CN108342447B - 一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法，包括将待选菌株与已知菌株分别培养至相同生长时期；分别取样后去除培养基，用低拉曼背景溶液清洗菌株并重悬；将待选菌株和已知菌株分别点样到低拉曼背景的点样片上；分别对待选菌株和已知菌株进行单细胞随机选取并采集拉曼组信号，选取的单细胞个数不少于10个；采集单细胞旁边的背景信号，进行背景信号扣除；分别对待选菌株和已知菌株扣除背景信号后的单细胞拉曼组数据进行基线处理后，得到对应的待选菌株和已知菌株的单细胞拉曼组预处理结果；用统计学分析算法对单细胞拉曼组预处理结果进行相似性分析，待选菌株中与已知菌株的单细胞拉曼组相似程度大于85％为与已知菌株表型相似的菌株。

Description

一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法
技术领域
本发明涉及菌株的筛选和评估领域，具体是利用比对待选菌株与已知菌株的单细胞拉曼组相似程度，筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法。
背景技术
性状优良且稳定的种质资源是发酵工业的灵魂和命脉，发酵质量的好坏与菌种的质量密切相关，但菌种在长期连续培养和保藏过程中，易受外界环境的影响而发生负突变，造成优良表型的丢失，一些重要性能如发酵力、悬浮性等发生变化，菌种的衰老和退化将严重影响产品的质量和经济效益。因此，为保证发酵质量的稳定，需对菌株定期进行复壮，将发酵性能优良且稳定遗传的菌种选育出来。
传统的菌种选育技术一般采用纯种分离法，如平板划线分离法、稀释平板法或涂布法等，再挑取平板上的单克隆进行扩大培养，最后针对不同工业指标分别进行性能测试(如发酵度、风味、成熟度、絮凝性等)，从衰退的群体中选育出未衰退的个体。但该评价过程比较漫长，且对多种指标测试后的结果没有一个综合量化比较的方法，只能依赖经验进行取舍，不仅耗时耗力，还会漏掉一些优质菌株。拉曼光谱技术是一种高效的化合物信息识别技术，可以提供化合物分子构成和结构的信息，对一个细胞进行拉曼光谱采集，会获得整个细胞全部物质的分子指纹信息(即拉曼组)，拉曼组可反映细胞在特定环境下的表型信息，越来越受到人们的重视，被用来区分细胞的不同时期，鉴定细胞的种类，评价药物的作用效果等，但目前对于单细胞拉曼组是否可以作为性能优良的菌株选育检测手段还没有相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法，包括如下步骤：
1)将待选菌株与已知菌株分别培养至相同生长时期；
2)分别取样后去除培养基，用低拉曼背景溶液清洗菌株并重悬；
3)将待选菌株和已知菌株分别点样到低拉曼背景的点样片上；
4)分别对待选菌株和已知菌株进行单细胞随机选取并采集拉曼组信号，选取的单细胞个数不少于10个；采集单细胞旁边的背景信号，进行背景信号扣除；
5)分别对待选菌株和已知菌株扣除背景信号后的单细胞拉曼组数据进行基线处理后，得到对应的待选菌株和已知菌株的单细胞拉曼组预处理结果；
6)用统计学分析算法对单细胞拉曼组预处理结果进行相似性分析，待选菌株中与已知菌株的单细胞拉曼组相似程度大于85％的为与已知菌株表型相似的菌株。
优选地，所述菌株培养包括以下步骤：1)将菌株分别置于标准培养基中活化；2)活化后的菌株进行EBC管发酵实验。
优选地，所述生长时期为发酵初期，中期，末期，或发酵后时期；优选地，为发酵后时期；更优选地，为后熟期。
所述已知菌株是已知表型的菌株，优选地，所述已知菌株属于酵母属，埃希氏菌属，或芽孢杆菌属。
优选地，所述已知菌株属于酵母属，优选地，是Lager酵母。
优选地，所述表型指发酵度，成熟度，乙醛浓度，双乙酰浓度，风味醇酯比，和/或絮凝蛋白含量。
优选地，所述已知菌株是优质的Lager酵母，所述优质指发酵度大于65％，成熟度乙醛小于15ppm，双乙酰小于60ppb，风味醇酯比大于4.0、小于4.5，和/或絮凝蛋白含量小于30000mg。
优选地，所述低拉曼背景溶液为ddH2O，所述点样片为CaF2载玻片。
优选地，所述选取的单细胞个数不少于20个，更优选地，不少于60个。
优选地，所述待选菌株或已知菌株组内至少采集两个生物学平行，更优选地，至少采集三个生物学平行。
优选地，所述拉曼组信号采集使用的激光波长为200-1064nm、激光能量1-500mW，采集时间为0.01-100s；优选地，所述激光波长为300-900nm，激光能量为50-300mW，采集时间为1-50s；优选地，所述激光波长为532nm、激光能量为100mw，采集时间为1-50s；更优选地，所述激光波长为532nm、激光能量为100mw，采集时间为10s。
优选地，所述单细胞拉曼组信号采集的滤片设定OD 0.6，光栅设定600刻线。
优选地，所述统计学分析的算法为ANOSIM，adonis，BIO-ENV,Moran’s I,MRPP,PERMANOVA,PERMDISP,或db-RDA，更优选地，为ANOSIM算法。
所述ANOSIM算法公式如下：
R＝(rb-rw)/(1/4[n(n-1)])，
rb表示组间差异的均值，rw表示组内差异的均值，n表示组内样本个数，其中R值小于等于0.15，优选地，小于等于0.1，表示组间相似程度大于85％，优选地，大于90％。
所述“单细胞拉曼组相似程度”指单细胞拉曼组光谱之间峰位和峰强度的相似程度。
所述待选菌株与已知菌株的“单细胞拉曼组相似程度”大于85％，优选地，大于90％，更优选地，大于95％，待选菌株为与已知菌株表型相似的菌株。
所述“表型相似”指菌株之间表型的相似度大于80％，优选地，大于85％，更优选地，大于90％。
Adonis，BIO-ENV,Moran’s I,MRPP,PERMANOVA,PERMDISP,或db-RDA是宏基因组领域用来比较菌群相似性的常规算法，本发明中上述算法用来比较单细胞拉曼组相似程度。adonis算法公式：Y～A+B*C，其中Y表示不相似程度，A、B、C表示影响因素，输出结果为F值，越大越不相似，优选地F小于10，表示相似程度大于85％；BIO-ENV算法，用相关系数r计算，r小于1，r越大越相关，优选地r大于0.9，表示相似程度大于85％，优选地相似程度大于90％；Moran’s I算法计算数据内部的空间构型，输出结果为Moran’s I指数，小于1，优选地小于0.1，表示相似程度大于85％，优选地相似程度大于90％；MRPP算法公式：A＝1-δ/E(δ)，其中δ表示加权平均数，E(δ)表示不相似度均数，小于1，优选地小于0.1，表示相似程度大于85％，优选地相似程度大于90％；PERMANOVA和PERMDISP与adonis类似，只是能接受的类别变量数不同；db-RDA与adonis类似，只是距离矩阵形式不同。
本发明作用原理：根据单细胞拉曼组的特点，其特征是：拉曼组信息来自于细胞内部所有分子的化学键振动，因此根据此原理单细胞拉曼组可作为细胞表型的“分子指纹”，每种待选菌株因内部成分的不同而具有独特的拉曼组，因此可以通过比较不同菌株与已知表型菌株单细胞拉曼组的相似程度，选育出与性能优良的菌株相似度最高的候选菌株。
本发明通过比对分析特定生长时期待选菌株与已知表型菌株之间单细胞拉曼组的相似程度，跳过大量针对不同检测指标的测定过程，直接选育出优质菌株，具有操作简单、耗时短、准确度高、筛选范围广等优势，可获得同时具备多项优良指标的工业菌株，对工业菌株复壮选育，以及突变体库/转化子库/环境中种质资源筛选等领域有重要的意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1、已知表型酵母菌株单细胞拉曼组平均图谱
图2、已知表型酵母菌株单细胞拉曼组相似性ANOSIM结果
图3、未知表型酵母菌株(21_1～8)与优质菌株单细胞拉曼组平均图谱
图4、待选菌株与优质lager酵母菌株复合表型典型区别函数分析
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
实施例仅以Lager酵母做为例子，其他发酵菌株同理适用，一个细胞的单细胞拉曼组是胞内所有物质的拉曼光谱总和，而胞内所有物质共同作用决定了这个状态下细胞的综合表型，通过分析单细胞拉曼组相似程度，即可简单、直接的找到与已知菌株表型最接近的菌株，从而简化选育过程，有效的保证了生产的稳定性。
实施例1、基于拉曼组相似程度分析的酵母细胞表型评价(表型已知)
1)Lager酵母细胞培养
取四株表型已知的Lager酵母菌株(#21、#25、#32、#45)，进行基于单细胞拉曼组分析的表型相似性评价，其中#21为劣质菌株，#25为中等菌株，#32与#45为优质菌株，将四株菌株置标准酵母培养基中活化后，进行EBC管发酵实验，取后熟期菌液各1mL，4500rpm离心1min收集，用1mL ddH2O重悬菌体，重复3次后，将样品稀释100倍，用移液枪吸取2uL，点样在CaF2载玻片上，室温进行风干。其中优质菌株：发酵度大于65％，成熟度乙醛小于15ppm，双乙酰小于60ppb，风味醇酯比大于4.0，小于4.5，絮凝蛋白含量小于30000mg；中等菌株：发酵度大于65％，成熟度乙醛小于20ppm，双乙酰小于70ppb，风味醇酯比大于4.0，小于4.5，絮凝蛋白含量小于40000mg；劣质菌株：发酵度大于60％，成熟度乙醛小于20ppm，双乙酰小于70ppb，风味醇酯比大于3.0，小于5.0，絮凝蛋白含量小于40000mg。
2)单细胞拉曼组测量
将风干后的CaF2载玻片，置于显微拉曼光谱仪载物台上，在100倍物镜视野下，进行单细胞随机选取，并进行拉曼光谱信号采集，选用100mW、532nm激光，滤片设定OD 0.6，光栅设定600刻线，每个细胞采集10s，每个生物学平行采集20个细胞，每组样品共采集60个细胞，同时采集5个细胞旁边的背景信号，将酵母单细胞拉曼光谱进行背景信号扣除，以及基线拉平处理，平均后的图谱如图1所示。
3)单细胞拉曼组相似程度分析
对预处理后的单细胞拉曼组数据进行相似程度分析(ANOSIM)，通过比较组内差异以及组间差异，评价样本间拉曼组数据的相似程度，ANOSIM公式如下：
R＝(rb-rw)/(1/4[n(n-1)])
其中rb表示的是组间差异的均值，rw表示的是组内差异的均值，n表示组内样本个数。将劣质菌株(#21)分别与中等菌株(#25)和优质菌株(#32和#45)进行相似性分析，得到R值(图2)，R值越小(最小为0)说明组间差异越小，即表型越接近，R值越大(最大为1)，说明组间差异越大，即表型越迥异，通过R值大小可以看出，劣质菌株(#21)与中等菌株(#25)拉曼组相似程度较接近，与优质菌株(#32和#45)拉曼组相似程度差异较大，该趋势与实际表型表现一致。
实施例2、基于拉曼组相似性分析的酵母细胞表型评价(表型未知)
1)Lager酵母细胞培养
从待筛选平板上随机挑取8个克隆，作为待评价的未知菌株(#21_1～8)，同时选用优质菌株#32作为对照菌株，将上述菌株置标准酵母培养基中活化后，进行EBC管发酵实验，取后熟期菌液各1mL，4500rpm离心1min收集，用1mL ddH2O重悬菌体，重复3次后，将样品稀释100倍，用移液枪吸取2uL，点样在CaF2载玻片上，室温进行风干。
2)单细胞拉曼组测量
将风干后的CaF2载玻片，置于显微拉曼光谱仪载物台上，在100倍物镜视野下，进行单细胞随机选取，并进行拉曼光谱信号采集，选用100mW 532nm激光，滤片设定OD 0.6，光栅设定600刻线，每个细胞采集10s，每个生物学平行采集20个细胞，每组样品共采集60个细胞，同时采集5个细胞旁边的背景信号，将酵母单细胞拉曼组光谱进行背景信号扣除，以及基线拉平处理，平均后的图谱如图3所示。
3)单细胞拉曼组相似程度分析
对预处理后的单细胞拉曼组数据进行相似程度分析(ANOSIM)，通过比较组内差异以及组间差异，评价样本间拉曼组数据的相似程度，ANOSIM公式如下：
R＝(rb-rw)/(1/4[n(n-1)])
其中rb表示的是组间差异的均值，rw表示的是组内差异的均值，n表示组内样本个数。将待选菌株(#21_1～8)分别与优质菌株(#32)进行单细胞拉曼组相似性分析，得到R值(表1)，R值越小(最小为0)说明与优质菌株差异越小，即表型越接近，R值越大(最大为1)，说明与优质菌株差异越大，即表型越迥异，通过R值大小可以看出，待选菌株21_1,2,3,4,6与优质菌株(#32)单细胞拉曼组相似程度较接近，待选菌株21_5,7,8与优质菌株(#32)单细胞拉曼组相似程度差异较大。
表1、待选菌株与优质菌株单细胞拉曼组相似程度ANOSIM结果
21_1 21_2 21_3 21_4 21_5 21_6 21_7 21_8
R(#32比) 0.023 0.06 0.022 0.006 0.265 0.031 0.398 0.158
为评价该结果的准确性，将待选菌株与优质菌株进行发酵度、成熟度以及风味等多指标测定，复合指标结果通过典型区别函数与优质菌株进行比较(图4)，结果表明21_1,2,3,4,6与优质菌株(#32)发酵复合结果很接近，21_5,7,8与优质菌株(#32)发酵复合结果差距较大，该结果与基于拉曼组的相似性分析一致。上述结果表明，通过对拉曼组相似性分析得出的R值进行比较，可快速、有效筛选出与优质菌株表型最相似的候选菌株。

Claims (5)

1.一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将待选菌株与已知菌株分别培养至相同生长时期；
2)分别取样后去除培养基，用低拉曼背景溶液清洗菌株并重悬；
3)将待选菌株和已知菌株分别点样到低拉曼背景的点样片上；
4)分别对待选菌株和已知菌株进行单细胞随机选取并采集拉曼组信号，选取的单细胞个数不少于10个；同时采集单细胞旁边的背景信号，进行背景信号扣除；
5)分别对待选菌株和已知菌株扣除背景信号后的单细胞拉曼组数据进行基线处理后，得到对应的待选菌株和已知菌株的单细胞拉曼组预处理结果；
6)用统计学分析算法对单细胞拉曼组预处理结果进行相似程度分析，待选菌株中与已知菌株的单细胞拉曼组相似程度大于85％的为与已知菌株表型相似的菌株；
其中，所述表型指发酵度、成熟度、乙醛浓度、双乙酰浓度、风味醇酯比和絮凝蛋白含量；
其中，所述“单细胞拉曼组相似程度”指单细胞拉曼组光谱之间峰位和峰强度的相似程度；
其中，所述统计学分析算法为ANOSIM算法，公式为R＝(rb-rw)/(1/4[n(n-1)])，rb表示待选菌株与已知菌株组间差异的均值，rw表示组内差异的均值，n表示组内样本个数；其中R值小于等于0.15，表示组间相似程度大于85％；
并且，所述已知菌株属于酵母属。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知菌株是Lager酵母。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长时期为发酵初期，中期，末期，或发酵后时期。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拉曼组信号采集使用的激光波长为200-1064nm，激光能量为1-500mW，采集时间为0.01-100s。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述拉曼组信号采集使用的激光波长为532nm，激光能量为100mW，采集时间为1-50s。
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