CN103108958A - 表征微生物中抗生素抗性的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种表征微生物中抗生素抗性的方法，所述方法包括步骤：(a)提供抗微生物化合物、其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱；(b)使微生物、其细胞裂解物、其生长培养基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，从而提供被暴露样品；(c)获取被暴露样品的质谱；(d)比较在c)步骤中获取的质谱和在a)步骤中的参考质谱，以及(e)从所述比较中确定在所述暴露后是否出现所述抗微生物化合物、其修饰产物、其分子靶标或所述底物的修饰，并确立在观察到所述修饰时所述微生物对所述抗微生物化合物潜在地存在抗性。

Description

表征微生物中抗生素抗性的方法和设备
技术领域
本发明涉及细菌诊断学领域，特别涉及一种表征微生物的抗生素抗性的方法、实施本发明方法的试剂盒以及用于表征微生物的抗生素抗性的系统，其包括用于实施本发明的方法的质谱分析装置以及样品制备材料。
背景技术
抗生素抗性是微生物抵御抗生素作用的能力。这种抗性通过基因突变和微生物间的质粒交换而发生。抗生素抗性已对医学产生主要影响，而这种影响在未来数年只会增长。
因表现出抗生素抗性而重新获得兴趣的一组机会微生物是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。这些菌种（包括，例如，克雷伯菌(Klebsiella spp)和大肠杆菌(Escherichia coli)）包括机会病原体，这些机会病原体已与尿路感染、败血症、呼吸道感染以及腹泻尤其相关。早在三十年前，人们便了解这些菌种对第三代头孢菌素（例如氧亚氨基β-内酰胺）具有抗性，但是从那时才开始记录抗性的指数增长。菌株通过生成分子A类β-内酰胺酶的称为超广谱β-内酰胺酶(ESBL)获得其抗性，所述酶能够灭活第三代头孢菌素（头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟）和单环内酰胺（氨曲南）。ESBL是常见β-内酰胺酶（例如TEM和SHVβ-内酰胺酶）的衍生物，这种衍生物在酶的活性部位附近进行一次或多次氨基酸置换，从而增加其对第三代头孢菌素和单环内酰胺的亲和力以及水解活性。新一代头孢菌素的广泛使用促使进化出了更多种类的ESBL。ESBL由可转移的接合质粒编码，这些接合质粒负责将抗性传播给其他的革兰氏阴性菌。
根据其物理特性，ESBL被区分为450多种，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦对ESBL有不同程度的抑制，这一特性可用于在实验室中检测ESBL。目前，在临床微生物学实验室中仅采用表型ESBL检测试验。分子（基因型）试验正处于开发阶段。然而，分子试验存在的问题在于基因型和表型之间缺少100%的相关性。因此，包括ESBL生成细菌在内的任何细菌表型的分子试验的预测值均受到限制。
一般情况下，目前的实验室表型试验较之ESBL基因型确证试验更具有灵敏性和针对性。所有的表型ESBL检测试验依据同样的原理：试验评估在β-内酰胺类抗生素存在时或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合存在时，对细菌生长的抑制作用的变化情况。还有一些从商业渠道获得的各种人工试验和自动化平台，可用于实施这些表型试验。人工试验采用浸有β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合的圆盘或试片。浸透的材料放置在固体培养基中，培养基事先接种了已知密度的细菌悬浮液。之后进行过夜培养，通过观察确定生长抑制的情况，并根据抑菌圈的直径对生长抑制的情况进行定量分析。自动化系统建立在细菌生长测量的基础之上，测量细菌在不同浓度的β-内酰胺类抗生素存在时或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合存在时的细菌生长情况。在4到18小时之后，获得此类系统的结果。
目前，需要能够更为迅速地诊断ESBL生成细菌的设备和方法。同时，也需要可以用于临床微生物学实验室的ESBL检测试验以便在酶动力学方面表征ESBL，从而可以跟踪进化趋势，并评估和预测抗生素治疗中的有效剂量。一般来说，这些设备广泛地应用于表征微生物的抗生素抗性。
发明概述
本发明现提供用于快速诊断产生抗生素修饰酶的微生物、尤其是（在优选实施方式中）生成ESBL的微生物的设备和方法。本发明还提供了可表征抗生素修饰酶本身的设备和方法。此类表征可提早检测出新型抗性。
第一方面，本发明提供了一种用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供抗微生物化合物或其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱；
b)使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，从而提供被暴露的样品；
c)获取被暴露样品的质谱；
d)比较在c)步骤中获取的质谱和在a)步骤中的参考质谱，以及
e)从所述比较中确定在所述暴露后是否出现所述抗微生物化合物、其修饰产物或所述底物的修饰，或者其分子靶标是否过量生成，并确立在观察到所述修饰时所述微生物对所述抗微生物化合物潜在地存在抗性。
在所述方法的优选实施方案中，修饰包括所述抗微生物化合物的酶钝化或酶降解和/或其分子靶标的甲基化或过量生成。更优选地，酶降解是由β-内酰胺酶的降解导致。在这种情况下，抗微生物化合物可以是β-内酰胺类抗生素或任何其他β-内酰胺酶底物。因此，在所述方法的另一个优选实施方案中，修饰抗微生物化合物的酶的底物化合物可以替代抗微生物化合物。在其他优选实施方案中，抗微生物化合物是β-内酰胺类抗生素，优选地选自青霉素、头孢菌素、头霉素类和碳青霉烯类，更优选地选自头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢泊肟和氨曲南。
清楚的是，根据抗生素抗性的机制，可能也会过量生成抗微生物化合物的分子靶标（例如叶酸），这会导致对叶酸拮抗剂产生抗性。可以通过使用内标物并观察目标物/内标物的比例增大来检测过量生成靶标。核酸（例如DNA）可以作为适用的内标物。
此外，再次根据抗生素抗性的机制，也可以检测出抗微生物化合物的分子靶标（例如，如核酸）甲基化。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，可通过将所述微生物同时暴露于多种抗微生物化合物中来实施本方法，从而表征所述微生物对多种抗生素化合物的抗性。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述抗微生物化合物的酶钝化或酶降解是由β-内酰胺酶导致。在特别优选的实施方案中，所述β-内酰胺酶可以选自头孢菌素酶（包括超广谱头孢菌素酶）、青霉素酶、羧苄西林酶、氯唑西林酶和碳青霉烯酶。
在本发明方法的另一个进一步优选实施方案中，β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。
在所述方法的另一个进一步优选实施方案中，微生物是可能会生成ESBL的微生物，优选是选自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）的革兰氏阴性菌。
本发明的各方面中使用的样品包括微生物或其裂解产物。微生物样品可以是微生物培养物样品。此类培养物不必为纯培养物。或者，培养基的部分或直接临床材料也可以作为样品来源。
在所述方法的另一个优选实施方案中，该方法也是用于表征微生物的抗微生物修饰酶的方法的一部分，优选地所述抗微生物修饰酶最好是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。在特别优选的实施方案中，本发明方法是用于表征超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的方法的一部分。
优选地，根据本发明的用于表征所述酶的方法包括确定在存在或不存在特定酶抑制剂的情况下，所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修饰（优选降解）速率和/或所述化合物或底物的酶修饰产物的生成速率，或者所述化合物分子靶标的过量生成速率，从而确定所述酶的米-曼(Km)常数和最大反应速率。
在所述方法的另一个优选实施方案中，使用MALDI三重四极质谱分析获取质谱。
在所述方法的另一个优选实施方案中，被暴露样品是被暴露的所述微生物的粗细胞裂解物。
在所述方法的另一个优选实施方案中，所述方法还包括定量分析所述微生物的步骤。优选地，通过定量分析所述样品中的从微生物衍生的一种或多种结构生物分子或代谢物来对微生物进行定量分析。在优选实施方案中，所述结构生物分子或代谢物选自核酸，优选（基因组）DNA。DNA作为单分子存在于细胞内，可通过使用例如PCR和/或DNA探测介导技术对其进行定量分析。
另一方面，本发明提供用于表征微生物的β-内酰胺类抗生素抗性的试剂盒，其包含：
a)用于裂解微生物的裂解缓冲液；
b)至少一种抗微生物化合物或抗微生物化合物修饰酶的底物，以及
c)MALDI基质，
优选地所述试剂盒进一步包含：
d)携带至少一种抗微生物化合物或底物的载体，其中所述载体任选地是一次性质谱分析样品载板的形式。
另一方面，本发明提供了适用于通过上述本发明的方法表征微生物的β-内酰胺类抗生素抗性的系统，所述系统包含以下一种或多种组成部分：
-至少一种抗微生物化合物或抗微生物化合物修饰酶的底物；
-容器，用于使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于所述水成液中的至少一种抗微生物化合物中，优选地所述至少一种底物化合物在所述容器中提供；
-用于裂解所述微生物种的裂解缓冲液；
-MALDI基质；
-质谱分析装置；
-抗微生物化合物、其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱，以及
-质谱分析样品载板，
任选地进一步包含
-用于液体处理的自动移液器；
-包含计算机程序代码工具的计算机程序，当所述程序在计算机上运行时，实施如上所述的本发明方法的所有步骤，程序包括例如结果转译算法、界面软件和/或专家系统软件。
本发明在另一方面提供了包含计算机程序代码工具的计算机程序，当所述程序在计算机上运行时，实施如上所述的本发明方法的所有步骤。
在另一方面，本发明提供了计算机程序产品，它包含存储在计算机可读介质上的计算机程序代码工具，当所述程序产品在计算机上运行时，实施所述的本发明方法。
发明详述
定义
术语“抗生素”和“抗微生物化合物”在本文可互换使用，在本文用于描述降低微生物生存能力或抑制微生物生长或繁殖的化合物或组合物。“抑制生长或繁殖”意味着世代周期时间增加至少2倍、优选至少10倍、更优选至少100倍、且最优选无限地，也就是全部细胞均死亡。正如本公开中所使用的，抗生素还意于包括抗菌剂、抑菌剂或杀菌剂。本发明中可用的抗生素的非限制性实例包括青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类、四环素、林可酰胺类、喹诺酮类、氯霉素、糖肽类、甲硝唑、利福平、异烟肼、壮观霉素、叶酸抑制剂、磺胺甲恶唑等等。
术语“β-内酰胺类抗生素”用于指具有包括β-内酰胺类功效在内的抗生素特性的化合物。β-内酰胺环（β-内酰胺类）是含有杂环结构的环酰胺，由三个碳原子和一个氮原子组成。本发明中涉及的有效β-内酰胺类抗生素的非限制性实例包括青霉素、头孢菌素、头霉素类、青霉烯类、碳青霉烯类和单环内酰胺。β-内酰胺类抗生素对多种细菌感染均有效（不存在抗药性的情况下）。本文中使用的术语“β-内酰胺类抗生素”是指包括任何经抗生素抗性微生物灭活而发生质量或结构变化的抗生素，如果所述的质量或结构变化可通过质谱分析检测。
术语“第三代头孢菌素”是指这样一类化合物，包括但不限于头孢克肟、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢他美、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻林、头孢唑肟和氧头孢烯类。
术语“β-内酰胺酶”是指由微生物（优选细菌）生成的酶(EC3.5.2.6)，这种酶能够水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环。根据所谓的Ambler分类法，这一类酶通常被分为4大类（A、B、C和D类），这种分类法主要依据蛋白质同源性。β-内酰胺酶的示例包括头孢菌素酶、青霉素酶、卡羧苄西林酶、氯唑西林酶、碳青霉烯酶和头孢他啶酶。这表示该术语包括“普通的”β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和AmpCβ-内酰胺酶。根据Ambler分类法，本发明中优选的β-内酰胺酶为A和D类的β-内酰胺酶，或者根据Bush分类，属于2类的β-内酰胺酶(Bush等人1995.Antimicrob AgentsChemother.39:1211-33)。Ambler分类法中A类抗生素为典型的活性部位丝氨酸β-内酰胺酶，而Ambler分类法中D类抗生素是一组特定的丝氨酸β-内酰胺酶，和A类的β-内酰胺酶几乎没有序列相似性，D类抗生素俗称为OXA（苯唑西林酶）类。还优选是金属碳青霉烯酶。
本文中使用的术语“超广谱β-内酰胺酶”（缩写ESBL）最初被称为“扩展广谱β-内酰胺酶”，首次发明用于TEM和SHV酶的衍生物，这两种酶能够水解氧亚氨基头孢菌素。这些均属于β-内酰胺酶官能团2be。此后，该术语的含义得到了扩展，包括：(1)与TEM和SHV突变体的谱相似、但是从其他来源衍生的酶，例如CTX-M和VEB类型；(2)具有临界ESBL活性的TEM和SHV突变体，例如TEM-12；以及(3)多种比其亲本型提供更宽的抗性、但不符合官能团2be定义的β-内酰胺酶，例如对头孢吡肟具有增强活性的OXA衍生物和突变体AMpC类型。
本文中使用的术语“抗性的”和“抗性”是指微生物暴露在通过正常人体治疗剂量方案能够达到的抗微生物剂的浓度下，微生物的生存能力没有降低并且生长或繁殖也未得到抑制的现象。这意味着无法使用这种抗微生物剂成功治疗由这种微生物引起的感染。
本文中使用的术语“微生物”尤其指病原微生物，例如细菌、酵母、真菌和细胞内外的寄生虫。在本发明的优选方面中，该术语指病原细菌或机会细菌。这些包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌可能是以下属中的细菌：假单胞菌属（Pseudomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏菌属（Shigella）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）、变形杆菌属（Proteus）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、摩根氏菌属（Morganella）、弧菌属（Vibrio）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、布拉汉菌属（Branhamella）、奈瑟氏菌属（Neisse ria）、伯克氏菌属（Burkholderia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、哈夫尼菌属（Hafnia）、爱德华菌属（Edwardsiella）、气单胞菌属（Aeromonas）、摩拉克氏菌属（Moraxella）、巴斯德菌属（Pasteurella）、普罗威登斯菌属（Providencia）、放线杆菌属（Actinobacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、包特氏菌属（Bordetella）、西地西菌属（Cedecea）、欧文氏菌属（Erwinia）、泛菌属（Pantoea）、雷尔氏菌属（Ralstonia）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、黄单孢菌属（Xanthomonas）和军团菌属（Legionella）。革兰氏阳性菌可能是以下属中的细菌：肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、李斯特菌属（Listeria）、梭状芽胞杆菌属（Clostridium）、加德纳菌属（Gardnerella）、考克氏菌属（Kocuria）、乳酸球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Micrococcus）、微球菌属（Leuconostoc）、分枝杆菌属（Mycobacteria）和棒状杆菌属（Corynebacteria）。酵母和真菌可能是以下属中的酵母：念珠菌属（Candida）、隐球菌属（Cryptococcus）、酵母属（Saccharomyces）和丝孢酵母属（Trichosporon）。
本文中使用的术语“质谱”是指一种图谱，以分子质量或其函数（例如质荷比(m/z)、离子质量等）作为自变量。因变量通常为定量测量，例如丰度、相对丰度、强度、浓度、离子数量、分子数量、原子数量、计数/毫伏、计数等等。例如，在离子环境内，质谱通常以质荷比(m/z)作为自变量，其中m是离子质量，z是离子电荷，而因变量最常见的是各分子离子和/或其碎片离子的丰度。术语“离子”是指通过得到或失去一个或多个电子或质子而获得净电荷的一个原子或原子团。可以多种方式形成离子，其中包括在电流、紫外线和某些其他射线和/或高温作用下分解气体分子。
本文中使用的术语“参考质谱”是指用于比较分析的对照质谱。
本文中使用的术语“修饰酶的底物化合物”是指任何可被抗生素修饰酶水解的化合物（无论是否为抗生素）。所述底物的酶修饰会使产生与原始底物化合物具有不同质荷比（或质谱）的反应产物。如果酶转化是酶降解，那么本文中使用的“反应产物”是指“降解产物”。
本文中使用的术语“修饰酶”泛指抗微生物化合物修饰酶，例如β-内酰胺酶。
本文中使用的“修饰”是指抗微生物化合物的化学或物理变化（优选是化学变化），这种变化会灭活化合物的抗微生物活性。修饰可包括降解，降解是指化合物分子的化学基团缺失，导致分子质量降低，有时还会伴随质荷比的变化。或者，修饰是指化合物分子的化学基团被置换或添加，从而灭活化合物的抗微生物活性，这种修饰模式会改变分子的质量，有时还会伴随质荷比的变化。
本文中使用的术语“细胞裂解物”是指通过破碎或裂解细胞而得到的细胞悬浮液或细胞碎片。粗细胞裂解物包含所有的蛋白质、糖蛋白、多糖、脂质和核酸。本发明中的细胞裂解物可以包括全细胞，但是基本上由裂解步骤之后获取的细胞成分或任何碎片或其混合物组成。然而，细胞裂解物溶液可以包括但不限于是裂解细胞溶液，可将这种溶液处理为清除或灭活了所选分子的溶液。这样，与最纯化的细胞成分相比，该溶液依然基本上是“原液”。例如，细胞裂解物可以是一种经制剂处理过的裂解细胞溶液，这种制剂可以灭活或清除聚合酶抑制剂。此外，细胞裂解物还可以是一种经抗凝剂处理过的裂解细胞溶液。任何方法均可用于裂解细胞样品中的细胞。例如，渗透休克法、超声裂解法、加热法、物理破碎法、微波处理和酶和/或碱裂解法均为可用于裂解细胞的方法。
本文中使用的术语“生长培养基”是指包含微生物基因表达和/或微生物种生长所需的所有元素的培养基。生长培养基可以是固体培养基、半固体培养基或液体培养基。生长培养基可以含有一种或多种元素，例如氨基酸、胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素、活性分子例如抗生素、酶、表面活性剂、缓冲液、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐、一种或多种可以检测酶的活性的底物等等。
本文中使用的术语“上清液”是指通过离心、过滤、沉淀或其他技术中的已知方法清除液体培养基（例如液体肉汤培养基）中培养的细胞时剩余的液体悬浮液，悬浮液中还包含溶解物质和悬浮物质。
本文中使用的术语“基质”和“MALDI基质”可互换使用，它是指一种液态或固态的化合物，可用来形成基质用于MALDI质谱分析。为了进行MALDI，分析物必须嵌入大量对激光器发射的波长具有良好吸收特性的分子中。这些基质分子通常为小分子有机化合物，主要是酸类。在现有技术中，每种用于MALDI的激光的合适基质材料是公知的，本领域技术人员也会清楚地理解“MALDI基质”这一术语。不限制本发明，常用基质材料包括芥子酸(SA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素(HFMC)、3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)、5-(三氟甲基)尿嘧啶、咖啡酸、琥珀酸、邻氨基苯甲酸、3-氨基吡嗪-2-羧酸、四（五氟苯基）卟啉和阿魏酸。基质适宜地溶于乙腈/水/甲酸（500:500:1；v/v/v），或其他适用比例取决于所用基质。
本文中使用的术语“样品”是指含有或疑似含有分析物的物质，例如要表征的微生物或β-内酰胺酶，或者β-内酰胺酶底物或其β-内酰胺酶降解产物。本发明方法中使用的样品可以为液态或是固态，可溶于或悬浮于液体、乳液或凝胶中，也可与某种物质结合或被其吸附。样品可以是生物样品、环境样品、实验样品、诊断样品或任何含有或疑似含有目标分析物的其他类型样品。同样，样品可以是或者可包含生物体、器官、组织、细胞、体液、活检样品或其碎片。本发明方法中使用的样品可以是任何疑似含有分析物的物质，例如β-内酰胺酶和ESBL的底物。在生物环境中，样品可以包含生物流体、整个生物体、器官、组织、细胞、微生物、培养基上清液、亚细胞器、蛋白质复合物、单体蛋白、重组蛋白、融合蛋白、病毒、病毒粒子、肽和氨基酸。
本文中使用的术语“样品载板”是指可适用于接受MALDI分析样品的所有载板。常用载板为10x10不锈钢靶板(Perseptive Biosystems,Framingham,MA,USA)，如果适用，可在靶板上涂一层疏水涂层。
本文中使用的术语“米-曼常数”即“Km”是指酶反应速率为最大值的一半时的底物浓度。本文中使用的术语“最大反应速率”即“Vmax”是指饱和底物浓度下的最大酶反应速率。米-曼动力学描述了酶化学反应生成分子的生成速率。为了确定酶反应的最大速率，应不断增加底物浓度直至产物形成速率恒定。这是酶的“最大速率”(Vmax)。在这种情况下，酶的活性部位充满底物。由于Vmax时无法准确测量底物浓度，因此可以通过最大速率达到一半时的底物浓度来表征酶。这个底物浓度就是米-曼常数(KM)。对于展示简单米-曼动力学的酶反应，这代表酶-底物(ES)复合物的解离常数（底物的亲和力）。值越低，亲和力越高。
本文中使用的术语“MALDI三重四极MS”是指一种基质辅助激光解析/电离方法，其中质谱仪具有三个与进入离子平行的四极子。第一个四极子充当滤质器。第二个四极子充当碰撞池，其中所选离子碎裂成碎片。第三个四极子对所产生的离子碎片进行扫描。四极杆质量分析器利用振荡电场有选择地稳定或扰动通过射频(RF)四极场的离子的路径。仅有一种质荷比可以在任何时间穿过系统，而改变磁透镜上的电势可以让多种m/z值快速摆动，以持续的方式或连续的离散跳跃方式。四极杆质谱分析器充当质量选择滤质器。
本文中使用的术语“定量分析”是指用于获取定量测量的任何方法。例如，对微生物进行定量分析包括确定微生物的丰度、相对丰度、强度、浓度和/或计数等等。
本文中使用的术语“结构生物分子”是指数量在微生物培养基的各个细胞间基本上恒定的任何细胞蛋白质、糖蛋白、多糖、脂质、核酸等，这一数量可用于定量分析那些微生物。例如，如果采用DNA，那么可通过DNA扩增或利用（可鉴定质谱的）核酸探针进行定量分析。此类定量分析方法可采用诸如标准校正曲线，其中可绘制DNA含量与细胞数量或其他生物量参数（例如培养基光密度或碳总质量）关系的图表。
本文中使用的术语“代谢物”是指在细胞或生物体内进行生物化学反应而生成的化合物，化合物的数量在微生物培养基的各个细胞间基本上恒定，这一数量可用于定量分析那些微生物。
优选实施方案
本发明提供用于表征微生物的抗生素抗性的方法。本方法的第一步是提供待表征对其抗性的抗生素化合物、其合适的模拟底物、抗生素化合物的分子靶标的一个或多个参考质谱表征。可通过使用任何用于样品分析的质谱分析(MS)技术来制作参考光谱。优选MS技术为MALDI-MS。
适用的β-内酰胺酶底物可以是任何β-内酰胺类抗生素。或者，可以使用诱导β-内酰胺酶在微生物中表达和/或能够被β-内酰胺酶的酶活性水解的β-内酰胺类衍生物或模拟物。本发明中使用的模拟底物本身可以但不是必须显示任何抗生素活性。
β-内酰胺酶底物优选是一种β-内酰胺酶降解产物能够易于被MS识别的化合物，最好是底物及其降解产物具有不同的质荷比。
用于表征微生物的β-内酰胺类抗生素抗性的优选方法的另一步骤涉及使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的底物化合物，从而提供被暴露样品。
适用的被暴露样品可以是疑似携带要表征β-内酰胺类抗生素抗性的微生物的受试者（即人或动物受试者）的体液或体组织样品。适用的体液样品可以是血液、粪便、尿液样品。
可以在体内或体外使微生物暴露于底物化合物。
在某些实施方案中，暴露可以包含培养步骤，其中在短时间内培养微生物，例如在含有目标抗微生物剂的溶液中培养1-5分钟到1-3小时。此外，也可以使用微生物的裂解物和微生物培养基的上清液。有特定的酶存在时，抗微生物剂或其模拟底物被修饰或被灭活，从而导致与活性药物形式相比在元素组成上有所不同。这会导致可通过质谱分析检测的抗微生物剂的质量发生变化。
本发明的一项优势在于粗细胞裂解物也可用于提供被暴露样品。因此，将要表征的微生物不需要存活，并且也无需在检测其中的β-内酰胺酶活性之前提纯被暴露样品。
当微生物含有β-内酰胺酶基因却在通行的生长条件下没有生成所述酶时，可通过在β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶诱导化合物存在的情况下培养微生物来诱导微生物在生物体中生成β-内酰胺酶。优选地，在细菌细胞裂解之前，可选择性地进行诱导或刺激β-内酰胺酶的生成。
一般来说，被暴露样品对抗生素化合物的修饰能力可以通过检测抗生素底物化合物的减少量来检测，或者通过检测修饰酶和底物化合物之间的水解反应的反应产物增加量来检测。因此，被暴露样品中β-内酰胺酶的活性可以通过检测β-内酰胺酶底物化合物的减少量来检测，或者通过检测β-内酰胺酶和底物化合物之间的水解反应的反应产物增加量来检测。
或者，被暴露样品对抗生素化合物的修饰能力还可以通过检测对抗生素化合物的分子靶标的修饰作用来检测。例如，对红霉素、环丙沙星、万古霉素、甲氧西林和四环素的抗性基于靶标修饰，例如RNA甲基化。同样，这些靶标修饰可以通过本文中所述的质谱分析来检测。因此，本发明不限于检测作为修饰酶的β-内酰胺酶，也可以表征对β-内酰胺类的抗性。同样，也可以使用本发明表征不基于药物修饰的对抗生素的其他抗性。尽管β-内酰胺类通常通过水解作用灭活抗生素药物，也可使用本发明中的设备和方法检测和表征其他类型的酶修饰。例如，可通过添加磷酸基团修饰氨基糖苷类抗生素。也可通过本发明中的方法检测这类修饰酶底物的修饰。
可通过质谱分析非常精确地测量（定量）反应或靶标化合物的变化，这是本发明人的一项重要发现。因此，在培养步骤之后，可使用通用质谱分析样品制备方法，例如通过有机溶剂沉淀蛋白质、固相萃取(SPE)或液液萃取（LLE），来制备用于质谱分析的被暴露样品。大约使用1μL的制备溶液用于质谱分析。在本发明的优选实施方案中，可采用MALDI MS，更优选采用MALDI四极MS。使用MALDI MS，可精确测量反应化合物，暴露时间（培养时段）可以非常短。通过大约5分钟的培养时间即可成功表征。
MALDI MS涉及将暴露样品连同基质涂布到质谱分析样品载板并在样品载板上干燥样品以制备质谱分析样品。适用的基质在上文中已详细说明，而基质的性质没有特殊的限制。可通过质谱分析领域的本领域技术人员的已知方法来从被暴露样品制备质谱样品。
样品置于质谱仪上之后，可通过标准程序获取样品的质谱，标准程序取决于所用设备和MS方法的类型。
在本发明的方法中，采用MS、优选串联质谱分析(MS-MS)或基质辅助激光解析/电离(MALDI)实施检测底物或靶标修饰（例如β-内酰胺酶底物降解或RNA甲基化）步骤。质谱分析提供一种有效的方法，用于确定复杂有机分子（包括蛋白质和肽）的结构和种类。在MS中，样品化合物被高能电子轰击，使其成为具有一定特性的碎片。这些重量和电荷各异的碎片随后经过一个磁场，并根据其质荷比进行分离。样品化合物的最终特有碎片特征样式（质谱）可用于鉴定和定量分析此化合物。典型的MS程序包括以下步骤：
1.通过将样品任选地（在称之为MALDI的特殊形式的MS的情况下）连同基质涂布到质谱分析样品载板上将样品装载到MS仪器，并通过蒸发溶剂在载板上干燥样品或混合物。
2.通过多种方法（例如通过电子束冲击样品）之一电离样品成分，从而形成带电荷的粒子（离子）
3.通过电场加速正离子
4.根据离子在电磁场中的运动的详细信息计算粒子的质荷比(m/z)，并且
5.检测在步骤4中根据m/z排列的离子。
在MALDI MS中，基质由结晶分子组成，其中三种适合的结晶分子示例分别是3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（芥子酸）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-氰基或α-基质）和2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。基质溶液与被暴露样品混合在一起。有机溶剂使疏水分子溶于溶液之中，而水则使可溶于水（亲水）的分子溶于溶液之中。在MALDI板或载板上（通常是特制的金属板）点涂此溶液。将溶剂蒸发掉，仅剩下重结晶的基质和分散在基质晶体上的样品分子。
可用于本发明的适用MS应用包括MALDI-TOF MS质谱分析、MALDI-FT质谱分析、MALDI-FT-ICR质谱分析、MALDI三重四极质谱分析。采用MALDI-TOF质谱分析，通量估计为每个样品1分钟。采用MALDI三重四极质谱分析，试验持续时间减少为每个样品大约5秒，不会丧失灵敏度或针对性。
采集质谱后，以定性、半定量或定量分析的方式比较衍生样品质谱与抗微生物化合物、其酶修饰产物、其分子靶标的参考质谱，也可与其修饰酶的底物化合物的参考质谱进行比较。通过此类比较，可以定性、半定量或定量分析的方式确定底物或靶标的修饰和/或修饰产物的生成。
质谱分析可以同时测量失活或修饰的抗生素（例如降解产物）和未受损的抗生素底物（或模拟底物）以及分子靶标，而产物与底物的比例可测量微生物灭活或修饰被测底物的能力。或者或此外，样品中的底物水平减少或产物水平增加的任意一个均可作为微生物的抗生素灭活或抗生素修饰能力的量度。或者，分子靶标水平增加或修饰（抗性）靶标水平增加可以指示微生物的抗性。在表征对药物的抗生素抗性（涉及靶标修饰作为抗性机制）的情况下，使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的抗微生物化合物的步骤相当于提供微生物、细胞裂解物或生长培养基上清液的样品并在其中检测被修饰靶标。
因此，在本发明的其中一个实施方案中，抗微生物底物化合物的修饰作为微生物生成诸如β-内酰胺酶的证据，并表明该微生物可能对例如通过降解、所提供的抗微生物底物化合物或适用的模拟底物的特定β-内酰胺酶灭活的β-内酰胺类抗生素化合物具有抗性。例如，通过这种方法，可表征所述微生物种对β-内酰胺类抗生素的抗性。
或者，在本发明的另一个实施方案中，微生物细胞中的抗微生物化合物分子靶标的修饰（相对数量或化学成分的修饰）表明微生物可能对目标抗生素化合物具有抗性。例如，通过这种方法，可表征微生物种对红霉素、环丙沙星、万古霉素、甲氧西林和四环素的抗性。
如上所述，本发明在某些实施方案中提供一种快速诊断微生物的方法，微生物生成灭活或在结构上修饰抗微生物剂的酶。该方法可用于快速检测ESBL活性。特别是在医院中，极为需要这种方法，因为第三代头孢菌素广泛用于针对感染的重症患者的经验疗法。快速检测患者样品中的ESBL活性对于尽早开始为患者提供最适用的抗生素药物疗法极为重要。本发明中的方法可用于快速检测ESBL活性。此外，本发明中的方法同样适用于微生物培养基上清液或直接从诸如经尿液样品离心后的患者样品分离出的微生物。通过这种方法，甚至在检测出（培养的）细菌之前，应当有可能检测出ESBL活性。
质谱分析尚未用于通过监测底物强度的降低和/或产物强度的增加来检测抗生素的酶失活或化学修饰。此外，质谱分析也尚未用于研究复杂样品（例如裂解微生物）的酶活性。更为具体地是，以前从未发表使用MS的ESBL酶检测和表征。
快速检测ESBL活性的诊断方法还需要适当地通过使用裂解试剂裂解样品从微生物中释放出抑制抗微生物剂的β-内酰胺酶。随后，可转移这些裂解物，最好使用自动移液器移液到多孔试片，例如ATBTM或RapidecTM试片，这些试片包含一些带有试剂的孔，可根据不同的抗微生物化合物进行不同的试验反应。例如，一些孔包含一定数量的一种或多种β-内酰胺酶底物，以干燥或固定（胶合）的形式存在。一些孔还可包含一种或多种内标物，便于进行定量分析。一些孔还可作为对照而未装有底物，用于抗微生物化合物的自降解。
转移到孔中、并如本文所述培养一小段时间后，每个孔的被暴露样品适于放置在MALDI板或其他MS载板上。在MALDI的情况下，将适用的基质添加到载板上。之后，即可获取质谱。使用专用的分析算法进行适当的质谱分析。随后，使用计算机软件比较从被暴露样品获得的质谱和参考质谱，以便确定每个孔的底物是否降解。如果出现降解，那么专用软件可能会以报告的形式提供试验结果，报告可能包含诸如如下内容：(1)微生物的种类（种名）（微生物种的鉴定可以通过参考试验进行，也可在相同或平行的试片中进行），(2)多孔试片中提供的被测抗微生物剂清单，(3)被微生物种抑制或降解的抗微生物剂清单，(4)假设负责抗微生物抑制的抗性机制，(5)关于结果的专用解释备注。
或者，可以在质谱载板上进行使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的底物化合物（从而提供被暴露样品）的步骤。在允许任选地存在的β-内酰胺酶在样品载板上降解β-内酰胺酶底物化合物时，可将MALDI基质直接添加到被暴露样品。
可使用复杂样品（其中包括粗细胞裂解物或患者样品）实施本发明中的方法。该方法允许精确评估抗微生物剂大小范围（通常200到1000道尔顿）内的分子，并且可适用于使用例如作为底物的抗微生物药物确定抗生素灭活或抗生素修饰酶的活性。
本发明中的方法还可作为ESBL确证试验使用。在大多数临床微生物学实验室中，首先要为ESBL表型筛选细菌，随后可采用独立的ESBL表型确证试验确定ESBL表型。本发明可用于确定细菌中的ESBL表型。较之目前的表型试验，本发明中的方法的优势在于本文中建议使用的方法不仅可以处理细菌悬浮液还可处理细菌裂解物。采用细菌裂解物能够抵消因基于其他机制的抗性而导致的潜在偏差，特别是药物的进入减少，排出增加。细菌裂解物与目前的表型ESBL确证试验不能配套使用，因为这些试验均依靠细菌的生长。
本发明中的方法还可作为高通量筛选方法使用，用于医药行业的新型β-内酰胺酶抑制剂。目前，β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦分别与氨基青霉素和哌拉西林配合使用，用于克服生成β-内酰胺酶的细菌带来的问题。克拉维酸或他唑巴坦抑制β-内酰胺酶的活性，而氨基青霉素或哌拉西林杀灭细菌。考虑到日益增长的ESBL问题，医药行业急需筛选抑制ESBL的新型化合物的工具。本发明极为适用于此目的。
实施例
我们通过使用作为底物的苄青霉素检测出生成CTX-M-1和CTX-M-9的大肠杆菌的粗裂解物以及生成SHV-2的肺炎克雷伯菌中的β-内酰胺酶的活性。以苄青霉素为底物，我们能够监测纯青霉素酶（源于蜡样芽胞杆菌(B.Cereus)）的酶动力学。

Claims (17)

1.一种用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供抗微生物化合物、其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱；
b)使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，从而提供被暴露样品；
c)获取被暴露样品的质谱；
d)比较在c)步骤中获取的质谱和在a)步骤中的参考质谱，以及
e)从所述比较中确定在所述暴露后是否出现所述抗微生物化合物、其修饰产物、其分子靶标或所述底物的修饰，并确立在观察到所述修饰时所述微生物潜在地对所述抗微生物化合物存在抗性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述修饰包括所述抗微生物化合物或所述底物的酶钝化或酶降解和/或其分子靶标的甲基化或过量生成。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的酶降解是由β-内酰胺酶降解导致。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的β-内酰胺酶选自根据Ambler分类法的A和D类的β-内酰胺酶，或者属于根据Bush分类的2类的β-内酰胺酶。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。
6.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述的微生物是疑似生成ESBL的微生物，优选地选自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的抗微生物化合物是β-内酰胺类抗生素，优选地选自青霉素、头孢菌素、头霉素类和碳青霉烯类，更优选选自头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢泊肟和氨曲南。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的方法也是用于表征微生物的抗微生物修饰酶的方法的一部分，优选地所述抗微生物修饰酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的用于表征所述酶的方法包括确定所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修饰速率、优选降解速率和/或所述化合物或底物的酶修饰产物的生成速率，或者所述化合物分子靶标的生成速率，从而确定所述酶的米-曼(Km)常数和最大反应速率(Vmax)。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)之后，所述被暴露样品和基质一同涂布在质谱分析样品载板上，其中所述样品在样品载板上干燥以制备质谱样品用于基质辅助激光解析电离质谱分析(MALDI-MS)。
11.根据权利要求10的方法，其中所述质谱是通过使用MALDI三重四极MS获得的。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的被暴露样品为所述微生物的被暴露于抗微生物化合物的粗细胞裂解物。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中在步骤(b)中，通过在所述样品中定量分析由所述微生物衍生的一种或多种结构生物分子或代谢物来定量分析所述微生物，优选地其中所述结构生物分子或代谢物为DNA分子。
14.用于表征微生物的抗生素抗性的试剂盒，其包含：
a)用于裂解微生物的裂解缓冲液；
b)至少一种抗微生物化合物或抗微生物化合物修饰酶的底物，以及
c)MALDI基质，
优选地所述试剂盒进一步包含：
d)携带所述至少一种抗微生物化合物或底物的载体，其中所述载体任选地是一次性质谱分析样品载板。
15.用于表征微生物的抗生素抗性的系统，其包含：
-至少一种抗微生物化合物或抗微生物化合物修饰酶的底物；
-容器，用于使微生物、其细胞裂解物、或其生长培养基上清液暴露于水成液中的所述至少一种抗微生物化合物，优选地其中至少一种底物化合物在所述容器中提供；
-用于裂解所述微生物的裂解缓冲液；
-MALDI基质；
-质谱分析装置；
-抗微生物化合物、其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱，以及
-质谱分析样品载板，
任选地进一步包含
-用于液体处理的自动移液器；
-计算机程序，其包含计算机程序代码工具，当所述程序在计算机上运行时或者其中所述的计算机程序在计算机可读介质上实现，可执行权利要求1-13任一项的所有步骤。
16.计算机程序，其包含计算机程序代码工具，当所述程序在计算机上运行时，可执行权利要求1-13任一项的所有步骤。
17.计算机程序产品，其包含存储在计算机可读介质上的计算机程序代码工具，当所述程序产品在计算机上运行时，可执行权利要求1-13任一项的方法。
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