismos recolectados en una superficie sólida (por ejemplo, una membrana de filtro) . El término también puede incluir una colección de microorganismos que han pasado parcialmente a través de una capa (por ejemplo, un cojín de densidad) . Como tal, una muestra separada de microorganismos puede incluir cualquier colección o capa de microorganismos y/o componentes de los mismos que están más concentrados que, o de otro modo separados de, la muestra original, y puede variar desde una aglomeración densa cerradamente empacada de microorganismos a una capa difusa de microorganismos. Los componentes de microorganismos que pueden estar comprendidos en una forma o muestra separada incluyen, sin limitación, pilli, flagelos, fimbrias, y cápsulas en cualquier combinación. Los componentes no de microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células no de microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquier componente de los mismos.

En aún otra modalidad, como se describe en detalle adicional en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden aislar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "aislado" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se a purificado al menos parcialmente de su estado original, o de un medio de cultivo o crecimiento, y cualquier no microorganismo o componentes de no microorganismo contenidos en el mismo. Por ejemplo, de acuerdo con esta invención, los microorganismos se pueden aislar de (por ejemplo, como una muestra aislada) de no microorganismos o componentes de no microorganismos que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. Los componentes de no microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células no de microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquier otro componente de los mismos .

En aún otra modalidad, como se describe en detalle adicional en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden sedimentar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "sedimento" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se ha comprimido o depositado de una masa de microorganismos. Por ejemplo, los microorganismos de una muestra se pueden comprimir o depositar en una masa en el fondo de un tubo por centrifugación, u otros métodos conocidos en la técnica. El método incluye una colección de microorganismos (y/o componentes de los mismos) en el fondo y/° lados de un recipiente después de la centrifugación.

Los componentes de microorganismos que pueden ser comprendidos en un sedimento incluyen, sin limitación, pilli, flagelos, fimbrias, y capsulas en cualquier combinación. De acuerdo con esta invención, los microorganismos se pueden sedimentar (por ejemplo, como un sedimento de microorganismos, sustancialmente purificado) de no microorganismos o componentes de no microorganismo que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. Los componentes de no microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células de no microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquiera de los componentes de los mismos .

Como se usa en la presente, el término "cojín de densidad" se refiere a una solución que tiene una densidad completamente homogénea.

La presente invención proporciona métodos para aislar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra. Además, el método puede ser particularmente útil para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos de muestras complejas tal como medio de cultivo que contiene sangre. Los métodos rápidos también permiten la caracterización y/o identificación de microorganismos más rápidamente que las técnicas anteriores, dando por resultado diagnósticos más rápidos (por ejemplo, en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene septicemia) y caracterización/identificación de materiales contaminados (por ejemplo, materias alimenticias y productos farmacéuticos) . Los pasos comprendidos en los métodos de la invención, desde obtener una muestra a la caracterización/identificación de microorganismos, se pueden llevar a cabo en un cuadro de tiempo muy corto para obtener información demandable clínicamente pertinente. En ciertas modalidades, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en menos de aproximadamente 120 minutos, por ejemplo, en menos de aproximadamente 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ó 1 minuto. La rapidez tremenda del método de la invención representa una mejora con respecto a los métodos anteriores. Los métodos se pueden usar para caracterizar y/o identificar cualquier microorganismo como se describe en la presente. En una modalidad, el microorganismo es una bacteria. En otra modalidad, el microorganismo es una levadura, en otra modalidad, el microorganismo es un moho. En una modalidad adicional, el microorganismo es un parásito. En otra modalidad, el microorganismo es un mollicute. Adicionalmente , los métodos de la invención se pueden automatizar de forma completa, reduciendo de este modo el riesgo de manejar materiales infecciosos y/o de contaminar las muestras.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente las células no de microorganismo en la muestra de prueba para producir una muestra lisada; (c) separar los microorganismos de otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar los microorganismos aislados usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscópicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscópicas con mediciones espectroscópicas tomadas, o propiedades espectroscópicas previstas, de microorganismos conocidos .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) colocar la muestra de prueba en un recipiente sellado; (c) separar los microorganismos in situ de los otros componentes de la muestra de prueba para formar una muestra aislada de microorganismos de los microorganismos en el recipiente sellado; (d) interrogar espectroscópicamente los microorganismos aislados in situ usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscópicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscópicas con mediciones espectroscópicas tomadas, o con propiedades espectroscópicas previstas, de microorganismos conocidos.

En otra modalidad de la invención, los métodos comprenden recuperar el sedimento de microorganismos formados durante el paso de separación o una porción del mismo del recipiente de separación antes de la interrogación de los microorganismos. Por ejemplo, después de la formación del sedimento, los ruidos se pueden aspirar del sedimento y el sedimento se puede resuspender en un medio adecuado (por ejemplo, un medio en el cual sean viables los microorganismos) . Los microorganismos resuspendidos se pueden remover del recipiente de separación. Los microorganismos entonces se pueden interrogar para caracterización y/o identificación, por ejemplo, en la suspensión o después de que se han re-sedimentado . En otras modalidades, los microorganismos resuspendidos se pueden interrogar en el recipiente de separación, por ejemplo, en la suspensión o después de que se han re-sedimentado . En una modalidad adicional, los microorganismos recuperados del sedimento se pueden usar directamente para interrogación adicional (por ejemplo, espectroscopia Raman) sin que se suspendan .

Muestras Las muestras que se pueden probar (es decir, una muestra de prueba) por los métodos de la invención incluyen muestras tanto clínicas como no clínicas en los cuales esté o se pueda sospechar la presencia y/o crecimiento de microorganismos, así como muestras de materiales que se prueban por rutina u ocasionalmente para la presencia de microorganismos. La cantidad de muestra utilizada puede variar grandemente debido a la versatilidad y/o sensibilidad del método. La preparación de la muestra se puede llevar a cabo por varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica aunque una de las ventajas de la presente invención es que se pueden probar tipos de muestras complejas, tal como por ejemplo, sangre, fluidos corporales y/o otras sustancias opacas, utilizando directamente el sistema con poco o ningún pre-tratamiento extensivo. En una modalidad, la muestra se toma de un cultivo. En otra modalidad, la muestra se toma de un cultivo microbiológico (por ejemplo, un cultivo sanguíneo) . En otra modalidad, la muestra se sospecha de, o se conoce que, contiene microorganismos en la misma .

Las muestras clínicas que se pueden probar incluyen cualquier tipo de muestra típicamente probada en laboratorios clínicos o de investigación, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, fracciones sanguíneas, ruido de articulaciones, orina, semen, saliva, heces, fluido cerebroespinal, contenidos gástricos, secreciones vaginales, homogenados de tejido, aspirados de médula ósea, homogenados óseos, esputo, aspirados, algodones frotados y enjuagues en algodón frotado, otros ruidos corporales, y similares. En otra modalidad, la muestra clínica se puede cultivar, y se usa una muestra de cultivo.

La presente invención encuentra uso en la investigación así como en aplicaciones veterinarias y clínicas. Los sujetos adecuados de los cuales se pueden obtener muestras clínicas en general son sujetos mamíferos, pero puede ser cualquier animal . El término "mamífero" como se usa en la presente incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, ganado, ovejas, cabras, cerdos, caballos, gatos, perros, conejos, roedores (por ejemplo, ratas o ratones), etc. Los sujetos humanos incluyen sujetos neonatos, infantes, juveniles, adultos y geriátricos. Los sujetos de los cuales se pueden obtener muestras incluyen, sin limitación, mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces.

Las muestras no clínicas que se pueden probar también incluyen sustancias, que abarcan, pero no se limitan a, materias alimenticias, bebidas, productos farmacéuticos, cosméticos, agua (por ejemplo, agua para beber, agua no potable y agua residual) , lastres de agua salada, aire, suelo, aguas residuales, material vegetal (por ejemplo, semillas, hojas, tallos, raíces, flores, frutas) , productos sanguíneos (por ejemplo, plaquetas, suero, plasma, reacciones de células sanguíneas blancas, etc.), muestras de tejido u órganos donadores, muestras de guerra biológica, y similares. El método también es particularmente bien adecuado para la prueba en tiempo real para monitorizar niveles de contaminación, control de proceso, control de calidad y similares en escenarios industriales. En otra modalidad, la muestra clínica se puede cultivar, y se usa una muestra de cultivo.

En una modalidad de la invención, se obtienen muestras de un sujeto (por ejemplo, un paciente) que tiene o se sospecha que tiene una infección microbiana. En una modalidad, el sujeto tiene o se sospecha que tiene septicemia, por ejemplo, bacteremia o fungemia. La muestra puede ser una muestra sanguínea directamente del sujeto. La muestra puede ser de un cultivo sanguíneo cultivado de una muestra de la sangre del paciente, por ejemplo, un cultivo sanguíneo BacT/ALERTMR . La muestra de cultivo sanguíneo puede ser de un cultivo sanguíneo positivo, por ejemplo, un cultivo sanguíneo que indica la presencia de un microorganismo. En ciertas modalidades, la muestra se toma de un cultivo sanguíneo positivo dentro de un tiempo corto después de que se vuelve positiva, por ejemplo, en el espacio de aproximadamente 6 horas, por ejemplo, en el espacio de aproximadamente 5, 4, 3, ó 2 horas, o en el espacio de aproximadamente 60 minutos, por ejemplo, aproximadamente 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ó 1 minuto. En una modalidad, la muestra se toma de un cultivo en el cual los microorganismos están en fase logarítmica de crecimiento. En otra modalidad, la muestra se toma de un cultivo en el cual los microorganismos están en una fase estacionaria.

La presente invención proporciona alta sensibilidad para la detección, caracterización y/o identificación de microorganismos. Esto permite la detección, caracterización y/o identificación sin tener primero que ir a través de los pasos de aislar los microorganismos al cultivarlos en un medio sólido o semisólido, y muestrear las colonias que crecen. De esta manera, en una modalidad de la invención, la muestra no es de una colonia microbiana (por ejemplo, bacterias, levadura o moho) cultivada en una superficie sólida o semisolida. De esta manera, en una modalidad de la invención, la muestra no es de una colonia microbiana (por ejemplo, bacterias, levadura o moho) en una superficie sólida o semisolida.

El volumen de la muestra debe ser suficientemente grande para producir una muestra aislada de microorganismos o un sedimento de microorganismos que se pueden interrogar después de que se lleve a cabo el paso de separación/aislamiento de los métodos de la invención. Los volúmenes apropiados dependerán de la fuente de la muestra y del nivel anticipado de microorganismos en la muestra. Por ejemplo, un cultivo sanguíneo positivo contendrá un mayor nivel de microorganismos por volumen que una muestra de agua para beber que se va a probar para contaminación, de modo que se puede necesitar un volumen más pequeño del medio de cultivo sanguíneo en comparación a la muestra de agua para beber. En general, el tamaño de muestra puede ser menos de aproximadamente 50 mi, por ejemplo, menos de aproximadamente 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 mi. En ciertas modalidades, el tamaño de muestra puede ser aproximadamente 1 mi, por ejemplo, aproximadamente 0.75, 0.5 ó 0.25 mi. En ciertas modalidades, en las cuales se lleva a cabo la separación a una microescala, el tamaño de muestra puede ser menos de aproximadamente 200 µ? , por ejemplo, menos de aproximadamente 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10 ó 5 µ? . En algunas modalidades (por ejemplo, cuando se espera que la muestra comprenda un pequeño número de microorganismos) , el tamaño de muestra puede ser de aproximadamente 100 mi o más, por ejemplo, aproximadamente 250, 500, 750 ó 1000 mi o más .

Paso Opcional de Lisis En algunas modalidades, después de obtener una muestra, el siguiente paso del método de la presente invención es lisar selectivamente células indeseadas que pueden estar presentes en la muestra, por ejemplo, células sanguíneas y/o células de tejido. Las células se pueden lisar para permitir la separación de microorganismos de otros componentes de la muestra. La separación de microorganismos de otros componentes impide la interferencia durante el paso de interrogación. Si las células no de microorganismo no se espera que estén presentes en la muestra o no se espera que interfieran con el paso de interrogación, pueden no necesitarse llevar a cabo el paso de lisis. En una modalidad, las células que se van a lisar son células no de microorganismo que están presentes en la muestra y las células de no microorganismo que pueden estar presentes en la muestra se lisan. Sin embargo, en algunas modalidades, la lisis selectiva de las clases específica de microorganismos puede ser deseable y de esta manera se lleva a cabo de acuerdo a los métodos descritos en la presente y como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede lisar selectivamente una clase de microorganismos indeseados, por ejemplo, se lisa levadura en tanto que no se lisa bacterias o viceversa. En otra modalidad, los microorganismos deseados se lisan a fin de separar un componente subcelular particular de los microorganismos, por ejemplo, membranas u organelos celulares. En una modalidad, se lisan todas las células no microbianas. En otras modalidades, una porción de las células no microbianas se lisan, por ejemplo, suficientes células para impedir la interferencia con el paso de interrogación. La lisis de las células se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica que es efectivo para lisar de manera selectiva células con o sin microorganismos de lisis, incluyendo, sin limitación, además de una solución de lisis, tratamiento con ultrasonido, choque osmótico, tratamiento químico y/o una combinación de estos.

Una solución de lisis es una que es capaz de lisar células, por ejemplo, células no de microorganismo (por ejemplo, al solubilizar membranas de células eucarióticas) y/o células de microorganismo. En una modalidad, la solución de lisis puede comprender uno o más detergentes, una o más enzimas, o una combinación de uno o más detergentes y una o más enzimas, y puede incluir además agentes adicionales. En una modalidad, el detergente puede ser un detergente lítico no desnaturalizante tal como TritonMR, X-100 Titon MR X-100-R, TritonMR X-114, NP-40, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, IgepalMR CA 630, ArlasolveMR200, BrijMR 96/97, CHAPS, octal-ß-?-glucopiranosido, saponina, y éter monododecílico de nonaetilenglicol (C12E9, polidocenol) . Opcionalmente , los agentes líticos desnaturalizantes se pueden incluir, tal como dodecil sulfato de sodio, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sodio, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaina-14, y C7BzO. Opcionalmente, también se pueden incluir solubilizadores, tal como BrijMR 98, BrijMR 58 BrijMR 35, TweenMR 80, TweenMR20, PluronicMR L64, PluronicMR P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201) , anfipoles (PMAL-C8) , y metil- ß-ciclodextrina . Típicamente, los detergentes y solubilizadores no desnaturalizantes se usan a concentraciones por arriba de su concentración micelar crítica (CMC) , en tanto que se pueden adicionar detergentes desnaturalizantes a concentraciones por abajo de su CMC. Por ejemplo, los detergentes líticos no desnaturalizantes se pueden usar a una concentración de aproximadamente 0.010 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, de aproximadamente 0.015 % a aproximadamente 1.0 %, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 0.5 %, por ejemplo, de aproximadamente' 0.10 % a aproximadamente 0.30 % (concentración final después de dilución con la muestra) . En otra modalidad, se pueden preferir detergentes de polioxietileno. El detergente de polioxietileno puede comprenderle la estructura Ci2-i8/E9-io, en donde C12-18 denota una longitud de cadena de carbonos de 12 a 18 átomos de carbono y E9-10 denota de 9 a 10 grupos guía hidrófilos de oxietileno. Por ejemplo, el detergente de polioxietileno se puede seleccionar del grupo que consiste de BrijMR 97, BrijMR 96V, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, éter monododecílico de nonaetilenglicol (polidocanol) , o una combinación de éstos.

Las enzimas que se pueden usar en las soluciones de lisis incluyen, sin limitación, enzimas que digieren ácidos nucleicos y otros materiales que contaminan la membrana (por ejemplo, proteinasa XXIII, NDasa, neuraminidasa , polisacaridasa, GlucanexMR, y PectinexMR) . Otros aditivos que se pueden usar incluyen, sin limitación, agentes reductores tal como 2 -mercaptoetanol (2 -Me) o ditiotreitol (DTT) y agentes estabilizadores tal como magnesio, pirubato y humectantes. La solución de lisis se puede amortiguar a cualquier pH que es adecuado para lisar las células deseadas, y dependerá de múltiples factores, incluyendo sin limitación, el tipo de muestra, las células que se van a lisar, y el detergente usado. En algunas modalidades, el pH puede estar en un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 13. Los amortiguadores adecuados de pH incluyen cualquier amortiguador capaz de mantener un pH en el intervalo deseado, por ejemplo, aproximadamente CAMPS 0.05 M a aproximadamente 1.0 M.

En una modalidad, la muestra y la solución de lisis se muestran y luego se incuban durante un tiempo suficiente para que se presente la lisis y solubilización de las membranas celulares, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 segundos, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 minutos o más tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente de 1 segundo a aproximadamente 2 minutos. El tiempo de incubación dependerá de la concentración de la solución de lisis, por ejemplo, la concentración de detergente y/o enzimas. En general, los amortiguadores de lisis, más suaves, requerirán más tiempo y una dilución mayor de la muestra para solubilizar completa células no microbianas. La concentración de la solución de lisis se puede seleccionar en base a los microorganismos que se conoce o que se sospecha que están en la muestra. Para microorganismos que son más susceptibles a lisis, se puede usar una solución suave de lisis. La lisis puede tomar lugar a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45 °C, por ejemplo, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C. En una modalidad, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y la muestra entonces se puede aspirar en la jeringa tal que se presente el mezclado de incubación dentro de la jeringa. En una modalidad, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y la muestra entonces se puede aspirar en la jeringa tal que se presente el mezclado de incubación dentro de la jeringa.

En algunas modalidades, las condiciones de lisis (por ejemplo, la solución o el tiempo de incubación) , así como los pasos de separación y/o interrogación, pueden ser suficientes para aniquilar algunos o todos los microorganismos en la muestra. Los métodos de la presente invención son altamente versátiles y no requieren que todos los microorganismos estén vivos para que se presente el aislamiento e identificación. En ciertas modalidades, algunos o todos los microorganismos pueden estar muertos, con la muerte que se presenta antes, durante y/o después de que se lleven a cabo los pasos de los métodos.

Los detalles adicionales y la descripción de los amortiguadores de lisis contemplados en la práctica de esta invención se describen en la solicitud de Patente de los Estados Unidos, pendiente, no. de serie , presentada el 30 de octubre del 2009, titulada "Methods for Isolation and Identification of icroorganisms" , los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Paso de Separación El siguiente paso del método de la presente invención (por ejemplo, el paso después de que se ha lisado la muestra, si se realiza un paso de lisis) es un paso de separación. El paso de separación se puede llevar a cabo para separar los microorganismos de otros componentes de la muestra (por ejemplo, no microorganismos o componentes de los mismos) y para concentrar los microorganismos en un sedimento que se puede interrogar para propósitos de identificación y caracterización. La separación no tiene que ser completa, es decir, no requiere que se presente 100 % de separación. Todo lo que se requiere es que la separación de los microorganismos de los otros componentes de la muestra sea suficiente para permitir la interrogación de los microorganismos sin interferencia sustancial de los otros componentes. Por ejemplo, la separación puede dar por resultado un sedimento de microorganismos que es al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 ¾ puro o mayor.

En una modalidad, la separación se lleva a cabo por un paso de centrifugación en el cual se coloca la muestra (por ejemplo, una muestra lisada) en la parte superior de un cojín de densidad en un recipiente de separación y el recipiente se centrifuga bajo condiciones que permitan que se aislen los microorganismos (por ejemplo, los microorganismos pueden formar un sedimento en el fondo y/o lados del recipiente) . De acuerdo a esta modalidad, otros componentes de la muestra (por ejemplo, no microorganismos o componentes de los mismos que pueden estar presentes en el medio de muestra) están en la parte superior del cojín de densidad o dentro de la porción superior del cojín de densidad. En general, se puede usar cualquier recipiente conocido para el paso de separación. En una modalidad, el recipiente de separación en el dispositivo de separación descrito en la solicitud de Patente de los Estados Unidos, relacionada, no. de serie , presentada el 30 de octubre del 2009, titulada "Separation Devide for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms" . Este paso de separación aisla los microorganismos de los materiales en la muestra, tal como el medio, desechos celulares y/o otros componentes que pueden interferir con la interrogación de los microorganismos (por ejemplo, por fluorescencia intrínseca) . En una modalidad, el cojín de densidad también sirve para separar microorganismos vivos de microorganismos muertos (que no pasa a través del cojín de densidad) . En otra modalidad, el cojín de densidad. No comprende un gradiente de densidad, ya sea antes o después de la centrifugación. En otras palabras, el recipiente de separación no se centrifuga durante una cantidad suficiente de tiempo y/o aceleración para que el material que constituye el cojín de densidad forme un gradiente de densidad.

La densidad del cojín se selecciona tal que los microorganismos en la muestra pasen a través del cojín en tanto que los otros componentes de la muestra (por ejemplo, caldo de cultivo sanguíneo, desechos celulares) permanezcan en la parte superior del cojín o no pasen por completo a través del cojín de densidad. El cojín de densidad también se puede seleccionar para separar microorganismos vivos (que pasan a través del cojín) de microorganismos muertos (que no pasan a través del cojín) . Las densidades adecuadas dependerán del material usado en el cojín de densidad y de la muestra que se va a separar. En una modalidad, la densidad del cojín está en el intervalo de aproximadamente 1.025 a aproximadamente 1.120 g/ml, por ejemplo, aproximadamente 1.030 a aproximadamente 1.070 g/ml, de aproximadamente 1.040 a aproximadamente 1.060 g/ml o cualquier intervalo entre aproximadamente 1.025, a aproximadamente 1.120 g/ml. En otra modalidad, la densidad del cojín es de aproximadamente 1.025, 1.030, 1.035, 1.040, 1.045, 1.050, 1.055, 1.060, 1.065, 1.070, 1.075, 1.080, 1.085, 1.090, 1.095, 1.100, 1.105, 1.110, 1.115 ó 1.120 g/ml .

El material para el cojín de densidad puede ser cualquier material que tenga el intervalo apropiado de densidad para los métodos de esta invención. En una modalidad, el material es sílice coloidal. La sílice coloidal puede estar no revestida (por ejemplo, LudoxMR (W.R. Grace, CT) ) o está revestida, por ejemplo, con silano (por ejemplo, PureSpermMR (Nidacon Int'l, Suecia) o IsolateMR (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ) o polivinilpirrolidona (por ejemplo, PercollMR, PercollMR Plus (Sigma-Aldrich, St . Louis, O) ) . En una modalidad, se selecciona la sílice coloidal que exhibe la menor interferencia con la interrogación espectroscopica, por ejemplo, el material con la fluorescencia intrínseca más baja. La sílice coloidal se puede diluir en cualquier medio adecuado para formar la densidad apropiada, por ejemplo, soluciones salinas balanceadas, solución salina fisiológica, y/o sacarosa 0.25 M. Las densidades adecuadas se pueden obtener con sílice coloidal a una concentración de aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 % v/v, por ejemplo, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 % v/v. Otro material adecuado para cojines de densidad es un agente de contraste, yodado, por ejemplo, iohexol (OmnipaqueMR NycoPrepMR, o NycodenzMR) e iodixanol (VisipaqueMR o OptiPrepMR) . Se pueden obtener densidades adecuadas con iohexol o iodixanol a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 % p/v, por ejemplo, de aproximadamente 14 % a aproximadamente 18 % p/v, para muestras de cultivo sanguíneo. Se puede usar sacarosa como un cojín de densidad a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % p/v, por ejemplo, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 % p/v, para muestras de cultivo sanguíneo. Otros materiales adecuados que se pueden usar para preparar el cojín de densidad incluyen aceites de baja viscosidad y alta densidad, tal como aceite de inmersión de microscopio (por ejemplo, Type DF; Cargille Labs, New Cork) , aceite mineral (por ejemplo, DrakeolMR 5, Draketex 50, PeneteckMR; Penreco Co., Pennsylvania) , aceite de silicón (polidimetilsiloxano) , aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrizoato-FicollMR (LymphoPrepMR) , por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 75 % a aproximadamente 100 % para muestras de cultivo sanguíneo, diatrizoato-dextrano (PolymorphoPrepMR) , por ejemplo, a una concertación de aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 % para muestras de cultivo sanguíneo, carboximetil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, óxido de polietileno (alto peso molecular), PluronicMR F127, PluronicMR F68, mezclas de compuestos PluronicMR, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico reticulado, polivinil-pirrolidina reticulada, metacrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR (por ejemplo, FicollMR 400 a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 % para muestras de cultivo sanguíneo) , glicerol, dextrano (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 % para muestras de cultivo sanguíneo) , glicógeno, cloruro de cesio (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 % para muestras de cultivo sanguíneo) , fluidos de perfluorocarburo (por ejemplo, perfluoro-n-octano) , fluidos de hidrofluorocarbono (por ejemplo, Vertrel XF) , y similares, así como los bien conocidos en la técnica. En una modalidad, el cojín de densidad se selecciona de uno o más de sílice coloidal, iodixanol, iohexol, cloruro de cesio, metrizoato-FicolMR, diatrizoato-dextrano, sacarosa, FicolMR 400 y/o dextrano en cualquier combinación. El cojín de densidad también se puede constituir en una combinación de materiales, por ejemplo, una combinación de sílice coloidal y aceite. Ciertas combinaciones de los compuestos anteriores pueden ser benéficas para los pasos de separación y lectura de la presente invención. Por ejemplo, las combinaciones de compuestos con diferentes propiedades de extinción de UV, tal como cloruro de cesio e Iohexol.

El volumen/peso del cojín de densidad debe ser suficiente para lograr la separación de los microorganismos de otros componentes de muestra. El volumen dependerá del tamaño y forma del recipiente de separación. En general, se puede usar un volumen de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a 0.5 mi . Si la separación se realiza a microescala, el volumen del coj ín de densidad puede ser de aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? . El volumen de la muestra colocada o estratificada en la parte superior del cojín de densidad debe ser suficiente para proporcionar suficientes microorganismos para producir un sedimento adecuado para interrogación. En general, cualquier volumen que se ajuste en el recipiente se puede usar. Por ejemplo, se puede usar un volumen de aproximadamente 0.1 mi a aproximadamente 5 mi , por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a aproximadamente 1 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a aproximadamente 0.5 mi . Si la separación se realiza a una microescala, el volumen de la muestra puede ser aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? . El espacio disponible del recipiente para la muestra dependerá de la muestra dependerá del tamaño y de la forma del recipiente. En algunas modalidades, se puede colocar una capa intermedia (líquida o sólida) en la parte superior del cojín de densidad antes de que la muestra se coloque o estratifique en la parte superior a fin de impedir cualquier mezclado del cojín de densidad y de la muestra. En una modalidad, la capa intermedia pueden ser cuentas de polietileno. En otra modalidad, se puede colocar una pequeña burbuja de aire entre el cojín de densidad y la muestra para impedir el mezclado. En una modalidad adicional, el cojín de densidad se puede estratificar en la parte superior de un material de alta densidad (por ejemplo, un fluido de perfluorocarburo) tal que los microorganismos pasen a través del cojín de densidad durante la separación y se recolecten en la entrecara entre el cojín de densidad y el material de alta densidad.

En una modalidad de la invención, el recipiente de separación se centrifuga en un rotor giratorio de modo que los microorganismos formen un sedimento directamente en el fondo del recipiente. El recipiente se centrifuga a una aceleración suficiente durante un tiempo suficiente para que los microorganismos se separen (por ejemplo, un sedimento formado) de los otros componentes de la muestra. La aceleración de centrifugación puede aproximadamente 1,000 x g a aproximadamente 20,000 x g, por ejemplo, aproximadamente 2,500 x g a aproximadamente 15,000 x g, por ejemplo, de aproximadamente 7,500 x g a aproximadamente 12,500 x g, etc. El tiempo de centrifugación puede ser de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 15 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos. La centrifugación se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, por ejemplo, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30°C. En una modalidad, el recipiente de separación comprende un cierre, y el cierre se aplica al siguiente para formar un sello hermético antes de la centrifugación. La presencia de un cierre disminuye los riesgos de manejar microorganismos que son o pueden ser infecciosos y/o peligrosos, así como el riesgo de contaminar la muestra. Una de las ventajas de los métodos de la invención es la capacidad de llevar a cabo cualquiera o más de los pasos de los métodos (por ejemplo, lisis, separación, interrogación, y/o identificación) con los microorganismos en un recipiente sellado (por ejemplo, un recipiente herméticamente sellado) . Los presentes métodos, que comprenden el uso de sistemas automatizados, evitan riesgos a la salud y de seguridad asociados con el manejo de microorganismos altamente virulentos, tal como se presenta con la recuperación de microorganismos de muestras de la prueba directa. En una modalidad, el recipiente no se centrifuga durante un tiempo suficiente y/o con una fuerza suficiente para que se forme un gradiente de densidad dentro del cojín de densidad. La presente invención no comprende la ultracentrifugación de muestras, por ejemplo, centrifugación a fuerzas mayores de aproximadamente 100,000 x g. Adicionalmente , la presente invención no comprende sedimentación isopícnica (equilibrio) o bandeo.

El recipiente de separación puede ser cualquier recipiente con volumen suficiente para retener un cojín de densidad en una muestra. Como se señala en la presente, el dispositivo de separación descrito en la solicitud de Patente de los Estados Unidos relacionada, No. de serie , presentada el 30 de octubre del 2009, titulada "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Miicroorganisms" , que se puede usar en la práctica de esta invención. En una modalidad, el recipiente se ajusta o se puede ajustar en un rotor de centrifuga. El volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 0.1 mi a aproximadamente 25 mi, por ejemplo, de aproximadamente 1 mi a aproximadamente 10 mi, por ejemplo, de aproximadamente 2 mi a aproximadamente 8 mi . Si la separación se hace a una microescala, el volumen del recipiente puede ser aproximadamente 2 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? . En una modalidad, el recipiente tiene un diámetro interno amplio en una porción superior para mantener la muestra y la mayoría del cojín de densidad, y un diámetro interno más estrecho en una porción inferior donde se recolecta el sedimento de los microorganismos. La porción estrecha puede tener un diámetro interno de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.12 pulgadas (0.1016 a 0.3048 cm) , por ejemplo, de aproximadamente 0.06 a aproximadamente 0.10 pulgadas (0.1524 a 0.254 cm) , por ejemplo aproximadamente 0.08 pulgadas (0.2032 cm) . La porción amplia puede tener un diámetro interno de aproximadamente 0.32 a aproximadamente 0.40 pulgadas (0.8128 a 1.016 pulgadas), por ejemplo de aproximadamente 0.34 a aproximadamente 0.38 pulgadas (0.8636 a 0.9652 cm) , por ejemplo de aproximadamente 0.36 pulgadas (0.9144 cm) . Para separaciones a microescala, los diámetros internos pueden ser aún más pequeños. Por ejemplo, el diámetro interno de la porción estrecha puede ser aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.04 pulgadas (0.00254 a 0.1016 cm) , por ejemplo, de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.01 pulgadas (0.00508-0.0254 cm) una porción de diámetro interno ahusado puede conectar las porciones superior e inferior. La porción ahusada puede tener un ángulo de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 grados, por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 grados. En una modalidad, la porción estrecha inferior es menor que la mitad de la altura total del recipiente, por ejemplo, menor de aproximadamente 40 %, 30 %, 20 % ó 10 % de la altura total del recipiente. El recipiente puede tener un dispositivo de cierre unido o se puede roscar para aceptar un dispositivo de cierre (por ejemplo, una tapa) tal que el recipiente se pueda sellar herméticamente durante la centrifugación. En ciertas modalidades, el recipiente se diseña tal que la muestra o sedimentos de microorganismos se pueda recuperar fácilmente, u obtener o remover de otro modo el recipiente después de la separación, ya sea manualmente o de una manera automatizada (de modo que los técnicos no se expongan a los contenidos del recipiente) . Por ejemplo, el recipiente puede comprender una porción removible o una porción separable que contiene el sedimento y que se puede separar del resto del recipiente. En otra modalidad, el recipiente puede comprender medios para el acceso al sedimento después de la separación, tal como uno o más orificios o superficies permeables para la inserción de una jeringa u otro dispositivo de muestreo o para extraer el sedimento. En una modalidad, el recipiente puede ser un tubo, por ejemplo, un tubo de centrífuga. En otra modalidad, el recipiente puede ser un chip o una tarjeta. En una modalidad, el recipiente es un recipiente independiente, es decir, un dispositivo para separar una muestra individual. En otras modalidades, el recipiente es parte de un dispositivo que comprende dos o más recipientes de separación tal que se pueden separar múltiples muestras al mismo tiempo. En una modalidad, el dispositivo comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96 ó más recipientes de separación.

El recipiente puede comprender una ventaja óptica a través de la cual puede presentarse la interrogación. La ventana óptica puede estar encima del fondo, parte superior y/o lados del recipiente. La ventana puede estar comprendida de cualquier material que tenga una estructura vibracional que sea distinguible de los espectros del microorganismo. Otras técnicas de discriminación tal como espectroscopia Raman confocal se puede utilizar para adquirir los espectros vibracionales del microorganismo en tanto que rechaza los espectros del material de ventana; esta técnica es bien conocida por los expertos en la técnica. Una técnica adicional es espectroscopia Raman espacialmente disfrazada en la cual la fibra de excitación se desplaza a lo largo de la ventana de la emisión (espectros de Rayleig y Raman) . También se conoce esta técnica por los expertos en la técnica como un medio para discriminar entre un material de ventana y una cantidad que se va a medir por abajo de la ventana. Para permitir la interrogación del sedimento microbiano con técnicas espectroscópicas adicionales, la ventana también se puede componer de cualquier material que sea transparente a la luz (por ejemplo, al menos una porción del espectro de luz casi infrarroja (NIR; 700 nm-1400 nm) , ultravioleta (UV; 190 nm-400 nm) y/o visible (VIS; 400 nm-700 nm) ) . En una modalidad, la ventana óptica es suficientemente delgada para permitir interrogación espectroscópica, que dependerá del material de la ventana y del método usado para la interrogación. En otra modalidad, la ventana óptica es tan delgada como sea posible para reducir la interferencia con la interrogación espectroscópica. Por ejemplo, la ventana puede tener un espesor menor de aproximadamente 0.20 pulgadas (0.058 cm) , por ejemplo, menos de aproximadamente 0.15, 0.10 ó 0.05 pulgadas (0.381, 0.254, ó 0.127 cm) .

En otra modalidad, la separación se lleva a cabo por un paso de filtración en el cual se coloca la muestra (por ejemplo, una muestra lisada) en un dispositivo adaptado con un filtro selectivo o filtro ajustado con tamaños de poro que retienen los microorganismos. Los microorganismos retenidos se pueden lavar al pasar suavemente un amortiguador adecuado a través del filtro. Los microorganismos lavados entonces se pueden interrogar directamente en el filtro y/o recuperar para interrogación al muestrear directamente la superficie del filtro o al volver a enjuagar el filtro con amortiguador acuoso adecuado .

Paso de Interrogación Una vez que se han separado, aislado y/o sedimentado los microorganismos, la muestra separada, la muestra aislada o el sedimento se pueden interrogar para identificar y/o caracterizar los microorganismos en la muestra o sedimento. En una modalidad, la interrogación toma lugar de una manera no invasiva, es decir, el sedimento se interroga en tanto que permanece en el recipiente de separación. En otra modalidad, el recipiente de separación permanece sellado a todo lo largo de la interrogación. La capacidad para identificar los microorganismos de una manera no invasiva, opcionalmente acoplados con mantener el recipiente sellado a todo lo largo del proceso de separación y de identificación/caracterización y automatizando algo o todo del procedimiento se evita el manejo constante de muestras contaminadas y/o infecciosas e incrementa en su mayor parte la seguridad del proceso completo. Además, la capacidad para identificar microorganismos por interrogación directa sin procesamiento adicional del sedimento (por ejemplo, re-suspensión, colocación en placa y crecimiento de colonias) incrementa en su mayor parte la velocidad con la cual se puede hacer la identificación. En una modalidad, el sedimento se recupera y/o re-suspende y opcionalmente se remueve del recipiente de separación antes de la interrogación. En otra modalidad, el sedimento se recupera y/o re-suspende después de la interrogación in situ y entonces se llega a cabo la interrogación adicional. Por ejemplo, las técnicas tal como pruebas de aglutinación en látex o pruebas automatizadas de identificación fenotípica que se pueden aplicar a los microorganismos aislados pero no a un sedimento de microorganismos se pueden llevar a cabo en los microorganismos recuperados y/o re-suspendidos .

En algunas modalidades, la muestra o sedimento aislado se puede interrogar de manera espectroscópica . La espectroscopia se puede usar para analizar una o más propiedades intrínsecas de los microorganismos, por ejemplo, una propiedad presente dentro del microorganismo en la ausencia de agentes adicionales, tal como manchas, tintes, agentes aglutinantes, etcétera. En otras modalidades, la espectroscopia se puede usar para analizar una o más propiedades extrínsecas de los microorganismos, por ejemplo, una propiedad que sólo se puede detectar con la ayuda de agentes adicionales. La interrogación se puede llevar usando, por ejemplo espectroscopia infrarroja.

Espectroscopia Raman, que incluye Espectroscopia Raman Mejorada en Superficie (SERS) , espectroscopia Raman espacialmente desfasada (SORS) , espectroscopia Raman de transmisión, y/o espectroscopia Raman de resonancia. Para mejorar las señales Raman (SERS) , los microorganismos ya sea se pueden revestir con nanopartículas de oro y/o plata antes de la centrifugación, y/o la superficie óptica interna se puede pre-revestir con coloides metálicos de tamaño y forma particular (Efrima et al, J. Phys . Chem. B. (Letter) 102:5941 (1998) para SERS). En otra modalidad, las nanopartículas están presentes en el cojín de densidad antes de la centrifugación y se asocian con microorganismos conforme los microorganismos pasan a través del cojín de densidad. En una modalidad, la muestra o sedimento aislado se interroga en tanto que permanece en el recipiente de separación. El recipiente se puede interrogar a través de una ventana óptica en el recipiente. La ventana óptica puede estar en el fondo y/o cualquier lado o lados y/o en la parte superior del recipiente. En una modalidad, el recipiente de separación se ajusta en o se puede ajustar en un soporte en un espectrómetro en una posición adecuada para interrogación. La interrogación espectroscópica se puede llevar a cabo por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica que sea efectiva para detectar y/o identificar una o más propiedades intrínsecas o extrínsecas de microorganismos. En otra modalidad, como se describe en la presente, la muestra o sedimento aislado se puede remover para interrogación (por ejemplo, la muestra o sedimento aislado se puede remover y preparar para interrogación por espectrometría de masa, como es bien conocido en la técnica) . En aún modalidades adicionales, la muestra o sedimento aislado se puede interrogas usando más de un medio. Por ejemplo, la muestra o sedimento aislado se puede interrogar usando espectroscopia de fluorescencia y espectroscopia Raman. De acuerdo con esta modalidad, estos pasos de interrogación se pueden llevar a cabo de manera secuencial o simultáneamente.

La fuente de excitación de muestra se puede seleccionar de cualquier número de fuentes adecuadas de luz como se conoce por los expertos en la técnica. Se puede usar cualquier porción del espectro electromagnético que produzca datos útiles. Las fuentes de luz capaces de emisión en los espectros ultravioleta, visible y/o casi infrarrojo, así como otras porciones del espectro electromagnético, se pueden utilizar y se conocen por los expertos en la técnica. Puesto que la generación de espectros Raman en general es un proceso ineficiente (por ejemplo, 1 fotón Raman generado por cada un millón de fotones incidentes) , Raman requiere una fuente de luz con un gran flujo de fotones. Desde la invención del láser en 1960 ( aiman, Nature) , los sistemas Raman han usado una fuente de luz láser para obtener espectros Raman. La luz láser se hace pasar a través de un filtro altamente selectivo (muesca) que permite la banda estrecha de longitud de onda de emisión de láser para transmitir a través del filtro en tanto que bloquea otros artefactos generados por el láser (por ejemplo, emisión espontánea amplificada, fluorescencia, líneas de plasma, etc.) La luz de láser se guía a la muestra usando una variedad de sistemas ópticos que se pueden crear usando sistemas de lente de relé, fibras ópticas, o una combinación de ambos . La luz láser se enfoca en la muestra usando un lente (tal como un objetivo de microscopio) de modo que se obtenga un pequeño punto de energía óptica concentrada en la muestra .

La luz retrodispersada Raman y la luz de excitación retrodispersada se recolectan y coliman por el mismo objetivo de microscopio. La luz dispersada a traviesa a través de un filtro óptico que separa la luz dispersada Raman de la luz de excitación. La luz dispersada de Raman entonces se propaga usando un lente y/o un sistema de fibras ópticas hacia un espectrofotómetro que dispersa la luz dispersada de Raman de modo que golpea sobre un arreglo detector de CCD.

La dispersión espacial de la luz dispersada de Raman genera un espectro (por ejemplo, longitud de onda dispersada versus intensidad) que se puede almacenar y comparar a espectros de referencia para caracterización.

La emisión de la muestra se puede medir por cualquier medio adecuado de discriminación espectral, de manera más preferente empleando un . espectrómetro. El espectrómetro puede ser un monocromador de exploración que detecta longitudes de onda de emisión, específicas, por lo que la salida del monocromador se detecta por un tubo fotomultiplicador y/o el espectrómetro se puede configurar como un espectrógrafo de formación de imágenes por lo que la salida se detecta por un arreglo detector de formación de imágenes tal como un arreglo detector de dispositivo acoplado a carga (CCD) . En una modalidad, un discriminador permite la observación de la fluorescencia y/o señal de dispersión por un medio de fotodetección (tal como un tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avalancha, arreglo detector de CCD, y/o arreglo detector de dispositivo de carga multiplicador de electrones (EMCCD) ) .

De acuerdo a la invención, se toman medidas de control para microorganismos conocidos, permitiendo de este modo la correlación de los datos medidos de prueba con la caracterización de los microorganismos de interés usando varios métodos matemáticos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, los datos de muestra se pueden comparar con las mediciones de control o de línea base utilizando sistemas de software conocidos por el experto en la técnica. De manera más particular, los datos se pueden analizar por varios métodos de análisis de multivariable , tal como, por ejemplo, Análisis Discriminante General (GDA) , Análisis Discriminante, Parcial, de Mínimos Cuadrados (PLSDA) , regresión Parcial de Mínimos Cuadrados, Análisis de Componentes Principales (PCA) , Análisis de Factor Paralelo (PARAFAC) , Análisis por Red Neural (N A) y/o Máquina de Vector de Soporte (SVM) . Estos métodos se pueden usar para clasificar microorganismos desconocidos de interés en grupos pertinentes en base a nomenclatura existente y/o en grupos que se presentan en forma natural en base al metabolismo, patogeneidad y/o virulencia del organismo al diseñar el sistema para monitorizar, detectar y/o caracterizar el organismo como se describe anteriormente.

En aún otra modalidad, las mediciones no espectroscópicas del sistema de detección, tal como tiempos de detección y velocidades de crecimiento se pueden usar para ayudar en la caracterización y/o identificación de microorganismos de la muestra o sedimento aislado. Adicionalmente , las mediciones tomadas de una imagen fotográfica de la región inferior del dispositivo de separación pueden proporcionar información valiosa de la identidad del producto aislado, tal como tamaño, forma, color y densidad del sedimento.

En algunas modalidades de la invención, la caracterización y/o identificación de los microorganismos en la muestra o sedimento aislado no necesita comprender la identificación de una especie exacta. La caracterización abarca la categorización o clasificación amplia de partículas biológicas así como la identificación real de una especie única. La clasificación del microorganismo de una muestra o sedimento aislado puede comprender la determinación de características fenotípicas y/o morfológicas para el microorganismo. Por ejemplo, la caracterización de las partículas biológicas se puede lograr en base a diferencias observables, tal como, composición, forma, tamaño, agrupación y/o metabolismo. En algunas modalidades, la clasificación de las partículas biológicas de interés puede no requerir conocimiento previo de las características de una partícula biológica determinada sino sólo requerir correlaciones consistentes con mediciones empíricas haciendo de esta manera a este método en general y más fácilmente adaptable que los métodos que se basan en eventos específicos de unión o en reacciones metabólicas. Como se usa en la presente "identificación", significa determinar a qué familia, género, especie y/o cepa corresponde un microorganismo previamente desconocido. Por ejemplo, la identificación de un microorganismo previamente desconocido a la familia, género, especie y/o nivel de cepa.

En algunos casos, la caracterización abarca modelos de clasificación que proporcionan suficiente información útil para que se tome una acción. Como se usa en la presente, los modelos preferidos de clasificación comprenden agrupar en uno o más de lo siguiente: (1) Grupos Gram; (2) Grupos Gram Clínicos; (3) Grupos Terapéuticos; y (4) Grupos Funcionales. (1) Grupos Gram : Dentro de la clasificación de Grupos Gram, se pueden colocar microorganismos en una de tres categorías de clasificación amplia en base a su reacción de tinción Gram y tamaño total, estos grupos se seleccionan de uno o más de lo siguiente: (a) microorganismos Gram-positivos que manchan azul oscuro con la tinción Gram; (b) microorganismos Gram-negativos que manchan rojo con la tinción Gram; y (c) células de levadura que manchan azul oscuro con la tinción Gram, pero son células grandes redondeadas que se distinguen de bacterias por sus características morfológicas y por su tamaño. (2) Grupos Gram Clínicos: Los Grupos Gram se pueden dividir adicionalmente en varias categorías secundarias que representan características morfológicas distintivas. Estas categorías secundarias comprenden toda la información clínica pertinente reportada por un técnico laboratorista experimentado, proporcionando de este modo un mayor nivel de identificación que una reacción Gram positiva o negativa. Esta clasificación particular es muy útil debido a que elimina cuestiones a cerca de depender de la calidad de una tinción Gram y/o el nivel de habilidad del técnico que lee la embarradura al proporcionar la información equivalente clínicamente pertinente con un sistema automatizado. De manera más específica, las categorías secundarias de los microorganismos en base a este modelo de clasificación se pueden seleccionar de uno o más de lo siguiente: (a) cocos, que son células redondeadas pequeñas; (b) diplococos, que son dos células redondeadas pequeñas unidas conjuntamente; (c) varillas, que son de forma rectangular; y (d) bacilos, que son de forma de varilla. Los ejemplos de estas categorías secundarias que se pueden determinar por información morfológica adicional incluyen: (i) cocos Gram-positivos ; (ii) cocos Gram-positivos en cadenas; (iii) cocos Gram-positivos en agrupaciones (es decir, agrupaciones "tipo uva"); (iv) diplococos Gram- positivos; (v) varillas Gram-positivas ; (vi) varillas Gram-positivas con endosporas; (vii) varillas Gram-negativas ; (viii) cocobacilos Gram-negativos ; (ix) diplococos Gram-negativos; (x) levadura; y (xi) hongos filamentosos. (3) Grupos Terapéuticos: Los grupos terapéuticos comprenden múltiples especies microbianas que, cuando se aislan de tipos particulares de especie, se tratan con la misma clase de antibióticos o mezcla de antibióticos (por ejemplo, como se describe en "Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"). En muchos casos, no se requiere identidad a nivel de especie por el facultativo para permitir un cambio de la terapia empírica inicial a una terapia más dirigida debido a que se puede tratar más de una especie con la misma elección de antibióticos. Este nivel de clasificación coloca correctamente estos microorganismos de "mismo tratamiento" en categorías terapéuticas individuales. Los ejemplos de este nivel de caracterización incluyen la capacidad de distinguir especies Enterobacterianas altamente resistentes (EB) de especies EB sensibles (Enterobacter spp. de E. coli) , o especies Candida resistentes a fluconazol (C. glabrata y C. kruzei) de especies Candida sensibles (C albicans y C. parapsilosis) , y demás. (4) Grupos Funcionales : De acuerdo a la invención, también se pueden colocar microorganismos en varios grupos en base a una mezcla de características metabólicas, virulentas y/o fenotípicas. Los organismos no termentadores se pueden distinguir claramente de los termentadores . Adicionalmente, las especies de microorganismo que producen hemolisinas se pueden agrupar de manera separada de las especies no hemolíticas. En algunos casos, estos grupos representan categorías amplias que a nivel de género (por ejemplo, coliformes, varillas no fermentadoras Gram-negativas) , algunos al nivel del género (por ejemplo, Enterococcus , Candida) , y algunos con discriminación más cercana al nivel de especie (por ejemplo, estafilococos negativos a coagulasa, estreptococos alfa-hemolíticos, estreptococos beta-hemolíticos, estafilococos positivos a coagulasa, es decir, S. aureus) .

Además de medir las propiedades intrínsecas de los microorganismos para propósitos de identificación, los métodos de la presente invención pueden comprender además el uso de agentes identificadores adicionales para ayudar en el proceso de separación y/o identificación. Los agentes que se unen a microorganismos específicos, tal como ligandos de afinidad, se pueden usar para separar microorganismos, para identificar una clase o especie de microorganismo (por ejemplo, a través de la unión a un receptor o proteína de superficie, única) y/o para identificar una característica del microorganismo (por ejemplo, resistencia a antibiótico) . Los agentes identificadores útiles incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos (por ejemplo, anti-Eap para la identificación de S. aureus) , sondas de ácido nucleico, antibióticos (por ejemplo, penicilina, vancomicina, polimixina B) , aptámeros, miméticos peptídicos, proteínas de unión derivadas de fagos, lectinas, biomarcadores de inmunidad innata al hospedador (proteínas de fase aguda, proteínas de unión a LPS, CD14, lectina de unión a mañosa, receptores tipo cuota) , péptidos de defensa del hospedador (por ejemplo, defensinas, catelicidinas , proteogrinas , magaininas) , bacterocinas (por ejemplo, lantibióticos , tal como nisina, mersacidina, epidermina, gallidermina , y plantaricina C, y péptidos de clase II) , bacteriófagos, y tintes selectivos para ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, polisacáridos, cápsulas/babaza o proteínas, o cualquier combinación de éstos. Si el agente en sí mismo no da una señal Raman detectable, el agente se puede marcar para proporcionar una señal detectable, tal como al conjugar el agente a un trazador activo de Raman, tal como dimetilaminoazobenceno (DAB) y , 4 ' ' -dipiridil (DPY) (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,376,556 y 7,518,721) . El agente se puede adicionar a los microorganismos en cualquier paso de los métodos de la invención, por ejemplo, cuando la muestra se obtiene, durante la lisis, y/o durante la separación. En algunas modalidades, la presencia del agente del sedimento se puede determinar durante la interrogación del sedimento. Como se apreciará fácilmente por un experto en la técnica, la sensibilidad de un microorganismo particular a cualquier compuesto que afecte su estado físico o metabolismo, tal como un antibiótico, se puede determinar fácilmente al adicionar el compuesto a la muestra, amortiguador de lisis, cojín de densidad o cualquier mezcla de éstos.

En un aspecto de la invención, el método puede comprender además el paso de recuperar el sedimento de microorganismos y realizar pruebas adicionales. En una modalidad, el sedimento se puede recuperar al aspirar el medio de muestra y el cojín de densidad. En otra modalidad, el sedimento se puede recuperar al insertar una jeringa en el recipiente y al aspirar el sedimento en tanto que permanecen intactos el medio de muestra y el cojín de densidad. El sedimento recuperado entonces se puede re-suspender en un medio adecuado, por ejemplo, solución salina. Una vez resuspendido, los microorganismos se pueden someter a cualquier prueba adicional que se desee, como es conocerá por los expertos en la técnica y como se describe anteriormente. En particular, cualquier prueba que requiera muestras limpias de microorganismos se puede llevar a cabo con los microorganismos resuspendidos . En algunas modalidades, se pueden realizar pruebas adicionales de identificación. Los ejemplos de pruebas de identificación incluyen VitekMR 2, pruebas de ácido nucleico amplificado y no amplificado (NAT) , ensayo de aglutinación en látex y cromogénico, inmunoensayos (por ejemplo, empleando anticuerpos marcados y/o otros ligandos) , espectrometría de masa (por ejemplo, espectrometría de masa MALDI-TOF) y/u otras técnicas ópticas tal como espectroscopia infrarroja (FTIR) o espectroscopia Raman. También se pueden realizar pruebas adicionales de caracterización, tal como resistencia a antibióticos y/o otros fármacos. La caracterización adicional puede ser parte de una prueba que se inició durante los pasos iniciales de separación e identificación del método. Por ejemplo, la detección de S. aureus resistente a meticilina puede empezar al adicionar penicilina marcada con trazador de Raman, a la muestra, antes de la separación de los microorganismos. Una vez que se ha recuperado y resuspendido el sedimento, se puede determinar el nivel de penicilina unida.

En un aspecto de la invención, se pueden automatizar algunos o todos los pasos de método. La automatización de los pasos de los métodos no sólo permite que se pruebe más rápidamente más muestras, también reduce los riesgos de errores humanos al manejar muestras que pueden contener microorganismos peligrosos y/o infecciosos.

En ciertas modalidades de la invención, los métodos también se pueden usar para detectar la presencia de microorganismos en una muestra de prueba. En estas modalidades, los métodos comprenden los pasos: (a) obtener una muestra de prueba; (b) lisar opcionalmente células en la muestra para producir una muestra lisasa; y (c) separar los microorganismos de otros componentes de la muestra lisada para formar un sedimento de microorganismos ; en donde la presencia de un sedimento indica que los microorganismos están presentes en la muestra de prueba. En una modalidad, el sedimento se detecta a simple vista. En otras modalidades, el sedimento se detecta por interrogación, por ejemplo, espectroscópicamente .

En algunas modalidades, los métodos de detección se pueden usar para monitorizar muestras para contaminación por microorganismos, por ejemplo, materias alimenticias, productos farmacéuticos, agua para beber, etc. En una modalidad, los métodos se pueden llevar a cabo de una manera repetitiva para monitoreo constante de contaminación, por ejemplo, una vez al mes, una vez a la semana, una vez al día, una vez cada hora, o en cualquier patrón de tiempo. En otra modalidad, se pueden probar las muestras conforme se necesite, por ejemplo, cuando se sospecha la contaminación. En modalidades adicionales, los métodos de detección se pueden usar para buscar la presencia de microorganismos en muestras clínicas, por ejemplo, cultivos sanguíneos. Por ejemplo, se puede remover una muestra de un cultivo sanguíneo en ciertos puntos de tiempo y el método de detección se lleva a cabo en la muestra para determinar si es positivo el cultivo sanguíneo. En una modalidad se puede tomar una muestra en un punto de tiempo establecido después de la inoculación del cultivo, por ejemplo, 24 horas después de la inoculación, para determinar si es positivo el cultivo sanguíneo. En otra modalidad, se pueden tomar muestras del cultivo sanguíneo regularmente, por ejemplo, cada 12, 6, 4, o 2 horas o cada 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5 minutos, para identificar cultivos sanguíneos positivos dentro de un tiempo corto de que son detectablemente positivos. En ciertas modalidades de los métodos de detección, el paso de detección se puede seguir opcionalmente por métodos de identificación como se describe en la presente.

En un aspecto de la invención, se pueden automatizar algunos o todos los pasos de método. La automatización de los pasos de los métodos permite que un mayor número de muestras se prueben más eficientemente y reduce los riesgos de errores humanos en el manejo de muestras que pueden contener microorganismos peligrosos y/o infecciosos. Sin embargo, de mayor importancia, la automatización puede dar resultados críticos en cualquier momento del día o noche sin retraso. Varios estudios han mostrado que la identificación más rápida de los microorganismos que provocan sepsis con relación a con cuidado mejorado del paciente, estancia más corta en hospital y menores costos totales.

Los detalles adicionales y la descripción del método para caracterizar y/o identificar microorganismos, de acuerdo con la presente invención, se describen en las solicitudes pendientes de Patente de los Estados Unidos Nos. De serie y , ambas presentadas el 30 de Octubre de 2009, tituladas "Method for Separation, Characterization y/o Identification of Microorganisms using Spectroscopy" y " ethod for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry" , respectivamente, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

La presente invención se detalla adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se ofrecen a manera de ilustración y no se proponen para limitar la invención de ninguna manera. Se utilizan técnicas normales bien conocidas o las técnicas descritas específicamente más adelante.

Ejemplos Ejemplo 1.- Método de Lisis-Centrifugación para Identificación de Microorganismos de Cultivo Sanguíneos por Espectroscopia Raman Se "sembraron" microorganismos a un bajo inoculo en botellas BacT/ALERTMR SA que contienen 10 mL de sangre humana. Se removieron muestras del caldo de cultivo sanguíneo de las botellas en el espacio de pocos minutos de ser marcadas positivas por el Sistema de Detección Microbiana BacT/ALERTMR 3D. Las muestras del caldo se procesaron para separar los microorganismos de la sangre y de los componentes del medio que pueden interferir con el análisis subsiguiente como sigue: Se combinaron 4.0 mL de caldo de los cultivos sanguíneos positivos recientes con 2.0 mL de Amortiguador de Lisis (0.45 % BrijMR 97 en 0.3M CAPS, pH 11.7), se mezclaron en vórtice durante 5 segundo y luego se incubaron en un baño de agua a 37°C durante 90 segundos. Después de la incubación, se estratificaron 0.95 mL de lisado en la parte superior de 0.5 mL del cojín de densidad (14 % p/v de Iohexol, Pluronic F-108 al 0.005 % en Hepes 10 mM, pH 7.4) en cada uno de cuatro tubos de centrífuga, cónicos, de 1.5 mL. Los cuatros tubos entonces se centrifugaron durante 2 minutos a 10,000 g a 25°C para sedimentar (agrupar) los microorganismos a través del cojín de densidad. La sangre lisada y el medio permanecieron por arriba del cojín.

Al termino del ciclo de la centrífuga, se removió el sobrenadante y los microorganismos sedimentados (agrupados) en cada tubo se resuspendieron con 10 de agua purificada. Los microorganismos resuspendidos de los 4 tubos se mezclaron en tubo limpio y se mezclaron suavemente. El volumen de cada espécimen procesado entonces se ajustó de modo que la densidad óptica a 660 nm (A66o) de la suspensión final fue igual a 20/cm. Los especímenes procesados ya sea se almacenaron a 2-8°C para la prueba en el mismo día, o se tomaron en alícuota y se congelaron a -70°C para la prueba en una fecha posterior.

Ejemplo 2. Análisis de Especímenes de Microorganismos Procesados de Cultivos Sanguíneos Positivos con Lisis-Centrifugación por Espectroscopia Raman.

Especímenes procesados de acuerdo al procedimiento en el Ejemplo 1 se descongelaron rápidamente a 37°C (si están previamente congelados), y se mezclaron suavemente. Una porción del espécimen se mantuvo sin diluir y el resto de diluyó a 1:2 en agua purificada. Un microlitro de cada espécimen diluido y no diluido se aplicó a la primera superficie de un portaobjetos de microscopio revestido con oro y se dejó secar bajo condiciones ambientes.

Después del secado, se adquirieron 25 espectros en un patrón de rejilla de 5x5 para cada uno de los especímenes secos con un microscopio Raman Modelo Rx l (Kaiser Optical Systems Inc., Michigan) a una longitud de onda de iluminación de 785 nm. El microscopio estuvo equipado con un lente objetivo 40X, la potencia del láser se ajustó a 400 mw, y cada uno de los 25 espectros individuales se adquirió con un tiempo de acumulación de 5 segundos.

Después de la adquisición, los espectros se preprocesaron para realizar substracción oscura, remoción de artefactos de rayos cónicos, truncamiento espectral, sustracción de línea base, normalización, y remoción de valores atípicos en la preparación y análisis estadístico multivariable .

Los espectros Raman representativos de los microorganismos seleccionados, recuperados y procesados de cultivos sanguíneos positivos, se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 muestra espectros de cuatro especies de microorganismos; cuatro aislados de C. albicans, seis aislados de P. aeruginosa , treces aislados de E. coli, y treces aislados de S. aureus. Los espectros de cada especie se promediaron para claridad de ilustración.

Las diferencias consistentes a través de los espectros de las diferentes especies son fácilmente evidentes para estos organismos. Esto muestra que se ha removido el medio de cultivo y la sangre potencialmente entorpecedores de suficiente para obtener espectros característicos para los microorganismos después del procesamiento .

La Figura 2 muestra los 13 espectros Raman individuales de los aislados de S. aureus que se mostraron promediados en la Figura 1. Los treces espectros muestran la consistencia del espectro Raman para este microorganismo a través de diferentes aislados clínicos, aún cuando crezcan en diferentes cultivos sanguíneos con diferentes donadores de sangre .

Ejemplo 3. Análisis no Invasivo de Especímenes de Microorganismos Procesados de Cultivos Sanguíneos Positivos con Lisis-Centrifugación por Espectroscopia Raman.

Se "sembraron" microorganismos a un inoculo bajo en botellas BacT/ALERTMR SA que contienen 10 mL de sangre humana. Las muestras de caldo de cultivo sanguíneo se removieron de las botellas en el espacio de unos pocos minutos de ser marcadas positivas por el Sistema de Detección Microbiana BacT/ALERTMR 3D. Las muestras se trataron como sigue: 1. Una muestra de 2.0 mL de caldo positivo se mezcló con 1.0 mL de amortiguador de lisis, selectivo (0.45 % p/v BrijMR 97 + 0.3M CAPS, pH 11.7), luego se colocó en un baño de agua a 37 °C durante 1 minuto. 2. Una muestra de 1.0 mL del lisado se sobrepuso sobre 0.5 mL de cojín de densidad (24 % p/v de cloruro de cesio en Hepes 10 mM ph 7.4 + Pluronic F-108 al 0.005 %) contenido en un tubo de separación, óptico, construido a medida. Estuvo presente una bola de polipropileno en la superficie del cojín de densidad para facilitar la carga sin perturbar las dos fases acuosas. 3. El tubo de separación óptica se selló con una capa rosca y se centrifugó durante 2 minutos a 10,000 rpm (microcentrífuga EppendorfMR 5417R equipada con un rotor giratorio A- 8 -11; ver Figura 4) . 4. El tubo sellado se transfirió a un adaptador construido a medida que facilitó la interrogación del sedimento microbiano en la base del tubo por un microscopio Raman Modelo RxNl (Kaiser Optical Systems Inc., Michigan) a una longitud de onda de iluminación 785 nm. También se registraron los espectros de tubo de separación vacíos para establecer los espectros Raman de línea base del plástico.

La Figura 3 muestra los espectros Raman tomados a través del tubo de separación de plástico tanto con cómo sin un sedimento de microorganismos. De este modo, los espectros se dominan por bandas Raman del plástico mismo; sin embargo, son visibles bandas únicas a los microorganismos sólo en el espectro del sedimento microbiano a números de onda cercanos a 1227/cm, 1583/cm, y 1660/cm. También están presentes otras bandas de microorganismos, pero se entorpecen por las bandas más fuertes de plástico a esta escala.

La Figura 4 muestra los espectros Raman de tres microorganismos después de que se ha removido el fondo al substraer el espectro ' del tubo de separación de plástico, vacío. En tanto que esta sustracción de fondo no es 100 % efectiva, las bandas espectrales de los microorganismos son claramente visibles. Otras geometrías de adquisición, tal como adquisición de transmisión o desfase espacial, son probables que mejoren adicionalmente la compensación de fondo (ver, por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos nos. 2008/0129992 y 2009/0244533) .

Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la presente invención, y no se van a considerar como que limitan la misma. La invención se define por las siguientes reivindicaciones, con los equivalentes de las reivindicaciones que se incluyen en la presente. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, publicaciones de patente, y cualquier otra referencia citada en la presente se incorporan como referencia en sus totalidades para las enseñanzas pertinentes a la secuencia y/o párrafo en el cual se presenta la referencia.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, caracterizado porque comprende : (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente células no de microorganismos en la muestra de prueba para producir una muestra Usada; (c) separar los microorganismos de otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar los microorganismos aislados usando una o más técnicas de espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscopicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscopicas con mediciones espectroscopicas tomadas o con propiedades espectroscopicas previstas, de microorganismos conocidos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los pasos (c) , y (d) se llevan a cabo en un recipiente sellado y en donde no es invasivo el paso (d) de interrogación.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la técnica de espectroscopia Raman se selecciona del grupo que consiste de espectroscopia Raman, espectroscopia Raman confocal , espectroscopia Raman mejorada en superficie, espectroscopia Raman espacialmente desfasada, espectroscopia Raman de resonancia, espectroscopia Raman de transmisión, y cualquier combinación de estas.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más características fenotípicas y/o morfológicas.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más mediciones de tiempo de detección, velocidad de crecimiento y tamaño, forma, color y/o densidad del sedimento de microorganismos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en uno o más modelos de clasificación seleccionados del grupo que consiste de Grupos Gram, Grupos Gram Clínicos, Grupos Terapéuticos y Grupos Funcionales.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se identifican a nivel de género, a nivel de especie o a nivel de cepa.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (b) de lisis selectiva se realiza usando una solución de lisis que comprende uno o más detergentes .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se selecciona uno o más detergentes del grupo que consiste de TritonMR X-100, TritonMR X-100-R, TritonMR X-114, NP-40, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, IgepalMR CA 630, ArlasolveMR 200, BrijMR 96/97, CHAPS, octil^-D-glucopiranosido, saponina, éter monododecílico de nonaetilenglicol (C12E9, polidocenol) , didecil-sulfato de sodio, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sodio, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosul fobetaína- 14 , C7BzO, BrijMR 98, BrijMR 58, BrijMR 35, TweenMR 80, TweenMR 20, PluronicMr L64, PluronicMR P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201), anfipoles (P AL-C8) , y metil-p-ciclodextrina.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el detergente es un detergente de polioxietileno que comprende la estructura C12-

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el detergente de polioxietileno se selecciona del grupo que consiste de BrijMR 97, BrijMR 96V, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, y polidocenol .

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la solución de lisis comprende además una o más enzimas, y en donde la una o más enzimas comprenden una mezcla de una o más proteínas y una o más nucleasas.

13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la solución de lisis comprende uno o más agentes amortiguadores.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra lisadas se estratifica en un cojín de densidad en el recipiente, y en donde el recipiente se centrifuga para formar un sedimento de microorganismo.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el cojín de densidad se selecciona del grupo que consiste de sílice coloidal, agentes de contraste yodados, sacarosa, aceite de inmersión de microscopio, aceite mineral, aceite de silicón, aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrizoato-FicollMR, diatrizoato-dextrano, carboximetil-celulosa , hidroxipropilmetil -celulosea , óxido de polietileno (de alto peso molecular), PluronicMR F127, PluronicMR F68, ácido poliacrílico , alcohol polivinílico reticulado, polivinil- pirrolidina reticulada, metracrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR, glicerol, dextrano, glicógeno, cloruro de cesio, fluidos de perfluorocarburos, fluido de hidrofluorocarburo y combinaciones de los mismos.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de prueba es una muestra de cultivo que se conoce que contiene microorganismos .

17. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de un cultivo sanguíneo, caracterizado porque comprende : (a) obtener una muestra de un cultivo sanguíneo que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente las células no de microorganismo en la muestra para producir una muestra lisada; (c) estratificar la muestra lisada en un cojín de densidad en un recipiente sellado; (d) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra y formar un sedimento de microorganismos; (e) interrogas espectroscópicamente los microorganismos aislados in situ usando una o más técnicas f 76 de espectroscopia Raman para producir mediciones microscópicas del microorganismo y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones 5 espectroscopicas con mediciones espectroscopicas tomadas, o con propiedades espectroscopicas previstas, de microorganismos conocidos.

18. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo, caracterizado porque comprende: 10 (a) obtener una muestra de prueba que se conocer que contiene o que puede contener microorganismos; (b) colocar la muestra de prueba en un recipiente sellado; (c) separar los microorganismos in situ de los 15 otros componentes de la muestra de prueba para formar una muestra aislada de microorganismos de los microorganismos en el recipiente sellado; (d) interrogar espectroscópicamente los microorganismos aislados in situ usando una o más técnicas 20 espectroscopia Raman para producir mediciones espectroscopicas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación de las mediciones espectroscopicas con mediciones espectroscopicas tomadas o 25 con propiedades espectroscopicas previstas, de microorganismos conocidos.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la técnica de espectroscopia Raman se selecciona del grupo que consiste de 5 espectroscopia Raman, espectroscopia Raman confocal, espectroscopia Raman mejorada en superficie, espectroscopia Raman espacialmente desfasada, espectroscopia Raman de resonancia, espectroscopia Raman de transmisión, y cualquier combinación de estas. 10

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más características fenotípicas y/o morfológicas.

21. El método de conformidad con la 15 reivindicación 18, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más mediciones de tiempo de detección, velocidad de crecimiento y tamaño, forma, color y/o densidad del sedimento de microorganismos.

22. El método de conformidad con la 20 reivindicación 18, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en uno o más modelos de clasificación seleccionados del grupo que consiste de Grupos Gram, Grupos Gram Clínicos, Grupos Terapéuticos y Grupos Funcionales.

23. El método de conformidad con la 25 reivindicación 18, caracterizado porque los microorganismos se identifican a nivel del género, a nivel de especie o al nivel de cepa .

24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la muestra se estratifica en un cojín de densidad en el recipiente, y en donde el recipiente se centrifuga para formar un sedimento de microorganismos.

25. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el cojín de densidad comprende uno o más de sílice coloidal, agentes de contraste yodados, sacarosa, aceite de inmersión de microscopio, aceite mineral, aceite de silicón, aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrizoato-FicollR, diatrizoato-dextrano, carboximetil-celulosa, hidroxipropilmetil -celulosa , óxido de polietileno (de alto peso molecular), PluronicMR F127, PluronicMR F68, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico reticulado, polivinil -pirrolidina reticulada, metracrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR, glicerol, dextrano, glicógeno, cloruro de cesio, fluidos de perfluorocarburo, y/o fluido de hidrofluorocarburo .

26. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la muestra de prueba es una muestra de cultivo que se conoce que contiene microorganismos.