CN1914332A - 用于鉴定微生物的电化学分析 - Google Patents

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Abstract

提供用于微生物表型鉴定的方法。该方法是以评估不同化合物(效应物)对微生物呼吸周期活性的影响为基础的。测量是基于微生物将电子转运至加入该微生物样品的外部化学氧化剂(介体)的能力。该介体与呼吸途径的终端成分相互作用，并且其消耗的程度与微生物呼吸的能力有关。随后用电化学方法测量消耗的介体。在存在或缺少效应物时产生的电化学信号可用于产生该生物体独特的信号模式并且可用于进行鉴定。

Description

用于鉴定微生物的电化学分析
发明领域
本发明涉及用于鉴定微生物的分析。更特别地，本发明涉及为了快速鉴定和表征对临床、农业和环境测试重要的培养物，以多试验方式检测原核和真核微生物。
发明背景
许多种属的微生物对人或动物有害，因此，正确鉴定引发疾病的病原体具有重大意义。微生物疾病在全世界的许多发展中国家中是死亡的主要原因。越来越多的微生物病原体已经被鉴定为重要的食物-和水媒病原体。
传统的微生物鉴定法包括预富集步骤和选择性富集步骤，然后是形态学检查、生化筛选、生长表征鉴定、血清分型和血清学确认。该富集步骤由在选择培养基上的生长组成。形态学检查包括观察菌落特征和色素沉着、染色(例如，革兰氏染色、抗酸染色)后的显微镜检查、检查鞭毛的运动和排列、检查孢子、荚膜和包涵体的存在、以及测定该生物体的形态。生化筛选由检查富集的微生物培养物中组成酶或代谢途径的存在或缺少组成；一般使用一些生物化学试验(例如氧化酶、硝酸还原作用、氨基酸降解酶、碳水化合物的发酵和利用)，而其它的测试是受限制的(例如，用于葡萄球菌属(Staphylococcus)种的凝固酶试验)。生长特点决定了生物体是需氧的、厌氧的、兼性的还是微需氧的、生长所需要的特定温度和pH条件、营养需要和对抗生素的抗性。血清分型使用抗体来确定存在于生物体上的O抗原(细胞壁)、H抗原(鞭毛的)和K抗原(荚膜的)种类并且提供对种和株的鉴定。血清学确认由患者血清(包含抗体)与分离生物体的体外反应组成。
现代的微生物鉴定法被分类为基因型的或表型的方法。基因型方法包括全部形式的微生物DNA和RNA分析。这些方法检测存在于微生物中的遗传物质，如果其表达，将容许合成生化途径成分(例如用于新陈代谢、应激反应因子、抗生素抗性机制)。
基因型方法不提供在给定时间对存在于给定微生物培养物中的活化途径的评估。已经推荐了许多基因型的方法用于微生物鉴定和抗生素抗性试验，包括美国专利申请20020187490(Tiedje等)、20030049636(Bergeron等)、20030124545(Rothman等)、20030180733(Bergeron等)和20040023208(Haydock等)。
表型鉴定法评估在给定的微生物培养物中普遍表达的微生物基因组部分。这些方法包括以观察不同条件下的生长以及生化筛选代谢途径的存在为基础的传统方法。许多发明描述了用于检测生长和以多试验方式进行生化筛选的方法和装置，包括美国专利3,957,586(Babson等)、4,118,280(Charles等)、4,129,483(Bochner)、4,235,964(Bochner)、4,456,380(Kondo等)、4,603,108(Bascomb)、4,604,351(Amaral)、4,724,215(Farber)、4,856,073(Farber等)、5,089,395(Snyder等)、5,164,301(Thompson等)、5,223,402(Abbas等)、5,340,747(Eden)、5,843,699(Strenkoski等)、5,888,760(Godsey等)、6,372,485(Clark等)、6,387,651(Bochner等)、6,436,631(Bochner等)、6,555,322(James等)、和6,611,765(Boeufgras等)，以及美国专利申请20020064867(Clark等)、20030032171(Gemmell等)、20030162164(Bochner等)和20040009572(Felice等)和国际专利申请WO2004050675(Taintor)。对微生物的电化学测量在美国专利6,391,577(Mikkelsen等)和Ertl，P.等(2000)，Analytical Chemistry 72：4957-64中有描述。
另一种表型方法已经在美国专利4,343,782(Shapiro)中有描述，该方法在使培养物暴露于生物活性的化学制品或生化试剂后利用荧光染料测量细胞膜电位变化。通过热解质谱数据的模式识别用于微生物指纹分析的数据库方法已经在美国专利申请20020138210(Wilkes等)中有描述。另一个用于微生物指纹分析的数据库方法已经在美国专利申请20030097059(Sorrell等)中有描述，用于微生物磁共振数据模式的匹配。第三种数据库方法包括在用设计用于识别和结合微生物表面上官能团的特异化合物修饰的表面上捕获微生物；将结合给定生物体的模式与结合不同生物体的模式的数据库相比较，如美国专利6,780,602(Lloyd等)所述。
一般地，单个试验不提供对未知微生物的决定性鉴定。进一步地，现有的试验是费时的，并且经常是不可靠的。因此需要鉴定未知微生物的快速和有效的方法。
发明概述
本发明的目的是避免或减轻先前微生物分析的至少一个缺点。
在本发明的一个方面，提供一种鉴定微生物的方法，包括步骤：获得未知微生物的测试样品；在存在效应物时，向该测试样品加入介体或介体混合物；评估该微生物在预定时限中的呼吸率变化；以及将该微生物呼吸率的变化与暴露于该效应物的已知微生物的呼吸率变化比较，由此鉴定该测试样品中的未知微生物。
在本发明的另一个方面，提供一种区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的方法，包括步骤：获得微生物的测试样品；向该测试样品的一部分加入脂溶性氧化还原-介体；评估该微生物在预定时限中的呼吸率变化；以及将该部分测试样品的呼吸率与未暴露于该脂溶性氧化还原介体的另一部分测试样品的呼吸率比较。
令人惊讶地，已经发现在将测试样品与效应化合物混合后测量的呼吸率测量值可用于鉴定和区别微生物。用于评估细胞对外部刺激的反应的方法包括在存在效应物时向该微生物的样品加入适合的介体或介体混合物，并且通过电化学测量由微生物呼吸引起的介体消耗来评估该微生物随时间的呼吸率变化。将其与暴露于相同效应物的其他微生物样品(原种生物体)的呼吸率变化相比较。
附图简述
现在参照附图描述本发明的实施方案，这些附图只是作为例子，其中：
图1显示实施例1的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC13048e样品的消耗电荷对时间的曲线。两个铂电极之间的电势差(面积＝0.017cm2)设定为-100mV。显示的迹线是重复测量值，并且是在存在10mM(a)葡萄糖、(b)乳酸、(c)丙酮酸、(d)精氨酸时和在(e)硝酸钾中获得的。
图2显示来自为了鉴别10种微生物菌株利用22种不同效应化合物获得的呼吸活性数据的主成分分析的得分图。
图3显示来自为了鉴别10种微生物菌株利用16种不同效应化合物获得的呼吸活性数据的主成分分析的得分图。该得分图是利用在PC 2和PC 4中发现的差异而产生的。
图4显示来自为了鉴别10种微生物菌株利用9种不同效应化合物获得的呼吸活性数据的主成分分析的三维得分图。
发明详述
一般地，本发明提供用于区别和鉴定不同微生物，或用于区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，或利用已知身分的微生物确定样品中效应化合物的存在和效力的快速新方法。更具体地，本发明提供一种鉴定微生物的方法，包括步骤：获得未知微生物的测试样品；在存在效应物时，向该测试样品加入介体或介体混合物；评估该微生物在预定时限中的呼吸率变化；以及将该微生物呼吸率的变化与暴露于该效应物的已知微生物的呼吸率变化进行比较，由此鉴定该测试样品中的未知微生物。
本发明以测量微生物的呼吸率为基础。在自然条件下，微生物消耗分子氧(如果它们是需氧的)或另一种氧化剂(如果它们是厌氧的)。对于需氧生物，存在于该生物体膜中的蛋白质将氧转变为水。氧通过称为还原的过程而被转化，其中从细胞内部提供四个质子和四个电子，导致氧被转化为水。相似的过程发生在厌氧生物中，导致例如硝酸盐或硫酸盐的氧化剂的还原。其他氧化剂或介体可发生这样的还原过程，它们也可接受来自细胞的电子并将其传递至导电的电流测量电极，从而产生所测量的电流。用于本发明的电极和测量设备是商业上可得到的并且是很好表征的。
本发明提供以微生物将电子转运至加入该微生物样品的外部化学氧化剂(介体)的能力为基础来评估不同化合物对该微生物的效应的快速方法。该介体与呼吸途径的终端成分相互作用并且其消耗的程度与微生物呼吸的能力有关。然而，在此处描述的分析条件下，介体消耗的程度不同于该微生物消耗氧或另一种天然氧化剂的能力，因为向该分析混合物中加入了可代谢的化合物或其他影响呼吸活性的化合物。随后用电化学方法在由近似相等表面积的两个可极化铂电极组成的双电极电化学电池的工作电极处测量消耗的介体(双安培分析或电量分析)。还可利用双-或三-电极电池进行这种测量，其中一个电极是不可极化的对照电极；将足以引起氧化的电势施加到工作电极上(相对于对照电极)以再氧化被微生物还原的介体。由在存在不同的效应化合物时培养的微生物悬浮物得到的电化学信号(测量为时间的函数的电流或电荷)是显著不同的。这些信号的差异可用于产生区分和鉴定微生物的模式。
本发明的方法可进一步包括样品制备步骤，其中该细胞培养物或微生物的悬浮物与推荐的效应物溶液混合并且培养规定的时间，第二个步骤中加入介体或介体混合物，以及第三个步骤中利用标准的、可商业购买的电化学设备(电势恒定器)和双电极电化学电池以固定的外加电势来进行双安培分析测量。在本发明的实施方案中，前两个步骤可合并成一个步骤。缺少效应物时，介体被微生物从氧化形式转化为还原形式，其转化速率是生物体的特征并且与样品中生物体和介体的浓度有关。在测量步骤期间，还原的介体通过在两个电极之间施加电压差而在工作电极处被再转化为氧化形式，并且测量的电流的大小与样品中还原的介体浓度成比例。
在培养和测量步骤期间，在存在效应物时，介体还原的速率和所得到的测量信号对于各个效应化合物和生物体是显著不同的。根据这些效应物的化学性质和与靶生物体的相互作用，获得的呼吸活性与在缺少效应物时测试的相同生物体的对照样品相比可达到10-600％之间的值。
为了确定样品中效应化合物的存在或缺少，向具有适合介体或介体混合物的样品加入具有已知反应的微生物。通过电化学测量介体的消耗来评估微生物随时间的呼吸率的变化。将这个速率与未暴露于该测试样品的另一部分相同微生物的呼吸率相比。
介体或介体混合物可以是任何适合的氧化剂，包括例如下列中的一种或多种：铁氰化物(六氰铁酸盐(III)是其另一名称)；二氯苯酚-靛酚(DCIP)；二茂络铁和二茂络铁衍生物；亚甲基蓝；贾纳斯绿；三(二吡啶基)铁(III)；醌类，其包括苯醌、萘醌、甲萘醌、蒽醌和这些醌类的取代衍生物；以及吩嗪类，其包括吩嗪硫酸甲酯和吩嗪硫酸乙酯。
在本发明的另一个方面，提供一种区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的方法，包括步骤：获得微生物的测试样品；向该测试样品加入包含脂溶性氧化还原介体的介体混合物；评估该微生物在预定时限中的呼吸率变化；以及将该微生物的呼吸率与未暴露于该脂溶性氧化还原介体的相同微生物的另一样品的呼吸率比较。将该呼吸率与未暴露于该脂溶性介体化合物的另一样品的呼吸率变化相比较。该脂溶性氧化还原介体化合物DCIP的省略允许快速区别通常用于将细菌分类为革兰氏阳性和革兰氏阴性的细胞壁性质。
本发明在下列实施例中描述。
实施例1
存在效应化合物时的呼吸周期活性
在这个实施例中，该分析使用下列步骤：(1)该方法包括将200μL细菌培养物与1300μL缓冲液(其包含或不包含效应物和5μM DCIP)在固定的温度(35℃)下在双电极电化学电池中混合固定的时间(10min)；(2)随后在固定的温度(35C)下加入介体(500μL的0.2M铁氰化钾)保持固定的时间(10min)；以及(3)在固定的电压差(-100mV)下和固定的时间(120sec)内测量电流。加入铁氰化物溶液以使得铁氰化物的终浓度是50mM。
在这个结构中，该分析使用各自具有大约0.017cm2表面积的两个铂电极。所测量的电流与溶液中最小浓缩的氧化还原对种类的浓度成比例。在本系统中，存在很大过量的铁氰化物(氧化形式)，导致微生物由于其呼吸能力而产生亚铁氰化物(还原形式)。所测量的电流的大小表明该分析溶液中存在的还原介体的量。所测量的电流随着时间进行积分以产生总电荷对时间的曲线。施加电势后60至120秒之间，测量总电荷的变化。
大肠杆菌B(E.coli B)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC 13048e、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)ATCC 6380种在可商业购买的MacConkey琼脂平板上于35℃生长过夜。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、粪肠球菌(Eneterococcus faecalis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538P种在可商业购买的5％-羊血琼脂平板上于35℃生长过夜。将各个菌株的5至6个菌落转移到包含由4.4g/L K2HPO4、2.88g/LKH2PO4、0.48g/L硫酸镁七水合物、0.048g/L氯化钙；1.43g/L硫酸铵和1.62g/L氯化铵组成的5.00mL缓冲溶液(pH7.2)的小瓶中。将细菌悬浮液调节至5.0(5.0×108cfu/mL)的MacFarland标准或在625nm下测量为1.2的光密度，并且通过使该细菌悬浮液在冰浴中冷却至少15分钟来终止细胞生长。
图1中显示了由在缺少和存在10mM葡萄糖、乳酸、丙酮酸、精氨酸和硝酸钾时培养的产气肠杆菌ATCC 13048e获得的迹线。表1显示了利用5种不同的效应化合物由产气肠杆菌ATCC 13048e和金黄色葡萄球菌ATCC 6538P得到的这些测量值的结果。这些效应物表现了广谱的已知活性和作用机制。乳糖是MacConkey琼脂平板中的唯一碳源，因此在MacConkey琼脂平板上生长的培养物具有乳酸途径。丙酮酸是生物体三羧酸循环的代谢副产物，是分别生物合成氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和谷氨酸所需要的。此外，丙酮酸盐可用于转化成为葡萄糖(葡萄糖异生)。许多微生物种进行氨基酸发酵(精氨酸)。利用现有的基于生长的方法，上述所有底物已经被应用于鉴定和区分细菌种。重要的是注意在存在这些效应化合物时的呼吸周期活性测量值与由传统的基于生长的方法或生化筛选试验得到的结果不相同。呼吸周期活性测量值是该生物体在某组条件下呼吸能力的反映。
表1中显示的结果是由已知利用乳酸作为碳源的产气肠杆菌ATCC 13048e(革兰氏阴性)和金黄色葡萄球菌ATCC 6538P(革兰氏阳性)得到的。将获得的电流信号积分，对于各个菌株和效应化合物将标准化面积和与对照测量值(缓冲液)相比的相对呼吸周期活性作图。
表1：
由金黄色葡萄球菌ATCC 6538P和产气肠杆菌ATCC 13048e得到的呼吸分析结果。
  效应物   浓度mM   n   金黄色葡萄球菌ATCC 6538P   产气肠杆菌ATCC13048e
斜率μC/min 标准化的μC/min*mm2 相对活性 斜率μC/min 标准化的μC/min*mm2 相对活性
  缓冲液*葡萄糖乳酸A精氨酸丙酮酸盐硝酸盐   -1010101010   223232   9.117.924.89.114.86.9   5.310.614.65.38.74.1   100％198％275％100％164％76％   16.429.627.720.523.43.7   9.717.516.312.113.72.2   100％181％169％125％143％23％
*缓冲液中的呼吸周期活性设置为100％-相对活性
表2显示利用以3个不同浓度存在的两种可代谢的效应化合物，葡萄糖和甘露糖，由金黄色葡萄球菌ATCC 6538P和粪肠球菌得到的结果。该结果显示所测量的呼吸活性随葡萄糖或甘露糖的浓度而增加。很明显获得的呼吸率差异是以效应物浓度为基础，因此可用于进一步帮助鉴定和区别微生物。
表2：
由金黄色葡萄球菌ATCC 6538P和粪肠球菌得到的斜率数据
 底物(n)   浓度   金黄色葡萄球菌μC/min   SD   粪肠球菌μC/min   SD
 缓冲液(2)葡萄糖(2)葡萄糖(2)葡萄糖(2)缓冲液(2)甘露糖(2)甘露糖(2)甘露糖(2)   -1mM10mM50mM-1mM10mM50mM   7.89.313.920.110.716.614.015.1   ±0.1±2.1±1.6±1.8±1.5±0.1±1.2±2.1   1.218.718.913.50.817.819.614.5   ±0.2±0.1±0.1±0.4±0.1±0.7±0.7±2.6
实施例2
区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌
下列步骤用于各个试验：(1)在固定的温度(35℃)下将150μL等份含或不含5μM DCIP、包含1mM葡萄糖(glc)的缓冲液预热固定的时间(4min)；(2)随后在固定的温度(35℃)下向该样品加入50μL细菌悬浮液，保持固定的时间(10min)；(3)然后在固定温度(35℃)下加入介体(50μL 0.4M铁氰化钾)，保持固定的时间(10min)；以及(4)在两个铂电极之间的固定电压差(100mV)下，在固定温度(35℃)下和固定的时间(120sec)内测量电流。与该微生物反应之前样品中最终的铁氰化物浓度是40mM。
在这个结构中，该分析使用各自具有大约0.03cm2表面积的两个铂电极。所测量的电流依赖于溶液中最小浓缩的氧化还原对种类的浓度。在我们的系统中，存在很大过量的铁氰化物(氧化形式)，导致微生物由于其呼吸能力而产生亚铁氰化物(还原形式)。所测量的电流的大小表明该分析溶液中存在的还原介体的量。所测量的电流随着时间进行积分以产生总电荷对时间的曲线。施加电势后30至120秒之间，测量总电荷的变化。
大肠杆菌B、大肠杆菌新型(Neotype)、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM105、产气肠杆菌ATCC 13048e、绿脓假单胞菌和普通变形杆菌ATCC 6380种在可商业购买的MacConkey琼脂平板上于35℃生长过夜。粪肠球菌和金黄色葡萄球菌ATCC 6538P种在可商业购买的5％-羊血琼脂平板上于35℃生长过夜。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)于35℃在可商业购买的Trypton-Soy琼脂平板上生长过夜。将各个菌株的5至6个菌落转移至包含由4.4g/L K2HPO4，2.88g/LKH2PO4，5.00g/L氯化钠组成的3.00mL缓冲溶液(pH6.8)的小瓶中。
脂溶性氧化还原介体化合物DCIP的省略允许快速区别通常用于将细菌分类为革兰氏阳性和革兰氏阴性的细胞壁性质。革兰氏阴性细菌在其外细胞壁中包含膜孔蛋白(通道)而容许铁氰化物与呼吸途径的终端成分直接相互作用。革兰氏阳性细菌不具有膜孔蛋白，更不会与铁氰化物反应；只在存在脂溶性氧化还原介体例如DCIP时观察到完全的呼吸活性信号。表3显示了由于在缓冲的效应物溶液中缺乏脂溶性氧化还原介体DCIP，10分钟培养期后由革兰氏阳性菌株得到较低的呼吸周期活性。
表3：
以膜组成为基础的鉴别
  革兰氏   种   条件   N   呼吸活性μC/min   SD±   剩余的％活性
  阳性   粪肠球菌   1mM glc w/o DCIP   4   7.3   0.1   15％
  1mM glc+DCIP   4   48.2   0.5
  阳性   金黄色葡萄球菌   1mM glc w/o DCIP   4   13.1   0.8   39％
  1mM glc+DCIP   4   33.8   4.0
  阴性   变通变形杆菌   1mM glc w/o DCIP   4   16.2   0.2   101％
  1mM glc+DCIP   4   16.1   6.1
  阴性   产气肠杆菌   1mM glc w/o DCIP   4   40.1   1.7   129％
  1mM glc+DCIP   4   31.0   2.0
  阴性   大肠杆菌B   1mM glc w/o DCIP   4   29.0   1.1   96％
  1mM glc+DCIP   4   30.1   1.4
  阴性   绿脓假单胞菌   1mM glc w/o DCIP   4   9.2   0.2   103％
  1mM glc+DCIP   4   8.9   0.8
表3中的结果显示适当选择氧化还原介体和效应化合物容许快速区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，这进一步有助于对它们进行鉴定。在存在1mM甘露糖或1mM琥珀酸酯(代替1mM葡萄糖)时获得相似的结果，其中在缺少5μM DCIP时，呼吸信号分别降低到60％和80％以下。适当选择效应化合物是为了区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌而优化呼吸活性的差异所必需的。
实施例3
通过呼吸活性数据的主成分分析利用模式识别来区别10个微生物菌株
在这个实施例中，除对照测量之外各个微生物经受22种不同的效应化合物。下列步骤用于各个试验：(1)在固定的温度(35℃)下将150μL等份包含效应化合物和5μM DCIP的缓冲液预热固定的时间(4min)；(2)随后在固定的温度(35℃)下向该样品加入50μL细菌悬浮液，保持固定的时间(10min)；(3)然后在固定温度(35℃)下加入介体(50μL 0.4M铁氰化钾)，保持固定的时间(10min)；以及(4)在两个铂电极之间的固定电压差(100mV)下，在固定温度(35℃)下和固定的时间(120sec)内测量电流。与该微生物反应之前样品中最终的铁氰化物浓度是40mM。对于各个微生物，用22种不同的效应化合物进行重复测量。此外，以不包含效应化合物的对照试验进行重复测量。另一个测量用包含微生物且具有铁氰化物但无效应物或DCIP的对照溶液进行。
在这个结构中，该分析使用各自具有大约0.03cm2表面积的两个铂电极。所测量的电流依赖于溶液中最小浓缩的氧化还原对种类的浓度。在我们的系统中，存在很大过量的铁氰化物(氧化形式)，导致微生物由于其呼吸能力而产生亚铁氰化物(还原形式)。所测量的电流的大小表明该分析溶液中存在的还原介体的量。所测量的电流随着时间进行积分并且对电极面积进行标准化以产生总电荷对时间的曲线。施加电势后30至120秒之间，测量总电荷的变化。
大肠杆菌B、大肠杆菌新型、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌JM105、产气肠杆菌ATCC 13048e、绿脓假单胞菌和普通变形杆菌ATCC 6380种在可商业购买的MacConkey琼脂平板上于35℃生长过夜。粪肠球菌和金黄色葡萄球菌ATCC 6538P种在可商业购买的5％-羊血琼脂平板上于35℃生长过夜。酿酒酵母于35℃在可商业购买的Trypton-Soy琼脂平板上生长过夜。将各个菌株的5至6个菌落转移至包含由4.4g/L K2HPO4，2.88g/L KH2PO4，5.00g/L氯化钠组成的3.00mL缓冲溶液(pH6.8)的小瓶中。
在这个实施例中，对于22种效应化合物中的每一种，将包含重复测量的各个标准化的数据组与重复的内对照进行参比，以进行批次与批次之间的比较。将重复对照测量获得的每单位电极面积的电荷信号进行平均，并将其设置为100％呼吸周期活性。然后平均由各个效应化合物得到的信号并且与这些对照样品相比，结果显示为相对的％-呼吸活性。对于每个细胞培养物(10个菌株)，用于产生模式识别图的数据组由5个重复批次(每个批次包含对于22种效应化合物中的每一种的重复测量)组成。这用于产生50(列)×22(行)的矩阵。将该矩阵输入MATLAB(版本6.0)。利用MATLAB Chemometric Toolbox(版本2.3)进行析因分析，并且包括产生简化的特征向量以确定最佳数目的因素，检验所得到的随机性残差图，并且产生前四种主要成分的得分。
表4：
根据种的反应分类
  浓度   效应物   普通变形杆菌ATCC6380   粪肠球菌   产气肠杆菌ATCC13048e   大肠杆菌JM105   大肠杆菌HB101   大肠杆菌B   大肠杆菌新型   绿脓假单胞菌   金黄色葡萄球菌ATCC6538P   酿酒酵母
  mM   n＝20   n＝20   n＝26   n＝10   n＝18   n＝10   n＝26   n＝18   n＝20   n＝10
  没有效应物+/-SD   100％6％   100％18％   100％4％   100％7％   100％6％   100％9％   100％14％   100％6％   100％7％   100％5％
  3   琥珀酸酯+/-SD   520％70％   87％11％   187％+/-24％   287％+/-47％   172％28％   134％18％   127％27％   102％14％   167％46％   108％8％
  10 L-精氨酸+/-SD   149％34％   130％27％   129％+/-15％   163％19％   114％11％   137％11％   114％21％   155％19％   132％11％   139％12％
  20   D-阿拉伯糖+/-SD   150％26％   139％50％   106％13％   137％16％   107％+/-22％   118％15％   103％19％   113％20％   115％25％   143％21％
  20   D-木糖+/-SD   178％51％   128％26％   149％20％   134％22％   110％18％   102％20％   110％20％   113％17％   128％22％   116％20％
  10   β-甘油磷酸酯+/-SD   136％28％   120％32％   131％30％   121％37％   110％13％   105％24％   108％19％   114％21％   114％21％   105％16％
  30   D-山梨糖醇+/-SD   186％33％   179％33％   260％30％   168％12％   124％29％   136％31％   111％22％   104％13％   167％24％   113％19％
  10   丙酮酸+/-SD   344％101％   136％26％   209％38％   249％21％   169％28％   120％24％   126％30％   125％16％   313％69％   109％11％
  20   D-乳糖+/-SD   162％29％   123％20％   268％44％   115％10％   192％40％   164％21％   150％27％   108％15％   138％25％   126％21％
  20   D-果糖+/-SD   183％48％   463％126％   275％48％   202％18％   202％39％   147％20％   125％27％   136％39％   289％106％   152％41％
  10   甲酸+/-SD   222％60％   157％61％   124％22％   136％34％   163％46％   132％31％   114％24％   120％22％   298％34％   132％14％
  20   柠檬酸+/-SD   142％26％   117％22％   163％49％   113％62％   137％27％   161％37％   158％36％   87％14％   83％11％   103％20％
  20   蔗糖+/-SD   164％47％   465％114％   188％20％   121％10％   110％13％   124％10％   122％21％   117％19％   290％49％   161％16％
  10   L-色氨酸+/-SD   521％125％   232％80％   126％22％   133％20％   129％22％   98％18％   93％19％   170％48％   139％49％   188％28％
  10   丙二酸+/-SD   125％30％   146％33％   156％28％   160％63％   124％24％   141％25％   141％32％   125％26％   117％20％   110％16％
  5   L-鸟氨酸+/-SD   151％33％   138％33％   142％17％   165％14％   114％9％   135％30％   134％23％   148％33％   154％22％   137％20％
  10   L-赖氨酸+/-SD   219％42％   243％46％   125％22％   118％22％   125％13％   100％26％   101％19％   186％27％   159％35％   240％42％
  20   D-半乳糖+/-SD   341％101％   208％35％   334％63％   173％23％   153％31％   165％43％   155％30％   130％22％   195％55％   143％19％
  20   D-甘露糖+/-SD   250％73％   654％168％   296％44％   212％41％   222％38％   152％26％   139％20％   108％14％   262％68％   125％11％
  10   α-酮戊二酸+/-SD   201％46％   109％25％   102％23％   142％18％   116％15％   130％37％   100％25％   97％22％   115％24％   124％17％
  10   乳酸+/-SD   457％89％   118％33％   182％55％   303％27％   171％40％   192％49％   126％27％   122％27％   622％205％   123％19％
  20   L-鼠李糖+/-SD   145％40％   105％24％   110％33％   116％38％   103％19％   119％35％   105％25％   94％20％   101％32％   124％33％
  10   β-环糊精+/-SD   151％36％   155％57％   110％35％   187％42％   132％46％   125％49％   81％17％   90％21％   98％28％   112％23％
最初，对表4中所示的％活性数据进行主成分分析，以求根据种对反应进行分类。各测量值(10个菌株的5次重复)作为22个元素的列被引入到矩阵中，以使得每一列包含应用22种效应化合物中每一个获得的一个测量值。然后，在二维图中使用PC1、PC2、PC3和PC4得分的所有可能的组合，以检验根据种的分组。利用PC3和PC4所得到的得分图显示在图2中。
为了优化所获得的模式识别结果，进行效应物排序，然后进行秩消(rank annihilation)。为了评估各种效应化合物的影响，对表4中的各行计算％-呼吸活性的标准偏差。这个方法使各效应物根据它们对10种生物体之间存在的差异所做贡献的重要性进行排序。
表5：
根据10个菌株之间存在的差异将效应物排序
  排序   效应物   ±SD
  12345678910111213141516171819   乳酸D-甘糖琥珀酸酯L-色氨酸蔗糖D-果糖丙酮酸D-半乳糖甲酸L-赖氨酸D-山梨糖醇D-乳糖β-环糊精α-酮戊二酸柠檬酸D-木糖D-阿拉伯糖丙二酸L-精氨酸   171％158％130％126％112％103％86％76％58％56％48％48％33％31％30％23％17％17％16％
  202122   L-鼠李糖L-鸟氨酸β-甘油磷酸酯   15％14％11％
各效应化合物的标准偏差值越高，则认为表示该效应物对得分图中生物体分组的重要性越高。然后从β-甘油磷酸酯起，从表5的底部延续向上，渐进地从数据矩阵中排除效应物(行)。
图3显示由利用前16种效应化合物的约化矩阵获得的PC 3和PC4的得分图。另外，大肠杆菌亚种(两个野生型菌株大肠杆菌B和大肠杆菌新型，以及两个实验室菌株大肠杆菌JM105和大肠杆菌HB101)组成可识别的亚群，相对于代表其他种的族群，它们相互非常接近的聚类。
利用如图4所示的PC 2、PC3、PC 4的3-D投影可能将该矩阵进一步约化为9种效应化合物。这例证说明了本发明的分析法可用于使用更复杂的数学方法的微生物鉴定。
实施例4
用于鉴定未知微生物样品的概率方法
在这个实施例中，进行与实施例3相同的实验，并且用显示在表4中的数据建立10个菌株微生物的参考数据库。在该参考数据库中，对于每种效应化合物与每个微生物的10个单独测量容许建立连同其置信区间一起的平均呼吸活性值。对未知生物体进行的一次批实验(在实施例3中有描述)产生每种效应化合物的两个测量值。将这两个值平均，并且将该平均值与参考数据库中各个生物体的相同效应物的90％置信区间相比。当该未知生物体的测量值落入参考数据库中一个生物体的相同效应化合物的置信区间时，表明该效应物是″效应物匹配″的。″总体匹配″简单计算为与给定生物体匹配的效应物的数目除以效应物的总数(22)。
表6显示将10个未知样品的三次重复测量值与已建立的文库进行比较获得的结果。高百分匹配值表明该未知培养物提供与来自参考数据库的已知样品基本上相同的对效应化合物的呼吸反应模式。从表6中可看出，由相应于相同生物体的数据库项得到30个未知样品中每一个的最高百分匹配值。
这些结果证明用电化学方法测量的对效应化合物的呼吸活性反应模式可用于鉴定未知的微生物。
表6：利用统计分析法，通过比较未知样品和参考文库获得的鉴定结果
  未知   预测   ％匹配
  1   2   3
  粪肠球菌   粪肠球菌酿酒酵母大肠杆菌B   96％72％68％   100％76％68％   96％68％64％
  产气肠杆菌   产气肠杆菌大肠杆菌B金黄色葡萄球菌   84％64％60％   92％76％60％   88％72％68％
  变通变形杆菌   变通变形杆菌大肠杆菌B金黄色葡萄球菌   88％64％60％   88％60％48％   92％56％80％
  金黄色葡萄球菌   金黄色葡萄球菌粪肠球菌变通变形杆菌   92％80％76％   92％84％76％   88％80％76％
  绿脓假单胞菌   绿脓假单胞菌酿酒酵母粪肠球菌   96％88％80％   92％88％76％   92％80％80％
  大肠杆菌B   大肠杆菌B大肠杆菌新型大肠杆菌HB101   88％88％84％   92％76％76％   88％88％76％
  大肠杆菌HB101   大肠杆菌HB101大肠杆菌B大肠杆菌新型   100％88％80％   84％84％60％   76％72％72％
  大肠杆菌新型   大肠杆菌新型大肠杆菌B大肠杆菌HB101   88％80％64％   100％92％80％   96％92％84％
  大肠杆菌JM105   大肠杆菌JM105金黄色葡萄球菌变通变形杆菌   92％80％76％   84％72％64％   80％72％72％
  酿酒酵母   酿酒酵母绿脓假单胞菌大肠杆菌B   96％88％84％   92％80％80％   88％88％80％
上述实施例只是例证性的。不是为了使本发明只局限于上述实施例。许多变化对本领域的技术人员来说是显而易见的，并且这种变化不管在此是否被明确地提及，均在所述和要求保护的本发明的范围之内。

Claims (22)

1.一种鉴定微生物的方法，包括步骤：
a)获得未知微生物的测试样品；
b)在存在效应物时，向该测试样品加入介体或介体混合物；
c)评估该微生物在预定时限中的呼吸率变化，以及
d)将该微生物呼吸率的变化与暴露于该效应物的已知微生物的呼吸率变化比较，由此鉴定该测试样品中的未知微生物。
2.权利要求1的方法，其中向测试样品加入介体或介体混合物的步骤包括在加入该介体前使该测试样品与该效应物的溶液混合固定的时间。
3.权利要求2的方法，其中所述的介体或介体混合物包括氧化剂。
4.权利要求3的方法，其中所述的介体或介体混合物是铁氰化物、二氯苯酚-靛酚(DCIP)、二茂络铁和二茂络铁衍生物、亚甲基蓝、贾纳斯绿、三(二吡啶基)铁(III)、醌或吩嗪。
5.权利要求4的方法，其中所述的醌是苯醌、萘醌、甲萘醌、蒽醌、或这些醌的取代衍生物。
6.权利要求4的方法，其中所述的吩嗪是吩嗪硫酸甲酯或吩嗪硫酸乙酯。
7.权利要求1的方法，其中利用电化学测量法评估所述未知微生物和已知微生物的呼吸率。
8.权利要求7的方法，其中所述的电化学测量法是双安培分析法或电量分析法。
9.权利要求7的方法，其中通过电化学测量介体的消耗来评估所述未知微生物和已知微生物的呼吸率。
10.权利要求1的方法，其中所述预定时限最高达15分钟。
11.权利要求1的方法，其中所述的未知微生物处于生长停滞状态。
12.权利要求1的方法，其中分别使用多种效应物来评估呼吸率的变化。
13.权利要求12的方法，其中所述的效应物选自琥珀酸酯、D-木糖、D-乳糖、鸟氨酸、α-酮戊二酸、β-甘油磷酸酯、D-果糖、蔗糖、L-赖氨酸、乳酸、L-精氨酸、D-山梨糖醇、甲酸、L-色氨酸、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、丙酮酸、柠檬酸、丙二酸、D-甘露糖、β-环糊精、硝酸盐和葡萄糖。
14.一种区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的方法，包括步骤：
a)获得细菌的测试样品；
b)向该测试样品加入包含脂溶性氧化还原介体的介体混合物；
c)评估该细菌在预定时限中的呼吸率变化；以及
d)将该细菌的呼吸率与未暴露于该脂溶性氧化还原介体的相同细菌的另一样品的呼吸率比较，其中呼吸率的显著变化表明存在革兰氏阳性细菌，而呼吸率没有显著变化表明存在革兰氏阴性细菌。
15.权利要求14的方法，其中所述的脂溶性氧化还原介体包括氧化剂。
16.权利要求15的方法，其中所述的介体或介体混合物是铁氰化物、二氯苯酚-靛酚(DCIP)、二茂络铁和二茂络铁衍生物、亚甲基蓝、贾纳斯绿、三(二吡啶基)铁(III)、醌或吩嗪。
17.权利要求16的方法，其中所述的醌是苯醌、萘醌、甲萘醌、蒽醌、或这些醌的取代衍生物。
18.权利要求16的方法，其中所述的吩嗪是吩嗪硫酸甲酯或吩嗪硫酸乙酯。
19.一种区分多个微生物菌株中各微生物菌株的方法，该方法包括步骤：
a)在多种效应化合物的存在下培养各个单独的微生物菌株的多个样品，每个样品在介体化合物的存在下分别与多种效应化合物之一一起培养；
b)评估在预定时限中在存在各种效应化合物时各个微生物呼吸率的变化；以及
c)转换在存在介体化合物时与效应化合物一起培养的各个单独微生物菌株的各个样品呼吸率变化的数据测量值，以强调所述各微生物菌株之间的区别特征。
20.权利要求19的方法，进一步包括根据各种单独效应化合物对所述各微生物菌株之间呼吸率变化的贡献而将各效应化合物的效力排序。
21.一种区分多个微生物菌株中各微生物菌株的方法，该方法包括步骤：
a)在多种介体化合物的存在下培养各个单独的微生物菌株的多个样品，每个样品在效应化合物的存在下分别与多种介体化合物之一一起培养；
b)评估在预定时限中在存在各种介体化合物时各个微生物呼吸率的变化；以及
c)转换在存在效应化合物时与介体化合物一起培养的各个单独的微生物菌株的各个样品呼吸率变化的数据测量值，以强调所述各微生物菌株之间的区别特征。
22.权利要求21的方法，进一步包括根据各种单独的介体化合物对所述各微生物菌株之间呼吸率变化的贡献而将各介体化合物的效力排序。
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