CN1582400A - 用于微生物鉴定和分类的磁共振波谱分析 - Google Patents

用于微生物鉴定和分类的磁共振波谱分析 Download PDF

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CN1582400A
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雷蒙德·L·召莫尔尧伊
塔尼亚·佐雷尔
卡罗琳·E·芒福德
乌韦·希默尔赖希
罗杰·伯恩
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University of Sydney
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School Of Magnetic Resonance Research
University of Sydney
National Research Council of Canada
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Abstract

本发明涉及利用磁共振波谱分析和多因素分析对微生物如细菌和真菌进行鉴定的统计学分类器。所述的细菌可以包括葡萄球菌、肠球菌和链球菌的菌种。所述的真菌可以包括致病性酵母，包括念珠菌和隐球菌的菌种。

Description

用于微生物鉴定和分类的磁共振波谱分析
参照相关申请
本申请要求申请日为2001年2月21日、美国临时申请号为No.60/270,367的专利申请的优先权。
背景技术
本发明涉及利用磁共振波谱分析和多因素分析对微生物如细菌和真菌进行鉴定和分类。
在本申请的各个部分，各参考文献在括号内。在此，这些文献的全文被并入本申请作为参考以更充分地描述与本发明相关的技术水平。这些文献的书目可以在本申请的末尾、权利要求书之前找到。
微生物的微生物分类学分类包括通过如基于检测微生物细胞的多种代谢物/化合物或分析遗传物质的特点将微生物分组。起源于被称为祖先核糖体DNA基因(ancestral ribosomal DNA gene)的序列的“基因树”，能将所有现存有机体区别到种(species)，有时候到单一株(strain)水平。如果将培养条件仔细地标准化，那么微生物的代谢物的模式(profile)也可以构建数字算法和“树”。在医学方面，微生物病原体的鉴定容得临床医生去预测和开始适当的治疗以及提供给患者预后信息。
感染组织的部位混合了微生物细胞、宿主免疫细胞、和通常的感染部位的器官或组织的细胞。病理学的诊断传统上是费时和费力的，依赖于组织病理学检查以及通过形态学和培养，或有时其他方法对微生物的鉴定。
在临床和工业实验室两者中，用于鉴定微生物的方法一直以来都根据多种表型特征，包括形态学特征和一组生化反应。这些检测在应用上经常是费时和/或相当昂贵的，以及有些是不精确的。最近，各种方法已经被研究以打算发展一种特征性刻画以及鉴定微生物的单一和快速的方法。这些方法包括傅立叶变换红外线波谱法(Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIRS)(11)(14)，热分解质谱法(pyrolysis mass spectrometry，PyMS)(12)，电喷电离质谱法(electrospray ionization mass spectrometry，EIMS)(7)，紫外线共振拉曼光谱学(UV resonance Raman spectroscopy，UVRRS)(15)，和蛋白电泳(16)。然而这些技术的报道只提示对某些微生物菌种有快速以及可靠鉴定的可能性，大多数测定了少量的数据组，以及除了FTIRS，它们都是用于分析细胞分解的产物的破坏性的技术。其共同的局限性是它们不能直接生成关于完整的活有机体的生物化学的信息。
相反的，活细胞的磁共振波谱分析(magnetic resonancespectroscopy，MRS)能提供大量的代谢物信息。最常见的MRS的生物应用是利用该技术的无创的特点去研究活体系统中细胞的生物化学的方面(6)。
然而，不是所有MRS的应用都要求或包括鉴定能产生MR波谱的代谢物。检测与由演绎方法确定的因素(如病理状态)相关的总体波谱特征的模式识别技术已经被成功地应用于组织和体液的MRS检测。以对1H MR波谱数据的多因素分析为基础的、用于对甲状腺(21)，卵巢(23)、前列腺(9)、乳腺(13)和脑(20)的肿瘤进行客观性诊断的精确而可靠的分类器(classifier)已经被发展并已得到验证。在一些病理情况下，MRS能在光镜下看到形态学表现之前检测到恶性病变。
新型隐球菌(C.neoformans)所引起的隐球菌病是一种对免疫抑制和健康宿主有着潜在致命的真菌病。新型隐球菌是真菌性脑膜炎(1)最常见的病因，以及局灶性的病变(隐球菌球)可以出现在肺和脑(2，3)。已经由报道脑部隐球菌球最高可占澳大利亚隐球菌病患者的14％，这依赖于诊断时宿主的免疫状态(4)。脑部病变通常在从组织或机体的其他部位的体液，或在脑脊液(CSF)中鉴定出新型隐球菌后才被诊断。
当病变局限在脑部或缺乏其他的诊断材料，以及感染病变的病理不能被例如计算机断层摄象(5)或磁共振成像(MRI)(6)等方法所区别时，脑活检对于诊断是必需的。
质子磁共振波谱分析(1H MRS)已经被应用于肿瘤、卒中和细菌感染(7-14)。以最初动物模型的体外和体内研究为基础，对脑的体内MRS检测被发展并被广泛地试验于人类肿瘤的诊断(7，9，13)。MRS检测在人活体组织活检中鉴定肿瘤病理有着非常高的敏感性和特异性(16-20)。
来自微生物和/或在宿主免疫反应中新出现的细胞的MR可见化合物可以作为诊断和预后的标记物。在隐球菌脑膜炎患者的CSF中鉴定出了新型隐球菌的细胞外糖和其他产物。能通过一种外在的多糖荚膜将新型隐球菌细胞从其他侵袭性的真菌病原体的细胞中区分出来，这种荚膜构成了高比例的隐球菌生物量。纯化的荚膜物质已经被1H和13C MRS所研究(22)。更多的最近的研究已经利用MRS鉴定了体外培养的新型隐球菌的细胞外产物(23)。
致病性细菌和真菌一般通过它们的细胞形态和生化特征被鉴定和分类。传统的方法通常是费时的。当要求一些生理学实验做出明确的鉴定时，对于酵母的一些菌种如念珠菌，其中只有很少的表型和化学型的差异存在，这些实验对于鉴定可能是困难的或甚至是失败的。遗传学方法是更准确的但是需要大量的工作且价格昂贵。
发明内容
本发明目的之一是提供一种能够鉴定各种微生物的统计学分类器，优选地可达到物种群(species group)或种的水平。这里使用的名词“微生物”意味着所有的显微镜下可见的有机体(也就是所有的单细胞或多细胞活体)包括细菌、真菌、寄生虫、病毒、原虫和藻类。
根据本发明，微生物如细菌细胞悬液的一维1H MR波谱提供了含氢化合物的概貌。因此，相对于代表细胞结构(包括固定的成分如细胞壁)而言，1H MR波谱更代表了细胞生理(代谢物池)。虽然许多不同的细菌物种群可以表达和利用完全相同的代谢途径，但是当不同的物种群生长在相同的环境时，不同物种群中酶的不同水平的表达和活性能造成明显不同水平的特定的代谢物。因此，提出代谢池大小的显著不同能被测定为不同细菌物种群间1H MR波谱的差异。这在以往的选定细菌的1H MR波谱的对比研究中被提到，然而在该研究中只有少量的微生物被检测且其所使用的定性的鉴定方法都不允许对物种群进行自动化和定量的比较。
根据本发明，利用线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)，对不同的微生物分离物如不同种的细菌的培养物进行分析，能够依据微生物的1H MR波谱，对细菌的种进行可靠的、自动化的鉴定。
根据本发明，提供了一种通过联合质子磁共振波谱法(1H MRS)和多因素统计分析来鉴定微生物、细菌的新的指纹技术。这使得对于常见的属于细菌的临床微生物，已经形成了一种有效的鉴定策略，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和米氏链球菌(Streptococcus milleri)物种群。利用1H MRS检测了总计104份不同的分离物的312份培养物。应用步步为营法(bootstrapping process)和LDA发展出了优化的分离器，以提供波谱的客观性分类。微生物的鉴定依据于对来自双份培养物的波谱的分类，并获得了与传统鉴定方法94％的一致。被不正确地鉴定的微生物少于1％。剩下的5％的微生物的鉴定被认为是不确定的(indeterminate)。检测了少量铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)和鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)的分离菌，并能与粪肠球菌区分，有着与传统鉴定方法96％的一致。
根据本发明，MRS能识别出能鉴别和区分微生物的代谢物。当联合于LDA，MRS能鉴定属于不同属的致病细菌的种(65)。根据本发明，MRS和能够鉴定致病微生物的LDA是分类学上紧密相关的，如Bourne等所描述的(63)。例如，根据本发明能鉴定出五种致病念珠菌属和两个致病酵母属新型隐球菌的变种(gattii变种和新型变种)。
根据本发明，提供了一种通过取得统计学分类器将未知微生物菌种分类进已知种的方法，包括：(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚区；和(c)选择每个微生物菌种的波谱的第一部分来交叉确认波谱，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱，该系数和分类器波谱能被用于确定未知微生物的菌种。
根据发明的另一方面，提供了一种确定未知微生物的菌种的方法，包括获得未知微生物菌种的磁共振波谱，以及获得的波谱与菌种分类器进行比较，该分类器已经通过以下步骤而获得：(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚区；和(c)选择每个微生物菌种的波谱的第一部分来交叉确认波谱，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个微生物菌种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱。并选择与未知微生物菌种的波谱最接近的波谱的微生物作为未知微生物菌种。
根据本发明，提供了一种通过取得统计学分类器将未知微生物菌种分类进已知种的方法，包括：(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚区；和(c)选择每个微生物菌种的波谱的第一部分来交叉确认波谱，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱，该系数和分类器波谱能被用于确定未知微生物的菌种。
附图说明
图1A显示了粪肠球菌、米氏链球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌的代表性的1HMR波谱。参照表3，大多数代谢物的一致造成波谱中每个重合区域。
图1B显示了表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和无乳葡萄球菌的代表性的1HMR波谱。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌波谱中强的甜菜碱(betaine)峰和无乳葡萄球菌的GPC峰已经被缩短以显示较弱峰的细节。图2中可以看到甜菜碱和GPC峰的相对强度。参照表3，大多数代谢物的一致造成波谱中每个重合区域。
图2A和2B显示了每个物种群的测定的重合强度的范围，线条表示为平均±SD。
图3显示：体外细胞体系的1HMR波谱：A)新型隐球菌，B)白色念珠菌(Candida albicans)，C)烟曲菌(Aspergillus fumigatus)，D)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和E)C6细胞株。共振识别：AA，氨基酸；ac，乙酸；CH，非特异性碳水化合物共振；lip，脂类；NCH，源自肌酸，GABA，赖氨酸残基；N(CH3)3，源自含胆碱化合物(胆碱，PC，GPC)，甜菜碱和氨基乙磺酸；海藻糖，a，a-海藻糖(a，a-trehalose)。注意新型隐球菌波谱中的显著的海藻糖共振，这没有在其他的波谱中发现。
图4显示鼠脑组织样本的1D和2D COSY MR波谱：(a)对照脑组织，(b)新型隐球菌感染的脑组织，以及(c)胶质瘤组织。共振识别：A-G，甘油三酯共振(32)，AA，氨基酸残基；ac，乙酸；ala，丙氨酸；chol，胆碱；EA，氨基乙醇；eth，乙醇；GABA，γ-氨基丁酸；glu/gln，谷氨酸/谷氨酰胺；GPC，甘油磷酸胆碱；h-tau，亚牛磺酸；ile，异亮氨酸；lac，乳酸；leu，亮氨酸；lip，脂类；lys，赖氨酸；mI，内消旋肌醇；NAA，N-乙酰天冬氨酸；NCHn，来自肌酸，磷酸肌酸，GABA，赖氨酸；N(CH3)3，来自含胆碱化合物(胆碱，PC，gPC)，甜菜碱和氨基乙磺酸PC，磷酸胆碱；PE，磷酸乙醇胺；tau，氨基乙磺酸；thr，苏氨酸；tre，海藻糖；val，缬氨酸。列举的氨基酸指的是氨基酸残基，未必是各自游离的氨基酸；以及
图5是根据本发明的一个系统的组方图。
具体实施方式
根据本发明，提供了一种通过取得统计学分类器将未知微生物菌种分类进已知种的方法，包括：(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚区；和(c)选择每个微生物菌种的波谱的第一部分来交叉确认波谱，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱，该系数和波谱能被用于确定未知微生物的菌种。
本发明的方法优选地的进一步包括将步骤(c)重复多次的步骤，每次选择该种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得该种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。交叉确认波谱的步骤优选地包括随机地选择波谱的一半对波谱进行交叉确认。将步骤(c)重复多次的步骤优选地包括重复步骤(c)约1000次。
本发明的方法优选地包括独立地获得多个分类器波谱的步骤，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断。
微生物可以包括细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌等菌种。微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、平滑念珠菌、以及新型与gattii的隐球菌变种。这些微生物可以包括培养的细菌感染物和/或来自有着细菌感染的哺乳动物的标本。
每个不同种的磁共振波谱的数目优选为至少10个，且可以是至少30个。
根据发明的另一方面，提供了一种确定未知微生物的菌种的方法，包括获得未知微生物菌种的磁共振波谱，以及获得的波谱与菌种分类器进行比较，上述分类器已经通过以下步骤而获得：(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚区；和(c)选择每个微生物菌种的波谱的第一部分来交叉确认波谱，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱，并选择与未知微生物菌种的波谱最接近的波谱的微生物作为未知微生物菌种。
本发明的方法优选地进一步包括将步骤(c)重复多次的步骤，每次选择该种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得该种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。交叉确认波谱的步骤优选地包括随机地选择波谱的一半对波谱进行交叉确认。将步骤(c)重复多次的步骤优选的包括重复步骤(c)约1000次。方法优选的包括独立地获得多个分类器波谱的步骤，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断。
微生物可以包括细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌等菌种。
微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、平滑念珠菌以及新型与gattii的隐球菌变种。这些微生物可以包括培养的细菌感染物，和/或来自有着细菌感染的哺乳动物的标本。
每个不同种的磁共振波谱的数目优选为至少10个，且可以是至少30个。
根据本发明的另一方面，提供了一种将未知微生物菌种分类进已知种的统计学分类器，包括：(a)用于获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁共振波谱的波谱仪，所述微生物菌种是已知微生物菌种；(b)定位器，用于在获得的磁共振波谱中定位出多个有着最大差异的亚区；和(c)交叉确认器，用于通过以下步骤交叉确认波谱：选择每个微生物菌种的波谱的第一部分，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类器波谱，该系数和分类器波谱能被用于确定未知微生物的菌种。
本发明的交叉确认器优选地将步骤(c)重复多次，每次选择微生物菌种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得微生物菌种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。交叉确认器优选地通过随机地选择波谱的一半对波谱进行交叉确认。分类器优选地将步骤重复(c)约1000次。分类器优选地独立地获得多个分类器波谱，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断。
微生物可以包括细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌等菌种。
微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、平滑念珠菌，以及新型与gattii的隐球菌变种。这些微生物可以包括培养的细菌感染物和/或来自有着细菌感染的哺乳动物的标本。
每个不同种的磁共振波谱的数目优选为至少10个，且可以是至少30个。
以下将描述若干鉴定不同类型的微生物(具体为不同的细菌和真菌)的实施例。然而，本发明不限定于实施例中的细菌和真菌菌种，而是能被应用于任何微生物使之能通过这里阐述的方法被鉴定。
实施例1：细菌检测
1.细菌的储存和培养
分离物是来自悉尼临床病理和医学研究所的感染疾病和微生物学中心(CIDM)以及美国典型培养物保藏中心的保藏菌，或是来自CIDM实验室服务处的临床鉴定实验室最近的临床分离菌。储存菌于-70℃悬浮在10％甘油的营养肉汤中。将无菌的马血加到高压灭菌的血琼脂培养基(Oxoid(英国)或Amyl Media(澳大利亚))中制成马血琼脂(HBA)。将从储存菌中还原的菌传代接种在5％马血琼脂上，并在37℃，5％ CO2条件下培养18-24小时。新生长的菌和储存后传代接种在HBA上的菌被接种在双份的HBA培养皿上，并在37℃下培养18-24小时，然后在进行波谱检测前于室温下(20-30℃)储存3-9小时。
为了测定短期方法的变异性，检测了所有被检测的菌株的双份培养。为了测定长期培养和方法的变异性，多种菌株在8个月时间内被反复培养7次。分析包括的是3个鹑鸡肠球菌和3个铅黄肠球菌的波谱，它们是与铅黄肠球菌和粪肠球菌紧密相关的(10)(表1)。每个物种群中被测定的不同的菌株数目和菌株被培养以及检测的次数都可以从表1中得到。
2.细菌的传统鉴定
鉴定金黄色葡萄球菌依据于阳性的凝固酶(用兔或人血浆)和脱氧核糖核酸酶实验。利用API ID32 staph试验(葡萄球菌试验)(BioMerieux，法国)鉴定表皮葡萄球菌。链球菌和肠球菌的鉴定是通过传统方法——双乙奎丁敏感性(肺炎链球菌)、盐耐受性和胆汁七叶苷琼脂(bile-esculin)阳性(肠球菌属)、乳胶凝集(无乳链球菌)、以及A PI ID32 staph试验(BioMerieux，法国)。所有的试验都按厂家说明书实施。通常，菌株在储存之前仅在微生物实验室接收时被鉴定一次。一些还原于储存菌的菌株通过传统方法被重新鉴定。
3.1H MR波谱法
用塑料接种环将细菌菌落(湿重2-200mg)从HBA培养皿中轻轻地取出并通过涡旋震荡悬浮在0.3ml含有D2O的磷酸缓冲液(pH7.2，室温)(PBS/D2O)中。对于大部分培养，从培养皿中刮走了多于80％的细胞。对于生长旺盛的培养，小于10％的细胞被收集，通常都取自第一象限。悬浮液被马上转移到一与5mm敏感度相匹配的MR样本管(Sigma，美国)。利用装配有1H/13C探头的Bruker Avance360MHz MR波谱仪在37℃进行1H MRS检测。采集1D波谱，其采集参数如下：频率360.13MHz，脉冲角90°(6-7ms)，重复时间ls，8k数据点，256或512过渡，波谱宽度3600Hz，总的采集时间10或20分钟。范围锁定于D2O。选择性激发野梯度法(DPFGSE，(3))进行水的校正抑制。悬浮在PBS/D2O的细胞的波谱在37℃下至少稳定2小时。
4.信号分配
采集每个种中至少两种分离物的二维同核和异核相关波谱以分配1D MR共振信号到特定的化合物。按幅值模式(magnitude-mode)进行{1H，1H}梯度COSY试验。采集参数为：t2相扫描宽度为3600赫兹，t2时间域为2K，每32或48采集的256倍增量，重复时间为ls。t1相应用正弦钟窗函数，和t2相应用Gaussian-Lorentzian窗函数。利用零充盈将数据矩阵扩展到1K。采集的TOCSY波谱具有40ms与150ms的混合时相以及2K数据点和32采集的256倍增量(1)。利用梯度HSQC脉冲程序获得1H检测模式下的{1H，13C}单键变换相关波谱(one-bond shift correlation spectra)(24)。1H MR波谱宽度为3600赫兹，而13C MR波谱宽度为15000赫兹。通过GARP-1完成采集过程中13C MR的解偶合(18)。40-64次采集的每次的演变时间(t)被增量以获得400 FIDs以及包括2K数据点。重复时间为ls。t2相应用正弦钟函数，而t1相应用Gaussian-Lorentzian函数。t1相在傅立叶转换之前应用1K的零充盈。利用与HSQC试验中除了13C MR波谱宽度为20KHz外均相同的参数采集{1H，13C}梯度异源核多键相关波谱(Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectra，HMBC)(24)。单键和长程的相关试验通常分别被优化为140赫兹的1JC，H以及7赫兹的nJC，H。在2D试验之前和之后采集一维1H MR波谱以确认无代谢物的改变存在。
5.数据处理
利用Bruker XWINNMR波谱仪软件处理波谱。用零充盈将自由感应衰减数据集扩展到16K。在傅立叶转换之前应用指数窗函数以生成一1赫兹的线性扩展。通过将波谱中心设定为4.64兆比率来进行化学变换校正(在37℃的PBS/D2O中水共振相对于四甲基硅烷(tetramethylsilane)的额定位点)。手动将波谱校对到获得一直线和平直的基线。
以代表性波谱(图1)中出现的主峰为基础主观地选择十六个连续的固定的重合区。个体的积分被标准化到16个积分的总和，为4.0和0.75兆比率之间。
6.线性判别分析
积分表从微软的Excel输入到STATISTICA(StaSofi Pacific P/L，澳大利亚)以进行LDA。每个16个被选择的重合区的头15个区(见结果)在LDA中都形成一个独立的变量(标准方法，7组，容限0.01，相称于组大小的推算的分类概率)。第16个区被删除，因为对于标准化的数据集的判别分析有一个区是多余的。用STATISTICA计算分类函数和分类概率。
7.波谱分类和分离物鉴定
这里使用的是以下的定义。术语分类(classification)指的是将细菌培养物的个体化波谱分配到物种群中。鉴定(identification)指的是将分离物分配到物种群中(以两次重复菌株培养物的两个独立波谱的分类为基础)。正确分类(Correct classification)指的是将波谱分配到与传统分类相同的物种群的分类概率大于75％。错误分类(Misclassification)指的是将波谱分配到与传统分类不同的物种群的分类概率大于75％。不确定分类(Indeterminate classification)指的是将波谱分配到任何物种群的分类概率小于等于75％。正确鉴定(Correct identification)指的是两次重复培养物的波谱的分配与传统鉴定一致，且平均分类概率百分比大于75％。错误鉴定(Misidentification)指的是将两次重复培养物的波谱分配到了相同的但不同于传统鉴定的物种群，且平均分类概率百分比大于75％。不确定鉴定(Indeterminate identification)为将两次重复培养物的波谱分配到了不同的组，或者相同的组但平均分类概率小于75％。
以Somorjai等(19)，(2)的稳定引导程序(RBS)方法为基础建立了对于所有7个物种群的优化的分类器。开始于所有的312个波谱，半数的波谱从每个物种群中随机挑选，以及该训练组(training set)用于训练7组分类器(LDA)。得到的分类器然后被用于确认剩下的波谱(测试组)。这个过程被重复B次(可以更改)，以及保存每次有效的LDA系数。加权平均这些B组的LDA系数形成最终的系数(B＝1000)。对于第m组的权数为Wm＝KmCm 1/2，m＝1，....，B，其中0＜Cm＜1是crispness(定义为测试样本的该部分被分配到某组的概率百分比为75％)，以及0＜Km＜1是Cohen一致性概率校正测量(Cohen′s chance-corrected measure of agreement)(4)，Km＝1意味着测试组的理想分类。权数Wm中应用的B值不是那些引导程序训练组中获得的，而是较少的理想的测试组中获得的。有效的分类器用于鉴定所有的312个物种群。分类器的结果报告为分类概率百分比。
对于单独的肠球菌的分类，以3个肠球菌种的62个波谱的RBS为基础发展出了优化的分类器(B＝200，LDA参数见上)。用STATISTICA，微软EXCEL和微软VISUAL BASIC forAPPLICATIONS(VBA)书写RBS分类软件，而且运行在以奔腾为基础的个人电脑。
8.1H MR波谱结果
图1显示了7个物种群的每个物种群的代表性的波谱和选择用于分析的16个重合区(integration region)。显示了可获得的ATCC型菌株的波谱，另外显示了每个分离物相邻于所有波谱的组的图心(根据重合强度)的波谱。表3列举了对于每个重合区鉴定最有价值的和用于统计分析的代谢物。
尽管不可能去显示每个物种群中被测定的30-60个波谱中建立的波谱模式范围，但图2显示了每个物种群测定的标准化的重合强度(平均±SD)的范围。
9.波谱分类和分离物鉴定
表1显示了根据优化分类器对7个物种群的312个波谱的分类以及对104种分离物的鉴定的结果。表2显示了实施分类和鉴定结果的摘要。小于2％的波谱被错误地分类，而小于1％的分离物被错误地鉴定。13个波谱被不确定分类。被不确定鉴定的9种分离物中有5种在不同日期的之后或之前的培养中被正确鉴定(剩下的4种没有被保存在储存库中而不能被重新测试)。
表4显示了计划从粪肠球菌中分别分类出3种铅黄肠球菌和3种鹑鸡肠球菌的14个波谱的结果。虽然只检测了少量的分离物，但是这些结果提示从从粪肠球菌中分别正确地分类出铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌是可能的。
10.波谱的可重复性
对同时的、重复的培养物的以及1-8个月时间内反复还原自储存的分离物的独立的波谱分析，确信了该分类方法是稳定的，且不受各种因素如培养条件、微生物数目或分离物储存条件等微小变化造成的短期或长期程序上的变异性的影响。
11.讨论
a.1H MRS和多因素分析的独立变量的选择
如图1所见，很容易观察一些菌种的典型的波谱之间可见的差异。然而，菌种如酿脓链球菌和肺炎链球菌的波谱之间的差异肉眼观察是不明显的，类似物种群间的可靠区分只可能依赖于数据的多因素分析。这种分析中的初始步骤是从包含有数千个数据点的波谱中提取出一组易控制的独立变量，这些变量表现出任何组间显著的差异。虽然选择最佳的判别波谱区有着成熟的方法(21)，但是如图1描述的，简单的划分是将挑选的所有波谱按波谱上出现的高峰分为16个肉眼可见的连续的区域。这种方法的优点是如果能确定形成每个重合区中信号的代谢物，那么这些独立变量的组合可能指向一特征性的生化意义(也就是，一个独立的变量可能于特定的代谢物或代谢物的组合相关)。尽管表3确定了形成图1的波谱的一些主要代谢物，但是这里应用的细菌鉴定方法不依赖于对形成MR信号的代谢物的识别或定量。然而，重要的是认识到分类依据的测定细胞内的特征在实质上是与常规鉴定中检测的特征是不同的，与通过其他完整有机体指纹技术测定的特征也是不同的。
b.分类和鉴定策略
依据LDA的分类要求源自训练组数据的LDA的一组函数能被用于分类测试组的数据，测试组优选的是独立于训练组(交叉确认)。训练组的功能是以源自MR波谱的n个独立变量的形式说明n维数据空间范围对应于每个演绎定义的组。如果训练组中定义的组在数据空间被很好地分开，那么LDA将训练能把每个训练组的组分设定到它的演绎定义的组的分类函数。与特定的组，特定物种群的成员间的表型差别，以及也与相关于一物种群的一特定成员的重复培养和分类的程序(环境，生化和方法学)差异相关的数据空间的范围将增加。仅仅包括一特定物种群的少数随机选择的成员的训练组因此不大可能精确地代表被物种群的所有成员所占据的数据空间(表型范围)。如果训练组仅仅包含每个分离物的单次测定，那么它也可能是不能说明程序变异性。因此，预计当建立于某一物种群的训练亚群的分类函数用于分类非训练组成员的组的成员时，将发生一些错误分类。
分类器的稳定性和可靠性要求训练组中的每个物种群的波谱的数目是独立变量数目的5-10倍以上(19)。如此大的数据组是少见的，采集通常是困难的，尤其是如果生成的分类器被用于确认独立于训练组的测试组。稳定引导程序方法通过允许依据所有获得的数据建立交叉确认分类器来部分解决这个问题(19)。
对于某一特定临床菌株的双重或甚至三重培养的制备以及检测，如这里所使用的，具有的优点是能根据多个独立变量分析获得对分离物的一致的鉴定。这种分离物鉴定策略的特点在其他的微生物的完整有机体的指纹研究中没有使用过(5，8)，那些研究最多仅仅使用双重设置。在少数情况下，双重培养可以被错误地鉴定为不同的菌种。因此，依据对分离物单次亚培养分析的鉴定不能达到与依据独立的双重培养分类的鉴定相同的可信度。应用传统的方法报道的鉴定概率是依据于对分离物单次培养的分析，实践中通常的方法是对鉴定概率为小于75％的分离物进行重新鉴定。分析将被重复直到一单次测定得到的鉴定概率大于75％。通过本方法，对一分离物的所有实验的平均鉴定概率可以得到小于75％的测试结论。本方法总是测试双重培养物并要求正确鉴定基于大于75％的平均概率，其具有更严格的和可靠的鉴定约束。在应用(临床实验室)方面，双重测试作为一个常规方法，双重测定指向物种群的差异应该被认为是对系统误差的提示，以及这些分离物应当被补充方法重新测试或者检查。
通过对每个物种群中至少11个分离物的检测来确定物种群内的表型变异。使用的分类方法的总的成就说明物种群之间具有比方法或表型决定的种内变异的标准范围更大的显著的且并立的波谱差异。
c.分类和鉴定结果
对波谱非常少的错误分类不能归结于方法的任何特定的步骤。通过对所有分离物双重培养的波谱进行独立分析，以及在最初培养和波谱测定的8个月后对25个分离物的波谱重新培养和分类可以排除短或长时间的方法变异(使用不同批次的培养基，储存的分离物等)造成的可重复性的潜在问题。错误鉴定的单个实施例(酿脓链球菌Lab.No.2212985)可能是污染的结果。对相同菌株的先前和随后的测定都得到了正确的鉴定结果。这里应用的方法有一些特点指出了鉴定的稳定性。
首先，样本的生长条件不是严格控制的。例如，生长培养基的精确的组分在批次之间可能是不同的(使用的基础培养基来自马血的两个不同生产商以及多个批次)。接种物的大小在各培养皿之间可能是不同的。琼脂皿上细菌的生长必然是不均衡的，因为拥挤生长以及氧气和其他营养缓慢通过菌落和琼脂。对所有菌株三重培养的早期实验说明在单一批次的培养基上生长的细胞的波谱缺少变异。因为种间在HBA培养皿上过夜生长获得的数目上有着很大的差异(米氏链球菌的生长通常是很差的)，所以悬浮的细胞的湿重从2-200mg不等。当MR信号直接地对应于样本浓度，贫瘠的细菌生长只要求一扩展数目的过渡以获得一个适当的信号干扰比。如实践时，在波谱处理的相校正和重合步骤中，要求一些操作者主观地输入。方法中的这些差异将在数据中引进一些额外的变异。利用幅值波谱和自动化重合可以克服这些问题(23)。其他的完整有机体的指纹技术要求对生长培养基的严格控制以及对对照培养物的反复标准化测定(12)，(11)。
检测米氏链球菌组中有效数目的分离物以打算依据MRS将分离物指向到米氏链球菌组中三个菌种中的一种(咽峡链球菌、星座链球菌、中间链球菌)。然而，结果说明这个组相比较于测定的七个物种群的多样性是生理学同源的。相同的，比较于测定的链球菌和葡萄球菌种，所测定的铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌分离物在生理学上与粪肠球菌更相似。
d.生长培养基的选择
在选择临床诊断或相关实验室使用的最适合的培养基上，常用的生长底物和样本制作的容易性是最重要的。既然HBA是诊断性微生物实验室常用的培养基，以及很容易从HBA培养皿上收集到细菌细胞且不需要洗涤，因此该生长培养基被选定为最符合目的的培养基。
这里获得的波谱与发表的生长在胰胨豆胨羊血琼脂上的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的波谱有着很大的差别(5)。在后者的研究中，据说波谱的解释不受选择的生长培养基的影响，可能是因为肉眼识别以及用峰的位置而不是峰的强度来区分波谱模式。由于代谢物池大小的改变，造成生长于不同的培养基(HBA对照于脑心浸液培养基)对于相对峰强度的影响比对峰位置的影响更显著，而一些因素如细胞内pH值可能只轻微地影响相对峰强度。
e.临床应用
尽管只是依据一组局限的革兰氏阳性细菌，但结果说明对完整细胞的1H MR波谱的测定对于现有的、自动化的菌种鉴定方法是比较精确和准确的。上述方法包括常用的实验室系统如VITEK(22)。方法的无创特性使得能够在分析后保存活有机体以便以后进行对污染或方法错误的检测。
使用比这里应用的更成熟的模式识别方法(19)可以进一步地提高判别力并允许在物种群内进行独立分类，尽管可能使生化信息的解释更为复杂。因为该应用针对于鉴定而不是特征性的描述，这将是可接受的让步。样本制备机器简单，生化信息的结果，快速的自动化的鉴定，以及方法的稳定性对于临床和工业应用都是有诱惑力的。事实上，这对于那些相对生长缓慢或传统方法难以鉴定的细菌菌种是最有价值的。
在此所描述的方法是简单的，快速的，可靠的，和有信息量的。其是可靠的，因为鉴定的结果是依据于对独立培养和分析的双重实验的分析。其是简单和快速的，因为能很容易地进行微生物的培养且可在20分钟内进行分析。其是有信息量的，因为它对分离的微生物归属于某一特定的组的可能性给出了定量化的估计。
该方法对于要求快速鉴定感染病原以进行合适和安全治疗的医院实验室是可行的。对于工业用途，方法将改进方法的可靠性和有效性。
实施例2：利用MRS在鼠和细胞培养中辨别隐球菌球和胶质瘤
1.序言
利用MRS在培养物和实验鼠中特征性描述新型隐球菌的临床分离菌和胶质瘤细胞株。从体外培养的真菌(新型隐球菌的16个菌株，3种白色念珠菌，3种烟曲菌，3种酿酒酵母)和C6胶质瘤细胞株中采集1D和2D1H MR波谱。脑活检取自健康鼠和实验感染的鼠或胶质瘤(19个健康脑，19个隐球菌球和20个胶质瘤)，利用同源和异源核2D相关波谱(COSY，TOCS，1H，13C-HSQC和HMBC)对细胞悬液与组织样本进行明确的信号分配。结果说明新型隐球菌和脑部隐球菌球的MR波谱是受来自胞浆的双糖a，a-海藻糖的共振所控制，但其他真菌，健康脑，或胶质瘤的波谱却不是。该波谱模式非常不同于受脂类和增高的胆碱/肌酸比控制的胶质瘤的波谱以及健康脑的波谱。结果形成的结论是相对于其他MR可见代谢物的显著高浓度的a，a-海藻糖可以诊断新型隐球菌。脑部隐球菌球在人类是少见的，但它是隐球菌病的严重表现。这些结果应用于脑部隐球菌球的无创诊断将减少不必要的外科手术或活检的危险性与代价，以及促进患者的处理。
2.材料和方法
a.真菌和C6胶质瘤细胞株的体外培养
16种隐球菌菌株被用于体外培养和MRS的研究。这些菌株包括8种新型隐球菌血清A型临床菌株(来自肺，血，CSF和脑的菌株)，7种血清B型菌株(临床的(脑和CSF)，兽医的和环境的菌株)以及1种有性型新型隐球菌-新生线状黑粉菌的杆状变种(AmericanType Culture Collection 32609)的临床菌株。其他被体外培养和MRS研究的真菌包括酵母白色念珠菌(临床菌株)和酿酒酵母(环境菌株和模式培养物)和霉菌烟曲菌(临床菌株)每种的3种分离物。利用API 20C AUX系统(BioMerieux，March toile，法国)进行酵母的生化鉴定。隐球菌被生物分型(45)以及血清分型(Crypto Checkagglutination test，Iatron Labs)。真菌在沙氏葡萄糖琼脂(SDA，DifcoLabs，Detroit，MI，USA)上培养24-48小时，然后27，30和/或37℃下培养在脑心浸液培养基(烟曲菌)和酵母氮源培养基(Difco)中的一种，其中含有1％葡萄糖，用0.345％重量/体积比的MOPS(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO，USA)将pH值缓冲在7.0。C6，一种鼠胶质瘤细胞株，按文献描述(51)维持并在3-30代内使用。在使用前即刻，将对数生长期的真菌细胞，或C6胶质瘤细胞，洗涤和重悬在dulbecco′s磷酸缓冲液(PBS，Difco)中用于动物模型，或重悬在含有99.5％重水(D2O)的PBS中用于MRS。
新型隐球菌的菌株(Mc Bride株)生长的培养条件是不同的以测试应激对MR可见代谢物组合的影响。将这些菌株培养在缓冲的含有10mM葡萄糖的酵母氮源培养基(Difco Labs，Detroit，MI，USA)内。下面的参数是不同的：培养温度(27，35和42℃)，pH值(5和7)，葡萄糖浓度(1，10，50mM)，用甘露糖(10mM)或蔗糖(10mM)代替葡萄糖，以及在无糖培养基上的延长培养(0-100小时)。
b.动物研究
将新型隐球菌血清B型的三个菌株(WM276，WM430，Mc Bride)和C6胶质瘤细胞株用于动物实验。将雄性的Wistar-furth和雌性的Fischer 344鼠(150-250g，Animal Research Council，Perth，WA)在腹腔内注射氯胺酮(11.6mg/kg，Apex Laboratories，Sydney)和赛拉嗪(1.2mg/kg，Apex Laboratories，Sydney)之前用4％氟烷的100％氧气吸入麻醉，同时允许呼吸室内空气。
为了形成脑部病变，将动物的头部固定在体位框架(David KopfInstruments，Tajunga，CA，USA)，通过一直的，平头的26号针头按3-6μl/分钟的速度注射进5μl的新型隐球菌血清B型或C6胶质瘤细胞。预实验确认悬浮在5μl体积的5×104菌落形成单位的隐球菌，以及也是在5μl体积的1×106 C6细胞在术后的6-12天(隐球菌，n＝18只鼠)或12-30天(胶质瘤，n＝26只鼠)能形成至少3mm直径的病灶。微注射的理想位置为：硬膜下2mm，相对于耳棒零点位置(ear barzero)侧面3mm与前后2.4mm。利用这些定位，将用新型隐球菌血清B型菌株McBride注射的鼠(隐球菌球，n＝20，胶质瘤，n＝19，对照，n＝19)用于MR的研究。从盐水注射的鼠中得到对照组织。在合适的时候，鼠被处死，取出并在病灶位置横切脑。用福尔马林固定脑组织，并用石蜡包埋。得到7μm的切片，用苏木精和cosin或高碘酸希夫试剂染色用于光镜检查。将取自每个隐球菌球或胶质瘤以及对照动物的脑组织标本(直径为4mm)悬浮在PBS/D2O中，在液氮中快速冻存，在-70℃保存4个月用于MRS分析。
依照澳大利亚国立卫生和医学研究委员会指南进行动物实验，并得到了悉尼大学伦理委员会的伦理许可。
7.MR实验
用装配有5mm的{1H，13C}反向检测双重频道探头的BrukerAvance 360MHz波谱仪获得1H MR波谱。温度保持在37℃。利用选择性门控辐射(46)或利用使用脉冲场梯度的选择性刺激(47)抑制残余水信号。相应的，将化学转换参照于外部的0.00ppm的3-三甲基硅丙磺酸盐(3-(trimethylsilyl)propanesulfonate，TSP)或内在水(4.65ppm)。
采集到的1D的1H MR波谱具有3600赫兹的波宽，8k的时间区，128或256个采集相，弛缓延迟1秒。在傅立叶转换之前，相应地将宽为1或3赫兹的线应用于细胞培养和组织的样本。将所有来自弛缓1H MR波谱的共振比用于细胞类型的比较。在20赫兹下旋转Packed细胞悬浮液和样本以避免细胞沉积在MR管上。应用5秒的弛缓延迟以允许完全弛缓。
用二维MR波谱采集明确的信号分配。按幅值模式进行{1H，1H}COSY试验(48)。采集参数为：t2相扫描频率为3600赫兹，t2时间域为2K，每32或48采集的256倍增量，弛缓延迟为ls。t1相应用正弦钟窗函数，和t2相应用Gaussian-Lorentzian窗函数。利用零充盈将数据矩阵扩展到1K。按描述的确定交叉峰值量(49)。
采集具有40ms与150ms的混合时相以及2K数据点和每增量48个扫描的TOCSY波谱以确认分配(1)。
利用梯度HSQC脉冲程序获得某些样本的1H检测模式的{1H，13C}单键变换相关波谱(50)以确认分配。1H MR波谱宽度为3600赫兹，而13C MR波谱宽度为15000赫兹。通过GARP-1完成采集过程中13CMR的解偶合(8)。80次采集的每次的演变时间(t)被增量以获得256FIDs以及包括2K数据点。弛缓延迟为ls。t2相应用正弦钟函数，而t1相应用Gaussian-Lorentzian函数。t1相在傅立叶转换之前应用1K的零充盈。
采集所有真菌菌株，C6胶质瘤细胞株以及大鼠脑标本(20个隐球菌球，19个胶质瘤和19个对照)的1H MR波谱与2D {1H，1H}COSY。用TOCSY和HSQC确认四个真菌种的每一种，C6胶质瘤细胞株以及不同的脑活检样本种的至少一个菌株或标本。
8.结果
a.细胞培养研究
图3比较了从体外培养的真菌以及C6胶质瘤细胞株获得的典型的一维(1D)和二维(2D)MR波谱。表5概述了2D波谱的主要的交叉峰。或通过与公布的数据(32，40，44，51，52)的比较或通过与COSY，TOCSY以及HSQC波谱的原始分析来分配共振。列于表5和显示于图3的共振表现于来自相应真菌的所有菌株以及C6胶质瘤细胞株的波谱。表6显示了各菌株之间的共振强度的不同。
b.体外培养的新型隐球菌
新型隐球菌的一维和二维COSY MR波谱受来自脂类和a，a-海藻糖信号的共振所支配。脂类波谱模式的特点是在0.9ppm，1.30ppm，1.60ppm，2.00ppm，2.30ppm和5.38ppm(51)的化学转换。利用HSQC波谱仪的3.46ppm，3.66ppm，3.77-3.85ppm与5.19ppm的共振分配给细胞悬浮液种的a，a-海藻糖。相应的分配为：h1-C1(5.19-93.50ppm)，H2-C2(3.66-71.50ppm)，H3-C3(3.86-73.0ppm)，H4-C4(3.46-70.00ppm)，H5-C5(3.83-72.50ppm)和H6-C6(3.78和3.88/61.00ppm)。来自氨基酸残基[赖氨酸(lys)，丙氨酸(ala)，苏氨酸(thr)，谷氨酸/谷氨酰胺(glu/gln)]与乙醇的较小强度的交叉峰值在某些菌株中是明显的(概述在表5和6)。占优势的MR可见的细胞外代谢物是乙酸(1.92ppm)和乙醇(1.16和3.63ppm)。
c.应激对隐球菌细胞的影响
既然已经报道海藻糖能保护真菌抵抗不利条件(热、干燥、渗透以及氧化应激等)(54-57)。考虑到MR可见的海藻糖能根据环境条件而改变的可能。测定了按材料和方法中指定的温度、pH值、葡萄糖浓度、替代葡萄糖的其他糖和孵育时间的影响。四个与标准条件相关的因素中的一个就能改变相应的共振比(数据没有显示)。脂类和海藻糖信号在1D和COSY波谱中仍是明显的，与培养条件无关。
d.体外培养的其他真菌的MRS
研究了其他两个临床重要的、致病的真菌，白色念珠菌和烟曲霉，以及酿酒酵母的MRS，找到了它们与新型隐球菌的差异。白色念珠菌(图3b)和酿酒酵母(图3d)的1D和2D COSY波谱显示出显著的脂类，而烟曲霉(图3c)的波谱的特点为氨基酸残基和糖的共振。这些真菌的糖的共振比新型隐球菌的糖的共振有着更弱的强度，以及不能被分配到特异的单糖残基中。如果暴露于高温(37-43℃)，仅在酿酒酵母的三个菌株的两个的COSY波谱中能鉴定到非常少数目的MR可见的a，a-海藻糖(比新型隐球菌中的低20倍)，白色念珠菌中没有检测到。在两个酵母菌种中鉴定到乙醇。在白色念珠菌与烟曲霉的培养上清的波谱中可见乙酸(数据没有显示)。
e.C6胶质瘤细胞株
体外培养的悬浮C6胶质瘤细胞的波谱中占优势的是来自氨基酸的共振。C6细胞的2D波谱显示出没有糖的交叉峰。出现了来自胆碱(chol)，磷酸胆碱(PC)和甘油磷酸胆碱(GPC)以及相当大量的氨基乙磺酸(tau)和氨基酸残基亮氨酸(leu)和glu/gln的强交叉峰，象已经报道的肿瘤细胞株一样(51)。相应地代表着含胆碱和肌酸的化合物的3.25到3.05ppm的共振比比真菌波谱中的更高(表6)。
f.动物研究
大鼠脑活检样本的组织病理学显示隐球菌球的生物物质主要由隐球菌构成，象人感染所见的一样，以及验证了大鼠模型中生长的肿瘤病理(数据没有显示)。图4显示了对照大鼠、脑隐球菌球大鼠和胶质瘤大鼠的代表性的1D 1H MR和2D COSY波谱。表6概述了共振比。
对照脑组织的波谱中占优势的是在2.00ppm的N-乙酰天冬氨酸(NAA)。更低强度的特征性信号包括合成峰在2.0-2.2ppm(谷氨酰胺/谷氨酸)，在3.0ppm(肌酸、磷酸肌酸、(y-氨基)丁酸(GABA)和lys残基)；在3.2ppm[胆碱的N(CH3)3基团、PC和GPC等]以及在3.6到3.9ppm(Ha氨基酸残基和内消旋肌醇)，氨基酸GABA、chol、PC、以及GPC信号也出现在COSY波谱。在1.3ppm处找到了不同强度的乳酸信号，是切除和冻存间发生无氧代谢的产物。
隐球菌球给出了有着如上述的隐球菌海藻糖和脂类的典型模式的1D与COSY MR波谱。5.38ppm的脂类共振到5.19ppm的海藻糖共振的强度波动于较宽的范围(表6)。此外，比较于对照脑组织，提高了3.2∶3.0ppm共振比。NAA信号戏剧性地减少以及在一些标本中不能检测到。在正常脑组织中没有观察到起于在一些但不是全部波谱中的乙酸(1D波谱)和乙醇(2D COSY)的其他共振。起于GPC的显著的交叉峰也比对照和胶质瘤波谱有着更高的强度。当比较于对照脑组织，COSY波谱的内消旋肌醇和GABA交叉峰强度相对于氨基酸交叉峰是减少了。
肿瘤活检波谱中占优势的是脂类信号和增高的3.20∶3.00ppm的共振比，这与文献中的许多报道一致(32，58，59)。对于大多数标本，脂类信号的相对增加和3.2∶3.0ppm比的增高要比隐球菌球中发现的增高更大(表6)。脂类的共振比是多种多样的。在许多肿瘤标本中，NAA仍是检测不到的，提示缺乏神经元活性。相比于其他氨基酸残基的交叉峰(例如赖氨酸、亮氨酸等)增加的不同于脂类的交叉峰是氨基乙磺酸(3.28-3.50ppm)、胆碱(3.50-4.07ppm)、PC(3.61-4.19ppm)和磷酸氨基乙醇(3.22-3.98ppm)的交叉峰。
9.讨论
通过MRS将新型隐球菌与其他酵母、丝状真菌烟曲霉和C6胶质瘤细胞明确区分，归结于大量的非还原性双糖，海藻糖。这些差异存在于来自体外培养细胞以及组织学明确诊断的大鼠皮质感染组织的波谱中。MRS因此提供了一种将活检标本的隐球菌球与健康脑及脑肿瘤组织区别开的方法。
被感染组织中的新型隐球菌被一荚膜所包裹，它典型的是真菌细胞体积的许多倍。这个荚膜主要由具有疏松针织样纤维结构的glucuroxylomannans(GXM)构成，来自体外培养的样本，或来自组织活检的细胞相关的GXM都不是MR可见的，提示天然的荚膜多糖在MRS下的易变性尚不足以被发现。
相反的，鉴定出了非常大量的细胞浆化合物，海藻糖。海藻糖存在于酵母和其他真菌，因此本质上它不是新型隐球菌的独特的特性。它是对热状态(57)、渗透应激(61)、脱水(56)、干燥以及其他状态(综述见于(54)和(55))的重要的保护剂。然而培养在25℃的新型隐球菌的海藻糖水平超过酿酒酵母在热应激状态(37℃)下的20倍。改变培养条件不减少新型隐球菌的海藻糖信号的强度。
相对于新型隐球菌波谱中其他MR可见化合物的大量的海藻糖确定了海藻糖能作为一种用于鉴别新型隐球菌与其他真菌的标记物。隐球菌中如此高水平的海藻糖可能是对环境应激，尤其是温度，脱水和饥饿的进化反应。适应于在生理温度下的生存和生长，新型隐球菌的一种公认的毒性决定簇(62)与细胞内高浓度的海藻糖是一致的。
利用1H MRS在来自细菌性脑脓肿患者的脓标本中鉴定了细菌的代谢物，但不是a，a-海藻糖(5，34，35，39)。乙醇，一种酵母中葡萄糖发酵的产物，被报道出现在隐球菌脑膜炎患者的CSF中(63)。本研究和Bubb等发现的大量细胞外代谢物(乙酸，乙醇)都不适合于体外或体内确诊隐球菌，因为其他致病性的微生物也生产这些代谢物(5)。然而，出现于许多隐球菌球，但不是健康或肿瘤组织的显著的乙酸信号是感染的一种有用的诊断提示物。细菌产生的乙酸已经被MRS在细菌脓肿中鉴定(34，35，39)以及在本研究的新型隐球菌和隐球菌球中鉴定。
上面讨论的结果提示MRS能正确地区分出大鼠的健康脑、试验性隐球菌球以及胶质瘤。高水平的来自隐球菌球的MR可见的a，a-海藻糖提供了脑隐球菌球病理诊断的方法基础。当这个方法被应用于人脑隐球菌球的体内诊断时，脑隐球菌球将不再会被传统的影象学方法误诊为恶性肿瘤。早期和正确的诊断将减少诊断延误所引起的高发病率和死亡率(27)。将体内MRS用作为脑部感染性病灶的无创诊断的方法将减少非必要的外科手术或活检的危险与代价，以及促进处理病人的决心。
实施例3：致病性真菌的鉴定
1.微生物
将致病性酵母白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母的205种培养物在30℃沙氏葡萄糖琼脂上培养48小时。将致病性酵母新型隐球菌变种新型和变种gattii的69和70种分离物分别地在37℃沙氏葡萄糖琼脂上培养48小时。利用API 20C AUX系统(BioMerieux，Marcy 1′Etoile，法国)生化鉴定酵母。将隐球菌进行生物分型和血清分型(Crypto Check agglutinationtest，Iatron Labs)。另外，将指纹PCR用于比较相应菌种的血清型。在MR试验之前，从培养皿上刮取菌落并马上悬浮在PBS/D2O中。
2.MR波谱检测
用装配有5mm的{1H，13C}反向检测探头的Bruker Avance 360MHz MR波谱仪采集MR波谱。利用COSY、TOCSY(tm＝40，150ms)、1H，13C HSQC(优化为1J＝130Hz)以及1H，13C HMBC(优化为nJ＝7Hz)进行信号分配。
3.统计学分类策略(SCS)(9)
将5种念珠菌菌种分为相应的包括2或3种的菌株的2组。用Pair-wise分类法进行组间区别，以及后来进行每组内菌种间的区别。对两个新型隐球菌变种实行Pair-wise分类法。将幅值MR波谱标准化到总积分，并用基于遗传算法的优化区域选择器(geneticalgorithm-based Optimal Region Selector)(66)分析以确认出三个最大差异的亚区，其使用排序为第一的波谱产生物(rank-ordered first derivatives of the spectra)(9)。利用这三个分区发展出了以线性判别分析为基础的分类器。用引导程序为基础(67)的交叉确认(1000次重复)(9)测定了分类器的稳定性。如果分类可能性大于0.75，那么分类分配则被称为crisp。
4.结果
所有酵母(念珠菌属和隐球菌变种)的MR波谱中占优势的是脂类、糖(海藻糖、葡萄糖)、多元醇(甘油、甘露醇、山梨糖醇与其他)、乙醇和氨基酸残基的信号。
a.念珠菌属：对念珠菌属1D MR波谱的肉眼分析将差别分为两组：(A)克鲁斯假丝酵母和光滑假丝酵母；(B)白色念珠菌、近平滑假丝酵母与热带假丝酵母。这些差别主要是因为组A中具有更高的糖和乙醇成分。这些分组与以部分肌动蛋白基因序列64为基础的系统生命树是一致的。组A和B之间，以及每组的菌种间的Pair-wise分类造成总的准确率达到99％。
b.隐球菌变种：肉眼观察不能区别出新型隐球菌变种的1D和2DMR波谱。但是，利用Pair-wise统计学分类策略对1D MR波谱的SCS区别新型和gattii变种有着98.6％的正确率。
5.讨论
将SCS分析的MRS数据比较目前使用的生化鉴定试验和分子生物学方法(指纹PCR)。对MR波谱应用统计学分类策略能鉴别真菌的不同菌种以及变种。在这些特殊的系统中对真菌的分类学等级以下的高准确程度的鉴定是可能的。SCS算法能在少于10分钟内分析采集和加工好的MR数据，这样的快速性使得这对微生物实验室的常规检测是一个很吸引人的选择。因此，根据本发明，MR数据的SCS分析能比其他常规方法更快地鉴定出真菌的菌种与变种，且具有高水平的准确率。
图5显示了装配有计算机的波谱仪10，它可以是Bruker Avance360MHz的磁共振波谱仪。统计学分类策略(SCS)计算机12储存了SCS与其他这里描述的程序。临床数据库包括来自采集数据和已知微生物鉴定的信息，以及类似的被计算机12用于发展分类器16的信息。
尽管描述的实施例是关于体外分析，但是本发明能被用于体内分析，其中需要在波谱仪中安装更强的磁体。
尽管本发明的至少一个实施方案已经被显示和描述，但是本领域人员可以变更和调整。本发明不局限于优选的实施方案，其范围仅由附加的权利要求书而确定。
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表1.优化的分类器的分类和鉴定结果
    重复培养1    2    3    4    5    6
    物种群     Lab.No.     分类概率(a)     错误组(b)   鉴定结果(c)
  粪肠球菌        ATCC 29212  100，100  100，100  100，100  100，100  100，100  100，99      c18分离物        083-1246    96， 98                                                        c60培养物        175-1753    100，100                                                       c184-0712    100，100  100，100                                             c184-0721    100，100  62， 97   100，100                                   c200-1831    100，98   77， 87                                              c200-2616    100，100  99， 100                                             c206-0685    100，100  98， 94                                              c270-2132    100，100                                                       c273-2358    100，100                                                       c282-0250    100，100                                                       c282-0407    100，100                                                       c(鹑鸡肠球菌)    182-2747    98， 96   98， 100                                             c(鹑鸡肠球菌)    4/14/1956   100，100                                                       c(鹑鸡肠球菌)    4/14/1953   100，100                                                       c(铅黄肠球菌)    4/14/1958   87， 76                                                        c(铅黄肠球菌)    4/14/1952   100，100                                                       c(铅黄肠球菌)    207-2246    100，100                                                       c
  金黄色葡萄球菌  ATCC 25923  100，100  100，100  100，100  100，100  100，100  100，100     c18分离物        088-1690    100，100                                                       c56培养物        040-2754    100，100                                                       c099-1094    89， 91                                                        c124-2873    100，100  94， 100                                             c127-2131    100，100  58， 82                             表皮葡萄球菌    不确定127-2297    100，100  100，100                                             c242-2881    100，100                                                       c261-1095    100，100                                                       c271-0835    99， 100                                                       c281-2429    100，100                                                       c29213       100，100                                                       c319-2410    100，100                                                       c320-2161    100，100                                                       c320-2356    72， 100  100，100  100，100                                   c323-0934    100，100                                                       c323-1573    100，100                                                       c338-1348    100，100                                                       c
表皮葡萄球菌        ATCC 12228      100，100     100，100    100，98    100，100    50，84          不确定
14分离物             003-1283       100，100     75，100                                            c
40培养物             141-1667       100，100                                                        c
                     162-2710       100，100                                                        c
                     170-1085       100，99                                                         c
                     174-2177       100，89                                                         c
                     177-1320       61，99                                        金黄色葡萄球菌    不确定
                     270-0170       100，100                                                        c
                     281-0122       100，100                                                        c
                     289-1072       95，99                                                          c
                     319-1923       100，100                                                        c
                     323-1622       100，100                                                        c
                     326-2592       100，100                                                        c
                     327-2569       100，100                                                        c
无乳链球菌           048-1676       100，100                                                        c
15分离物             159-2821       100，100                                                        c
36培养物             165-1046       98，97                                            米氏链球菌    不确定
                     176-0797       100，100     100，100    100，100                               c
                     183-2646       100，100                                                        c
                     208-2835       100，100                                                        c
                     242-1786       100，100                                                        c
                     260-1829       100，100                                                        c
                     269-0712       100，100                                                        c
                     269-1137       100，100                                                        c
                     269-1160       100，100                                                        c
                     270-1106       100，100                                                        c
                     285-2806       100，100                                                        c
                     290-1094       100，100                                                        c
                     201-1523       100，100                                                        c
米氏链球菌           073-0596       100，100                                                        c
11分离物             097-1166       100，100                                                        c
30培养物             141-0714       100，100     99，100                                            c
                     141-1834       99，100                                                         c
                     150-1172       100，100                                                        c
                     154-0507       98，89                                                          c
                     185-1175       100，100     100，99                                            c
                     291-0591       98，  96                                                        c
                     291-1767       42，84       100，99                              肺炎链球菌    不确定
                     349-2486       42，47       92，84                   肺炎链球菌，酿脓链球菌    不确定
                     408-0803       100，100                                                         c
肺炎链球菌    ATCC 6305    99，100    100，100    97，100    100，99    100，100    100，99    100，100    酿脓链球菌    不确定
15分离物      221-2745     78，74                                                                                        c
42培养物      221-2755     100，100                                                                                      c
              230-2817     100，99                                                                                       c
              234-1207     91，100                                                                                       c
              235-2193     94，100                                                                                       c
              241-1187     100，92                                                                                       c
              259-1456     100，100                                                                                      c
              272-0604     100，96                                                                                       c
              278-1723     64，73                                                                    酿脓链球菌(两者)    不确定
              278-1727     97，100                                                                                       c
              324-1010     100，100                                                                                      c
              404-0191     100，98                                                                                       c
              467143       100，100                                                                                      c
              480837       72，90                                                                                        c
酿脓链球菌    ATCC 19615   96，99     99，100     100，100   100，100   100，100   100，100                              c
13分离物      162-1915     99，59                                                                          肺炎链球菌    不确定
48培养物      213-0136     100，70    100，100                                                                           c
              221-1798     99，100    99，99                                                                             c
              221-2985     99，95     95，95      96，95                                               粪肠球菌(两者)    不确定
              223-2690     99，100    100，100                                                                           c
              235-3096     94，87                                                                                        c
              236-1570     98，100                                                                                       c
              260-2388     88，100  93，96                                                                               c
              312-2457     99，99                                                                                        c
              3/12/2006    98，99                                                                                        c
              326-0413     95，100                                                                                       c
              3-61-70      89，90                                                                                        c
a.数值为双份培养物中每一种的波谱的分类概率(％)。分类概率小于75％以粗体字显示。阴影内显示的为双份培养物之一或两者的波谱是错误分类的。
b.错误组波谱被错误地分配至某一菌种。
c.分离物鉴定结果(c＝正确)。
表2.分类和鉴定结果小结
    分类     数值     占总体的％
正确     294     94.2
不确定     13     4.2
错误分类     5     1.6
合计：     312     100.0
    鉴定     数值     占总体的％
正确     146     93.6
不确定     9     5.8
错误分类     1     0.6
合计：     156     100.0
表3.重合区域和作用最强的代谢物
    区域     范围     该区域产生共振的代谢物
    (ppm)
    1.     4.00-3.81  AA，甜菜碱，GPC，GPE，EA
    2.     3.81-3.70  AA，甘油，G3P
    3.     3.70-3.50  AA，GPC，甘氨酸，胆碱，肌醇
    4.     3.50-3.34 牛磺酸，GPE，色氨酸
    5.     3.34-3.10 组氨酸，酪氨酸，牛磺酸，苯丙氨酸，甜菜碱，GPC，胆碱，肌醇，PA，EA
    6.     3.10-2.88 赖氨酸，组氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，PA
    7.     2.88-2.61 天冬氨酸，天冬酰胺，甲硫氨酸
    8.     2.61-2.42 琥珀酸
    9.     2.42-2.22 缬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，缬氨酸，琥珀酸
    10.     2.22-1.95 异亮氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸，PA，N-乙酰基化合物
    11.     1.95-1.80 乙酸，赖氨酸，异亮氨酸
    12.     1.80-1.58 亮氨酸，赖氨酸
    13.     1.58-1.40 赖氨酸，丙氨酸
    14.     1.40-1.23 乳酸，异亮氨酸，苏氨酸
    15.     1.23-1.08 (未鉴定到代谢物)
    16.     1.08-0.75 缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸
缩写：
AA，氨基酸(非特异性)；PA，多胺。
GPC，甘油磷酸胆碱；GPE，甘油磷酸乙醇胺；EA，乙醇胺。
表4.肠球菌的波谱分类
    重复培养物1    2    3    4    5
    物种群     Lab.No.     分类概率(a)                    错误组(b)
粪肠球菌      ATCC 292 12    100，100    100，100    100，100    100，100   100，100   100，10010分离物      083-1246       100，100培养物        175-1753       100，100184-0721       100，100    100，100    100，100200-1831       100，100    100，100200-2616       100，100    100，100206-0685       100，100    100，100270-2132       100，100273-2358       100，100282-0250       100，100282-0407       100，100
鹑鸡肠球菌    182-2747       100，100    100，1003分离物       4-14-56        100，100                                             粪肠球菌(两者)8培养物，     4-14-53        100，100
铅黄肠球菌    4-14-58        100，1003分离物       4-14-52        100，1006培养物       207-2246       100，100
注释同表1所示。
表5：由交叉峰值鉴定的COSY波谱中的主要组分
                No.       A*    B*    C*   F*   Chol   PC    GPC    tre       tre       tre         ala     lys    tau     inos    glu/   gaba    NAA     eth
化学位移        样品/                                                    (H1/H2)   (H2/H3)   (H4/H3.5)                                   gln
(ppm)           分离物    0.9-   1.3-   2.02-  1.6-  3.5-   3.61  3.67-  5.19-     3.66-      3.47-      1.49-   1.72   3.28    3.25-    2.1-   1.9-    2.58-   1.16-
                          1.3    2.08   5.3    2.3   4.07   -4.2  4.33   3.66      3.86       3.8        3.79    -3.0   -3.5    3.64     2.47   2.31    4.4     3.63
培养物
新型隐球菌     16/16      3-4    3-4    2      3-4    -     -     -      3         4          4          1-2     1-3    -       -        1ψ      1ψ        -       1-2
白色念珠菌     5/3        4      4      3      4      -     -     -      -         -          -          1       2-3    1ψ        -               1-2     -       2-3
烟曲菌         3/3        2-3    2-3    1-2    2-3    -     -            -         -          -          1-2     4      1ψ        -        1-2    1ψ        -       1
酿酒酵母       6/3        3      3      2      2-3    -     -            -         1ψ              1ψ              3-4     3      -       -        2-4    2       -       1-2
C6胶质细胞     3/1        1-3    1-3    1-2    2-3    1-2   2     1ψ      -         -          -          2-4     2-4   3-4      -        3-4    -       -       -
动物研究                                                                 -
对照脑         19         1      -      -      -      2     1-2   -      -         -          -          3-4     2     3-4      3-4      2-3    1-2     2-3     -
神经胶质瘤     19         4      4      2-3    3-4    3-4   1     2-3    -         -          -          2       2     2        2        1-2    -       -       -
隐球菌         20         3      3      1      2      1     -     1-2    2         3-4        3-4        1-2     2     1        1ψ          3      -       -       -
将交叉峰值与相应的COSY-波谱中的最强交叉峰相比较。如果信号的值为60-100％，则将其分类为4，如为30-60％，分类为3，如为10-30％，分类为2，而如果值小于最强峰值的10％，则分类为1。*甘油三酯峰(32)。ψ所有样品均未检测到。其他缩写：ala，丙氨酸；chol，胆碱；eth，乙醇；gaba，γ-氨基丁酸；glu/gln.，谷氨酰胺/谷氨酸；GPC，甘油磷酸胆碱；lys，赖氨酸；inos，肌醇；NAA，N-乙酰天冬氨酸；PC，磷酸胆碱；tau.牛磺酸；tre，α，α-海藻糖。注意检测到的氨基酸残基不一定代表游离氨基酸。以上包括了来自于一些个别分离物的重复培养物的波谱。
    表6：选定的1H MR信号的峰值比
样品            *样品/     3.25 ppm∶3.05 ppm      5.18 ppm∶3.05 ppm        5.38 ppm∶3.05 ppm      2.00 ppm∶3.05 ppm    5318 ppm∶5.18 ppm
                分离物的      平均值±SD               平均值±SD              平均值±SD                 平均值±SD           平均值±SD
                数量          (最小-最大)              (最小-最大)            (最小-最大)                 (最小-最大)          (最小-最大)
培养物
新型隐球菌      24/16         2.1±0.6(1.4-3.0)        4.7±2.3(0.5-8.0)       1.5±0.6(0.6-2.3)            n.d                 0.4±0.3(0.2-2.0)
白色念珠菌      5/3           1.5±0.3(0.8-2.2)        0.1±0.1(n.d.-0.1)      0.9±0.3(0.4-1.9)            n.d                 15±7(10-20)
烟曲菌          3/3           1.7±0.4(1.1-2.1)        n.d                     0.4±0.4(n.d.-1.0)           n.d                 n.d
酿酒酵母        6/4           1.4±0.3(1.0-1.9)        0.1±0.1(n.d.-0.2)      0.3±0.2(0.1-0.8)            n.d                 7±2(5-10)
C6神经胶质瘤    3/1           3.6±1(2.0-8.0)          n.d                     0.5±0.2(n.d.-0.6)           n.d                 n.d
细胞系
动物研究
对照脑          19            1.2±0.3(0.8-1.7)        n.d                     n.d                         2.1±0.4(1.5-3.0)    n.d
隐球菌          20            1.5±0.3(1.0-1.9)        0.8±0.4(0.2-1.8)       0.4±0.2(0.1-0.7)           1.0±0.7(n.d.-2)     0.6±0.3(0.3-1.2)
神经胶质瘤      19            1.9±0.4(1.2-2.4)        n.d                     1.3±0.7(0.2-3.0)           0.9±0.7(n.d.-2)     n.d
比值表示为平均值±标准差(SD)。括号内为相应比值的最大和最小值(最小-最大)；n.d.-未检测到。一些信号为复合峰值。指定信号的主要成分为：2.00ppm-NAA和其他乙酰基；3.05ppm-肌酸，磷酸肌酸，lya残基，gaba和含NCHa-基团的化合物；3.25ppm-胆碱，PC，GPC，甜菜碱，tau，其他含N(CH3)3基团的化合物；5.18ppm-α，α-海藻糖的H-1，对于所有新型隐球菌细胞和动物模型样品或其他体外培养的非新型隐球菌的真菌的其他碳水化合物残基的异质子；5.38ppm-甘油三酯酰基链的烯(CH＝CH)的质子(缩写见表1的图例)。*对于有些分离物n＞1个样品。

Claims (54)

1.一种通过获得统计学分类器将未知微生物菌种分类进已知种的方法，其包括：
(a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁
   共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；
(b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚
   区；和
(c)如下交叉确认波谱：选择每个微生物菌种的波谱的第
   一部分，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出
   线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种
   的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余
   部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分
   析系数和分类器波谱，该系数和分类器波谱能被用于
   确定未知微生物的菌种。
2.权利要求1的方法，其进一步包括将步骤(c)重复多次的步骤，每次选择所述菌种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得所述菌种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。
3.权利要求1的方法，其中所述交叉确认波谱的步骤包括通过随机选择大约一半的波谱对波谱进行交叉确认。
4.权利要求2的方法，其中将步骤(c)重复多次的步骤包括重复步骤(c)约1000次。
5.权利要求1的方法，其进一步包括独立地获得多个分类器波谱，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述的微生物包括细菌。
7.权利要求6的方法，其中所述的细菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌种。
8.权利要求6的方法，其中所述的细菌包括粪肠球菌、铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌菌种。
9.权利要求6的方法，其中所述的细菌包括肺炎链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌菌种。
10.权利要求1的方法，其中所述的微生物包括真菌。
11.权利要求10的方法，其中所述的真菌包括致病性酵母。
12.权利要求11的方法，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌和平滑念珠菌。
13.权利要求11的方法，其中所述的致病性酵母包括隐球菌变种。
14.权利要求13的方法，其中所述的隐球菌变种包括新型隐球菌和Cryptococcus gattii。
15.权利要求1的方法，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是10个。
16.权利要求1的方法，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是30个。
17.权利要求1的方法，其中所述的微生物包括培养的细菌感染物。
18.权利要求1的方法，其中所述的微生物包括来自被细菌感染的哺乳动物的标本。
19.一种确定未知微生物的菌种的方法，其包括：
    获得未知微生物菌种的磁共振波谱，以及将获得的波谱与菌
种分类器进行比较，该分类器已经通过以下步骤而获得：
    (a)获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多个磁
       共振波谱，所述微生物菌种是已知微生物菌种；
    (b)在获得的磁共振波谱中找出多个有着最大差异的亚
       区；和
    (c)如下交叉确认波谱：选择每个微生物菌种的波谱的第
       一部分，从每个微生物菌种的波谱的第一部分发展出
       线性判别分析分类器，以及利用来自每个微生物菌种
       的波谱的第一部分的分类器确认每个种的波谱的剩余
       部分以获得每个已知种的微生物的优化的线性判别分
       析系数和分类器波谱；并选择与未知微生物菌种的波
       谱最接近的波谱的微生物作为未知微生物的菌种。
20.权利要求19的方法，其中所述获得分类器的步骤进一步包括将步骤(c)重复多次的步骤，每次选择微生物菌种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得微生物菌种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。
21.权利要求19的方法，其中所述交叉确认波谱的步骤包括通过随机选择大约一半的波谱对波谱进行交叉确认。
22.权利要求20的方法，其中所述将步骤(c)重复多次的步骤包括重复步骤(c)约1000次。
23.权利要求19的方法，其进一步包括独立地获得多个分类器波谱，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断的步骤。
24.权利要求19的方法，其中所述的微生物包括细菌。
25.权利要求24的方法，其中所述的细菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌种。
26.权利要求24的方法，其中所述的细菌包括粪肠球菌、铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌菌种。
27.权利要求6的方法，其中细菌包括肺炎链球菌、酿脓链球菌，无乳链球菌菌种。
28.权利要求1的方法，其中所述的微生物包括真菌。
29.权利要求28的方法，其中所述的真菌包括致病性酵母。
30.权利要求29的方法，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌和平滑念珠菌。
31.权利要求29的方法，其中所述的致病性酵母包括隐球菌变种。
32.权利要求31的方法，其中所述的隐球菌变种包括新型隐球菌和Cryptococcus gattii。
33.权利要求19的方法，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是10个。
34.权利要求19的方法，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是30个。
35.权利要求19的方法，其中所述的微生物包括培养的细菌感染物。
36.权利要求19的方法，其中所述的微生物包括来自被细菌感染的哺乳动物的标本。
37.一种将未知微生物菌种分类进已知种的统计学分类器，其包括：
    (a)用于获得多种不同微生物菌种中的每一种微生物的多
       个磁共振波谱的波谱仪，所述微生物菌种是已知微生
       物菌种；
    (b)用于在获得的磁共振波谱中定位出多个有着最大差异
       的亚区的定位器；和
    (c)用于通过以下步骤来交叉确认波谱的交叉确认器：选
        择每个微生物菌种的波谱的第一部分，从每个微生物
        菌种的波谱的第一部分发展出线性判别分析分类器，
        以及利用来自每个微生物菌种的波谱的第一部分的分
        类器确认每个微生物菌种的波谱的剩余部分以获得每
        个已知种的微生物的优化的线性判别分析系数和分类
        器波谱，该系数和分类器波谱能被用于确定未知微生
        物的菌种。
38.权利要求37的分类器，其中所述的交叉确认器多次重复步骤(c)的步骤，每次选择该种的波谱的不同部分作为波谱的第一部分，以获得该种的一组不同的优化的线性判别分析系数，并获得这些线性判别分析系数的加权平均数以获得最终的分类器波谱。
39.权利要求37的分类器，其中所述的交叉确认器通过随机选择大约一半的波谱对波谱进行交叉确认。
40.权利要求38的分类器，其中所述的分类器重复步骤(c)约1000次。
41.权利要求37的分类器，其中所述的分类器独立地获得多个分类器波谱，以及汇总这些独立的分类器的结果以获得一致的诊断。
42.权利要求37的分类器，其中所述的微生物包括细菌。
43.权利要求42的分类器，其中所述的细菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌种。
44.权利要求42的分类器，其中所述的细菌包括粪肠球菌、铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌菌种。
45.权利要求42的分类器，其中所述的细菌包括肺炎链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌菌种。
46.权利要求37的分类器，其中所述点微生物包括真菌。
47.权利要求46的分类器，其中所述的真菌包括致病性酵母。
48.权利要求47的分类器，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌和平滑念珠菌。
49.权利要求47的分类器，其中所述的致病性酵母包括隐球菌变种。
50.权利要求49的分类器，其中所述的隐球菌变种包括新型隐球菌和Cryptococcus gattii。
51.权利要求37的分类器，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是10个。
52.权利要求37的分类器，其中每种不同的菌种的所述多个磁共振波谱至少是30个。
53.权利要求1的分类器，其中所述的微生物包括培养的细菌感染物。
54.权利要求1的分类器，其中所述的微生物包括来自被细菌感染的哺乳动物的标本。
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