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一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，包括：取相同藻种的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，采用拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息；对采集的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后采用偏最小二乘法从各预处理谱图中提取主因子；更换藻种，获得与不同藻种相对应的主因子；以所有藻种的主因子作为输入，以与各主因子相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型；取待鉴别活体藻液，获得该待鉴别活体藻液的主因子并输入所述BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。本发明实现了基于拉曼光谱技术的藻种快速准确分类，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间。

Description

一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法
技术领域
本发明涉及藻种分类检测技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法。
背景技术
微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用（少部分为异养生长）的水生（或陆生、气生、共生）低等植物。它是能够进行光合作用的微生物，可以利用阳光、水和CO2合成自身所需要的物质。目前，对藻类的识别分类及其生化分析已经成为海洋生物学的研究热点之一。
小球藻(Chlorella)是一类单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、小球藻属，广泛分布于自然界，淡水水域中种类最多。小球藻易于培养，生长繁殖速度很快，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖，应用价值很高。已有研究表明，小球藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物。国内外的学者对小球藻的药理作用进行了广泛的研究，发现小球藻具有防治消化性溃疡、抗肿瘤、增强免疫、抗辐射、抗病原微生物、防治贫血、降血脂和抗动脉粥样硬化等药理作用。近年来，我国也开始重视小球藻的开发利用。
等鞭金藻属于金藻门、等鞭金藻纲、等鞭藻属，细胞大小一般为6-7μm×5-6μm，细胞上有两条等长鞭毛。等鞭金藻具有繁殖速度快、没有细胞壁、易于吸收、生产成本低等优点。等鞭金藻营养丰富，富含蛋白质、多糖和类胡萝卜素等，且安全无毒、易于人体吸收，其营养研究已受到广泛的关注。同时等鞭金藻含有大量的ω-3多不饱和脂肪酸，其中DHA和C18:2的含量最为丰富。等鞭金藻还被用于研发抗肿瘤药物，以及用于重金属吸附。因此，等鞭金藻在生物质能源生产上具有广阔的应用前景。
拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，它的原理和机制与红外光谱不同，红外光谱对极性基团有很强的检出能力，而非极性基团如C=C，C-C等则具有很强的拉曼活性。但它们提供的结构信息是类似的，都是关于分子内部各种分子振动频率及有关振动能级的情况，所以能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。另外水的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研究水溶液中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。
发明内容
本发明提供了一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，解决了现有检测方法检出率低，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，包括以下步骤：
（1）取相同藻种的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，采用拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息；
（2）对步骤（1）采集的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后采用偏最小二乘法从各预处理谱图中提取主因子；
（3）更换藻种，重复操作步骤（1）和步骤（2），获得与不同藻种相对应的主因子；
（4）以所有藻种的主因子作为输入，以与各主因子相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型；
（5）取待鉴别活体藻液，通过步骤（1）和步骤（2）的处理获得该待鉴别活体藻液的主因子并输入所述BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
偏最小二乘法(PLS)是一种应用非常广泛的化学计量学方法，它综合了多元线性回归法(MLR)和主成分回归法(PCR)的优势，具有预测能力强和模型相对简单等优点。PLS能根据输出变量将原始数据压缩为主成分，用它压缩成的主成分能提高非线性模型的预测精度。
人工神经网络是模仿人脑神经细胞的结构和功能的系统。目前应用较广的是一种基于误差反向传播算法的BP神经网络。由于其具有高度非线性隐射的能力，现已在各个领域得到了广泛的应用，并取得了令人满意的结果。
在所述的步骤（1）中，将样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间1s，累计次数一次，得到所述的拉曼光谱原始信息，且整个实验过程都是在恒温（约25℃）条件下进行的。
步骤（2）中，所述的预处理为依次进行的基线校正、宇宙射线去除方法和平滑处理，且预处理过程都是在软件WIRE3.3中实现。
由于原始拉曼受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用基线校正的方法去除荧光的干扰，凸显信号；宇宙射线是采用电荷耦合检测器(CCD)收集拉曼信号时产生的一种射线，尤其是在较长的积分时间内采集较弱信号的时候，宇宙射线非常容易产生，它是一种数据污染源，有时候会被误认为是信号，因此光谱处理的第二步是去除宇宙射线。最后对获得的拉曼曲线进行平滑处理，以提高信噪比。
在所述的步骤（2）中，从各预处理谱图中提取主因子数为5。采用预处理后的拉曼光谱曲线建立神经网络模型，当采用主因子数为5作为神经网络的输入时得到的模型效果最佳。
在所述的步骤（5）中，待鉴别活体藻液的主因子输入BP神经网络模型中，与已知藻种的主因子进行对比，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明实现了基于拉曼光谱技术的藻种快速准确分类，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。
附图说明
图1a为本发明实施例中某小球藻藻液样本的原始拉曼光谱图。
图1b为本发明实施例中某小球藻藻液样本经预处理后的拉曼光谱。
图2为预处理后小球藻与等鞭金藻样本的平均拉曼谱线。
图3为实施例中小球藻藻液样本与等鞭金藻藻液样本的预测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
在实施例中，选取的活体藻液样本为小球藻和等鞭金藻样本，拉曼光谱仪为雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪（inVia–Reflex 532/XYZ）。
取一定浓度的小球藻和等鞭金藻样本100ml，分别加入水0ml，10ml，20ml，30ml，40ml进行稀释，得到五种不同浓度梯度的反应液，每种梯度8个样本，每种藻类各40个样本。采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪（inVia–Reflex 532/XYZ），获取活体小球藻藻液、活体等鞭金藻藻液各40个样本的拉曼光谱原始信息。即将制好的藻液切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面。其中曝光时间设置为1s，激光强度为1mv，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温（约25℃）条件下进行的，图1a是某小球藻藻液样本的原始拉曼光谱。
由于原始拉曼光谱图受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用基线校正的方法去除荧光的干扰，凸显信号。宇宙射线是当用电荷耦合检测器(CCD)收集拉曼信号时产生的一种射线，尤其是在较长的积分时间内采集较弱的信号的时候，宇宙射线非常容易产生，它是一种数据污染源，有时候会被误认为是信号，因此光谱处理的第二步是去除宇宙射线。最后对获得的拉曼谱线进行平滑处理以提高信噪比，这些预处理的过程都是在软件WIRE3.3中实现的，其中图1b是图1a中的小球藻样本经上述预处理后的拉曼光谱。
对80个藻液样本进行上述预处理，图2为预处理后小球藻与等鞭金藻样本的平均拉曼谱线。然后采用神经网络建立两种藻类的判别模型，其中将小球藻藻液、等鞭金藻藻液分别标定为“1”和“2”。随机选取小球藻藻液、等鞭金藻藻液各30个样本用于建模，各10个样本用于预测。采用PLS分析方法，经交互验证法判断，最佳主成分数为5，其中这5个主成分对原始数据的累积贡献率为98.9％。于是选择这5个特征变量，以它们作为的输入变量，并设定网络输入层、隐含层、输出层的节点数分别为5，8，1，训练集的样本数是60，预测样本集为20个样本数，得到模型的判别率为100%，拟合残差为5.361×10-5。
小球藻藻液和等鞭金藻藻液各有10个预测样本，针对每个预测样本，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息，并对拉曼光谱原始信息依次进行基线校正、宇宙射线去除方法和平滑处理，得到对应的预处理谱图，然后采用偏最小二乘法从各预处理谱图中提取主因子，再将该预测样本所提取的主因子输入BP神经网络模型，与已知藻种的主因子进行对比，获得预测样本的结果如图3所示，图中横坐标“1”代表小球藻藻液，“2”代表等鞭金藻藻液，从图中可以看出每个预测样本的预测结果与标准的藻液类别数值存在一定差值，只要差值在±0.5之内，即可将该预测样本划分为对应的数值类别的藻类。

Claims (5)

1.一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取相同藻种的多个样本，每个样本均为当前藻种的活体藻液，采用拉曼光谱仪获取各个样本的拉曼光谱原始信息；
（2）对步骤（1）采集的拉曼光谱原始信息进行预处理，得到对应的预处理谱图，然后采用偏最小二乘法从各预处理谱图中提取主因子；
（3）更换藻种，重复操作步骤（1）和步骤（2），获得与不同藻种相对应的主因子；
（4）以所有藻种的主因子作为输入，以与各主因子相对应的藻种分类为输出，建立BP神经网络模型；
（5）取待鉴别活体藻液，通过步骤（1）和步骤（2）的处理获得该待鉴别活体藻液的主因子并输入所述BP神经网络模型，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
2.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，其特征在于，在所述的步骤（1）中，将样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间1s，得到所述的拉曼光谱原始信息。
3.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的预处理为依次进行的基线校正、宇宙射线去除方法和平滑处理。
4.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，其特征在于，在所述的步骤（2）中，从各预处理谱图中提取主因子数为5。
5.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，其特征在于，在所述的步骤（5）中，待鉴别活体藻液的主因子输入BP神经网络模型中，与已知藻种的主因子进行对比，获得待鉴别活体藻液中所包含的藻种分类。
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