CN107561058B - 一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法，属于生物工程技术领域，该方法无需发酵试验，即可对酵母风味物质代谢进行快速、准确、可靠性高的相似性评价。该方法包括取同一酵母菌株的不同的单菌落按照预定培养方式进行培养；取优势菌株作为对照菌株按照所述预定培养方式进行培养；将上述培养后的不同的单菌落和对照菌株分别进行拉曼单细胞光谱分析；对拉曼单细胞光谱分析得到的数据进行处理，通过比对不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值以及不同的单菌落和对照菌株的相似性R值之间是否存在差异显著性来判断不同的单菌落与对照菌株之间的相似性。本发明能够应用于工业Lager酵母菌株的复壮筛选中。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法。
背景技术
啤酒是一种深受人们喜爱的低酒精含量且营养丰富的饮料。随着人民生活水平的不断提高，其消费量与日俱增。同时，消费者对啤酒质量的需求及品评标准也在不断提高。
啤酒中的风味物质被认为是啤酒质量的重要评价指标之一，是产品质量的核心和灵魂，其特征会直接影响啤酒产品的品质及其市场竞争力。在啤酒的多组分风味体系中，高级醇和酯类物质是构成啤酒整体风味特色的主要物质，对啤酒的质量及风味典型性的形成起着关键性的作用。
传统上对酵母风味物质代谢产物的检测都是基于一定规模的发酵实验，结束后再通过高效气相/液相色谱的方法对发酵产物进行检测。基于发酵实验的风味物质检测方法不仅耗时长，且工作繁琐。
单细胞拉曼光谱技术，是一种无需添加任何化学染料及其他标记就能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质和糖含量等大量信息的光谱分析新技术，可在不损伤细胞的条件下实时动态的监测细胞分子结构变化，具有快速、敏感性高、实时监测、活样品不需固定及染色、不损伤细胞等众多特点。因此，如何能够基于单细胞拉曼光谱技术建立一种对酵母风味物质代谢相似性评价的方法，从而实现无需发酵试验，即可对酵母风味物质代谢进行快速、准确的相似性评价将是本领域所面临的重要课题。
发明内容
本发明提供了一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法，该方法无需发酵试验，即可对酵母风味物质代谢进行快速、准确、可靠性高的相似性评价。
为了达到上述目的，本发明的一方面提供了一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法，包括以下步骤：
取同一酵母菌株的不同的单菌落按照预定培养方式进行培养；
取优势菌株作为对照菌株按照所述预定培养方式进行培养；
将上述培养后的不同的单菌落和对照菌株分别进行拉曼单细胞光谱分析；
对拉曼单细胞光谱分析得到的数据进行处理，通过比对不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值以及不同的单菌落和对照菌株的相似性R值之间是否存在差异显著性来判断不同的单菌落与对照菌株之间的相似性。
作为优选技术方案，不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越大、且二者相似性R值之间不存在显著差异，与对照菌株的相似性越大。
作为优选技术方案，某一单菌落和对照菌株之间的相似性R值大于0.8且差异显著性P大于0.05时，所述单菌落与对照菌株之间的相似性更大。
作为优选技术方案，不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越小、且二者相似性R值之间存在或不存在差异显著性，与对照菌株的相似性越小。
作为优选技术方案，所述预定培养方式具体包括：在酵母膏胨葡萄糖培养基平板上筛选菌落形态优良的不同的单菌落后，将其分别转接至酵母膏胨葡萄糖液体培养基中于12℃下恒温培养72小时。
作为优选技术方案，所述拉曼单细胞光谱分析具体包括：分别收集不同的单菌落的菌悬液，4500rpm离心1.5分钟后弃上清，用双蒸水将离心后的菌体洗净后，于532nm钇铝石榴石晶体激光照射后在100倍物镜下进行检测。
作为优选技术方案，检测时，分别取每个单菌落中的30个酵母单细胞进行检测，对每个酵母单细胞的激光照射时间为10秒，检测范围在580cm-1到2100cm-1之间。
本发明的另一方面提供了一种如上述任一项技术方案所述的工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法在工业Lager酵母菌株的复壮筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、采用本发明所提供的酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法可预测同一酵母菌株的不同的单菌落与对照菌株的风味物质代谢相似性，因此可以用于Lager酵母菌株的复壮筛选。
2、相比于传统的基于发酵实验的风味检测方法，本发明所提供的评价方法采用拉曼光谱分析技术，其具有更加快速、自动化程度高等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。另外，由于无需进行发酵实验即可对酵母发酵风味物质代谢相似性进行分析，因此可大大缩短实验时间。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-1与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图2为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-2与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图3为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-3与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图4为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-4与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图5为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-5与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图6为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-6与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图7为本发明实施例所提供的单菌落TT-21-7与对照菌株TT-21-32之间的拉曼图谱；
图8为本发明实施例所提供的利用IBM SPSS 22软件对不同的单菌落与对照菌株的群组重心的判别分析示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一方面提供了一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法，包括以下步骤：
取同一酵母菌株的不同的单菌落按照预定培养方式进行培养；
取优势菌株作为对照菌株按照所述预定培养方式进行培养；
将上述培养后的不同的单菌落和对照菌株分别进行拉曼单细胞光谱分析；
对拉曼单细胞光谱分析得到的数据进行处理，通过比对不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值以及不同的单菌落和对照菌株的相似性R值之间是否存在差异显著性来判断不同的单菌落与对照菌株之间的相似性。
本发明实施例提供的上述评价方法通过对同一酵母菌株的不同单菌落和对照菌株进行拉曼光谱分析，研究其拉曼光谱特性，结合其相似性R值以及相似性R值之间的差异显著性分析，即可确定不同单菌落酵母菌株与对照菌株之间的差异及表型相似性，从而建立了基于酵母单细胞拉曼光谱的酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法。该方法通过发酵实验的风味物质含量结果验证后说明该方法可靠、快速、准确。需要说明的是,由于本实施例对不同的单菌落的筛选是高通量的，且在筛选中对于每个单菌落和对照菌株的测试重复多次进行，因此本实施例中所述的相似性R值均为单菌落和对照菌株的相似性R值的均值,下述实施例中所述的R值也均代表均值。
在一优选实施例中，不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越大、且二者相似性R值之间不存在显著差异，与对照菌株的相似性越大。本实施例中给出了不同的单菌落和对照菌株之间相似性的评价标准，为了能够在大批菌落中快速、准确预筛选出较为符合预定目标的单菌落，可通过单个单菌落与对照菌株之间的相似性R值的大小结合二者相似性R值之间是否存在差异显著性进行判定。至于在预筛选得到较为符合预定目标的单菌落后，如何对具体的单菌落与对照菌株的相似性进行排序，则可根据对R值的具体限定实现。
在一优选实施例中，某一单菌落和对照菌株之间的相似性R值大于0.8且差异显著性P大于0.05时，所述单菌落与对照菌株之间的相似性更大。通过大批多次的酵母菌株拉曼光谱的相似性试验得出，当R值大于0.8且差异显著性P大于0.05时，该菌落在代谢水平上与对照菌株无明显差异，这也可为其后续作为对照菌株奠定基础。
在一优选实施例中，不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越小、且二者相似性R值之间存在或不存在差异显著性，与对照菌株的相似性越小。当二者之间的相似性R值越小，其相似程度越低，在这种情况下，不论二者相似性R值之间是否存在差异显著性，其相似性均较低，这样可有效筛选出与对照菌株性能不相近的菌落，从而进行筛除。
在一优选实施例中，所述预定培养方式具体包括：在酵母膏胨葡萄糖培养基平板上筛选菌落形态优良的不同的单菌落后，将其分别转接至酵母膏胨葡萄糖液体培养基中于12℃下恒温培养72小时。本实施例中的预定培养方式是按照目前实际生产中所采用的对照菌株所给出的，为了能够在相同条件下筛选出可与目前的对照菌株在代谢水平上相当的单菌落，因此本实施例中单菌落的培养也采用对照菌株的培养方式进行。可以理解的是，本实施例仅是一列举，当实际生产中的对照菌株发生变更时，在核心方案不变的基础上，预定培养方式相应发生变更，同时一并调整与其对应的不同单菌落的预定培养方式即可。
在一优选实施例中，所述拉曼单细胞光谱分析具体包括：分别收集不同的单菌落的菌悬液，4500rpm离心1.5分钟后弃上清，用双蒸水将离心后的菌体洗净后，于532nm钇铝石榴石晶体激光照射后在100倍物镜下进行检测。本实施例提供了一具体的拉曼单细胞光谱分析方法，该方法适用于对菌悬液中的单细胞进行分析，结合分析结果，可有效获得与其对应的拉曼数据。为了使获得的数据真实、可靠，在对每个单菌落中的酵母细胞进行检测时，均平行操作30次，即分别取每个单菌落中的30个酵母单细胞进行分析，相应的具体参数为：对每个酵母单细胞的激光照射时间为10秒，检测范围在580cm-1到2100cm-1之间，这样经大量多批次取样分析后，可保证最后所得到的数据真实有效。
本发明实施例的另一方面提供了一种如上述任一项实施例所述的工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法在工业Lager酵母菌株的复壮筛选中的应用。由于上述实施例提供的评价方法可对同一酵母菌株的不同单菌落与对照菌株的风味物质代谢相似性进行有效预测，具有更加快速、自动化程度高等特点，且结果可靠性高、可重复性好，并能够大大缩短分析时间，因此，可有效用于工业Lager酵母菌株的复壮筛选中。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
选取工业Lager酵母菌株TT-21，并对其不同的单菌落进行培养，培养方式为：在酵母膏胨葡萄糖培养基平板上筛选菌落形态优良的7个不同单菌落，分别标记为TT-21-1、TT-21-2、TT-21-3、TT-21-4、TT-21-5、TT-21-6、TT-21-7，将这7个不同单菌落分别转接至酵母膏胨葡萄糖液体培养基中，于12℃恒温培养箱中培养72小时左右。
选取优势菌株作为对照菌株TT-21-32按照上述培养方式进行培养。其中，该优势菌株为酵母发酵风味物质代谢水平较高的菌株。
分别收集1.5ml的TT-21-1、TT-21-2、TT-21-3、TT-21-4、TT-21-5、TT-21-6、TT-21-7及TT-21-32的菌悬液，4500rpm离心1.5分钟后弃上清，用双蒸水将离心后的菌体洗3遍后，于532nm钇铝石榴石晶体激光照射后在100倍物镜下进行检测。为了使检测数据真实可靠，在检测时，对每个单菌落中的30个酵母单细胞分别进行检测，每个细胞的激光照射时间为10s，检测范围在580cm-1到2100cm-1之间。结果参见图1-7。
将上述拉曼光谱分析后的数据处理后，在IBM SPSS 22软件中进行不同酵母单菌落的相关性距离分析来区分同一酵母菌株的不同单菌落与对照菌株之间的相似性。通过比对二者相似性R值的大小以及二者相似性R值之间的差异显著性来判断不同的单菌落与对照菌株的相似程度。通过多批次的酵母菌株拉曼光谱的相似性预测，相似性R值大于0.8且差异显著性P大于0.05时，菌株相似性较高。如表1结果所示，菌落TT-21-1、TT-21-3与对照菌株TT-21-32的相似性较高，而菌落TT-21-2、TT-21-4、TT-21-5、TT-21-6、TT-21-7与对照菌株TT-21-32的相似性较低。
表1不同的单菌落与对照菌株的相似性R值(Person相关性)
实施例2
利用发酵实验对上述评价方法进行验证
为了检测单一菌落的酵母发酵所产生的风味差异，分别对扩培后的TT-21-1、TT-21-2、TT-21-3、TT-21-4、TT-21-5、TT-21-6、TT-21-7及TT-21-32进行了220ml的EBC管发酵实验。发酵实验麦汁取自工厂，分别接种2×107cell/mL的酵母细胞后于12℃进行发酵。10天后利用顶空气相色谱法(HS-GC)进行醇酯及成熟度风味物质检测。每个单菌落的EBC管发酵实验进行两个平行。发酵结束后风味物质含量的结果利用IBM SPSS 22软件进行判别分析，记录结果见图8。
从图8中可以看出，菌落TT-21-4与对照菌株TT-21-32的发酵产物较为接近，菌落TT-21-1、TT-21-3的发酵产物与对照菌株TT-21-32的发酵产物最为接近，而菌落TT-21-2、TT-21-5、TT-21-6、TT-21-7的发酵产物与对照菌株TT-21-32的发酵产物差距较大。这一结果与酵母拉曼光谱的相似性分析结果基本一致。从酵母菌株发酵后的醇酯产物来看，TT-21-1、TT-21-3和TT-21-4均与TT-21-32较为接近，但综合拉曼光谱的相似性分析结果推测，菌株TT-21-4与TT-21-32在其它代谢产物的含量上可能存在差异，而TT-21-1、TT-21-3与TT-21-32在整体代谢水平上更为接近。
因此，可说明本发明实施例所提供的评价方法可有效替代基于传统发酵实验的风味检测方法，可有效、准确、快速地预测同一酵母菌株的不同的单菌落与对照菌株的风味物质代谢相似性。
Claims (3)
1.一种工业Lager酵母菌株风味物质代谢相似性评价方法在工业Lager酵母菌株的复壮筛选中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
取同一酵母菌株的不同的单菌落按照预定培养方式进行培养；
取优势菌株作为对照菌株按照所述预定培养方式进行培养；
将上述培养后的不同的单菌落和对照菌株分别进行拉曼单细胞光谱分析；
对拉曼单细胞光谱分析得到的数据进行处理，通过比对不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值以及不同的单菌落和对照菌株的相似性R值之间是否存在差异显著性来判断不同的单菌落与对照菌株之间的相似性；其中，
不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越大、且二者相似性R值之间不存在显著差异，与对照菌株的相似性越大；
某一单菌落和对照菌株之间的相似性R值大于0.8且差异显著性P大于0.05时，所述单菌落与对照菌株之间的相似性更大；
不同的单菌落和对照菌株之间的相似性R值越小、且二者相似性R值之间存在或不存在差异显著性，与对照菌株的相似性越小；
所述拉曼单细胞光谱分析具体包括：
分别收集不同的单菌落的菌悬液，4500rpm离心1.5分钟后弃上清，用双蒸水将离心后的菌体洗净后，于532nm钇铝石榴石晶体激光照射后在100倍物镜下进行检测。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预定培养方式具体包括：在酵母膏胨葡萄糖培养基平板上筛选菌落形态优良的不同的单菌落后，将其分别转接至酵母膏胨葡萄糖液体培养基中于12℃下恒温培养72小时。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测时，分别取每个单菌落中的30个酵母单细胞进行检测，对每个酵母单细胞的激光照射时间为10秒，检测范围在580cm-1到2100cm-1之间。
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