CN109991208B - 基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法 - Google Patents
基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，属于种群研究技术领域。该方法包括以下步骤：S1：制备双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；S2：蓝绿藻细胞混合培养；S3：藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征；S4：建立藻细胞种水平表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；S5：基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用研究。本发明公开的双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底，可直接对藻细胞指纹特征进行增强，避免传统金属纳米粒子混合培养或胞内合成纳米粒子对细胞的毒性问题，减小衬底对藻毒素化感作用机制研究的影响。
Description
技术领域
本发明属于种群竞争作用机制研究技术领域，涉及基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法。
背景技术
目前，国内外主要是通过自然水体生理参数及优势藻种的统计分析来研究藻群落中不同藻种竞争关系，或者通过实验模拟水体不同生理环境对藻群细胞生长状态的影响，或者研究藻细胞分泌毒素/多糖等对藻群体大小、藻种相互作用及群落占优的促进机制，对浮游藻群落演替及水华机理进行阐述。其中，藻群落生命特征表征和优势藻种鉴定都采用传统/标准的方法结合统计学来完成，包括水体叶绿素吸收/遥感光谱表征，藻细胞内特殊分子免疫、荧光及高效液相色谱等分子生物学表征，优势藻种显微镜或借助人工智能的藻细胞显微图像识别等。但是，这些传统方法普遍存在对样品需要复杂的前处理、检测成本昂贵、测试周期长、对检验人员专业素质要求较高等特点，在一定程度上限制了其在藻群细胞胞内生命特征动态监测的应用。
拉曼光谱，以其分子指纹特性，被用作研究水生生态环境扰动对浮游藻细胞生长及胞内生理特征分子水平上的影响。然而，普通拉曼无法满足产毒/不产毒微囊藻种间分子指纹差异、藻毒素诱导藻种群竞争化感作用引起的特征分子指纹演变规律分析分辨率。基于贵金属纳米粒子电磁增强机制，藻细胞生物合成纳米粒子显著增强了细胞内分子拉曼散射活性，原位获得了胞内色素、脂质、蛋白质等分子指纹。但是，细胞内分子原位表面增强拉曼散射光谱研究面临着生物合成纳米粒子的电磁增强性能不可控、合成过程纳米粒子生物毒性等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，实现藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像，开展蓝绿藻种群竞争化感作用机制表面增强拉曼散射光谱研究。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，该方法包括以下步骤：
S1：制备双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；
S2：蓝绿藻细胞混合培养；
S3：藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征；
S4：建立藻细胞种水平表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；
S5：基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究。
进一步，所述步骤S1具体为：在经过等离子体或化学方法清洗过的硅或玻璃硬质基底表面上，采用磁控溅射方法，依次镀金、银膜，金膜厚度为50-100纳米，银膜厚度为20-50纳米；其中，为提高金膜在衬底表面的吸附性，在镀金膜前需镀2-3纳米的铬；
基于聚焦离子束刻蚀系统，采用氦源，选用10um光阑，束流大小约为2pA，利用其精密加工性能，在镀贵金属膜硬质衬底上制备纳米孔阵列；其中，聚焦离子束剂量约为14-20nC/μm2；纳米孔孔径为20-40纳米，周期为40-100纳米；
在氦离子束对上层银膜刻蚀时，氦离子与银原子相互作用，掺杂到银膜里面，产生两种作用力，一是溅射出银原子，二是促使银原子相互挤压，在纳米孔边沿形成隆起；溅射出的银原子在衬底表面电荷的作用下，重新沉积在衬底表面；同时，刻蚀下层金膜过程中溅射出来的金原子，在银膜或纳米孔表面电荷的作用下，重新沉积在银膜表面及纳米孔四壁和孔的边沿，构建了新型双金属火山口等离子体结构；其中，纳米金、银双金属层用于增强纳米孔附近单分子的拉曼散射信号，溅射沉积的金原子层用于防止银原子层的氧化；纳米孔边沿凸起间歇尺寸为20-40纳米，在纳米孔附近形成复合局域增强电磁场。
进一步，所述步骤S2具体为：
分别选取一种蓝绿藻种细胞进行灭菌扩大培养培养基为Blue-Green Medium，即BG11，在适宜的温度和光照下静止培养，每天摇动1～2次；待两种藻细胞处于稳定生长期，取相同数量的两种藻细胞进行混合培养，培养基为BG11，混合培养的目的是为了研究蓝绿藻种群竞争化感作用机制。
进一步，所述步骤S3具体为：
提取藻液并稀释，取1ul藻液滴定到制备好的表面增强拉曼散射衬底上，藻细胞会固定在火山口纳米孔或者火山口间隙处，进而采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征，获取藻细胞表面增强拉曼散射光谱；
拉曼表征参数为：选择532nm或785nm激光，激发功率不大于0.01mw，避免藻细胞光损伤，拉曼积分时间小于2秒，积分次数为1-5次，显微物镜放大倍数为50或100倍，拉曼成像扫描步长0.5-1um。
进一步，所述步骤S4具体为：
建立不同藻种藻细胞的表面增强拉曼散射光谱标准数据库，基于判别式最小二乘算法、支持向量分类机、人工神经网络或其相应地改进算法，建立藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型。
进一步，所述步骤S5具体为：
利用前述藻细胞培养方法，选择蓝绿藻种进行混合培养，并添加不同浓度的微囊藻毒素或蓝藻毒素，培养过程中隔天对混合藻液采样，采用前述方法对藻细胞进行表面增强拉曼散射光谱成像表征，并对藻细胞种类进行判别，分析不同浓度不同藻毒素诱导下藻细胞表面增强拉曼指纹特征演变规律，进而研究藻毒素在蓝绿藻种群竞争中的化感作用。
本发明的有益效果在于：1974年发展起来的表面增强拉曼光谱技术能够显著增强拉曼散射信号，具有较高的检测灵敏度，理论上可实现单分子水平上的高灵敏度检测。本发明公开的一种新型双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底制备方法及基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，新型双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底优良的细胞指纹拉曼增强性能，可以原位获得胞内色素、脂质、蛋白质等分子指纹。本发明公开的双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底，可直接对藻细胞指纹特征进行增强，避免传统金属纳米粒子混合培养或胞内合成纳米粒子对细胞的毒性问题，减小衬底对藻毒素化感作用机制研究的影响。
与现有技术相比，现阶段的技术针对的是普通拉曼光谱，且是线扫描成像光谱的藻种判别分析模型，而本发明是针对的表面增强拉曼散射光谱建立藻种判别分析模型；另外，在制备SERS衬底方面，本发明的纳米孔孔径小于现阶段的技术，且聚焦离子束指定为氦离子束。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法流程图；
图2为双金属火山口表面增强拉曼散射衬底制备工艺流程图；
图3为双金属火山口表面增强拉曼散射衬底侧视图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例一
1.一种双金属火山口表面增强拉曼散射衬底制备
如图1所示为双金属火山口表面增强拉曼散射衬底制备工艺流程，在经过等离子体或化学方法清洗过的硅、玻璃等硬质基底表面上，采用磁控溅射方法，依次镀金、银膜，金膜厚度为50纳米，银膜厚度为20纳米；其中，为了提高金膜在衬底表面的吸附性，在镀金膜前需镀2纳米的铬；
基于聚焦离子束刻蚀系统，采用氦源，选用10um光阑，束流大小约为2pA，利用其精密加工性能，在镀贵金属膜硬质衬底上制备纳米孔阵列；其中，聚焦离子束剂量约为14nC/μm2；纳米孔孔径为20纳米，周期为40纳米，如图2所示；
在氦离子束对上层银膜刻蚀时，氦离子与银原子相互作用，掺杂到银膜里面，产生两种作用力，一是溅射出银原子，二是促使银原子相互挤压，在纳米孔边沿形成隆起；溅射出的银原子在衬底表面电荷的作用下，重新沉积在衬底表面。同时，刻蚀下层金膜过程中溅射出来的金原子，在银膜或纳米孔表面电荷的作用下，重新沉积在银膜表面及纳米孔四壁和孔的边沿，构建了一种新型双金属火山口等离子体结构，如图2所示；其中，纳米金、银双金属层可以极大地增强纳米孔附近单分子的拉曼散射信号，同时，溅射沉积的金原子层也可以防止银原子层的氧化；纳米孔边沿凸起间歇尺寸为20纳米，在纳米孔附近形成复合局域增强电磁场。
2.蓝绿藻细胞混合培养
分别选取一种蓝绿藻种细胞进行灭菌扩大培养(培养基为Blue-Green Medium(BG11))，在适宜的温度和光照下静止培养，每天摇动1～2次；待两种藻细胞处于稳定生长期，取相同数量的两种藻细胞进行混合培养，培养基为BG11，混合培养的目的是为了研究蓝绿藻种群竞争化感作用机制。
3.藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征
提取藻液并稀释，取1ul藻液滴定到制备好的表面增强拉曼散射衬底上，藻细胞会固定在火山口纳米孔或者火山口间隙处，进而采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征，获取藻细胞表面增强拉曼散射光谱；
拉曼表征参数为：选择532nm激光，激发功率0.01mw，避免藻细胞光损伤，拉曼积分时间小于0.5秒，积分次数为2次，显微物镜放大倍数为50倍，拉曼成像扫描步长0.5um。
4.藻细胞种水平表面增强拉曼散射光谱判别分析模型
建立不同藻种藻细胞的表面增强拉曼散射光谱标准数据库，基于判别式最小二乘算法及其相应地改进算法，建立藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；
5.基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用研究
利用前述藻细胞培养方法，选择铜绿微囊藻、小球藻种进行混合培养，并添加不同浓度的微囊藻毒素，培养过程中隔天对混合藻液采样，采用前述方法对藻细胞进行表面增强拉曼散射光谱成像表征，并对藻细胞种类进行判别，分析不同浓度不同藻毒素诱导下藻细胞表面增强拉曼指纹特征演变规律，进而研究藻毒素在铜绿微囊藻和小球藻种群竞争中的化感作用。
实施例二
1.一种双金属火山口表面增强拉曼散射衬底制备
如图1所示为双金属火山口表面增强拉曼散射衬底制备工艺流程，在经过等离子体或化学方法清洗过的硅、玻璃等硬质基底表面上，采用磁控溅射方法，依次镀金、银膜，金膜厚度为100纳米，银膜厚度为50纳米；其中，为了提高金膜在衬底表面的吸附性，在镀金膜前需镀3纳米的铬；
基于聚焦离子束刻蚀系统，采用氦源，选用10um光阑，束流大小约为2pA，利用其精密加工性能，在镀贵金属膜硬质衬底上制备纳米孔阵列；其中，聚焦离子束剂量约为20nC/μm2；纳米孔孔径为40纳米，周期为100纳米，如图2所示；图3为双金属火山口表面增强拉曼散射衬底侧视图，其中D代表纳米孔直径；G代表火山口突起间隙。
在氦离子束对上层银膜刻蚀时，氦离子与银原子相互作用，掺杂到银膜里面，产生两种作用力，一是溅射出银原子，二是促使银原子相互挤压，在纳米孔边沿形成隆起；溅射出的银原子在衬底表面电荷的作用下，重新沉积在衬底表面。同时，刻蚀下层金膜过程中溅射出来的金原子，在银膜或纳米孔表面电荷的作用下，重新沉积在银膜表面及纳米孔四壁和孔的边沿，构建了一种新型双金属火山口等离子体结构，如图2所示；其中，纳米金、银双金属层可以极大地增强纳米孔附近单分子的拉曼散射信号，同时，溅射沉积的金原子层可以防止银原子的氧化；纳米孔边沿凸起间歇尺寸为50纳米，在纳米孔附近形成复合局域增强电磁场。
2.蓝绿藻细胞混合培养
分别选取一种蓝绿藻种细胞进行灭菌扩大培养(培养基为Blue-Green Medium(BG11))，在适宜的温度和光照下静止培养，每天摇动1～2次；待两种藻细胞处于稳定生长期，取相同数量的两种藻细胞进行混合培养，培养基为BG11，混合培养的目的是为了研究蓝绿藻种群竞争化感作用机制。
3.藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征
提取藻液并稀释，取1ul藻液滴定到制备好的表面增强拉曼散射衬底上，藻细胞会固定在火山口纳米孔或者火山口间隙处，进而采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征，获取藻细胞表面增强拉曼散射光谱；
拉曼表征参数为：选择785nm激光，激发功率0.01mw，避免藻细胞光损伤，拉曼积分时间小于1秒，积分次数为1次，显微物镜放大倍数为100倍，拉曼成像扫描步长1um。
4.藻细胞种水平表面增强拉曼散射光谱判别分析模型
建立不同藻种藻细胞的表面增强拉曼散射光谱标准数据库，基于支持向量分类机及其相应地改进算法，建立藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；
5.基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用研究
利用前述藻细胞培养方法，选择水华微囊藻、衣藻种进行混合培养，并添加不同浓度的蓝藻毒素，培养过程中隔天对混合藻液采样，采用前述方法对藻细胞进行表面增强拉曼散射光谱成像表征，并对藻细胞种类进行判别，分析不同浓度不同藻毒素诱导下藻细胞表面增强拉曼指纹特征演变规律，进而研究藻毒素在水华微囊藻和衣藻种群竞争中的化感作用。综上所述，本发明提供的一种新型双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底制备方法及基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，可实现藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像，易于实现藻细胞种间拉曼指纹特征差异的辨别。
本发明公开的一种新型双金属火山口纳米孔阵列表面增强拉曼散射衬底制备方法及基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，可以应用到三峡库区支流回水区蓝藻水华中蓝绿藻种群竞争化感作用机制的研究，对有毒藻种占优的生理生化条件进行预测，阐述蓝藻水华成因的根本所在，为有害水华防治提供科学依据。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
S1：制备双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；
S2：蓝绿藻细胞混合培养；
S3：藻细胞表面增强拉曼散射光谱成像表征；
S4：建立藻细胞藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；
S5：基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究；
所述步骤S1具体为：在经过等离子体或化学方法清洗过的硅或玻璃硬质基底表面上，采用磁控溅射方法，依次镀金、银膜，金膜厚度为50-100纳米，银膜厚度为20-50纳米；其中，为提高金膜在基底表面的吸附性，在镀金膜前需镀2-3纳米的铬；
基于聚焦离子束刻蚀系统，采用氦源，选用10um光阑，束流大小为2pA，在镀贵金属膜硬质衬底上制备纳米孔阵列；其中，聚焦离子束剂量为14-20nC/μm2；纳米孔孔径为20-40纳米，周期为40-100纳米；
在氦离子束对上层银膜刻蚀时，氦离子与银原子相互作用，掺杂到银膜里面，产生两种作用力，一是溅射出银原子，二是促使银原子相互挤压，在纳米孔边沿形成凸起；溅射出的银原子在未被刻蚀的银膜表面电荷的作用下，重新沉积在未被刻蚀的银膜表面；待所述银膜被刻穿后，开始刻蚀金膜，刻蚀下层金膜过程中溅射出来的金原子，在未被刻蚀的银膜或纳米孔表面电荷的作用下，重新沉积在银膜未被刻蚀的表面及纳米孔四壁和纳米孔的边沿，构建双金属火山口表面增强拉曼散射衬底；其中，纳米金、银双金属层用于增强纳米孔附近单分子的拉曼散射信号，溅射沉积的金原子层用于防止银原子层的氧化；纳米孔边沿凸起间隙尺寸为20-40纳米，在纳米孔附近形成复合局域增强电磁场；
所述步骤S2具体为：
分别选取一种蓝绿藻种细胞进行灭菌扩大培养，在适宜的温度和光照下静止培养，每天摇动1～2次；待两种藻细胞处于稳定生长期，取相同数量的两种藻细胞进行混合培养；所述步骤S3具体为：
提取混合培养的藻液并稀释，取1ul稀释后的藻液滴到制备好的双金属火山口表面增强拉曼散射衬底上，藻细胞固定在火山口纳米孔或者火山口纳米孔边沿凸起间隙处，进而采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征，获取藻细胞表面增强拉曼散射光谱；
所述步骤S4具体为：
建立不同藻种藻细胞的表面增强拉曼散射光谱标准数据库，基于判别式最小二乘算法、支持向量机或人工神经网络，建立藻种表面增强拉曼散射光谱判别分析模型；
所述步骤S5具体为：
利用步骤S2所述的蓝绿藻细胞混合培养方法，选择蓝绿藻种进行混合培养，并添加不同浓度的微囊藻毒素或蓝藻毒素，培养过程中隔天对混合藻液采样，采用步骤S3所述的方法对混合藻液进行表面增强拉曼散射光谱成像表征，并对藻细胞种类进行判别，分析不同浓度不同藻毒素诱导下藻细胞表面增强拉曼指纹特征演变规律，进而研究藻毒素在蓝绿藻种群竞争中的化感作用。
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射光谱的蓝绿藻种群竞争化感作用机制研究方法，其特征在于：
采用共聚焦显微拉曼光谱仪对藻细胞进行成像表征的参数为：选择532nm或785nm激光，激发功率不大于0.01mw，避免藻细胞光损伤，拉曼积分时间小于2秒，积分次数为1-5次，显微物镜放大倍数为50或100倍，拉曼成像扫描步长0.5-1um。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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