CN103954604A - 基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，包括以下步骤：1)采用拉曼光谱仪，获取不同农药水体中的藻类样本的拉曼光谱信息，并进行预处理得到预处理后的拉曼光谱信息；2)根据水体中农药的种类和所述预处理后的拉曼光谱信息，采用偏最小二乘法(PLS)建立预测模型；3)取待测藻类样本，获得待测藻类样本的拉曼光谱信息，采用最大谱峰比值标准化法对待测藻类样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测藻类样本所处农药水体中的农药种类。本发明无需对水样进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，提高了测量正确率。

Description

基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法

技术领域

本发明涉及基于藻类的水体检测技术领域，尤其涉及一种基于藻类拉曼光谱技术的水体残留农药检测方法。

背景技术

水体中的残留农药对全球生态平衡和饮用水安全构成极大的威胁，农药中抑制光合作用的除草剂毒性最高，这类除草剂主要是脲类、三嗪类、酞亚胺类等。

微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用(少部分为异养生长)的水生(或陆生、气生、共生)低等植物。它作为水生生态系统的初级生产者，其生长受外界多种因素的影响，因而其生理的变化可以快速反映外界环境的变化。例如，有些藻类对污染物很敏感，某些微量污染物就能对其产生影响。由于不同的除草剂能对藻体的光合作用进行不同程度的抑制，因此考虑采用藻类作为含除草剂水体的分析试验材料。

拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，它能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。如公开号为CN103472051A的专利文献提供了一种水果农药残留的表面增强拉曼光谱检测方法，可高效快速的实现水果中的农药检测。

另一方面，水和固态琼脂的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研究水溶液和固态琼脂中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。

发明内容

本发明提供了一种基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，以藻体内叶绿素为天然探针，通过拉曼光谱信号变化来反映细胞的光合代谢状态，从而反应水体中除草剂污染状况，解决了现有检测方法需要对水样进行复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。

一种基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，包括以下步骤：

1)采用拉曼光谱仪，获取不同农药水体中的藻类样本的拉曼光谱信息，并进行预处理得到预处理后的拉曼光谱信息；

2)根据水体中农药的种类和所述预处理后的拉曼光谱信息，采用偏最小二乘法(PLS)建立预测模型；

3)取待测藻类样本，并获得待测藻类样本的拉曼光谱信息，采用最大谱峰比值标准化法对待测藻类样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测藻类样本所处农药水体中的农药种类。

为便于藻类样本的信号采集，在步骤1)和步骤3)中，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液在去离子水中回火至40℃，并通过移液与藻类样本混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，用盖玻片固定后，然后再采用拉曼光谱仪进行采集。

利用拉曼光谱仪进行光谱信息采集时，采用514.5nm氩离子(Ar+)激光器(功率20mW)发出激光束，通过50X的物镜聚焦到藻类样本的表面，曝光时间设置为10s，激光强度为1％，扫描范围从500到2000(RamanShift/cm^-1)，累计次数一次，即可得到所述的拉曼光谱信息。

为使建立的模型预测范围更广，更加准确，还可以将正常水体中的藻类样本与农药水体中的藻类样本结合建立模型，具体为：重复步骤1)中的操作得到正常水体中的藻类样本的拉曼光谱信息，结合农药水体中的农药种类和对应藻类样本的拉曼光谱信息，根据步骤2)中的方法建立模型，此时得到模型可用于检测样本所处的水体是否为正常水体。

优选的，所述的预处理为Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理或卷积平滑处理。

进一步优选的，所述的预处理为依次进行的Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理和卷积平滑处理。

进一步优选的，所述的预处理为依次进行的Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理、卷积平滑处理和最大谱峰比值标准化法处理。

由于初始的拉曼光谱信息受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，采用RCF去除荧光背景，以凸显样本信号，然后再进行基线校正和SG平滑处理，其中RCF采用自编程序(Visual Basic6.0平台下编写)，基线校正和SG平滑处理采用WIRE3.3软件实现；所述的最大谱峰比值标准化法为：采用同一拉曼曲线中每一拉曼位移下的拉曼强度与最高峰拉曼强度的比值，对得到的拉曼光谱信息进行校正，以消除单个谱峰强度的变化对藻类检测的影响，克服拉曼光谱强度值容易受微藻不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等产生的误差。

在对预测模型进行校验时，在步骤3)中，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型后，设定阈值为±0.5～±0.2，用以消除误差对检测结果造成的影响。阈值越大，预测正确率越高，当阈值为±0.5时，预测正确率达到100％，当阈值为±0.2时，预测正确率达到86.67％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明实现了基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，不需要对水样进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果，进一步的，通过最大谱峰比值标准化法克服了拉曼光谱强度值容易受微藻不同生长阶段、不同曝光时间以及色素随时间推移产生分解等的影响。

附图说明

图1为三种水体下蛋白核小球藻单细胞的原始拉曼谱线。

图2为正常水体下蛋白核小球藻单细胞拉曼光谱的两种预处理结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。

取正常水样下的蛋白核小球藻样本40个，并取含脲类除草剂水体和含三嗪类除草剂水体下的蛋白核小球藻样本各40个，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪(inVia–Reflex532/XYZ)，获取各活体小球藻藻液样本的拉曼光谱原始信息。

针对每个小球藻藻液样本，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液(Sigma公司，第十一类型：底胶凝温度)在去离子水中回火至40℃，并通过移液混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，并盖上盖玻片固定，固定化后，将样本放在显微拉曼光谱仪下进行分析。在无菌操作台上，将制好的样本固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，用514.5nm氩离子(Ar+)激光器(功率20mW)发出激光束，通过50X的物镜聚焦到样本的表面。曝光时间设置为10s，激光强度是1％，扫描范围从500到2000(RamanShift/cm^-1)，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温(约25℃)条件下进行。图1是蛋白核小球藻在三种水体下的单个细胞的原始拉曼谱线。其中光谱曲线中都有比较明显的β-胡萝卜素等色素谱峰位于1522与1156(cm^-1)处，另外还有一些小峰在869、961、1005、1190、1269、1352、1388、1447(cm^-1)处，均为藻体内色素对应的特征峰。

对于每个样本的拉曼光谱原始信息，为获得较高信噪比的光谱曲线，采用RCF、基线矫正和SG平滑对原始拉曼光谱进行预处理。从图1的藻体细胞原始拉曼光谱图中，可以看到荧光信号干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此采用Rolling Circle Filter(RCF)去除荧光背景，以凸显样本信号。图2直观的显示了原始拉曼光谱的两种预处理结果。图2a是蛋白核小球藻在正常水体下的原始拉曼光谱曲线，图2b是经过RCF去荧光背景之后的拉曼光谱曲线，图2c是基线矫正和卷积平滑(Savitzky-Golay)处理的拉曼谱线。从图2c中可以看到该预处理方法可以有效的解决上述问题，因此后续提到的拉曼光谱都是基于上述预处理的。

同时，为了解决同一藻种不同情况下拉曼光谱变化的问题，本实例中采用最大谱峰比值法来消除单个谱峰的强度变化，即采用同一拉曼曲线中每一拉曼位移下的拉曼强度与最高峰(1522cm^-1)拉曼强度的比值来消除单个谱峰强度的变化对藻类检测的影响，并依此对预处理后的样本标准化处理。

在得到的120各样本中，每种水体下随机抽取25个(共75个)样本用于模型建立，剩下的45个样本用于验证。

为便于对比不同预处理后效果，本实施例分别采用RCF、基线矫正和SG平滑对原始拉曼光谱进行预处理，利用PLS对不同预处理程度下(下一种方法是在上一种方法的基础上获得的，即在原始数据上依次进行RCF、基线矫正、SG平滑和最大谱峰比值标准化)获取的数据建立预测模型，用决定系数R_c ²、R_p ²，均方根误差RMSEC、RMSEP对模型的精确性进行评价，预测正确率是阈值为±0.2时计算所得。不同的预处理方法所建立的PLS模型比较分析见表1。

表1不同预处理程度下的预测模型结果

由表1可以得出，使用SG平滑处理后，预测正确率反而有所下降，如再对SG平滑后的结果加之最大谱峰比值标准化处理则使得预测正确率提高到86.67％，因此，通过对原始数据采用RCF+基线校正+SG平滑+最大谱峰比值标准化处理后建立的PLS模型预测性能较好，能很好的满足水体除草剂鉴别的要求。

在本发明中，最大谱峰比值标准化能较好地提高预测准确的原因，是由于不同藻种所含的色素含量不同，同藻种不同个体的色素含量不同，同一个体不同采集时间的色素含量变化都会影响采集的拉曼光谱，而最大谱峰比值标准化的方法能够校正每个光谱的拉曼信号并获得较为理想的光谱，通过这种校正，随机变异得到最大程度的消除。

利用剩余的45个样本，对原始的拉曼光谱信息依次通过RCF、基线校正、SG平滑和最大谱峰比值标准化处理后处理的建立模型进行验证，具体预测结果(阈值为±0.2)如表2所示。

表2基于蛋白核小球藻的不同水体农药污染鉴别准确率

由表2可知，本发明的检测方法具有较高的预测正确率，尤其适用于含有残留农药的水体。

Claims (9)

1.一种基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用拉曼光谱仪，获取不同农药水体中的藻类样本的拉曼光谱信息，并进行预处理得到预处理后的拉曼光谱信息；

2)根据水体中农药的种类和所述预处理后的拉曼光谱信息，采用偏最小二乘法(PLS)建立预测模型；

3)取待测藻类样本，获得待测藻类样本的拉曼光谱信息，采用最大谱峰比值标准化法对待测藻类样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测藻类样本所处农药水体中的农药种类。

2.如权利要求1所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，在步骤1)和步骤3)中，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液在去离子水中回火至40℃，并通过移液与藻类样本混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，用盖玻片固定后，采用拉曼光谱仪进行采集。

3.如权利要求2所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，在拉曼光谱仪内，采用514.5nm氩离子激光器发出激光束，通过50X的物镜聚焦到藻类样本的表面，曝光时间设置为10s，激光强度为1％，扫描范围从500到2000(Raman Shift/cm^-1)，累计次数一次，得到所述的拉曼光谱信息。

4.如权利要求1所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，针对正常水体中的藻类样本，重复步骤1)中的操作得到相应的拉曼光谱信息，结合农药水体中的农药种类和对应藻类样本的拉曼光谱信息，根据步骤2)中的方法建立模型。

5.如权利要求1所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，所述的预处理为Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理或卷积平滑处理。

6.如权利要求5所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，所述的预处理为依次进行的Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理和卷积平滑处理。

7.如权利要求1所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，所述的预处理为依次进行的Rolling Circle Filter(RCF)算法处理、基线校正处理、卷积平滑处理和最大谱峰比值标准化法处理。

8.如权利要求1或7所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，所述的最大谱峰比值标准化法为：采用同一拉曼曲线中每一拉曼位移下的拉曼强度与最高峰拉曼强度的比值，对得到的拉曼光谱信息进行校正。

9.如权利要求1所述的基于藻类拉曼信号的水体残留农药检测方法，其特征在于，在步骤3)中，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型后，设定阈值为±0.5～±0.2。