CN104237200A - 基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法 - Google Patents

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邵咏妮
蒋林军
潘健
何勇
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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，包括步骤：1)获取不同浓度草甘膦水体中的蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，并对所述的拉曼光谱信息进行预处理；2)根据水体中草甘膦的浓度和预处理后的拉曼光谱信息，采用交替最小二乘建立预测模型；3)取待测蛋白核小球藻样本，获得待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，采用多元曲线分辨方法对待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测蛋白核小球藻样本所处草甘膦水体中的草甘膦浓度。本发明不需要对水样进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间。

Description

基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法
技术领域
本发明涉及关于藻类的水体检测技术领域，尤其涉及一种基于蛋白核小球藻拉曼光谱技术的草甘膦浓度检测方法。
背景技术
水体中的残留农药对全球生态平衡和饮用水安全构成极大的威胁，而除草剂属于农药中的一类。目前除草剂主要有氨基酸类、磺酰脲类、酰胺类、芳氧苯氧丙酸类、三嗪类除草剂五大类，草甘膦除草剂属于氨基酸类的一种。草甘膦是一种非选择性、无残留灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。虽然草甘膦属低毒除草剂，但是最近研究表明，草甘膦具有明显的毒性且本身是致癌物质，会对环境及人体产生损害，因此对水体残留草甘膦除草剂浓度进行检测十分重要。
微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用(少部分为异养生长)的水生(或陆生、气生、共生)低等植物。它作为水生生态系统的初级生产者，生长受外界多种因素的影响，因而其生理的变化可以快速反映外界环境的变化。例如，有些藻类对污染物很敏感，某些微量污染物就能对其产生影响。由于不同浓度的除草剂能对藻体的光合作用进行不同程度的抑制，而蛋白核小球藻，对毒物敏感、个体小、繁殖快、培养简单，在较短时间内可得到化学物质对其许多世代及种群水平的影响评价，因此考虑用它作为含草甘膦水体的分析实验材料。
拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，它能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。如公开号为CN 103472051 A的专利文献提供了一种水果农药残留的表面增强拉曼光谱检测方法，可高效快速的实现水果中的农药检测。
另一方面，水和固态琼脂的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研究水溶液和固态琼脂中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。
发明内容
本发明提供了一种基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，以藻体内叶绿素为天然探针，通过拉曼光谱信号变化来反映细胞的光合代谢状态，从而反应水体中除草剂的浓度状况，解决了现有检测方法需要对水样进行复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
一种基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，包括以下步骤：
1)获取不同浓度草甘膦水体中的蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，并对所述的拉曼光谱信息进行预处理；
2)根据水体中草甘膦的浓度和预处理后的拉曼光谱信息，采用交替最小二乘建立预测模型；
3)取待测蛋白核小球藻样本，获得待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，采用多元曲线分辨方法对待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测蛋白核小球藻样本所处草甘膦水体中的草甘膦浓度。
为便于蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息采集，在步骤1)和步骤3)中，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液在去离子水中回火至40℃，并通过移液与蛋白核小球藻样本混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，用盖玻片固定后，然后再采用拉曼光谱仪进行采集。
利用拉曼光谱仪进行光谱信息采集时，采用514.5nm氩离子(Ar+)激光器(功率20mW)发出激光束，通过50X的物镜聚焦到蛋白核小球藻样本的表面，曝光时间设置为10s，激光强度为1％，扫描范围从500到2000(Raman Shift/cm-1)，累计次数一次，即可得到所述的拉曼光谱信息。
为使建立的模型预测范围更广，更加准确，还可以将正常水体中的蛋白核小球藻样本与农药水体中的蛋白核小球藻样本结合建立模型，具体为：重复步骤1)中的操作得到正常水体中的蛋白核小球-藻样本的拉曼光谱信息，结合草甘膦水体中的草甘膦浓度和对应蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，根据步骤2)中的方法建立模型，此时得到模型可用于检测样本所处的水体是否为正常水体。
优选的，所述的预处理采用小波变换，包括Haar、Daubechies(dbn)、Coiflet(coifN)等小波函数。
传统的光谱信号去噪方法存在不足，他们消除噪声的同时也会丢失信号的高频部分，给光谱分析带来困难。由于传统去噪方法的种种限制，考虑采用基于小波的信号去噪方法。小波变换是在傅里叶变换基础上发展起来的数学方法，可用于数据压缩、平滑滤噪、基线校正、多组分重叠信号解析和图像处理等。它是一种时域一频域分析方法，具有多分辨率分析的特性，对信号不同频率成分的时间分辨率不同，可由粗及精地观察信号。
所述的多元曲线分辨方法(MCR)，能够从未知混合物的各种演进过程的数据中提取出纯物质的各种响应曲线，而不需要预先知道未知样本的种类及组成信息。
在对预测模型进行校验时，在步骤3)中，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型后，设定阈值为±0.5～±0.2，用以消除误差对检测结果造成的影响。阈值越大，预测正确率越高，当阈值为±0.5时，预测正确率达到100％，当阈值为±0.2时，预测正确率达到86.67％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明实现了基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，不需要对水样进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果，进一步的，通过多元曲线分辨方法(MCR)对重叠的信号峰进行“软分离”。
附图说明
图1是蛋白核小球藻在不同草甘膦浓度下的单个细胞的原始拉曼谱线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
取正常水样下的蛋白核小球藻样本40个，并取浓度梯度为0.6mg/L、3mol/L、15mg/L的草甘膦除草剂水体下的蛋白核小球藻样本各40个，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪(inVia–Reflex 532/XYZ)，获取各活体蛋白核小球藻藻液样本的拉曼光谱原始信息。
针对每个蛋白核小球藻样本，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液(Sigma公司，第十一类型：底胶凝温度)在去离子水中回火至40℃，并通过移液混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，并盖上盖玻片固定，固定化后，将样本放在显微拉曼光谱仪下进行分析。在无菌操作台上，将制好的样本固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，用514.5nm氩离子(Ar+)激光器(功率20mW)发出激光束，通过50X的物镜聚焦到样本的表面。曝光时间设置为10s，激光强度是1％，扫描范围从500到2000(RamanShift/cm-1)，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温(约25℃)条件下进行。图1是蛋白核小球藻在不同草甘膦浓度下的单个细胞的原始拉曼谱线。对于每个样本的拉曼光谱原始信息，为获得较高信噪比的光谱曲线，采用Haar、Daubechies(dbn)、Coiflet(coifN)等小波函数对原始光谱进行处理。
为便于比较不同小波函数对预处理的效果，本实施例分别采用Haar、Daubechies(dbn)、Coiflet(coifN)小波函数对原始拉曼光谱进行预处理，然后采用多元曲线分辨方法(MCR)对重叠的信号峰进行“软分离”。其中，多元曲线分辨方法(MCR)，能够从未知混合物的各种演进过程的数据中提取出纯物质的各种响应曲线，而不需要预先知道未知样本的种类及组成信息。将多元曲线分辨与交替最小二乘法(MCR-ALS)结合具有从混合体系光谱测定信号中直接提取纯组分光谱信息的能力，并且MCR-ALS还可以较为方便地将光谱或浓度信息合理的非负约束。
在得到的120个样本中，每种浓度下随机抽取25个(共75个)样本用于模型建立，剩下的45个样本用于验证。对MCR处理后的拉曼信号，结合交替最小二乘(ALS)对不同预处理获取的数据建立基于MCR-ALS的草甘膦浓度预测模型，用决定系数Rc 2、Rp 2，均方根误差RMSEC、RMSEP对模型的精确性进行评价，预测正确率是阈值为±0.2时计算所得。不同的预处理方法所建立的MCR-ALS模型比较分析见表1。
表1 不同小波函数处理后的MCR-ALS模型预测结果
由表1可以得出，采用不同的小波函数，所得到的MCR-ALS模型预测结果有所差异，其中采用Daubechies小波函数的效果最佳，其次是采用Haar小波函数。
在本发明中，多元曲线分辨方法能较好地提高预测准确的原因，是由于不同藻种所含的物质成分不同，同藻种不同个体的物质含量不同，同一个体不同采集时间的色素含量变化都会影响采集的拉曼光谱，而多元曲线分辨方法能够从混合物的各种演进过程的数据中提取出纯物质的各种响应曲线，而不需要预先知道未知样本的种类及组成信息。
利用剩余的45个样本，对原始的拉曼光谱信息采用Daubechies小波函数去噪和多元曲线分辨方法处理后建立MCR-ALS预测模型，其预测结果(阈值为±0.2)如表2所示。
表2 基于蛋白核小球藻的草甘膦浓度等级的鉴别准确率
由表2可知，本发明的检测方法具有较高的预测正确率，尤其适用于含有不同浓度的残留农药的水体。

Claims (7)

1.一种基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取不同浓度草甘膦水体中的蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，并对所述的拉曼光谱信息进行预处理；
2)根据水体中草甘膦的浓度和预处理后的拉曼光谱信息，采用交替最小二乘建立预测模型；
3)取待测蛋白核小球藻样本，获得待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，采用多元曲线分辨方法对待测蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息进行处理，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型，获得待测蛋白核小球藻样本所处草甘膦水体中的草甘膦浓度。
2.如权利要求1所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，在步骤1)和步骤3)中，采用2-4％w/v的琼脂糖溶液在去离子水中回火至40℃，并通过移液与蛋白核小球藻样本混合，将20％v/v的藻液滴在显微镜载玻片上，用盖玻片固定后，采用拉曼光谱仪采集拉曼光谱信息。
3.如权利要求2所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，在拉曼光谱仪内，采用514.5nm氩离子激光器发出激光束，通过50X的物镜聚焦到蛋白核小球藻样本的表面，曝光时间设置为10s，激光强度为1％，扫描范围从500到2000(Raman Shift/cm-1)，累计次数一次，得到所述的拉曼光谱信息。
4.如权利要求1所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，针对正常水体中的蛋白核小球藻样本，重复步骤1)中的操作得到相应的拉曼光谱信息，结合草甘膦水体中的草甘膦浓度和对应蛋白核小球藻样本的拉曼光谱信息，输入并建立所述的预测模型。
5.如权利要求1所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，在步骤1)中所述的预处理为小波变换。
6.如权利要求5所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，所述的预处理采用的小波函数为Haar、Daubechies或Coiflet。
7.如权利要求1所述的基于蛋白核小球藻拉曼信号的草甘膦浓度检测方法，其特征在于，在步骤3)中，将处理后的拉曼光谱信息输入所述的预测模型后，设定阈值为±0.5～±0.2。
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