CN111289489A - 一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 - Google Patents
一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111289489A CN111289489A CN202010145970.6A CN202010145970A CN111289489A CN 111289489 A CN111289489 A CN 111289489A CN 202010145970 A CN202010145970 A CN 202010145970A CN 111289489 A CN111289489 A CN 111289489A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth
- peak
- raman
- raman spectrum
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 89
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 29
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 25
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000009499 grossing Methods 0.000 claims description 20
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000668842 Lepidosaphes gloverii Species 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，设计构思是基于机器学习中聚类分析算法，结合培养时间(或OD600)确定单细胞的生长时期，通过分析单细胞拉曼光谱，检测微生物单细胞生长过程中胞内物质生长变化，该方法能快速、灵敏且无需标记的检测微生物单细胞生长，解决了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题，操作简单，适合推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种单细胞生长检测方法，尤其是一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法。
背景技术
微生物生长分为不同的阶段：滞后期(为细胞分裂做准备)，对数期(以细胞加倍为特征)、稳定期(细胞生长速率和凋亡速率相等)和死亡期(细胞死亡)四个生长周期；
在一个封闭的环境中，由于细胞的生长，所需的营养液被消耗殆尽，细胞的群体呈现了生长曲线的各个时期，不同的生长阶段具有不同的生化反应，以合成细胞生长和分裂所必须的细胞成分；准确识别微生物的生长时期，对于实时监测食品发酵、生物制药等工程菌的代谢状态，判断反应终点具有重要意义；
现有技术中，对微生物生长时期的检测方法主要基于群体细胞水平，这种群体细胞检测方法(如光密度、标准平板计数等)存在耗时、操作繁琐、需要样品量大、不适用于连续监测等问题；而且，现有方法也不能描述单个微生物细胞在生长过程中胞内物质(如DNA、蛋白质、脂质等)相对含量所发生的变化；
如何快速、灵敏的从本质上检测微生物单细胞在生长过程中所发生的生化变化，是单细胞生长研究的重要难题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，该方法能快速、灵敏且无需标记的检测微生物单细胞生长，解决了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题，操作简单，适合推广。
一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，包括如下步骤：
步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；
作为一种举例说明，所述微生物包括但不限于：细菌、真菌、藻类；
步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD600；
作为一种举例说明，所述现有生长曲线检测方法：包括但不限于光密度、比浊法、标准平板计数法等；
步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；
作为一种举例说明，分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组；
步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：
步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；
基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：
式中，
为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；
作为一种举例说明，所述设置窗口宽度可设置为2-5个波数；
步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；
步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；
信噪比计算方法公式：
其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；
作为一种举例说明，所述snr为：10-20；
步骤4.4，将所述微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；
步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期，用聚类算法将步骤四中处理后的微生物单细胞拉曼光谱聚成四个簇，分别对应生长周期的四个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个培养时间段映射到4个生长时期，分析四个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若某簇中对应培养时间单细胞数量占比大于该比例阈值，可用该培养时间映射的生长时期表示该簇；如果对应培养时间单细胞数量的最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分；
作为一种举例说明，所述聚类算法采用层次聚类算法，即HCA；
步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：
步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞求均谱；
步骤6.2，确定标准峰位；
作为一种举例说明，选择波数参照文献：744.3-770.2、825.9-861.2、1003-1042中记载的数据，作为蛋白质峰区间；
作为一种举例说明，选择波数参照文献：633.5-674中记载的数据，作为核酸峰区间；
步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：
6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；
6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；
6.3.3,特征物质含量计算，
Xi→Ti
其中，Xi表示波数值，Ti表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t1和t2表示峰波数的起止位置；
步骤七、不同生长阶段单细胞胞内物质变化可视化分析；
作为一种举例说明，所述可视化分析包括但不限于蛋白、核酸峰面积随生长时间变化的柱状图，蛋白与核酸比率变化柱状图等。
本发明的有益效果：
拉曼光谱具有提供生物分子化学组成信息的优势,单细胞拉曼光谱是胞内所有物质的拉曼光谱总和，不同物质分布在不同的峰位，某峰面积可表示细胞内某种物质含量，可以通过聚类算法确定微生物单细胞生长时期，可以通过分析不同生长时期某处峰面积变化来反应胞内某种物质变化；
引入拉曼光谱技术，对单细胞拉曼光谱优化处理，用于检测细胞生长过程胞内物质变化，实现从本质上检测微生物单细胞胞内物质含量随生长状态变化；具有快速、灵敏且无需标记的优势，跳过了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题。
附图说明
图1是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之不同培养时间单细胞拉曼光谱层次聚类(HCA)结果示意图
图2是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之统计聚类分析中各生长时期数据分布示意图
图3是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之各生长时期单细胞拉曼光谱均谱示意图
图4是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之单细胞生长过程胞内物质变化可视化分析的蛋白和核酸生长变化示意图
图5是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之单细胞生长过程胞内物质变化可视化分析的蛋白核酸比例示意图
图6是本发明一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之设计原理图
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明。
详见图1至图6所示，一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，包括如下步骤：
步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；
作为一种举例说明，所述微生物包括但不限于：细菌、真菌、藻类；
步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度(OD600)；
作为一种举例说明，所述现有生长曲线检测方法：包括但不限于光密度、比浊法、标准平板计数法等；
步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；
作为一种举例说明，，所述采集不同生长时期为分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组；
步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：
步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；
基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：
式中，
为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；
作为一种举例说明，所述设置窗口宽度可设置为2-5个波数；
步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；
步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；
信噪比计算方法公式：
其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；
作为一种举例说明，所述snr为：10-20；
步骤4.4，将微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；
步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期，用聚类算法将微生物单细胞拉曼光谱聚成四个簇，分别对应生长周期的四个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个培养时间段映射到4个生长时期，分析四个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若某簇中对应培养时间单细胞数量占比大于该比例阈值，可用该培养时间映射的生长时期表示该簇；如果对应培养时间单细胞数量的最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分；
作为一种举例说明，所述聚类算法为层次聚类算法(HCA)；
步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：
步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞求均谱；
步骤6.2，确定标准峰位；
作为一种举例说明，选择波数参照文献：744.3-770.2、825.9-861.2、1003-1042中记载的数据，作为蛋白质峰区间；
作为一种举例说明，选择波数参照文献：633.5-674中记载的数据，作为核酸峰区间；
步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：
6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；
6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；
6.3.3,特征物质含量计算，
Xi→Ti
其中，Xi表示波数值，Ti表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t1和t2表示峰波数的起止位置；
步骤七、不同生长阶段单细胞胞内物质变化可视化分析；所述可视化分析包括但不限于蛋白、核酸峰面积随生长时间变化的柱状图，蛋白与核酸比率变化柱状图等。
本发明基本思想是利用机器学习中聚类分析算法，结合培养时间(或OD600)确定单细胞的生长时期。通过分析单细胞拉曼光谱，检测微生物单细胞生长过程中胞内物质生长变化。
实施例1：
为了更好的说明本发明，现以大肠杆菌生长周期测定为例，举例说明检测方法如下：
步骤一、取过夜培养的大肠杆菌菌液，以1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃，200rpm进行培养，分别培养至1h,2h,3h,4h,6h,14h 6个培养时间；
步骤二、使用光密度法测出6个培养时间的OD600值；
步骤三、使用拉曼光谱仪测量6个培养时间的单细胞拉曼光谱，测试条件为：激发波长532nm，激光功率5nW，积分时间5s，每个培养时间测50组，共计300组；
步骤四、使用一系列自适应预处理算法对单细胞拉曼光谱数据进行处理，主要包括如下步骤：
步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；
基于差分法，首先计算光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：
式中，
为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，窗口宽度：Δ＝5，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；
步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法(airPlS)对单细胞拉曼光谱进行基线校正；
步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值snr＝18，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；
其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；
步骤4.4，将微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；
步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期。首先，将所有单细胞拉曼光谱仪进行批处理，处理后的拉曼数据进行层次聚类，根据生长时期确定4个聚类簇，聚类结果见图1；其次，将图1中每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个培养时间段映射到四个生长时期，见图2；分析四个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值为0.7，各簇中都存在占该簇总数量大于0.7的培养时间段，将该培养时间映射到簇所表示的生长时期。如果最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分。
培养时间和生长时期映射结果为：
1h对应为滞后期；2-3h对应为对数期；4-6h对应为稳定期；14h对应为凋亡期；
步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼数据均谱，并计算特征峰面积。
步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞求均谱，见图3；
步骤6.2，确定标准峰位；
作为一种举例说明，选择波数：744.3-770.2、825.9-861.2、1003-1042作为蛋白质峰区间，选择波数：633.5-674作为核酸峰区间；
步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：
6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；
6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；
6.3.3,特征物质含量计算，
Xi→Ti
Xi表示波数值，Ti表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t1和t2表示峰波数的起止位置；
根据计算结果，3个波段所表示蛋白峰面积之和在四个生长时期值为：5.374,7.36,12.049,3.186；核酸峰面积在四个生长时期值为：2.977,4.553,2.039,2.447.
步骤七、将步骤六中胞内物质含量结果进行可视化分析。其中，蛋白和核酸生长变化图表示为图4、蛋白核酸比例图表示为图5。
拉曼光谱具有提供生物分子化学组成信息的优势,单细胞拉曼光谱是胞内所有物质的拉曼光谱总和，不同物质分布在不同的峰位，某峰面积可表示细胞内某种物质含量，可以通过聚类算法确定微生物单细胞生长时期，可以通过分析不同生长时期某处峰面积变化来反应胞内某种物质变化；
引入拉曼光谱技术，对单细胞拉曼光谱优化处理，用于检测细胞生长过程胞内物质变化，实现从本质上检测微生物单细胞胞内物质含量随生长状态变化；具有快速、灵敏且无需标记的优势，跳过了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题。
以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；
步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD600；
步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；
步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：
步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；
基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：
式中，
为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；
步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；
步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；
信噪比计算方法公式：
其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；
步骤4.4，将微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；
步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期，用聚类算法将微生物单细胞拉曼光谱聚成4个簇，分别对应生长周期的4个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个各培养时间段映射到4个生长时期，分析4个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若某簇中对应培养时间单细胞数量占比大于该比例阈值，可用该培养时间映射的生长时期表示该簇；如果对应培养时间单细胞数量的最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分；
步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：
步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞求均谱；
步骤6.2，确定标准峰位；
步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：
6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数范围和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；
6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；
6.3.3,特征物质含量计算，
Xi→Ti
其中，Xi表示波数值，Ti表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t1和t2表示峰波数的起止位置；
步骤七、不同生长阶段单细胞胞内物质变化可视化分析；所述可视化分析包括但不限于蛋白、核酸峰面积随生长时间变化的柱状图，蛋白与核酸比率变化柱状图等。
2.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于：细菌、真菌、藻类。
3.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述现有生长曲线检测方法：包括但不限于光密度、比浊法以及标准平板计数法。
4.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述采集不同生长时期为：分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组。
5.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述设置窗口宽度设置为：2-5个波数。
6.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，所述snr为：10-20。
7.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，选择波数参照文献：744.3-770.2、825.9-861.2、1003-1042中记载的数据，作为蛋白质峰区间。
8.根据权利要求1所述的一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，选择波数参照文献：633.5-674中记载的数据，作为核酸峰区间。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010145970.6A CN111289489B (zh) | 2020-03-05 | 2020-03-05 | 一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010145970.6A CN111289489B (zh) | 2020-03-05 | 2020-03-05 | 一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111289489A true CN111289489A (zh) | 2020-06-16 |
| CN111289489B CN111289489B (zh) | 2023-06-02 |
Family
ID=71019207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010145970.6A Active CN111289489B (zh) | 2020-03-05 | 2020-03-05 | 一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111289489B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112102898A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-18 | 安徽大学 | 一种醋醅固态发酵过程谱图模态辨识方法及系统 |
| CN113989578A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 季华实验室 | 拉曼光谱的峰位分析方法、系统、终端设备及介质 |
| US11358984B2 (en) | 2018-08-27 | 2022-06-14 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | Use of Raman spectroscopy in downstream purification |
| CN115060631A (zh) * | 2022-07-14 | 2022-09-16 | 长光辰英(杭州)科学仪器有限公司 | 一种自适应的颗粒物拉曼相似度判别方法 |
Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005043085A1 (ja) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | 平均化反復法を用いたスパイクノイズ除去方法及びコンピュータプログラム |
| US20110143391A1 (en) * | 2007-07-17 | 2011-06-16 | Kornelis Maquelin | Method for typing and identification of micro-organisms |
| CN102881003A (zh) * | 2012-08-30 | 2013-01-16 | 暨南大学 | 一种消除ccd天文图像中宇宙射线的方法 |
| CN103487425A (zh) * | 2013-09-12 | 2014-01-01 | 福建师范大学 | 一种利用表面增强拉曼光谱判别癌细胞的方法 |
| JP2014003909A (ja) * | 2012-06-21 | 2014-01-16 | National Agriculture & Food Research Organization | 病害抵抗性品種系統の識別方法 |
| CN103674251A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-26 | 浙江大学 | 拉曼光谱中宇宙射线干扰的识别及消除方法 |
| WO2014094039A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Rmit University | A background correction method for a spectrum of a target sample |
| CN103940801A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-07-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法 |
| CN104077307A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-10-01 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 单细胞表现型数据库系统和搜索引擎 |
| US20170138845A1 (en) * | 2007-08-06 | 2017-05-18 | The Regents Of The University Of California | Rapid and label-free procedure for microbial community screening and profiling |
| WO2018007415A1 (en) * | 2016-07-04 | 2018-01-11 | Celltool Gmbh | Device and method for the determination of transfection |
| WO2018026594A1 (en) * | 2016-08-05 | 2018-02-08 | University Of Notre Dame Du Lac | Tunable attribute precision screening assessment platform |
| US20180044712A1 (en) * | 2015-06-25 | 2018-02-15 | Ascus Biosciences, Inc. | Methods, Apparatuses, and Systems for Analyzing Microorganism Strains from Complex Heterogeneous Communities, Predicting and Identifying Functional Relationships and Interactions Thereof, and Selecting and Synthesizing Microbial Ensembles Based Thereon |
| CN108181295A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-19 | 华南师范大学 | 拉曼成像光谱数据中宇宙射线Spike的识别及修正方法 |
| CN108342447A (zh) * | 2017-01-22 | 2018-07-31 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法 |
| WO2018188395A1 (zh) * | 2017-04-10 | 2018-10-18 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法 |
| CN108932491A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-12-04 | 华南师范大学 | 利用五点三次平滑法进行宇宙射线的识别和去除方法 |
-
2020
- 2020-03-05 CN CN202010145970.6A patent/CN111289489B/zh active Active
Patent Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005043085A1 (ja) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | 平均化反復法を用いたスパイクノイズ除去方法及びコンピュータプログラム |
| US20110143391A1 (en) * | 2007-07-17 | 2011-06-16 | Kornelis Maquelin | Method for typing and identification of micro-organisms |
| US20170138845A1 (en) * | 2007-08-06 | 2017-05-18 | The Regents Of The University Of California | Rapid and label-free procedure for microbial community screening and profiling |
| JP2014003909A (ja) * | 2012-06-21 | 2014-01-16 | National Agriculture & Food Research Organization | 病害抵抗性品種系統の識別方法 |
| CN102881003A (zh) * | 2012-08-30 | 2013-01-16 | 暨南大学 | 一种消除ccd天文图像中宇宙射线的方法 |
| WO2014094039A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Rmit University | A background correction method for a spectrum of a target sample |
| CN104077307A (zh) * | 2013-03-29 | 2014-10-01 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 单细胞表现型数据库系统和搜索引擎 |
| CN103487425A (zh) * | 2013-09-12 | 2014-01-01 | 福建师范大学 | 一种利用表面增强拉曼光谱判别癌细胞的方法 |
| CN103674251A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-26 | 浙江大学 | 拉曼光谱中宇宙射线干扰的识别及消除方法 |
| CN103940801A (zh) * | 2014-04-17 | 2014-07-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法 |
| US20180044712A1 (en) * | 2015-06-25 | 2018-02-15 | Ascus Biosciences, Inc. | Methods, Apparatuses, and Systems for Analyzing Microorganism Strains from Complex Heterogeneous Communities, Predicting and Identifying Functional Relationships and Interactions Thereof, and Selecting and Synthesizing Microbial Ensembles Based Thereon |
| WO2018007415A1 (en) * | 2016-07-04 | 2018-01-11 | Celltool Gmbh | Device and method for the determination of transfection |
| WO2018026594A1 (en) * | 2016-08-05 | 2018-02-08 | University Of Notre Dame Du Lac | Tunable attribute precision screening assessment platform |
| CN108342447A (zh) * | 2017-01-22 | 2018-07-31 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种筛选与已知菌株表型相似的菌株的方法 |
| WO2018188395A1 (zh) * | 2017-04-10 | 2018-10-18 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种基于拉曼光谱测量的细胞培养液质量检测方法 |
| CN108181295A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-19 | 华南师范大学 | 拉曼成像光谱数据中宇宙射线Spike的识别及修正方法 |
| CN108932491A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-12-04 | 华南师范大学 | 利用五点三次平滑法进行宇宙射线的识别和去除方法 |
Non-Patent Citations (20)
| Title |
|---|
| UTE NEUGEBAUER ETAL: "Towards Detailed Understanding of Bacterial Metabolism-Spectroscopic Characterization of Staphylococcus Epidermidis", 《CHEMPHYSCHEM》 * |
| UTE NEUGEBAUER ETAL: "Towards Detailed Understanding of Bacterial Metabolism-Spectroscopic Characterization of Staphylococcus Epidermidis", 《CHEMPHYSCHEM》, vol. 8, no. 1, 5 December 2006 (2006-12-05), pages 128 - 135, XP072157392, DOI: 10.1002/cphc.200600507 * |
| 余胜威 等: "《Matlab图像滤波去噪分析及其应用》", 30 September 2015, 北京航空航天大学出版社, pages: 152 * |
| 刘靖宇 等: "iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术在草菇不同生长发育时期蛋白质组分析中的应用", 《微生物学通报》, vol. 39, no. 6 * |
| 孙美娟 等: "酿酒酵母孢子萌发的激光镊子拉曼光谱研究", 《广西科学》 * |
| 孙美娟 等: "酿酒酵母孢子萌发的激光镊子拉曼光谱研究", 《广西科学》, vol. 22, no. 02, 30 April 2015 (2015-04-30) * |
| 尚廷义 等: "《基于光谱技术的寒地水稻稻瘟病害分析及机理研究》", 30 September 2016, 哈尔滨工程大学出版社, pages: 190 - 193 * |
| 张逊 等: "自适应拉曼光谱成像数据去噪及其在植物细胞壁光谱分析中的应用", 《分析化学》 * |
| 张逊 等: "自适应拉曼光谱成像数据去噪及其在植物细胞壁光谱分析中的应用", 《分析化学》, vol. 44, no. 12, 31 December 2016 (2016-12-31) * |
| 李志刚: "《光谱数据处理与定量分析技术》", 31 July 2017, 北京邮电大学出版社, pages: 52 - 54 * |
| 李晟 等: "一种简单的在线拉曼光谱spike剔除方法", 《光散射学报》 * |
| 李晟 等: "一种简单的在线拉曼光谱spike剔除方法", 《光散射学报》, vol. 23, no. 03, 30 September 2011 (2011-09-30) * |
| 范贤光 等: "基于特征提取的低信噪比拉曼光谱去噪方法研究", 《光谱学与光谱分析》, vol. 35, no. 12 * |
| 赖钧灼 等: "单细胞拉曼光谱结合多元统计方法分析不同酿酒酵母菌株的成分差异", 《光谱学与光谱分析》 * |
| 赖钧灼 等: "单细胞拉曼光谱结合多元统计方法分析不同酿酒酵母菌株的成分差异", 《光谱学与光谱分析》, vol. 31, no. 02, 28 February 2011 (2011-02-28) * |
| 闫静文 等: "基于最近邻比较和中值滤波的拉曼光谱spike自动检测及剔除方法研究", 《大气与环境光学学报》, vol. 12, no. 2 * |
| 陶站华 等: "基于单细胞拉曼光谱技术的葡萄球菌黄素生物合成分析", 《分析化学》 * |
| 陶站华 等: "基于单细胞拉曼光谱技术的葡萄球菌黄素生物合成分析", 《分析化学》, vol. 44, no. 03, 31 March 2016 (2016-03-31) * |
| 陶站华 等: "金黄色葡萄球菌细胞内生物大分子含量变化的光镊拉曼光谱研究", 《广西科学》 * |
| 陶站华 等: "金黄色葡萄球菌细胞内生物大分子含量变化的光镊拉曼光谱研究", 《广西科学》, vol. 23, no. 01, 29 February 2016 (2016-02-29) * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11358984B2 (en) | 2018-08-27 | 2022-06-14 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | Use of Raman spectroscopy in downstream purification |
| CN112102898A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-18 | 安徽大学 | 一种醋醅固态发酵过程谱图模态辨识方法及系统 |
| CN112102898B (zh) * | 2020-09-22 | 2022-09-23 | 安徽大学 | 一种醋醅固态发酵过程谱图模态辨识方法及系统 |
| CN113989578A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 季华实验室 | 拉曼光谱的峰位分析方法、系统、终端设备及介质 |
| CN113989578B (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-26 | 季华实验室 | 拉曼光谱的峰位分析方法、系统、终端设备及介质 |
| CN115060631A (zh) * | 2022-07-14 | 2022-09-16 | 长光辰英(杭州)科学仪器有限公司 | 一种自适应的颗粒物拉曼相似度判别方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111289489B (zh) | 2023-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111289489B (zh) | 一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法 | |
| Jayan et al. | Recent developments in Raman spectral analysis of microbial single cells: Techniques and applications | |
| Boyd et al. | Physiological responses of a Southern Ocean diatom to complex future ocean conditions | |
| Franco et al. | Monoalgal and mixed algal cultures discrimination by using an artificial neural network | |
| Havlik et al. | Monitoring of microalgal processes | |
| CN109001180B (zh) | 一种拉曼光谱结合人工智能高通量单细胞分析鉴定方法 | |
| Nadadoor et al. | Online sensor for monitoring a microalgal bioreactor system using support vector regression | |
| Xu et al. | Qualitative discrimination of yeast fermentation stages based on an olfactory visualization sensor system integrated with a pattern recognition algorithm | |
| Liu et al. | The application of spectroscopy technology in the monitoring of microalgae cells concentration | |
| Wood et al. | A simple and non-destructive method for chlorophyll quantification of Chlamydomonas cultures using digital image analysis | |
| CN111742055A (zh) | 使用光谱技术识别微生物的方法 | |
| US10184144B2 (en) | Identification and/or characterization of a microbial agent using taxonomic hierarchical classification | |
| Alam et al. | Standard techniques and methods for isolating, selecting and monitoring the growth of microalgal strain | |
| WO2024061126A1 (zh) | 聚羟基脂肪酸酯含量的检测方法、装置、系统、设备 | |
| Giordano et al. | Spectroscopic classification of 14 different microalga species: first steps towards spectroscopic measurement of phytoplankton biodiversity | |
| CN117079724A (zh) | 一种基于谱聚类与单细胞拉曼光谱的细胞生长分析方法 | |
| Obata et al. | Using chlorophyll fluorescence to monitor yields of microalgal production | |
| CN115963074A (zh) | 一种微生物材料孢子菌丝占比的快速检测方法和系统 | |
| EP2569732B1 (en) | Identification and/or characterization of a microbial agent using taxonomic hierarchical classification | |
| CN112326619A (zh) | 一种基于双光谱技术的微流控农药残留检测方法 | |
| Schiewe et al. | Real‐time monitoring of biomass during Escherichia coli high‐cell‐density cultivations by in‐line photon density wave spectroscopy | |
| CN111122484A (zh) | 一种水体细菌的定性与定量方法 | |
| CN111024670B (zh) | 一种基于pea荧光曲线测定水体初级生产力的方法 | |
| CN118549380A (zh) | 基于gru-rnn模型的细胞培养基葡萄糖浓度测量方法 | |
| CN118318765B (zh) | 一种基于代谢组学的单环刺螠速生品系选育方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Hong Xi Inventor after: Li Xinli Inventor after: Xue Ying Inventor after: Li Hang Inventor after: Wang Nan Inventor before: Li Wenjie Inventor before: Li Xinli Inventor before: Xue Ying Inventor before: Li Hang Inventor before: Wang Nan |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |