CN103940801A

CN103940801A - 一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法

Info

Publication number: CN103940801A
Application number: CN201410157736.XA
Authority: CN
Inventors: 徐健; 何曰辉; 籍月彤; 王婷婷; 王允; 黄巍
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明涉及微藻鉴定领域，具体是一种基于单细胞拉曼光谱的在单细胞水平快速鉴定微藻的方法。采集微藻细胞的单细胞拉曼光谱，建立微藻单细胞拉曼光谱数据库，根据未知微藻的单细胞拉曼光谱与建立的微藻单细胞拉曼光谱数据库进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。本发明利用单细胞拉曼光谱技术鉴定微藻，提供了一种简单、快速、非侵入的在单细胞水平鉴定微藻的方法，为微藻鉴定和突变体筛选提供了一种高效的判别方法。

Description

一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法

技术领域

本发明涉及微藻鉴定领域，具体是一种基于单细胞拉曼光谱的在单细胞水平快速鉴定微藻的方法。

背景技术

微藻为一类光合自养微生物，能够利用光能和CO₂合成蛋白质、糖类、脂质、色素等物质并放出O2；微藻种类多、数量大、繁殖快，是生态系统中的初级生产者，是生态系统物质和能量循环的重要组成部分；同时微藻在食品、保健、医药、环保和新型生物燃料炼制领域具有广阔的应用前景。例如，小球藻、栅列藻、新月藻、螺旋藻等蛋白质含量高，已被用作蛋白质来源；小球藻、螺旋藻、杜氏盐藻、雨生红球藻等含丰富的不饱和脂肪酸（DHA、EPA）、微藻多糖及多种具生理活性蛋白和分子，已被用作功能食品和医药工业；小球藻、微拟球藻等淀粉、脂质含量高，被公认为是最有潜力的新型生物燃料的原料供应者。

微藻的分类鉴定是研究微藻的基础，微藻传统分类鉴定方法分为形态学鉴定法、生化鉴定法和分子生物学鉴定法。每种方法各有优缺点，形态学鉴定法主要根据藻细胞外部形态和结构来确定其归属，是最传统和直接的分类鉴定方法。形态学鉴定法存在许多制约因素，第一，需要具有丰富经验的专业人员，且费时费力；第二，微藻在不同生长阶段或条件下，其形态结构会发生变化；第三，大多微藻的鉴定需要经过扩大培养，增大了鉴定的难度。生化鉴定法是根据细胞内以糖类、脂质、蛋白质和核酸等生物大分子的组成来对微藻分类鉴定的方法。生化鉴定法需要定量或定性分析细胞中的微藻“特征化学成分”，因此需要昂贵的化学物质分离提取和分析仪器；需要经过扩大培养，以提取相当量的生物大分子；生化特性只是对传统分类方法的一个补充，不是一个完整的分类体系。分子生物学分类是通过比较真核生物核糖体rDNA序列的同源性确定其分类地位。分子生物学鉴定方法由于操作容易、结果可靠，广泛应用于微藻的分类鉴定，但其仍是基于对纯种微藻群体的分析，无法鉴定复杂微藻生物群落中的微藻。

单细胞拉曼光谱技术（Single-Cell Raman Spectroscopy，SCRS）是将光学囚禁技术与显微拉曼光谱技术相结合用于检测细胞的一项新技术。拉曼光谱在细菌种类鉴定上有少许报道，Susan等应用拉曼光谱鉴定牛奶中的布鲁氏菌，准确率达到94%；Sandra等应用拉曼光谱鉴定了引起尿道感染的微生物，在种水平上，其准确率为92%。应用单细胞拉曼光谱技术鉴定微藻还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法，采集微藻细胞的单细胞拉曼光谱，建立微藻单细胞拉曼光谱数据库，根据未知微藻的单细胞拉曼光谱与建立的微藻单细胞拉曼光谱数据库进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。

进一步的说，将不同种类的微藻在不同条件下培养至不同的生长时期，利用拉曼光钳捕获不同种类不同条件下不同生长时期的微藻单细胞，同时瞬间淬灭细胞内的色素，采集细胞的拉曼光谱，进而获得不同种类微藻中每一种微藻所对应的一组拉曼光谱数据，构建微藻的拉曼光谱数据库；将未知待测藻株或突变体的拉曼光谱与相应的微藻拉曼光谱数据库中的拉曼光谱进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。

再进一步的说，

1）将不同种类的微藻细胞在不同培养条件下培养至不同的生长时期；

2）用ddH2O洗净细胞，重悬，吸入毛细管中；

3）在显微视野下用拉曼光钳捕获不同种类微藻不同生长时期的微藻细胞，采集细胞的拉曼光谱；并测定细胞周围背景的拉曼信号；

4）数据处理。

所述步骤中激发光源波长为532nm，功率为100mW，拉曼光谱采集时间为2秒。

所述步骤中数据处理包括扣除背景值、基线校准、归一化处理等，多维数据分析方法为主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、线性判别式分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、支持向量机（Support Vector Machine，SVM）分析等。

同时可以在单细胞水平上实现微藻鉴定和突变体筛选；微藻可为四爿藻、筒柱藻、微拟球藻、杜氏盐藻、三角褐指藻、金藻，也可为四株莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）突变体CC124，CC4324，CC4333和CC4334。

本发明所具有的优点：

本发明利用单细胞拉曼光谱技术的简单、快速、非侵入的在单细胞水平鉴定微藻。与传统细胞鉴定技术相比，单细胞拉曼光谱技术具有以下优势：（1）细胞是生命活动的基本单位，单细胞拉曼光谱从单细胞层面鉴定细胞的种类，样本需求量小，不需要对细胞进行培养以获得大量的生物质，避免群体分析引入的误差；（2）无需添加化学染料及其他标记，不侵入细胞，对细胞不产生或产生较少的损伤，因此对鉴定的细胞可以分离并再培养；（3）简单快速，不需要复杂的分析步骤，每个细胞拉曼光谱采集时间仅为2秒；（4）拉曼光谱反应了整个细胞中的化学物质指纹图谱，如核酸、蛋白质、脂质和糖类等，可用于监测细胞的代谢过程。

附图说明

图1为本发明实施例提供的四株莱茵衣藻突变体不同培养条件、不同生长时期的平均拉曼光谱。

图2为本发明实施例提供的四株莱茵衣藻突变体基于单细胞拉曼光谱的PC-LDA score值图。

具体实施方式

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明将不同种类的微藻在不同条件下培养（按照常规技术以适合各自微藻的培养条件进行培养）至不同的生长时期，利用拉曼光钳捕获不同种类不同条件下不同生长时期的微藻单细胞，同时瞬间淬灭细胞内的色素，采集细胞的拉曼光谱，进而获得不同种类微藻中每一种微藻所对应的一组拉曼光谱数据，构建微藻的拉曼光谱数据库；将未知待测藻株或突变体的拉曼光谱与相应的微藻拉曼光谱数据库中的拉曼光谱进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。

实施例

1）四株莱茵衣藻（Chlamydonomas reinhardtii）突变体CC124、CC4324、CC4333和CC4334购自Chlamydomonas Resource Center：http://chlamycollection.org/strains/。

2）莱茵衣藻分别接种到有氮或缺氮的TAP（Tris acetate phosphate）液体培养基中（3个生物学重复），150μmol photons m^-2s^-1光照，25℃，通气搅拌培养。培养至0h、12h、24h、48h、72h和96h时取样。其中，有氮或缺氮的TAP液体培养基，TAP（Tris acetate phosphate）培养基：

NH₄Cl(7.48mM)，MgSO₄(406μM)，CaCl₂(340μM),K₂HPO₄(540μM),KH₂PO₄(463μM),20mM Tris,17.4mM acetate,H₃BO₃(184μM),ZnSO₄(76.5μM),MnCl₂(25.5μM),FeSO₄(17.9μM),CoCl₂(6.77μM),(NH4)₆Mo₇O₂₄(0.88μM),CuSO₄(6.29μM),and Na₂EDTA(148μM)

3）取步骤2）不同培养时间的藻液，每个样本取1mL藻液，用ddH₂O洗涤三次；将藻液吸到扁平毛细管中（50mm length×1mm width×0.1mmheight，Camlab，UK）。

4）用单细胞拉曼分选仪（Raman-Activated Cell Sorter，RACS，Wellsens Inc，China）捕捉单细胞并采集拉曼光谱，激光参数为100mW、532nm，拉曼采集时间为2秒，每个样本采集20个细胞及4个背景值。

5）用Labspec5（HORIBA Scientific）进行背景扣除、基线校准、归一化处理和求平均值等操作。如图1所示，为四株莱茵衣藻突变体CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮（Group N+）或缺氮（Group N-）培养条件下培养至0h、12h、24h、48h、72h和96h的平均拉曼图谱，每条图谱为60个细胞的平均值，范围为450-1800cm^-1和2600-3100cm^-1。

6）对450-1800cm^-1和2600-3100cm^-1范围的单细胞拉曼光谱进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），多个变量通过线性变换以选出较少个数的重要变量。选取8个变量（变量解释率为94.66%），进行线性判别式分析（Linear Discriminant Analysis， LDA）。图2为四株莱茵衣藻突变体CC124、CC4324、CC4333和CC4334经过PC-LDA分析后得到的Scores值图，每个点代表1个细胞；图2可知四株藻株差异明显，因此通过细胞的拉曼光谱可以区分不同的藻株。

7）四株莱茵衣藻突变体CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮（GroupN+）或缺氮（Group N-）培养条件下（3个生物学重复），培养至12h、24h、48h、72h和96h，每个样本随机采集20个细胞的拉曼光谱，共获得2400个细胞的拉曼光谱；每个样本中随机抽取15个细胞作为训练组，建立微藻的拉曼光谱数据库，共1800个细胞建立支持向量机（Support VectorMachine，SVM）模型；每个样本剩余5个细胞作为测试组，共600个细胞，用已建立的模型预测测试组细胞的藻株种类；共进行了10次随机分组，每个模型10倍交叉检验。表1为鉴定四株藻株的准确性的灵敏度和特异性；鉴定四株莱茵衣藻突变体藻株的总准确率为97.93%。

表1为本发明实施例提供的四株莱茵衣藻突变体基于单细胞拉曼光谱的SVM（支持向量机分析）模型的预测结果

同时采用本发明的技术方案在单细胞水平对微藻鉴定分析和突变体筛选；微藻可为四爿藻、筒柱藻、微拟球藻、杜氏盐藻、三角褐指藻、金藻；微藻也可为四株莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）突变体CC124，CC4324，CC4333和CC4334。。以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法，其特征在于：采集微藻细胞的单细胞拉曼光谱，建立微藻单细胞拉曼光谱数据库，根据未知微藻的单细胞拉曼光谱与建立的微藻单细胞拉曼光谱数据库进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。

2.按权利要求1所述的单细胞水平快速鉴定微藻的方法，其特征在于：

将不同种类的微藻在不同条件下培养至不同的生长时期，利用拉曼光钳捕获不同种类不同条件下不同生长时期的微藻单细胞，同时瞬间淬灭细胞内的色素，采集细胞的拉曼光谱，进而获得不同种类微藻中每一种微藻所对应的一组拉曼光谱数据，构建微藻的拉曼光谱数据库；将未知待测藻株或突变体的拉曼光谱与相应的微藻拉曼光谱数据库中的拉曼光谱进行比对进而在单细胞水平实现微藻鉴定或突变体筛选。

3.按权利要求1或2所述的单细胞水平快速鉴定微藻的方法，其特征在于：

2）用ddH₂O洗净细胞，重悬，吸入毛细管中；

4）数据处理。

4.按权利要求3所述的单细胞水平快速鉴定微藻的方法，其特征在于：所述步骤中激发光源波长为532nm，功率为100mW，拉曼光谱采集时间为2秒。