CN104198409A - 一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法 - Google Patents

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邵咏妮
潘健
朱红艳
蒋林军
何勇
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Abstract

本发明公开了一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，包括步骤：(1)取单一藻种且浓度不同的多个活体藻液样本，采集各活体藻液样本的原位透射光谱信号；(2)更换藻种，获得不同藻种样本的原位透射光谱信号；(3)对原位透射光谱信号预处理，得到预处理谱图，并采用连续投影算法提取预处理谱图中的有效波长；(4)以有效波长对应的透射率值作为输入值，藻种类别作为输出，采用极限学习机建立藻种类别判定模型；(5)取待鉴别的活体藻液，获得所述的有效波长，用该有效波长对应的透射率值输入藻种类别判定模型，得到待鉴别的活体藻液中所包含的藻种分类。本发明实现了基于可见近红外光谱的微藻种类原位、无损、快速鉴别。

Description

一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法
技术领域
本发明涉及藻种分类检测技术领域，尤其涉及一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种分类识别方法。
背景技术
微藻(Microalgae)是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用(少部分为异养生长)的水生(或陆生、气生、共生)低等植物。它是能够进行光合作用的微生物，可以利用阳光、水和CO2合成自身所需要的物质。目前，对藻类的识别分类及其生化分析已经成为海洋生物学的研究热点之一。微藻种类很多，目前全球范围已知的微藻有两万余种，占全部藻类品种的70％。
传统的微藻鉴定方法主要依赖于显微镜对微藻形态结构的观察和一些藻体所固有的生理生化特性。通过显微镜的放大作用，有许多的形态特征被用于微藻的鉴定及分类。但是对于许多小型、微型的藻类，形态鉴定显得非常困难，而且不准确。
为实现对活体生物的无损检测，公开号为CN 103411952 A的专利文献提供了一种基于拉曼光谱技术的藻种分类识别方法，以及公开号为CN103499560A的专利文献提供了一种结合拉曼光谱技术和谱峰比值法的藻种鉴别方法，上述两篇文献均结合光谱技术，实现藻类的快速鉴别。
可见近红外光谱法是近年来迅速发展起来的分析检测方法，可充分利用全谱段或多波长下的光谱数据进行定性或定量分析。与传统的分析化学方法相比，可见近红外光谱法具有分析速度快、效率高、成本低、无损伤、无污染等特点，已经广泛应用于各个领域。目前，国内外利用光谱技术进行藻种鉴别的研究还很少，近年来出于方法的快速、简单和活体生物无损监测的需求，研究光谱技术在藻种鉴别方面的可行性显得尤为必要。
发明内容
本发明提供了一种可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，解决了现有检测方法检出率低，相对繁琐、耗时、耗力的问题。
一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，包括步骤：
(1)取单一藻种且浓度不同的多个活体藻液样本，采集各活体藻液样本的原位透射光谱信号；
(2)更换藻种，重复操作步骤(1)，获得不同藻种的活体藻液样本的原位透射光谱信号；
(3)对步骤(1)和步骤(2)中的原位透射光谱信号预处理，得到预处理谱图，并采用连续投影算法(SPA)提取预处理谱图中的有效波长(EWs)；
(4)以有效波长对应的透射率值作为输入值，藻种类别作为输出，采用极限学习机(ELM)建立藻种类别判定模型；
(5)取待鉴别的活体藻液，通过步骤(1)和步骤(3)的处理，获得待鉴别的活体藻液的所述有效波长，用该有效波长对应的透射率值输入所述的藻种类别判定模型，得到所述待鉴别的活体藻液中所包含的藻种分类。
在步骤(1)和步骤(2)中，采集所述原位透射光谱信号的设备包括光纤光谱仪和连接光纤光谱仪的Y形光纤，所述Y形光纤的一端连接有光纤探针。具体采用的是便携式USB4000微型光纤光谱仪，光纤探针可以浸入藻液体内至任意深度，所述光纤探针的光程为5mm。
为了去除光谱信号中存在的噪声和谱线平移等干扰，提高信号的信噪比，最大限度地挖掘光谱曲线的有效信息，提高模型的检测精度和稳定度，需要采取光谱预处理方法在建模前对原始光谱数据进行预处理，步骤(3)中的预处理包括依次进行平滑、变量标准化、多元散射校正和导数。
优选的，每个藻种对应的活体藻液样本的浓度梯度为0.8的n次方，n＝0～9。采用10个浓度梯度是使被检测微藻的浓度梯度尽可能的大且涵盖比较大的浓度范围，扩大藻种类别判定模型可检测微藻的浓度范围。
为了简化模型和提供运算速度，同时也为发开相应的检测仪器奠定理论基础，所述步骤(3)中的有效波长分别是512.8nm，688.48nm，442.23nm，432.27nm，713.46nm和929.4nm。
本发明实现了基于可见近红外光谱的微藻种类原位、无损、快速鉴别，不需要配制任何溶液或采用显微技术等，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。
附图说明
图1为本发中藻液样本透射光谱的采集装置图。
图2为本发明中4种微藻的原始可见/近红外光谱平均曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
实验所用的普通小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)购置于中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库。微绿球藻(Nannochloropsis oculata)购置于中国科学院海洋研究所。实验所用培养基根据藻种库提供的标准来配制，普通小球藻、蛋白核小球藻和莱茵衣藻均为SE培养基培养，微绿球藻为f/2培养基培养。将四种藻在相同的温度、光照(25℃，2500Lux-3500Lux，周期为12h昼12h夜)下培养。
分别取培养好的四种藻液10毫升于15毫升的离心管中，然后浓度梯度为0.8的n次方来稀释藻液，共10个浓度梯度。所含藻液分别是10ml，10×0.8ml，10×0.82ml，10×0.83ml，10×0.84ml，10×0.85ml，10×0.86ml，10×0.87ml，10×0.88ml，10×0.89ml，即10，8.0，6.4，5.1，4.1，3.3，2.6，2.1，1.7，1.3(ml)然后用蒸馏水稀释，分别获得10毫升样品在10个浓度水平。每个样品重复3次，共得到120个样本。
如图1所示，实验由便携式USB4000微型光纤光谱仪2，Y形光纤，卤素光源1和一台电脑构成。其中光纤一端连接有光纤探针。光谱范围是346nm到1038nm，并每隔0.3nm采集一次。其光谱采样间隔(波段宽)为0.3nm。每个光谱平均测量次数是5次，积分时间为13ms。通过把光纤探针浸入至藻液中固定深度得到光谱透射信息。图1为藻液样本透射光谱采集装置图。其中采用蒸馏水对光谱信号进行校正，采用RS3TM光谱采集软件保存光谱曲线，并在软件10.1(CAMO AS,Oslo,Norway)中进行预处理等的分析。实验共采集120个样本(每个藻种30个)的可见近红外透射光谱，其中随机选取80个样本用于建模，剩余的40个样本用于预测。4种微藻的原始可见/近红外光谱平均曲线如图2所示。图中横坐标为光谱波长，采用藻种光谱波长范围是346-1038nm，纵坐标为透射率值。为了去除光谱信号中存在的噪声和谱线平移等干扰，提高信号的信噪比，最大限度地挖掘光谱曲线的有效信息，提高模型的检测精度和稳定度，需要采取光谱预处理方法在建模前对原始光谱数据进行预处理。各种光谱预处理方法具有不同的功能，需要根据不同的光谱数据和检测对象，选择应用效果最佳的预处理方法。实验采用了平滑、变量标准化、多元散射校正、导数等预处理方法。然后采用SPA对预处理后的光谱数据进行有效波长的提取，被SPA选择的特征变量会根据重要性进行排列。经SPA处理，优选出6个有效波长，分别是512.8nm，688.48nm，442.23nm，432.27nm，713.46nm，929.4nm。于是将原始光谱的2582个光谱变量减少到了6个。
极限学习机(Extreme Learning Machine，ELM)是针对单个隐藏层的前馈型神经网络的监督型学习算法提出来的一种简单实用的新型算法。它能够有效克服传统神经网络训练参数选取复杂、易陷入局部最优等问题，并以其学习速度快、泛化能力强等优点成为近年来非线性拟合与模式分类领域被广泛关注和应用的新方法。其主要思想是：输入层与隐藏层之间的权值参数，以及隐藏层上的偏置向量参数是不需要像其他基于梯度的学习算法一样通过迭代反复调整刷新，求解很直接，只需求解一个最小范数最小二乘问题。因此，该算法具有训练参数少、速度非常快等优点。
将SPA优选得到的6个有效波长对应的透射率值作为ELM模型的输入，微藻的不同品种(将蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、莱茵衣藻品种值分别设为1，2，3，4)作为输出值。采用Matlab自编程序极限学习机(ELM)进行建模。
利用剩余的40个样本，在40个样本的光谱数据中，选取有效波长512.8nm，688.48nm，442.23nm，432.27nm，713.46nm和929.4nm所对应的透射率值，并输入上述的ELM模型，预测结果如下表所示：
根据上表可知，本发明的藻种鉴别方法具有较高预测准确率，四种藻类的预测正确率均在80％以上。

Claims (6)

1.一种基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取单一藻种且浓度不同的多个活体藻液样本，采集各活体藻液样本的原位透射光谱信号；
(2)更换藻种，重复操作步骤(1)，获得不同藻种的活体藻液样本的原位透射光谱信号；
(3)对步骤(1)和步骤(2)中的原位透射光谱信号预处理，得到预处理谱图，并采用连续投影算法提取预处理谱图中的有效波长；
(4)以有效波长对应的透射率值作为输入值，藻种类别作为输出，采用极限学习机建立藻种类别判定模型；
(5)取待鉴别的活体藻液，通过步骤(1)和步骤(3)的处理，获得待鉴别的活体藻液的所述有效波长，用该有效波长对应的透射率值输入所述的藻种类别判定模型，得到所述待鉴别的活体藻液中所包含的藻种分类。
2.如权利要求1所述的基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中，采集所述原位透射光谱信号的设备包括光纤光谱仪和连接光纤光谱仪的Y形光纤，所述Y形光纤的一端连接有光纤探针。
3.如权利要求2所述的基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，所述光纤探针的光程为5mm。
4.如权利要求1所述的基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中的预处理包括依次进行的平滑、变量标准化、多元散射校正和导数处理。
5.如权利要求1所述的基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中，每个澡种对应的活体藻液样本的浓度梯度为0.8的n次方，n＝0～9。
6.如权利要求5所述的基于可见近红外光谱技术的浸入式藻种鉴别方法，其特征在于，所述步骤(3)中的有效波长分别是512.8nm，688.48nm，442.23nm，432.27nm，713.46nm和929.4nm。
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