KR20210015450A - 베타-락탐 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 직접 검출 방법 - Google Patents
베타-락탐 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 직접 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics)에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 검출 방법과, 생물학적 시료 내 포함된 베타-락탐계 항생제 내성 관련 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 질량분석법을 통해 N-말단이 절단된 ESBL(Extended Spectrum β-Lactamase) 단백질을 직접적으로 확인함으로써 병원성 균주의 항생제 내성 여부는 물론 내성관련 단백질의 종류까지 신속하고 정확하게 판별할 수 있다. 이에, 본 발명은 감염 초기에 적절한 항생제 투여전략을 신속하게 수립하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 탑-다운(top-down) 질량 분석을 통해 검체 시료에 대한 전처리 없이 베타-락탐 항생제에 대한 내성 관련 단백질을 직접 검출하는 방법에 관한 것이다.
항생제 내성균의 지속적 증가로 인해 상용화된 항생제의 치료효율이 급감하는 상황에서 병원균에 감염된 환자에 대한 적절한 항생제 투여 및 항생제 내성균의 저감화를 동시에 유도함으로써 치료효율을 향상시키기 위한 전략이 활발하게 연구되고 있다. 현재 항생제 내성 여부를 판별하기 위해 최소억제농도(Minimum Inhibition Concentration, MIC) 검사가 시행되고 있으나 필수적 단계인 미생물 배양에 18시간 이상의 시간이 소요되고 정확성도 떨어져 신속한 판별 및 감염 초기의 최적 항생제 선정이 불가능하다. 실시간 PCR 등을 이용한 유전자 진단기술 역시 유전자 추출 및 증폭 과정 등에서 복잡하고 고비용의 시료 전처리를 거쳐야 하고 타켓 유전자의 염기서열에 대한 사전정보가 필수적이라는 점, 이미 항생제 분해 활성을 잃은 효소의 유전자 검출 등으로 인해 내성 여부에 대한 부정확한 정보가 포함되는 점 등 신속, 정확한 대량 진단에 적용하기에는 한계를 가지고 있다.
MALDI-TOF를 비롯한 질량분석법은 PCR 등에 의한 서열분석 방법에 비하여 저비용 고효율의 동정 시스템으로서 미생물의 신속한 동정에 필요한 중요한 수단이 될 수 있는데, 균주 배양 후 시료 처리에서 동정까지 10분 이내에 가능할 뿐 아니라, 미지의 균주에 질량분석 데이터를 통해 구축한 데이터베이스내의 질량 데이터와 비교하여 질량값이 일치되는 균주를 신속하게 동정할 수 있다.
그러나, 종래의 질량 분석법은 정확한 항생제 내성 단백질의 종류를 판별하지 못할 뿐 아니라, 타겟 내성 단백질을 가수분해 효소를 이용하여 펩타이드 단위로 분해한 뒤 이들 절편들의 질량 값을 통해 간접적으로 내성 단백질의 종류를 유추하는 것으로 절차의 번거로움은 물론 신뢰성에서 적지 않은 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 베타-락탐계 항생제 내성에 직접적으로 관여하는 단백질을 선별하고, 이들의 생체 내 활성형의 정확한 질량값을 측정한 뒤, 이에 대한 효소 처리 등의 전처리 없이 탑-다운(top-down) 질량 분석을 수행하여 신속하면서도 정확하게 베타-락탐계 항생제 내성 균주 및 내성 단백질을 확인할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
비특허문헌 1. Yasufumi M. et al., Journal of Clinical Microbiology 52(4): 1034-1040 (2014)
본 발명자들은 베타-락탐계 항생제 내성에 관여하는 베타-락타마제 단백질을 간단하면서도 높은 신뢰도로 검출하는 효율적 진단방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 베타-락탐계 항생제 내성을 가지는 균주의 ESBL (Extended Spectrum β-Lactamase) 단백질들이 감염 후 생체 내에서 일정 길이의 N-말단 잔기가 절단된 활성형(active form)으로 존재한다는 사실을 새로이 발견하고, 이들 활성형 ESBL 단백질을 질량분석법을 통해 직접적으로 확인할 경우 병원성 균주의 항생제 내성 여부는 물론 내성관련 단백질의 종류까지 신속하고 정확하게 판별함 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics)에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제 내성 관련 단백질을 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics)에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 검출 방법:
(a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료 내에서 병원성 균주가 발현하는 단백질을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 단백질에 대해 탑-다운(top-down) 질량 분석을 수행하는 단계,
상기 질량 분석 결과 N-말단의 28개 아미노산 잔기가 제거된 베타-락타마제(β-lactamase)와 동일한 질량의 단백질이 검출된 경우, 상기 생물학적 시료 내에는 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주가 존재하는 것으로 판정한다.
본 발명자들은 베타-락탐계 항생제 내성에 관여하는 베타-락타마제 단백질을 간단하면서도 높은 신뢰도로 검출하는 효율적 진단방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 베타-락탐계 항생제 내성을 가지는 균주의 ESBL (Extended Spectrum β-Lactamase) 단백질들이 감염 후 생체 내에서 일정 길이의 N-말단 잔기가 절단된 활성형(active form)으로 존재한다는 사실을 새로이 발견하고, 이들 활성형 ESBL 단백질을 질량분석법을 통해 직접적으로 확인할 경우 병원성 균주의 항생제 내성 여부는 물론 내성관련 단백질의 종류까지 신속하고 정확하게 판별함으로써, 감염 초기에 적절한 항생제 투여전략을 수립할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서“병원성 균주”는 예를 들어 포도상구균, 연쇄상구균, 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 수도모나스 애루기노사, 수도모나스 오티티디스, 마이크로코커스 루테우스, 시트로박터 코세리, 프로튜스 미라빌리스 및 미코박테리움 울서란스를 포함하나, 이에 제한되지 않고 감염 또는 질환의 원인으로 작용하는 모든 세균을 포함한다.
본 명세서에서“항생세에 대한 내성을 가진다”고 함은 특정 병원성 미생물에 대한 항생제가 고농도로, 또는 유효량으로 존재하는 환경 내에서도 해당 미생물이 생육 가능한 경우를 의미한다. 항생제 내성 여부는 병원성 미생물이 분비하는단백질로서 해당 항생제를 분해하여 그 활성을 제거하거나 저하시키는 분해 효소의 존재를 검출함으로써 판별할 수 있다. 예를 들어, 세균의 세포벽 합성을 억제하는 베타-락탐계 항생제인 페니실린, 세팔로스포린, 모노박탐, 카바페넴 등은 베타-락타마제(β-lactamase)에 의해 무력화되어 이를 발현하는 병원균을 억제하지 못한다. 따라서, 용어“내성”은“저항성” 또는“낮은 치료적 반응성”과 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 따라서“치료적 반응성”은 베타-락탐계 항생제가 병원성 균주에 감염된 환자에게 치료적 유효량으로 투여되었을 때 생체 내에서 위와 같은 작용을 하는 정도를 의미한다.
본 명세서에서, 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 따라서 “예방적 반응성”은 베타-락탐계 항생제가 아직 감염이 확진되지 않은 정상인에게 예방적 유효량으로 투여되었을 때 생체 내에서 감염을 억제하는 작용을 하는 정도를 의미한다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 베타-락탐계 항생제로 억제하고자 하는 병원성 균주를 포함하고 있거나 포함할 가능성이 있는 모든 시료로서, 혈액, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 베타-락탐계 항생제로 억제하고자 하는 병원성 균주의 존재 또는 상기 균주의 항생제 내성 여부를 조사하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 항생제 내성을 가지는 병원성 균주에 의해 감염되었는지 여부의 분석 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 조성물은 베타-락탐계 항생제의 치료적 반응성 뿐 아니라 예방적 반응성을 예측하기 위한 정보도 제공하기 때문에, 본 발명의 개체는 균주에 감염된 환자일 수도 있고 아직 감염이 확진되지 않은 정상 개체(healthy subject)일 수도 있다.
본 명세서에서 용어“탑-다운(top-down) 질량 분석”은 단백질을 펩타이드 조각으로 절편화(fragmentation)하는 과정을 거치지 않고도 전장 단백질에 대한 질량값을 직접 측정하는 분석을 의미하며, 구체적으로는 단백질 시료가 질량 분석기에 주입되기 전에 타겟 단백질의 절편화가 이루어지지 않는 분석을 의미한다. 본 발명의 또 다른 특징 중 하나는, 트립신 등의 단백질 분해효소를 이용한 단백질의 무작위적인 분해 없이 전장(full length) 단백질에 대한 직접적인 질량 분석을 수행함으로써 절차가 보다 단순화될 뿐 아니라, 분해된 절편에 대한 질량정보를 수집하고 다양한 단백질들의 절편화 경향에 대한 방대한 정보를 취합하여 간접적으로 단백질을 동정하는 종래 방법에 비해 훨씬 짧은 시간 동안 현저하게 높은 신뢰도로 타겟 단백질의 존재 여부를 판단할 수 있다는 점이다.
본 명세서에서“단백질의 질량이 동일”하다 함은 본 발명의 질량분석 방법을 통해 측정된 질량 값과 참조(reference) 질량 값, 예를 들어 아미노산 서열 및 분자량이 알려진 베타-락타마제에서 N-말단의 1-28 아미노산 잔기가 제거된 질량 값에 해당하는 수치와 실질적으로 동일한 경우를 의미한다. 실질적인 동일이란 예를 들어 측정된 Da 값 또는 m/z × z 값이 참조 질량 값의 ±10 범위 내에 존재하는 경우, 보다 구체적으로는 ±7 범위 내에 존재하는 경우, 보다 더 구체적으로는 ±5 범위 내에 존재하는 경우, 가장 구체적으로는 ±3 범위 내에 존재하는 경우를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (a)에서 분리된 단백질에 대해 이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에서 용어“이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)”는 이온 또는 하전된 화합물이 정전기적인 힘(electrostatic force)에 의해 이온교환수지에 결합하는 현상을 이용하여 비균질성 혼합물로부터 전하를 띄는 목적 물질을 분리해내는 분리 및 정제방법을 의미한다. 이온교환 크로마토그래피는 다양한 작용기가 결합된 이온교환수지(ion exchange resin)를 가지는데, 음이온 교환수지는 양전하를 띄는 작용기를 가져 혼합물 내 음전하를 띄는 목적물질과 정전기적 인력으로 결합하고, 양이온 교환수지는 양전하를 띄는 목적물질과 특이적으로 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 이온교환 크로마토그래피는 음이온교환 크로마토그래피이다. 본 발명에서 이용되는 음이온교환수지는 예를 들어 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium) 작용기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않고 지지체에 양의 전하를 제공하는 통상적인 양이온성 작용기라면 제한없이 사용될 수 있다. 강염기성의 음이온교환 그룹에는 예를 들어 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20) 및 TSKgel SuperQ-5PW를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 음이온교환수지를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 검출되는 베타-락타마제는 CTX-M 단백질이다.
보다 구체적으로는 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1 내지 CTX-M7, CTX-M9, CTX-M10, CTX-M12 내지 CTX-M17, CTX-M19 내지 CTX-M24, CTX-M27 내지 CTX-M38, CTX-M40 내지 CTX-M44, CTX-M46 내지 CTX-M56, CTX-M58 내지 CTX-M69, CTX-M71 내지 CTX-M77, CTX-M79 내지 CTX-M88, CTX-M90, CTX-M92, CTX-M93, CTX-M95 내지 CTX-M105, CTX-M110 내지 CTX-M117, CTX-M121 내지 CTX-M127, CTX-M129 내지 CTX-M132, CTX-M134, CTX-M136 내지 CTX-M139, CTX-M141, CTX-M142, CTX-M144, CTX-M146 내지 CTX-M148, CTX-M150, CTX-M155 내지 CTX-M159, CTX-M161 내지 CTX-M184, CTX-M186 내지 CTX-M204, CTX-M206 내지 CTX-M210, CTX-M212 내지 CTX-M216 및 CTX-M218 내지 CTX-M226으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이며, 가장 구체적으로는 CTX-M1, CTX-M14, CTX-M15, CTX-M27, CTX-M142 및 CTX-M186으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이다.
보다 더 구체적으로는, 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1, CTX-M3, CTX-M10, CTX-M15, CTX-M22, CTX-M23, CTX-M28, CTX-M32 내지 CTX-M34, CTX-M36, CTX-M42, CTX-M52 내지 CTX-M55, CTX-M58, CTX-M61, CTX-M62, CTX-M64, CTX-M69, CTX-M71, CTX-M72, CTX-M79, CTX-M80, CTX-M82, CTX-M88, CTX-M101, CTX-M103, CTX-M114, CTX-M116, CTX-M117, CTX-M123, CTX-M127, CTX-M132, CTX-M136, CTX-M138, CTX-M142, CTX-M144, CTX-M146, CTX-M150, CTX-M155 내지 CTX-M158, CTX-M166, CTX-M167, CTX-M169, CTX-M170, CTX-M172, CTX-M173, CTX-M175 내지 CTX-M184, CTX-M187 내지 CTX-M190, CTX-M193, CTX-M197, CTX-M199, CTX-M201 내지 CTX-M204, CTX-M206 내지 CTX-M209, CTX-M212, CTX-M216, CTX-M218, CTX-M220, CTX-M222 및 CTX-M225로 구성된 군으로부터 선택된다.
가장 구체적으로는, 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1, M14, M15, M27, M142 및 M186으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (a)는 상기 생물학적 시료에 계면활성제를 첨가함으로써 이루어진다.
본 발명은 단백질 분해효소를 이용한 절편화(fragmentation) 과정 없이도 전장 단백질에 대한 탑-다운(top-down) 방식의 직접 질량 분석이 가능함은 전술한 바와 같다. 본 발명자들은 분석하고자 하는 생물학적 시료에 계면활성제를 첨가할 경우 세포막 또는 세포질 내에 존재하는 온전한 상태의 전장 단백질이 포집(encapsulation)됨으로써 효소에 의한 무작위적인 단백질 분해 없이도 신속하고 정확하게 타겟 단백질을 동정할 수 있음을 발견하였다.
본 발명에서는 전장 단백질을 포집할 정도의 미포(micelle)를 형성할 수 있는 일반적인 계면활성제라면 이온성, 비이온성 및 양쪽이온성(zwitterionic) 계면활성제 모두 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 이온성 계면활성제는 예를 들어 DOC(Sodium Deoxycholate), 메디알란 A(Medialan A), 쿼터늄-60, 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride), 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpyridinium bromide), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimetylammoniumchloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimetylammonium bromide) 및 가디놀(Gardinol)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용될 수 있는 비이온성 계면활성제는 예를 들어 OG(n-octyl-β-D-glucopyranoside), OTG(n-octyl-β-D-thioglucopyranoside), OGNG(Octyl Glucose Neopentyl Glycol) 및 DDM(n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside), DDTM(n-Dodecyl-β-D-thiomaltopyranoside)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용될 수 있는 양쪽이온성 계면활성제는 예를 들어 코카미도프로필베타인, 라우라미도프로필베타인, 라우릴 베타인, 코코-베타인, 미리스틸베타인, 코코디메틸카복시메틸베타인, 라우릴디메틸카복시메틸베타인, 코카미도프로필 하이드록시설테인, 코코-하이드록시설테인, 코코-설테인, 에루카미도프로필 하이드록시설테인, 하이드록시설테인, 라우라미도프로필 하이드록시설테인, 라우릴 하이드록시설테인, 라우릴 설테인, 메톡시신나미도프로필 하이드록시설테인, 마이리스타미도프로필 하이드록시설테인, 올레아미도프로필 하이드록시설테인 및 탈로우아미도프로필 하이드록시설테인을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 계면활성제는 병원성 균주가 발현하는 단백질을 분리하기 위해 세포를 용해하는 단계에서 라이시스 완충액과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (b)는 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight) 질량분석, ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight) 질량분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 질량분석 방법을 이용하여 이루어진다.
보다 구체적으로는 MALDI-TOF 질량분석을 이용하여 이루어진다.
MALDI-TOF 질량분석은 매트릭스(matrix)로 지지되어 있는 시료에 레이져를 조사하여 탈착 및 이온화시킨 후, 생성된 이온들이 검출기에 도달하는데 소요되는 시간(Time-of-Flight)을 측정하여 이온들의 분자량을 분석하는 방법으로, 타겟 물질의 절편화(fragmentation)가 일어나지 않기 때문에 단백질과 같은 거대 생체분자의 질량을 신속하고 정확하게 측정할 수 있다. 이온화된 분자가 전기장에 의해 가속되고 비행시간이 측정되면 질량 대 전하 비율(mass-to-charge ratio)(m/z)이 생성되는데, 이러한 m/z 값을 통해 타겟 물질의 분자량을 측정할 수 있다. 예를 들어 m/z=30000 (z=+1) 또는 15000(z=+2)일 경우 분자량은 m/z × z = 30000이 된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 질량 분석 결과 28210, 28287, 28166, 28164, 28203, 28116, 27946, 28153, 28089, 27974, 28108, 27888, 27973, 27964, 28321, 27932, 28165, 28197, 28044, 27916, 28107, 28167, 28273, 28152, 28081, 28212, 28277, 28182, 28139, 28043, 27819, 27810, 28170, 28298, 28356, 28027, 28073, 28001, 28099, 28000, 27974, 28184, 28148, 28136, 28314, 28214, 28263, 28181, 28211, 28156, 28046, 28071, 27947, 28180, 28121, 28154, 28067, 28006, 28291, 28261, 28307, 28135, 28194, 27998, 28134, 27983, 27944, 27958, 28008, 28018, 28002, 28317, 27931, 28289, 28095, 28033, 27798, 28005, 28193, 28059, 28024, 27948, 28109, 28229, 28042, 27852, 28345, 28238, 27992, 28053, 28036, 28094, 28050, 27915, 28260, 28014, 28218, 28092, 28138, 28240, 28078, 28151, 28140, 28131, 28150, 27975, 27889, 27985, 28125, 28313, 28023, 28120, 28178, 28198, 28090, 27976, 28025, 28122, 28224, 27917 및 이들 값의 ±5 범위의 값으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질량 값(m/z × z)이 검출된 경우, 상기 생물학적 시료 내에는 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주가 존재하는 것으로 판정한다.
본 발명에 따르면, 상기 질량 값은 상술한 205개 CTX-M 단백질에서 N-말단의 28개 아미노산 잔기가 제거된 질량 값들이다. 따라서, 질량 분석 결과 이들 중 어느 하나 이상의 질량 값이 검출될 경우, 상술한 205개 CTX-M 단백질 중 하나 이상을 발현하는 균주, 즉 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주에 감염된 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 질량 값(m/z × z)은 각 질량 값에 16 또는 32만큼 증가된 질량 값을 추가적으로 포함한다.
하기 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명자들은 CTX-M 단백질 내 1개 또는 2개의 메티오닌 잔기가 산화된 상태로 존재할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 상기 나열된 질량 값에서 산소 원자 1개(16) 또는 2개(32) 만큼 증가된 분자량이 측정된 경우에도 역시 시료 내에 CTX-M 단백질을 발현하는 균주가 존재하는 것으로 판정함으로써, 본 발명은 균주의 베타-락탐계 항생제 내성을 보다 빈틈없이 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics) 내성 관련 단백질을 동정하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료 내에서 병원성 균주가 발현하는 단백질을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 단백질을 탑-다운(top-down) 방식을 통해 질량 분석을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 질량 분석 결과와 하기 표 1에 나열된 N-말단의 28개 아미노산 잔기가 제거된 베타-락타마제(β-lactamase)의 질량 값(m/z × z), 상기 질량 값의 ±5 범위 내의 값, 상기 질량 값에 16만큼 증가된 값 및 상기 질량 값에 32만큼 증가된 값으로 구성된 군으로부터 선택되는 질량 값을 비교하여 상기 생물학적 시료 내에 포함된 베타-락탐계 항생제 내성 관련 단백질의 종류를 판정하는 단계.
단백질 | 질량값 | 단백질 | 질량값 | 단백질 | 질량값 |
CTX-M1 | 28210 | CTX-M74 | 28291 | CTX-M159 | 27915 |
CTX-M2 | 28287 | CTX-M75 | 28287 | CTX-M161 | 28046 |
CTX-M3 | 28166 | CTX-M76 | 28261 | CTX-M162 | 28166 |
CTX-M4 | 28164 | CTX-M77 | 28307 | CTX-M163 | 28108 |
CTX-M5 | 28203 | CTX-M79 | 28135 | CTX-M164 | 28136 |
CTX-M6 | 28116 | CTX-M80 | 28194 | CTX-M165 | 28260 |
CTX-M7 | 28166 | CTX-M81 | 27998 | CTX-M166 | 28238 |
CTX-M9 | 27946 | CTX-M82 | 28134 | CTX-M167 | 28212 |
CTX-M10 | 28166 | CTX-M83 | 27983 | CTX-M168 | 28014 |
CTX-M12 | 28153 | CTX-M84 | 27944 | CTX-M169 | 28081 |
CTX-M13 | 28089 | CTX-M85 | 27958 | CTX-M170 | 28107 |
CTX-M14 | 27974 | CTX-M86 | 28008 | CTX-M171 | 28218 |
CTX-M15 | 28108 | CTX-M87 | 28018 | CTX-M172 | 28092 |
CTX-M16 | 27888 | CTX-M88 | 28089 | CTX-M173 | 28138 |
CTX-M17 | 27973 | CTX-M90 | 28002 | CTX-M174 | 27916 |
CTX-M19 | 27964 | CTX-M92 | 28317 | CTX-M175 | 28240 |
CTX-M20 | 28321 | CTX-M93 | 27931 | CTX-M176 | 28078 |
CTX-M21 | 27932 | CTX-M95 | 28289 | CTX-M177 | 28151 |
CTX-M22 | 28165 | CTX-M96 | 28095 | CTX-M178 | 28138 |
CTX-M23 | 28197 | CTX-M97 | 28287 | CTX-M179 | 28140 |
CTX-M24 | 28044 | CTX-M98 | 27944 | CTX-M180 | 28138 |
CTX-M27 | 27916 | CTX-M99 | 28033 | CTX-M181 | 28131 |
CTX-M28 | 28107 | CTX-M100 | 27798 | CTX-M182 | 28136 |
CTX-M29 | 28108 | CTX-M101 | 28134 | CTX-M183 | 28135 |
CTX-M30 | 28167 | CTX-M102 | 27974 | CTX-M184 | 28095 |
CTX-M31 | 28273 | CTX-M103 | 28135 | CTX-M186 | 28108 |
CTX-M32 | 28152 | CTX-M104 | 28001 | CTX-M187 | 28170 |
CTX-M33 | 28081 | CTX-M105 | 28002 | CTX-M188 | 28138 |
CTX-M34 | 28212 | CTX-M110 | 28089 | CTX-M189 | 28078 |
CTX-M35 | 28277 | CTX-M111 | 28005 | CTX-M190 | 28150 |
CTX-M36 | 28182 | CTX-M112 | 27944 | CTX-M191 | 27975 |
CTX-M37 | 28139 | CTX-M113 | 28002 | CTX-M192 | 27944 |
CTX-M38 | 28043 | CTX-M114 | 28108 | CTX-M193 | 28138 |
CTX-M40 | 27819 | CTX-M115 | 28317 | CTX-M194 | 28108 |
CTX-M41 | 27810 | CTX-M116 | 28193 | CTX-M195 | 27889 |
CTX-M42 | 28170 | CTX-M117 | 28139 | CTX-M196 | 27985 |
CTX-M43 | 28298 | CTX-M121 | 27946 | CTX-M197 | 28094 |
CTX-M44 | 28356 | CTX-M122 | 28059 | CTX-M198 | 27974 |
CTX-M46 | 28027 | CTX-M123 | 28121 | CTX-M199 | 28125 |
CTX-M47 | 28073 | CTX-M124 | 28287 | CTX-M200 | 28313 |
CTX-M48 | 28001 | CTX-M125 | 28024 | CTX-M201 | 28023 |
CTX-M49 | 28099 | CTX-M126 | 27948 | CTX-M202 | 28120 |
CTX-M50 | 28000 | CTX-M127 | 28109 | CTX-M203 | 28194 |
CTX-M51 | 27974 | CTX-M129 | 27944 | CTX-M204 | 28178 |
CTX-M52 | 28184 | CTX-M130 | 28024 | CTX-M206 | 28139 |
CTX-M53 | 28148 | CTX-M131 | 28229 | CTX-M207 | 28166 |
CTX-M54 | 28197 | CTX-M132 | 28042 | CTX-M208 | 28166 |
CTX-M55 | 28136 | CTX-M134 | 27946 | CTX-M209 | 28120 |
CTX-M56 | 28314 | CTX-M136 | 28194 | CTX-M210 | 28138 |
CTX-M58 | 28214 | CTX-M137 | 27852 | CTX-M212 | 28198 |
CTX-M59 | 28263 | CTX-M138 | 28184 | CTX-M213 | 28090 |
CTX-M60 | 28181 | CTX-M139 | 28108 | CTX-M214 | 27976 |
CTX-M61 | 28211 | CTX-M141 | 28345 | CTX-M215 | 28025 |
CTX-M62 | 28156 | CTX-M142 | 28107 | CTX-M216 | 28138 |
CTX-M63 | 28046 | CTX-M144 | 28152 | CTX-M218 | 28122 |
CTX-M64 | 28081 | CTX-M146 | 28238 | CTX-M219 | 27976 |
CTX-M65 | 28071 | CTX-M147 | 27992 | CTX-M220 | 28139 |
CTX-M66 | 28166 | CTX-M148 | 28053 | CTX-M221 | 27900 |
CTX-M67 | 27947 | CTX-M150 | 28167 | CTX-M222 | 28224 |
CTX-M68 | 28180 | CTX-M155 | 28036 | CTX-M223 | 27917 |
CTX-M69 | 28121 | CTX-M156 | 28094 | CTX-M224 | 28108 |
CTX-M71 | 28154 | CTX-M157 | 28050 | CTX-M225 | 28138 |
CTX-M72 | 28067 | CTX-M158 | 28238 | CTX-M226 | 28136 |
CTX-M73 | 28006 |
본 발명의 생물학적 시료, 항생제 내성 관련 단백질 및 이의 질량측정 방법에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명은 N-말단이 제거된 특정 기준(reference) 질량 값을 제공함으로써 균주가 베타-락탐계 항생제 내성을 가지는지 여부 뿐 아니라 어떠한 종류의 내성 단백질을 발현하는지에 대한 정보도 제공한다. 이러한 정보를 통해 각 내성 단백질의 베타-락탐계 항생제 분해력, 생체 내 활성, 반감기 및 프로테아제에 의한 분해 여부 등을 참조하여, 환자에 대한 보다 구체적인 항생제 투여전략을 수립할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics)에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 검출 방법과, 생물학적 시료 내 포함된 베타-락탐계 항생제 내성 관련 단백질을 동정하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 질량분석법을 통해 N-말단이 절단된 ESBL(Extended Spectrum β-Lactamase) 단백질을 직접적으로 확인함으로써 병원성 균주의 항생제 내성 여부는 물론 내성관련 단백질의 종류까지 신속하고 정확하게 판별할 수 있어, 감염 초기에 적절한 항생제 투여전략을 신속하게 수립하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 항생제 내성 균주 유래 CTX-M 단백질의 발현 및 크기에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 임상균주 유래 CTX-M 단백질과 임상균주 유래 유전자를 포함한 재조합 균주에서의 단백질 발현 및 크기에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도면 3은 시료 전처리시, 계면활성제 종류에 따른 조추출액과 조효소액의 단백질 차이를 비교한 결과이다.
도 4는 이온 크로마토그래피를 사용한 타겟 단백질의 분리와 정제 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 MS-GF+로 동정된 CTX-M 단백질의 펩타이드를 나타내는 그림으로, 동정된 각 펩타이드의 위치 및 서열 정보펩타이드 정보를 나타낸 표(도 5a) 및 균주에서 동정되는 대표적 CTX-M 단백질들의 동정 범위(회색)와 산화되는 메티오닌 잔기들(볼드체 밑줄)을 비교하여 나타낸 정렬 결과(도 5b)를 각각 보여준다.
도 6은 CTX의 N-말단 및 C-말단으로 동정된 펩타이드의 텐덤 스펙트럼 결과로서, CTX-M 펩타이드의 분리 크로마토그램(도 6a), CTX-M의 C-말단 펩타이드 동정 결과(도 6b) 및 CTX-M의 N-말단 펩타이드 동정 결과(도 6c)를 각각 나타낸다.
도 7은 Clustal Omega 프로그램을 사용한 CTX-M 단백질 아미노산 서열의 다중 정렬(multiple alignment) 분석결과와 보존적 아미노산 서열의 동정 결과의 예시를 보여주는 그림이다.
도 8은 고분해능 질량분석기를 이용한 단백질 동정 결과를 보여주는 그림으로, CTX-M 단백질의 용출 크로마토그램 (RT 23.63분에 용출)(도 8a), 다중 전하된 CTX-M 단백질의 질량 스펙트럼(단일 동위원소 질량 - 28,192 m/z × z, 평균분자량 - 28,210 m/z × z)(도 8b) 및 25가의 CTX-M 단백질 이온에 대한 텐덤 스펙트럼과 29-291 서열에 대한 동정 결과 (위/평균분자량 - 28,210 m/z × z: E = 1.3E-27, 아래/평균분자량 28,210+32 m/z × z: E = 2.36E-25)의 일 예(도 8c)를 각각 나타낸다.
도 9는 저분해능 질량분석기(MALDI-TOF)를 이용한 CTX-M 단백질 질량분석 스펙트럼의 일 예를 보여주는 그림이다.
도 2는 임상균주 유래 CTX-M 단백질과 임상균주 유래 유전자를 포함한 재조합 균주에서의 단백질 발현 및 크기에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도면 3은 시료 전처리시, 계면활성제 종류에 따른 조추출액과 조효소액의 단백질 차이를 비교한 결과이다.
도 4는 이온 크로마토그래피를 사용한 타겟 단백질의 분리와 정제 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 MS-GF+로 동정된 CTX-M 단백질의 펩타이드를 나타내는 그림으로, 동정된 각 펩타이드의 위치 및 서열 정보펩타이드 정보를 나타낸 표(도 5a) 및 균주에서 동정되는 대표적 CTX-M 단백질들의 동정 범위(회색)와 산화되는 메티오닌 잔기들(볼드체 밑줄)을 비교하여 나타낸 정렬 결과(도 5b)를 각각 보여준다.
도 6은 CTX의 N-말단 및 C-말단으로 동정된 펩타이드의 텐덤 스펙트럼 결과로서, CTX-M 펩타이드의 분리 크로마토그램(도 6a), CTX-M의 C-말단 펩타이드 동정 결과(도 6b) 및 CTX-M의 N-말단 펩타이드 동정 결과(도 6c)를 각각 나타낸다.
도 7은 Clustal Omega 프로그램을 사용한 CTX-M 단백질 아미노산 서열의 다중 정렬(multiple alignment) 분석결과와 보존적 아미노산 서열의 동정 결과의 예시를 보여주는 그림이다.
도 8은 고분해능 질량분석기를 이용한 단백질 동정 결과를 보여주는 그림으로, CTX-M 단백질의 용출 크로마토그램 (RT 23.63분에 용출)(도 8a), 다중 전하된 CTX-M 단백질의 질량 스펙트럼(단일 동위원소 질량 - 28,192 m/z × z, 평균분자량 - 28,210 m/z × z)(도 8b) 및 25가의 CTX-M 단백질 이온에 대한 텐덤 스펙트럼과 29-291 서열에 대한 동정 결과 (위/평균분자량 - 28,210 m/z × z: E = 1.3E-27, 아래/평균분자량 28,210+32 m/z × z: E = 2.36E-25)의 일 예(도 8c)를 각각 나타낸다.
도 9는 저분해능 질량분석기(MALDI-TOF)를 이용한 CTX-M 단백질 질량분석 스펙트럼의 일 예를 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. ESBL 유전자의 클로닝 및 항생제 내성 균주의 제작
E. coli 유래 ESBL 단백질에 대한 유전자로부터 얻어진 CTX-M 유전자 서열(유럽분자생물학연구소(EMBL) 염기서열데이터베이스 식별번호: CP008736.1, 876nt) (서열목록 제1서열)의 정보를 기반으로 다음과 같은 올리고 뉴클레오티드를 제작하였다.
프라이머 1: 5’- AACTGCAGGATGGTTAAAAAATCACTGCGTCAG -3’(33 nt)
프라이머 2: 5’- GGAATTCTCACAAACCGTTGGTGACGATT -3’(29 nt)
올리고뉴클레오티드는 클로닝을 위해 제한효소 사이트를 추가했고, 클로닝 벡터에서 직접적으로 발현을 유도하기 위하여 ORF(Open Reading Frame)를 맞추어 제작했다.
CTX-M 주형 DNA로부터 PCR을 통해 타겟 유전자를 증폭하였다. PCR 수행시, 반응액은 주형 DNA 3μl, 5’프라이머 1.25 ul, 3’프라이머 1.25μl, dNTPs 1μl, 5X 버퍼 10μl를 사용하여 총 50μl PCR 반응액으로 만든 후, PCR을 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 1) 변성(Denaturation)-98℃에서 10초; 2) 어닐링(Annealing)- 57℃에서 30초; 3) 확장(Extension)- 72℃에서 30초. 타겟 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 제작을 위한 클로닝은 다음과 같이 시행하였다; 1) 삽입유전자와 벡터는 제한효소를 사용하여 DNA의 양쪽 끝을 점착성 말단(Sticky end)으로 절단하고, 2) DNA 라이게이즈 효소를 사용하여 삽입 유전자를 벡터에 접합하였다. 3) 그 후에, 대장균(E. coli Top10)에 형질전환하고, 4) White/Blue 스크린 방법으로 재조합 대장균을 선별하였다. 5) 선별된 균주로부터 재조합 플라스미드를 추출하였고, 6) 추출된 플라스미드는 제한효소를 처리하여 DNA 크기를 확인하였다. 7) 최종적으로 DNA 염기서열 분석을 통해 삽입 유전자를 확인하였다.
실시예 2. 타겟 단백질 발현 및 크기 확인
타겟 유전자를 포함한 플라스미드의 형질전환한 대장균은 50mg/L의 암피실린 항생제가 포함된 Luria-bertani 액체배지에 접종하고, 37℃에서 16시간이상 배양하였다. 타겟 단백질의 발현과 크기를 확인하기 위해 배양액은 4,000rpm에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 제거하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 SDS-샘플 완충액을 넣고 95℃에서 5분 동안 가열한 뒤, 15,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 준비된 샘플을 사용하여 SDS-PAGE 젤 분석을 통해 타겟 단백질의 발현과 크기를 확인하였다(도 1).
실시예 3. 시료 전처리 방법 및 조효소액으로부터의 타겟 단백질 확인
(1) 비이온성 계면활성제를 이용한 시료 전처리
시료 전처리를 위해 배양액은 4,000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하여 세포를 수확하였다. 조추출액을 확보하기 위해 완충용액(0.25 mM Tris-HCl, 2% OG)을 처리하고 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 만들어진 조추출액은 4℃에서 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액(이하, 조효소액)과 침전물로 분리하였다. 조효소액으로부터 SDS-PAGE 분석을 통해 타겟 단백질의 발현과 크기를 확인하였다(도 2).
(2) 이온성 계면활성제를 이용한 시료 전처리
다음의 단계로 시료 전처리를 수행하였다: 1) 발현된 세포배양액 100μl를 원심분리하여 세포를 회수하고, 2) 상등액을 제거한 후, 비이온성 계면활성제인 DOC(Sodium Deoxycholate) 2%를 포함한 완충용액(0.25 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 2% DOC)을 첨가하였다. 3) 혼탁액은 10분간 상온에서 인큐베이션하고 4) 4℃에서 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 조효소액을 확보하였다.
비이온성 계면활성제(OG)와 이온성 계면활성제(DOC)를 처리한 조추출액과 조효소액은 각각 SDS-PAGE 젤 분석을 통하여 단백질의 발현 및 크기를 확인하였다(도 3).
실시예 4. 임상균주 유래 CTX-M의 유전형 확인 및 단백질 확인
임상균주 유래 CTX-M을 확인하기 위해 ESBL 양성으로 확인된 균주를 수집하였다. 수집된 균주는 CTX-M 유전자 증폭에 사용한 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 이를 통해 증폭된 PCR 산물은 한천젤 전기영동을 통해 타겟 유전자의 크기를 확인하였다. 크기가 확인된 PCR산물은 DNA 염기서열분석을 통하여 정확한 CTX-M 유전자의 유전형을 확인하였다.
유전형이 확인된 균주는 LB 액체배지를 사용하여 배양하였고, SDS-PAGE 겔 분석을 통해 CTX-M 단백질의 발현유무를 확인하였다. 또한 기존의 CTX-M 유전자를 내포하는 백터를 포함한 재조합 균주와 동일하게 임상균주 유래 CTX-M 유전자를 포함하는 재조합균주를 제작하고 재조합 균주도 임상균주와 동일하게 SDS-PAGE 젤 분석을 통하여 실제 발현된 CTX-M 단백질의 크기를 확인하였다(도 3).
실시예 5. 타겟 단백질 분리/정제
타겟 단백질을 분리/정제하기 위해 이온교환 크로마토그래피를 사용하였다. 이온교환 수지는 Q-레진을 사용하였고, Q-레진이 포함된 컬럼에 조효소액 500μl를 로딩한 뒤 용출되는 용액을 수집하였다. 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 완충용액 1 ml을 사용하여 세척하고, 1M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 완충용액으로 용출하였다. 단계별 수집된 샘플을 SDS-PAGE 젤을 사용하여 분리/정제된 구획을 확인하였다(도 4). 최종적으로, 위와 같은 방법을 사용하여 세포 파쇄액으로부터 순도 높은 CTX-M 단백질을 분리/정제하였다.
실시예 6. 타겟 단백질의 확인 발현 및 크기 확인
SDS-PAGE 겔에서 발현과 크기가 확인된 단백질은 In-gel digestion 방법과 nano-LC-MS/MS 방법을 사용하여 동정함으로써 실제로 균주에서 발현된 항생제 내성 단백질의 종류를 확인하였다(도 5).
(1) In-Gel Digestion
SDS-PAGE 겔에서 타겟 단백질 크기에 해당하는 밴드부분만 확보하고, 염색되어 있는 겔을 탈색(destain)하였다. 탈색된 겔은 환원/알킬화(Reduction/ alkylation) 과정을 거친 후, 트립신 효소를 사용하여 단백질을 선택적으로 절단(digestion)하였다. 절단된 펩타이드를 회수하고 DK-Tip(C18 Tip)을 사용하여 탈염하였다.
(2) nano-LC-MS/MS
균주 내에서 발현되는 활성 단백질(Active protein)의 서열 및 범위를 확인하기 위해 나노액체크로마토그래피 및 고분해능 질량분석을 수행하였다(Q-Exactive HF-X 질량분석기 시스템). 탈염된 펩타이드 시료를 0.1% 포름산 용액으로 용해시킨 후, 컬럼에 시료를 주입하였다. C18 컬럼(75μm x 70cm)과 나노유속 액상 크로마토그래피를 이용하여 펩타이드 시료를 분리하였다. 이때 사용한 시료 로딩 및 분리용 구배(gradient) 조건은 다음과 같다:
- 버퍼 A: 물 내의 0.1% 포름산/ 버퍼 B: 아세토니트릴 내의 0.1% 포름산
- 시료 로딩: 0 - 5분, 5%(B), 유속 5μL/min
- 분리 농도 구배:
5 - 7분, 5%에서 10%(B), 유속 300nL/min
7 - 38분, 10%에서 40%(B), 유속 300nL/min
38 - 38.5분, 40%에서 80%(B), 유속 300nL/min
38.5 - 39.5분, 80%(B), 유속 300nL/min
39.5 - 40분, 80%에서 5%(B), 유속 300nL/min
40 - 60분, 5%(B), 유속 300nL/min
이때 사용된 질량분석기의 파라미터는 다음과 같다:
-분해능: Full MS 60,000, MS2 30,000
-Full MS: 350~2,000 m/z, 100 msec
-MS2: 50 msec, NCE 28, 1, >6가로 이온화 물질은 MS2 대상에서 제외
Bottom-up 데이터로 펩타이드 및 단백질을 동정하기 위한 소프트웨어는 미국 샌디에이고 주립대에서 개발한‘MS-GF+’서치엔진을 활용하였으며, 단백질/펩타이드 동정은 FDR(false discovery rate) 1%를 기준으로 선별하였다. E. Coli 유래 단백질 중에서 CTX-M 단백질이 동정되었으며, 143개의 펩타이드가 동정되었다(총 90.38% 커버리지). 6개의 메티오닌 잔기(71, 78, 120, 138, 189, 214) 중 1개 또는 2개의 메티오닌이 산화된 형태의 펩타이드도 동시에 동정되었다. 특이하게도, 1-28번 잔기의 N-말단 서열 펩타이드는 검출되지 않았으며, 이 1-28번을 제외한 서열을 고려했을 때 모든 서열 범위에 걸친 펩타이드가 동정되어 커버리지는 100%로 확인되었다 (도 5b, 회색 바탕).
(3) N-말단 및 N-말단 서열의 동정 (도 7)
- N말단 서열: (A)/QTADVQQK (semi-tryptic)
- C말단 서열: (R)/RDVLASAAKIVTNGL- (semi-tryptic)
실시예 7. CTX-M 단백질의 아미노산서열 분석 및 특성 확인
상기 실시예 3의 MS2 결과를 바탕으로, 현재까지 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 알려진 전체 205개의 CTX-M 단백질에 대한 다중정렬 분석을 수행하였다(도 8). 그 결과, 전체 아미노산 서열이 97.6%이상 보존된 CTX-M 단백질은 98개로 확인되었고, CTX-M-1과 동일한 N-말단 펩타이드(1-28 a.a)를 포함한 CTX-M 단백질은 82개로 확인되었다. 확인된 82개의 단백질은 모두 291개 아미노산 서열로 구성된 특징을 보여준다.
실시예 8. 질량 분석법을 이용한 타겟 단백질 동정 (Top-down 방법)
균주에서 발현되는 활성 단백질(Active protein)의 질량값을 확인하기 위한 Top-Down 질량분석을 진행하였다. 정확한 단백질의 질량 값을 확인하기 위해서 균주 유래 조 단백질 추출액을 사용하였으며 Top-Down용 LC-MS/MS 시스템(Nano-LC 및 Q-Exactive HF-X 질량분석기 시스템)을 활용하였다.
(1) 조 단백질 추출액의 분리
단백질 시료 약 0.1μg을 1% 포름산 용액과 1:1로 혼합하여 대략 pH3으로 조절한 뒤, 컬럼에 시료를 주입하였다. PLRP-S 레진을 충진한 컬럼(150μm x 20cm)과 나노유속 액상 크로마토그래피법을 이용하여 조 단백질 추출액을 분리하였다. 이때 사용한 시료 로딩 및 분리용 구배(gradient) 조건은 다음과 같다.
- 버퍼 A: 물 내의 0.1% 포름산/ 버퍼 B: 아세토니트릴 내의 0.1% 포름산
- 시료 로딩: 0 - 10분, 5%(B), 유속 5μL/min
- 분리 농도 구배:
10 - 10.01분, 5%에서 10%(B), 유속 300nL/min
10.01- 40분, 10%에서 40%(B), 유속 300nL/min
40 - 41분, 40%에서 80%(B), 유속 300nL/min
41 - 42분, 80%(B), 유속 300nL/min
42 - 43분, 80%에서 5%(B), 유속 300nL/min
43 - 60분, 5%(B), 유속 300nL/min
(2) 고분해능 질량분석기를 이용한 CTX-M 단백질 질량분석
Q-Exactive HF-X 질량분석기의 Protein Mode Analysis 방법을 이용하여 온전한(Intact) 단백질의 질량값과 단백질들의 텐덤 스펙트럼을 얻어 동정하였다(도 5). 이때 사용된 파라미터는 다음과 같다.
- 분해능: Full MS 240,000, MS2 120,000으로 사용
- Full MS: 620~2,400 m/z, 100 msec
- MS2: 1 마이크로스캔 사용, 1,000 msec, NCE 50, 1~8가로 이온화 물질은 MS2 대상에서 제외함.
Top-Down 데이터로 단백질을 동정하기 위한 소프트웨어는 미국 PNNL (Pacific Northwest National Laboratory)에서 개발한‘Informed Proteomics’를 활용하였다. 23.63분경에 다중 하전된 CTX-M 단백질 피크들이 여럿 확인되었으며 (도 5), 해당 피크를 역합성곱(deconvolution)하여 수득한 대표적 질량값은 평균분자량 28,209.69 m/z × z, 단일 동위원소 질량(Monoisotopic mass)으로는 28,192.69 m/z × z로 확인되었다. 또한, 메티오닌 산화로 발생한 다른 피크들이 관측되었다(예를 들어, 2개의 메티오닌이 산화된 폴리펩타이드의 경우 평균분자량 28,210+32 m/z × z로 나타남). 이들은 In-Gel Digestion(Bottom-up방식)을 통해 얻은 CTX 단백질 범위(29-291 a.a.) 내 산화된 메티오닌 잔기위치(71, 78, 120, 138, 189, 214)와 부분적으로 일치하였다. Top-down 방식의 분석에서도 1-29의 N말단 서열을 포함한 폴리펩타이드는 관측되지 않았다.
(3) 저분해능 질량분석기를 이용한 CTX-M 단백질 질량분석
Bruker Biotyper MALDI-TOF MS 장비를 활용하여 CTX-M 단백질의 질량분석 스펙트럼을 얻었다. 먼저, SA(Sinapinic acid, 0.1% TFA/50% 아세토니트릴 내 10mg/mL으로 존재) 매트릭스 1μL와 약 100ng의 정도의 CTX-M 단백질을 플레이트 spot 위에 올려놓고, 완전 건조시켜 질량분석을 실시하였다. 이때 사용한 에너지는 최대 30%, 무작위 위치 수득(random position acquisition)을 수행하였으며, 40 shot씩 총 2,000 shot의 레이저를 조사하고 각 스펙트럼 데이터를 누적하여 수득하였다. 10,000에서부터 40,000 m/z 구간의 범위에 대하여 질량분석 스펙트럼을 얻었으며, +1가의 CTX-M은 물론 +2가의 CTX-M 단백질도 동시에 검출하였다(도 9).
(4) CTX-M 단백질들의 질량값 비교
상기의 방법을 통하여 CTX-M 단백질의 정확한 질량값을 확인하였고, 확인된 질량값을 바탕으로 N-말단 펩타이드가 제거된 활성 CTX-M 단백질의 질량값을 확인할 수 있었다. 따라서 NCBI에서 확인된 모든 CTX-M 단백질은 고분해능 또는 저분해능 질량분석기를 통하여 활성 단백질(Active protein)의 정확한 질량값을 확인할 수 있고, 질량분석을 통하여 다양한 종류의 CTX-M 단백질에 대한 신속/정확한 동정이 가능하다(표 2).
CTX -M | 전장 CTX-M 단백질 | 활성형 단백질 | |||||||
Da | 평균 분자량 | 단일동위원소질량 | PI | Da | 평균 분자량 | 단일동위원소질량 | PI | 제거된 N 말단 | |
1 | 31246 | 31245.69 | 31226.29 | 9.25 | 28210 | 28209.95 | 28192.58 | 8.63 | 1-28aa |
2 | 31378 | 31377.79 | 31358.23 | 8.91 | 28287 | 28287.02 | 28269.62 | 7.99 | 1-28aa |
3 | 31202 | 31201.64 | 3118.26 | 9.25 | 28166 | 28165.90 | 28148.55 | 8.63 | 1-28aa |
4 | 31255 | 31254.52 | 31235.00 | 7.86 | 28164 | 28163.75 | 28146.39 | 6.59 | 1-28aa |
5 | 31294 | 31293.67 | 31274.17 | 9.12 | 28203 | 28202.90 | 28185.57 | 8.60 | 1-28aa |
6 | 31207 | 31206.51 | 31187.07 | 8.61 | 28116 | 28115.74 | 28098.46 | 7.15 | 1-28aa |
7 | 31202 | 31201.64 | 31182.25 | 9.10 | 28166 | 28165.90 | 28148.54 | 7.99 | 1-28aa |
9 | 30951 | 30951.32 | 30932.03 | 9.09 | 27946 | 27945.57 | 27928.42 | 8.02 | 1-28aa |
10 | 31202 | 31201.64 | 31182.25 | 9.10 | 28166 | 28165.90 | 28148.54 | 7.99 | 1-28aa |
12 | 31159 | 31158.61 | 31139.26 | 9.25 | 28153 | 28152.90 | 28135.55 | 8.63 | 1-28aa |
13 | 31127 | 31126.57 | 31107.10 | 9.07 | 28089 | 28088.76 | 28071.52 | 8.01 | 1-28aa |
14 | 30979 | 30979.38 | 30960.06 | 9.09 | 27974 | 27973.62 | 27959.46 | 8.02 | 1-28aa |
15 | 31144 | 31143.60 | 31124.26 | 9.38 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
16 | 30893 | 30893.29 | 30874.28 | 9.27 | 27888 | 27887.53 | 27870.42 | 8.70 | 1-28aa |
17 | 30978 | 30978.43 | 30959.11 | 9.39 | 27973 | 27972.68 | 27955.51 | 9.02 | 1-28aa |
19 | 30969 | 30969.34 | 30950.04 | 9.09 | 27964 | 27963.58 | 27946.44 | 8.02 | 1-28aa |
20 | 31412 | 31411.81 | 31392.21 | 8.91 | 28321 | 28321.04 | 28303.61 | 7.99 | 1-28aa |
21 | 30897 | 30897.17 | 30877.98 | 9.21 | 27932 | 27931.54 | 27914.41 | 8.02 | 1-28aa |
22 | 31201 | 31200.65 | 31181.28 | 9.38 | 28165 | 28164.91 | 28147.57 | 8.95 | 1-28aa |
23 | 31233 | 31232.70 | 31213.30 | 9.38 | 28197 | 28196.96 | 28179.59 | 8.95 | 1-28aa |
24 | 31048 | 31048.48 | 31029.13 | 9.27 | 28044 | 28043.73 | 28025.53 | 8.70 | 1-28aa |
27 | 30921 | 30921.34 | 30902.06 | 9.27 | 27916 | 27915.59 | 27898.45 | 8.70 | 1-28aa |
28 | 31143 | 31142.62 | 31123.27 | 9.49 | 28107 | 28106.88 | 28089.56 | 9.16 | 1-28aa |
29 | 31114 | 31113.58 | 31094.25 | 9.38 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
30 | 31173 | 31172.60 | 31153.24 | 9.10 | 28167 | 28166.88 | 28149.53 | 7.99 | 1-28aa |
31 | 31364 | 31363.76 | 31344.21 | 8.91 | 28273 | 28272.99 | 28255.61 | 7.99 | 1-28aa |
32 | 31188 | 31187.66 | 31168.28 | 9.38 | 28152 | 28151.92 | 28134.57 | 8.95 | 1-28aa |
33 | 31117 | 31116.58 | 31097.25 | 9.28 | 28081 | 28080.84 | 28063.53 | 8.95 | 1-28aa |
34 | 31248 | 31247.72 | 31228.24 | 9.00 | 28212 | 28211.98 | 28194.53 | 7.91 | 1-28aa |
35 | 31368 | 31367.75 | 31348.21 | 8.91 | 28277 | 28276.98 | 28259.60 | 7.99 | 1-28aa |
36 | 31218 | 31217.64 | 31198.26 | 9.25 | 28182 | 28181.90 | 28164.54 | 8.63 | 1-28aa |
37 | 31149 | 31148.53 | 31129.20 | 8.90 | 28139 | 28138.83 | 28121.49 | 6.95 | 1-28aa |
38 | 31048 | 31048.48 | 31029.13 | 9.27 | 28043 | 28042.73 | 28025.53 | 8.70 | 1-28aa |
40 | 31065 | 31065.43 | 31046.01 | 8.45 | 27819 | 27819.40 | 27802.30 | 5.97 | 1-28aa |
41 | 31046 | 31045.52 | 31025.98 | 8.96 | 27810 | 27810.46 | 27793.28 | 6.95 | 1-28aa |
42 | 31206 | 31205.63 | 31186.26 | 9.25 | 28170 | 28169.89 | 28152.54 | 8.63 | 1-28aa |
43 | 31389 | 31388.86 | 31369.29 | 9.27 | 28298 | 28298.09 | 28280.69 | 8.91 | 1-28aa |
44 | 31447 | 31446.90 | 31427.30 | 9.12 | 28356 | 28356.13 | 28338.69 | 8.60 | 1-28aa |
46 | 31032 | 31032.44 | 31013.09 | 9.09 | 28027 | 28026.69 | 28009.48 | 8.02 | 1-28aa |
47 | 31079 | 31078.51 | 31059.14 | 9.27 | 28073 | 28072.76 | 28055.54 | 8.70 | 1-28aa |
48 | 31006 | 31006.40 | 30987.07 | 9.09 | 28001 | 28000.65 | 27983.47 | 8.02 | 1-28aa |
49 | 31105 | 31104.55 | 31085.16 | 9.27 | 28099 | 28098.80 | 28081.55 | 8.70 | 1-28aa |
50 | 31005 | 31005.41 | 30986.08 | 9.09 | 28000 | 27999.66 | 27982.47 | 8.02 | 1-28aa |
51 | 30979 | 30979.38 | 30960.06 | 9.09 | 27974 | 27973.62 | 27956.46 | 8.02 | 1-28aa |
52 | 31220 | 31219.65 | 31200.27 | 9.25 | 28184 | 28183.91 | 28166.56 | 8.63 | 1-28aa |
53 | 31184 | 31183.71 | 31164.31 | 9.25 | 28148 | 28147.97 | 28130.60 | 8.63 | 1-28aa |
54 | 31233 | 31232.65 | 31213.27 | 9.25 | 28197 | 28196.91 | 28179.56 | 8.63 | 1-28aa |
55 | 31172 | 31171.66 | 31152.29 | 9.38 | 28136 | 28135.92 | 28118.58 | 8.95 | 1-28aa |
56 | 31405 | 31404.81 | 31385.24 | 8.91 | 28314 | 28314.05 | 28296.63 | 7.99 | 1-28aa |
58 | 31250 | 31249.68 | 31230.28 | 9.25 | 28214 | 28213.94 | 28196.57 | 8.63 | 1-28aa |
59 | 31354 | 31353.81 | 31334.25 | 8.91 | 28263 | 28263.04 | 28245.65 | 7.99 | 1-28aa |
60 | 31187 | 31186.67 | 31167.29 | 9.25 | 28181 | 28180.95 | 28163.59 | 8.63 | 1-28aa |
61 | 31247 | 31246.68 | 31227.27 | 9.10 | 28211 | 28210.94 | 28193.56 | 7.99 | 1-28aa |
62 | 31192 | 31191.60 | 31172.24 | 9.25 | 28156 | 28155.86 | 28138.53 | 8.63 | 1-28aa |
63 | 31092 | 31092.46 | 31073.02 | 8.45 | 28046 | 28045.63 | 28028.41 | 5.97 | 1-28aa |
64 | 31117 | 31116.61 | 31097.31 | 9.30 | 28081 | 28080.86 | 28063.60 | 8.66 | 1-28aa |
65 | 31077 | 31076.54 | 31057.16 | 9.27 | 28071 | 28070.79 | 28053.56 | 8.70 | 1-28aa |
66 | 31229 | 31228.67 | 31209.27 | 9.25 | 28166 | 28165.90 | 28148.55 | 8.63 | 1-28aa |
67 | 30952 | 30952.35 | 30933.05 | 9.09 | 27947 | 27946.60 | 27929.45 | 8.02 | 1-28aa |
68 | 31190 | 31189.63 | 31170.27 | 9.27 | 28180 | 28179.93 | 28162.57 | 8.63 | 1-28aa |
69 | 31157 | 31156.60 | 31137.25 | 9.40 | 28121 | 28120.86 | 28103.54 | 8.97 | 1-28aa |
71 | 31190 | 31189.69 | 31170.24 | 9.30 | 28154 | 28153.95 | 28136.53 | 8.84 | 1-28aa |
72 | 31103 | 31102.50 | 31083.18 | 9.10 | 28067 | 28066.76 | 28049.47 | 7.99 | 1-28aa |
73 | 31011 | 31011.44 | 30992.03 | 9.09 | 28006 | 28005.68 | 27988.43 | 8.02 | 1-28aa |
74 | 31382 | 31381.78 | 31362.22 | 8.91 | 28291 | 28291.01 | 28273.62 | 7.99 | 1-28aa |
75 | 31368 | 31367.75 | 31348.21 | 8.91 | 28287 | 28287.02 | 28269.62 | 7.99 | 1-28aa |
76 | 31352 | 31351.71 | 31332.18 | 8.91 | 28261 | 28260.94 | 28243.57 | 7.99 | 1-28aa |
77 | 31398 | 31397.86 | 31378.29 | 9.25 | 28307 | 28307.09 | 28289.69 | 8.89 | 1-28aa |
79 | 31171 | 31170.67 | 31151.30 | 9.49 | 28135 | 28134.93 | 28117.59 | 9.16 | 1-28aa |
80 | 31230 | 31229.69 | 31210.29 | 9.25 | 28194 | 28193.95 | 28176.58 | 8.63 | 1-28aa |
81 | 31003 | 31003.31 | 30983.99 | 7.77 | 27998 | 27997.56 | 27980.38 | 5.97 | 1-28aa |
82 | 31170 | 31169.64 | 31150.27 | 9.38 | 28134 | 28133.90 | 28116.56 | 8.95 | 1-28aa |
83 | 30988 | 30988.39 | 30969.06 | 9.09 | 27983 | 27982.63 | 27965.46 | 8.03 | 1-28aa |
84 | 30949 | 30949.35 | 30930.05 | 9.09 | 27944 | 27943.60 | 27926.45 | 8.02 | 1-28aa |
85 | 30963 | 30963.33 | 30944.03 | 9.09 | 27958 | 27957.58 | 27940.42 | 8.02 | 1-28aa |
86 | 31013 | 31013.39 | 30994.05 | 9.09 | 28008 | 28007.64 | 27990.44 | 8.02 | 1-28aa |
87 | 31023 | 31023.47 | 31004.12 | 9.09 | 28018 | 28017.72 | 28000.52 | 8.02 | 1-28aa |
88 | 31125 | 31124.56 | 31105.21 | 9.25 | 28089 | 28088.82 | 28071.50 | 8.63 | 1-28aa |
90 | 31007 | 31007.43 | 30988.09 | 9.09 | 28002 | 28001.68 | 27984.49 | 8.02 | 1-28aa |
92 | 31408 | 31407.82 | 31388.24 | 8.91 | 28317 | 28317.05 | 28299.63 | 7.99 | 1-28aa |
93 | 30936 | 30936.31 | 30917.03 | 9.27 | 27931 | 27930.56 | 27913.43 | 8.70 | 1-28aa |
95 | 31380 | 31379.76 | 31360.20 | 8.58 | 28289 | 28288.99 | 28271.59 | 7.15 | 1-28aa |
96 | 31101 | 31100.58 | 31081.25 | 9.38 | 28095 | 28094.86 | 28077.55 | 8.95 | 1-28aa |
97 | 31279 | 31278.65 | 31259.15 | 8.58 | 28287 | 28287.02 | 28269.62 | 7.99 | 1-28aa |
98 | 30949 | 30949.39 | 30930.09 | 9.27 | 27944 | 27943.64 | 27926.48 | 8.70 | 1-28aa |
99 | 31038 | 31038.45 | 31019.11 | 9.27 | 28033 | 28032.69 | 28015.50 | 8.70 | 1-28aa |
100 | 31033 | 31033.47 | 31013.94 | 8.96 | 27798 | 27798.40 | 27781.25 | 6.95 | 1-28aa |
101 | 31170 | 31169.68 | 31150.31 | 9.38 | 28134 | 28133.94 | 28116.60 | 8.95 | 1-28aa |
102 | 30979 | 30979.38 | 30960.06 | 9.09 | 27974 | 27973.62 | 27956.46 | 8.02 | 1-28aa |
103 | 31171 | 31170.63 | 31151.27 | 9.38 | 28135 | 28134.89 | 28117.55 | 8.95 | 1-28aa |
104 | 31006 | 31006.40 | 30987.07 | 9.09 | 28001 | 28000.65 | 27983.47 | 8.02 | 1-28aa |
105 | 31007 | 31007.43 | 30988.09 | 9.09 | 28002 | 28001.68 | 27984.49 | 8.02 | 1-28aa |
110 | 31094 | 31094.42 | 31075.05 | 8.53 | 28089 | 28088.67 | 28071.45 | 6.20 | 1-28aa |
111 | 31010 | 31010.39 | 30991.07 | 9.09 | 28005 | 28004.64 | 27987.46 | 8.02 | 1-28aa |
112 | 30949 | 30949.35 | 30930.05 | 9.09 | 27944 | 27943.60 | 27926.45 | 8.02 | 1-28aa |
113 | 31007 | 31007.43 | 30988.10 | 9.27 | 28002 | 28001.68 | 27984.50 | 8.70 | 1-28aa |
114 | 31144 | 31143.60 | 31124.26 | 9.38 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
115 | 31408 | 31407.82 | 31388.24 | 8.91 | 28317 | 28317.05 | 28299.63 | 7.99 | 1-28aa |
116 | 31229 | 31228.71 | 31209.31 | 9.38 | 28193 | 28192.97 | 28175.60 | 8.95 | 1-28aa |
117 | 31175 | 31174.62 | 31155.26 | 9.38 | 28139 | 28138.88 | 28121.55 | 8.95 | 1-28aa |
121 | 30951 | 30951.37 | 30932.07 | 9.27 | 27946 | 27945.61 | 27928.46 | 8.70 | 1-28aa |
122 | 31064 | 31064.48 | 31045.12 | 9.27 | 28059 | 28058.73 | 28041.52 | 8.70 | 1-28aa |
123 | 31157 | 31156.58 | 31137.31 | 9.40 | 28121 | 28120.84 | 28103.59 | 8.97 | 1-28aa |
124 | 31378 | 31377.79 | 31358.23 | 8.91 | 28287 | 28287.02 | 28269.62 | 7.99 | 1-28aa |
125 | 31029 | 31029.44 | 31010.09 | 9.09 | 28024 | 28023.69 | 28006.48 | 8.03 | 1-28aa |
126 | 30953 | 30953.34 | 30934.05 | 9.09 | 27948 | 27947.59 | 27930.44 | 8.02 | 1-28aa |
127 | 31145 | 31144.59 | 31125.24 | 9.25 | 28109 | 20108.85 | 28091.53 | 8.63 | 1-28aa |
129 | 30949 | 30949.35 | 30930.06 | 9.30 | 27944 | 27943.60 | 27926.46 | 8.72 | 1-28aa |
130 | 31029 | 31029.44 | 31010.09 | 9.09 | 28024 | 28023.69 | 28006.48 | 8.03 | 1-28aa |
131 | 31320 | 31319.75 | 31300.22 | 9.12 | 28229 | 28228.98 | 28211.62 | 8.60 | 1-28aa |
132 | 31078 | 31077.54 | 31058.23 | 9.38 | 28042 | 28041.80 | 28024.52 | 8.95 | 1-28aa |
132 | 30951 | 30951.37 | 30932.07 | 9.27 | 27946 | 27945.61 | 27928.46 | 8.70 | 1-28aa |
136 | 31230 | 31229.69 | 31210.29 | 9.25 | 28194 | 28193.95 | 28176.58 | 8.63 | 1-28aa |
137 | 30857 | 30857.39 | 30838.05 | 9.32 | 27852 | 27851.64 | 27834.44 | 8.95 | 1-28aa |
138 | 31220 | 31219.61 | 31200.24 | 9.25 | 28184 | 28183.87 | 28166.52 | 8.63 | 1-28aa |
139 | 31128 | 31127.60 | 31108.26 | 9.40 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
141 | 31436 | 31435.83 | 31416.24 | 8.58 | 28345 | 28345.06 | 28327.63 | 7.15 | 1-28aa |
142 | 31143 | 31142.62 | 31123.27 | 9.49 | 28107 | 28106.88 | 28089.56 | 9.16 | 1-28aa |
144 | 31188 | 31187.70 | 31168.32 | 9.38 | 28152 | 28151.96 | 28134.61 | 8.95 | 1-28aa |
146 | 31274 | 31273.71 | 31254.29 | 9.27 | 28238 | 28237.97 | 28220.58 | 8.64 | 1-28aa |
147 | 30997 | 30997.39 | 30978.07 | 9.09 | 27992 | 27991.64 | 27974.47 | 8.02 | 1-28aa |
148 | 31059 | 31058.51 | 31039.20 | 9.27 | 28053 | 28052.75 | 28035.60 | 8.70 | 1-28aa |
150 | 31203 | 31202.68 | 31183.28 | 9.38 | 28167 | 28166.94 | 28149.57 | 8.95 | 1-28aa |
155 | 31072 | 31071.54 | 31052.24 | 9.49 | 28036 | 28035.80 | 28018.52 | 9.16 | 1-28aa |
156 | 31130 | 31129.53 | 31110.20 | 9.27 | 28094 | 28093.79 | 28076.49 | 8.64 | 1-28aa |
157 | 31086 | 31085.57 | 31066.25 | 9.49 | 28050 | 28049.83 | 28032.54 | 9.16 | 1-28aa |
158 | 31274 | 31273.75 | 31254.32 | 9.25 | 28238 | 28238.01 | 28220.61 | 8.63 | 1-28aa |
159 | 30920 | 30920.40 | 30901.11 | 9.51 | 27915 | 27914.64 | 27897.50 | 9.24 | 1-28aa |
161 | 31051 | 31051.44 | 31032.08 | 8.86 | 28046 | 28045.69 | 28028.48 | 6.96 | 1-28aa |
162 | 31133 | 31132.53 | 3113.19 | 9.10 | 28166 | 28165.90 | 28148.55 | 8.63 | 1-28aa |
163 | 31074 | 31074.49 | 31055.19 | 9.25 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
164 | 31172 | 31171.70 | 31152.32 | 9.47 | 28136 | 28135.92 | 28118.58 | 8.95 | 1-28aa |
165 | 31351 | 31350.76 | 31331.22 | 8.91 | 28260 | 28259.99 | 28242.61 | 7.99 | 1-28aa |
166 | 31274 | 31273.75 | 31254.32 | 9.25 | 28238 | 28238.01 | 28220.61 | 8.63 | 1-28aa |
167 | 31248 | 31247.73 | 31228.25 | 9.16 | 28212 | 28211.99 | 28194.54 | 8.51 | 1-28aa |
168 | 31019 | 31019.40 | 31000.07 | 9.09 | 28014 | 28013.65 | 27996.46 | 8.03 | 1-28aa |
169 | 31117 | 31116.58 | 31097.25 | 9.38 | 28081 | 28080.84 | 28063.53 | 8.95 | 1-28aa |
170 | 31143 | 31142.62 | 31123.27 | 9.49 | 28107 | 28106.88 | 28089.56 | 9.16 | 1-28aa |
171 | 31309 | 31308.68 | 31289.16 | 8.58 | 28218 | 28217.91 | 28200.55 | 7.15 | 1-28aa |
172 | 31128 | 31127.56 | 31108.22 | 9.38 | 28092 | 28091.82 | 28074.51 | 8.95 | 1-28aa |
173 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
174 | 30906 | 30906.37 | 30887.08 | 9.27 | 27916 | 27915.59 | 27898.45 | 8.70 | 1-28aa |
175 | 31276 | 31275.72 | 31256.30 | 9.25 | 28240 | 28239.98 | 28222.59 | 8.63 | 1-28aa |
176 | 31114 | 31113.58 | 31094.25 | 9.38 | 28078 | 28077.84 | 28060.53 | 8.95 | 1-28aa |
177 | 31187 | 31186.67 | 31167.29 | 9.25 | 28151 | 28150.93 | 28133.57 | 8.63 | 1-28aa |
178 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
179 | 31176 | 31175.65 | 31156.28 | 9.38 | 28140 | 28139.90 | 28122.57 | 8.95 | 1-28aa |
180 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
181 | 31167 | 31166.64 | 31147.27 | 9.38 | 28131 | 28130.90 | 28113.56 | 8.95 | 1-28aa |
182 | 31172 | 31171.62 | 31152.26 | 9.40 | 28136 | 28135.88 | 28118.55 | 8.97 | 1-28aa |
183 | 31171 | 31170.67 | 31151.30 | 9.47 | 28135 | 28134.93 | 28117.59 | 9.14 | 1-28aa |
184 | 31131 | 31130.60 | 31111.26 | 9.38 | 28095 | 28094.86 | 28077.55 | 8.95 | 1-28aa |
186 | 31118 | 31117.52 | 31098.20 | 9.38 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
187 | 31206 | 31205.58 | 31186.22 | 9.25 | 28170 | 28169.84 | 28152.51 | 8.63 | 1-28aa |
188 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
189 | 31114 | 31113.58 | 31094.25 | 9.38 | 28078 | 28077.84 | 28060.53 | 8.95 | 1-28aa |
190 | 31186 | 31185.68 | 31166.30 | 9.38 | 28150 | 28149.94 | 28132.59 | 8.95 | 1-28aa |
191 | 30980 | 30980.36 | 30961.04 | 8.86 | 27975 | 27974.61 | 27957.44 | 6.95 | 1-28aa |
192 | 30949 | 30949.35 | 30930.06 | 9.30 | 27944 | 27943.60 | 27926.46 | 8.72 | 1-28aa |
193 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
194 | 31125 | 31124.56 | 31105.21 | 9.25 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
195 | 30894 | 30894.31 | 30875.04 | 9.27 | 27889 | 27888.56 | 27871.44 | 8.70 | 1-28aa |
196 | 30990 | 30990.45 | 30971.12 | 9.42 | 27985 | 27984.70 | 27967.52 | 9.04 | 1-28aa |
197 | 31130 | 31129.58 | 31110.24 | 9.38 | 28094 | 28093.84 | 28076.53 | 8.95 | 1-28aa |
198 | 30953 | 30953.34 | 30934.05 | 9.09 | 27974 | 27973.62 | 27956.46 | 8.02 | 1-28aa |
199 | 31161 | 31160.66 | 31141.34 | 9.30 | 28125 | 28124.92 | 28107.63 | 8.66 | 1-28aa |
200 | 31404 | 31403.87 | 31384.28 | 8.91 | 28313 | 28313.10 | 28295.68 | 7.99 | 1-28aa |
201 | 31208 | 31028.45 | 31009.08 | 9.07 | 28023 | 28022.70 | 28005.48 | 8.01 | 1-28aa |
202 | 31156 | 31155.66 | 31136.29 | 9.38 | 28120 | 28119.92 | 28102.58 | 8.95 | 1-28aa |
203 | 31230 | 31229.65 | 31210.27 | 9.27 | 28194 | 28193.91 | 28176.56 | 8.64 | 1-28aa |
204 | 31214 | 31213.69 | 31194.30 | 9.25 | 28178 | 28177.95 | 28160.59 | 8.63 | 1-28aa |
206 | 31175 | 31174.61 | 31155.25 | 9.25 | 28139 | 28138.87 | 28121.54 | 8.63 | 1-28aa |
207 | 31202 | 31201.68 | 31182.30 | 9.38 | 28166 | 28165.94 | 28148.59 | 8.95 | 1-28aa |
208 | 31202 | 31201.64 | 31182.26 | 9.25 | 28166 | 28165.90 | 28148.55 | 8.63 | 1-28aa |
209 | 31156 | 31155.66 | 31136.29 | 9.38 | 28120 | 28119.92 | 28102.58 | 8.95 | 1-28aa |
210 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
212 | 31234 | 31233.68 | 31214.29 | 9.25 | 28198 | 28197.94 | 28180.58 | 8.63 | 1-28aa |
213 | 31128 | 31127.51 | 31108.04 | 8.51 | 28090 | 28089.70 | 28072.47 | 6.21 | 1-28aa |
214 | 30981 | 30981.35 | 30962.04 | 9.09 | 27976 | 27975.60 | 27958.44 | 8.02 | 1-28aa |
215 | 31030 | 31030.42 | 31011.07 | 8.86 | 28025 | 28024.67 | 28007.47 | 7.04 | 1-28aa |
216 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
218 | 31158 | 31157.63 | 31138.27 | 9.38 | 28122 | 28121.89 | 28104.56 | 8.95 | 1-28aa |
219 | 30981 | 30981.39 | 30962.08 | 9.09 | 27976 | 27975.64 | 27958.47 | 8.02 | 1-28aa |
220 | 31175 | 31174.61 | 31155.25 | 9.25 | 28139 | 28138.87 | 28121.54 | 8.63 | 1-28aa |
221 | 30905 | 30905.39 | 30886.03 | 9.18 | 27900 | 27899.64 | 27882.43 | 8.63 | 1-28aa |
222 | 31260 | 31259.72 | 31240.30 | 9.25 | 28224 | 28223.98 | 28206.59 | 8.63 | 1-28aa |
223 | 30922 | 30922.37 | 30903.08 | 9.27 | 27917 | 27916.61 | 27899.47 | 8.70 | 1-28aa |
224 | 31015 | 31015.47 | 30996.20 | 9.38 | 28108 | 28107.86 | 28090.54 | 8.95 | 1-28aa |
225 | 31174 | 31173.63 | 31154.27 | 9.38 | 28138 | 28137.89 | 28120.55 | 8.95 | 1-28aa |
226 | 31176 | 31175.65 | 31156.28 | 9.38 | 28136 | 28135.92 | 28118.58 | 8.95 | 1-28aa |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seegene Medical Foundation
<120> A Method for Direct Detection of Pathogenic Microbes with
Resistance to beta-Lactam Antibiotics
<130> HPC-8812
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 876
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atggttaaaa aatcactgcg tcagttcacg ctgatggcga cggcaaccgt cacgctgttg 60
ttaggaagtg tgccgctgta tgcgcaaacg gcggacgtac agcaaaaact tgccgaatta 120
gagcggcagt cgggaggaag actgggtgtg gcattgatta acacagcaga taattcgcaa 180
atactttatc gtgctgatga gcgctttgcg atgtgcagca ccagtaaagt gatggccgtg 240
gccgcggtgc tgaagaaaag tgaaagcgaa ccgaatctgt taaatcagcg agttgagatc 300
aaaaaatctg acttggttaa ctataatccg attgcggaaa agcacgtcga tgggacgatg 360
tcactggctg agcttagcgc ggccgcgcta cagtacagcg ataacgtggc gatgaataag 420
ctgatttctc acgttggcgg cccggctagc gtcaccgcgt tcgcccgaca gctgggagac 480
gaaacgttcc gtctcgaccg taccgagccg acgttaaaca ccgccattcc gggcgatccg 540
cgtgatacca cttcacctcg ggcaatggcg caaactctgc gtaatctgac gctgggtaaa 600
gcattgggtg acagccaacg ggcgcagctg gtgacatgga tgaaaggcaa taccaccggt 660
gcagcgagca ttcaggctgg actgcctgct tcctgggttg tgggggataa aaccggcagc 720
ggtgactatg gcaccaccaa cgatatcgcg gtgatctggc caaaagatcg tgcgccgctg 780
attctggtca cttacttcac ccagcctcaa cctaaggcag aaagccgtcg cgatgtatta 840
gcgtcggcgg ctaaaatcgt caccaacggt ttgtga 876
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Val Lys Lys Ser Leu Arg Gln Phe Thr Leu Met Ala Thr Ala Thr
1 5 10 15
Val Thr Leu Leu Leu Gly Ser Val Pro Leu Tyr Ala Gln Thr Ala Asp
20 25 30
Val Gln Gln Lys Leu Ala Glu Leu Glu Arg Gln Ser Gly Gly Arg Leu
35 40 45
Gly Val Ala Leu Ile Asn Thr Ala Asp Asn Ser Gln Ile Leu Tyr Arg
50 55 60
Ala Asp Glu Arg Phe Ala Met Cys Ser Thr Ser Lys Val Met Ala Val
65 70 75 80
Ala Ala Val Leu Lys Lys Ser Glu Ser Glu Pro Asn Leu Leu Asn Gln
85 90 95
Arg Val Glu Ile Lys Lys Ser Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Ala
100 105 110
Glu Lys His Val Asp Gly Thr Met Ser Leu Ala Glu Leu Ser Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Asn Val Ala Met Asn Lys Leu Ile Ser His
130 135 140
Val Gly Gly Pro Ala Ser Val Thr Ala Phe Ala Arg Gln Leu Gly Asp
145 150 155 160
Glu Thr Phe Arg Leu Asp Arg Thr Glu Pro Thr Leu Asn Thr Ala Ile
165 170 175
Pro Gly Asp Pro Arg Asp Thr Thr Ser Pro Arg Ala Met Ala Gln Thr
180 185 190
Leu Arg Asn Leu Thr Leu Gly Lys Ala Leu Gly Asp Ser Gln Arg Ala
195 200 205
Gln Leu Val Thr Trp Met Lys Gly Asn Thr Thr Gly Ala Ala Ser Ile
210 215 220
Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ser Trp Val Val Gly Asp Lys Thr Gly Ser
225 230 235 240
Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Asn Asp Ile Ala Val Ile Trp Pro Lys Asp
245 250 255
Arg Ala Pro Leu Ile Leu Val Thr Tyr Phe Thr Gln Pro Gln Pro Lys
260 265 270
Ala Glu Ser Arg Arg Asp Val Leu Ala Ser Ala Ala Lys Ile Val Thr
275 280 285
Asn Gly Leu
290
Claims (18)
- 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics)에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 검출 방법:
(a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료 내에서 병원성 균주가 발현하는 단백질을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 단백질에 대해 탑-다운(top-down) 질량 분석을 수행하는 단계,
상기 질량 분석 결과 N-말단의 28개 아미노산 잔기가 제거된 베타-락타마제(β-lactamase)와 동일한 질량의 단백질이 검출된 경우, 상기 생물학적 시료 내에는 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주가 존재하는 것으로 판정한다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)에서 분리된 단백질에 대해 이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 이온교환 크로마토그래피는 음이온교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 베타-락타마제는 CTX-M 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1 내지 CTX-M7, CTX-M9, CTX-M10, CTX-M12 내지 CTX-M17, CTX-M19 내지 CTX-M24, CTX-M27 내지 CTX-M38, CTX-M40 내지 CTX-M44, CTX-M46 내지 CTX-M56, CTX-M58 내지 CTX-M69, CTX-M71 내지 CTX-M77, CTX-M79 내지 CTX-M88, CTX-M90, CTX-M92, CTX-M93, CTX-M95 내지 CTX-M105, CTX-M110 내지 CTX-M117, CTX-M121 내지 CTX-M127, CTX-M129 내지 CTX-M132, CTX-M134, CTX-M136 내지 CTX-M139, CTX-M141, CTX-M142, CTX-M144, CTX-M146 내지 CTX-M148, CTX-M150, CTX-M155 내지 CTX-M159, CTX-M161 내지 CTX-M184, CTX-M186 내지 CTX-M204, CTX-M206 내지 CTX-M210, CTX-M212 내지 CTX-M216 및 CTX-M218 내지 CTX-M226으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1, CTX-M3, CTX-M10, CTX-M15, CTX-M22, CTX-M23, CTX-M28, CTX-M32 내지 CTX-M34, CTX-M36, CTX-M42, CTX-M52 내지 CTX-M55, CTX-M58, CTX-M61, CTX-M62, CTX-M64, CTX-M69, CTX-M71, CTX-M72, CTX-M79, CTX-M80, CTX-M82, CTX-M88, CTX-M101, CTX-M103, CTX-M114, CTX-M116, CTX-M117, CTX-M123, CTX-M127, CTX-M132, CTX-M136, CTX-M138, CTX-M142, CTX-M144, CTX-M146, CTX-M150, CTX-M155 내지 CTX-M158, CTX-M166, CTX-M167, CTX-M169, CTX-M170, CTX-M172, CTX-M173, CTX-M175 내지 CTX-M184, CTX-M187 내지 CTX-M190, CTX-M193, CTX-M197, CTX-M199, CTX-M201 내지 CTX-M204, CTX-M206 내지 CTX-M209, CTX-M212, CTX-M216, CTX-M218, CTX-M220, CTX-M222 및 CTX-M225으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 CTX-M 단백질은 CTX-M1, CTX-M14, CTX-M15, CTX-M27, CTX-M142 및 CTX-M186으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 생물학적 시료에 계면활성제를 첨가함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight) 질량분석, ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight) 질량분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 질량분석 방법을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 MALDI-TOF(Matrix Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 질량 분석 결과 28210, 28287, 28166, 28164, 28203, 28116, 27946, 28153, 28089, 27974, 28108, 27888, 27973, 27964, 28321, 27932, 28165, 28197, 28044, 27916, 28107, 28167, 28273, 28152, 28081, 28212, 28277, 28182, 28139, 28043, 27819, 27810, 28170, 28298, 28356, 28027, 28073, 28001, 28099, 28000, 27974, 28184, 28148, 28136, 28314, 28214, 28263, 28181, 28211, 28156, 28046, 28071, 27947, 28180, 28121, 28154, 28067, 28006, 28291, 28261, 28307, 28135, 28194, 27998, 28134, 27983, 27944, 27958, 28008, 28018, 28002, 28317, 27931, 28289, 28095, 28033, 27798, 28005, 28193, 28059, 28024, 27948, 28109, 28229, 28042, 27852, 28345, 28238, 27992, 28053, 28036, 28094, 28050, 27915, 28260, 28014, 28218, 28092, 28138, 28240, 28078, 28151, 28140, 28131, 28150, 27975, 27889, 27985, 28125, 28313, 28023, 28120, 28178, 28198, 28090, 27976, 28025, 28122, 28224, 27917 및 이들 값의 ±5 범위 내의 값으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질량 값(m/z × z)이 검출된 경우, 상기 생물학적 시료 내에는 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주가 존재하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 질량 값(m/z × z)은 각 질량 값에 16 또는 32만큼 증가된 질량 값을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 베타-락탐계 항생제(β-lactam antibiotics) 내성 관련 단백질을 동정하는 방법:
(a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료 내에서 병원성 균주가 발현하는 단백질을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 단백질을 탑-다운(top-down) 방식을 통해 질량 분석을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 질량 분석 결과와 표 1에 나열된 N-말단의 28개 아미노산 잔기가 제거된 베타-락타마제(β-lactamase)의 질량 값(m/z × z), 상기 질량 값의 ±5 범위 내의 값, 상기 질량 값에 16만큼 증가된 값 및 상기 질량 값에 32만큼 증가된 값으로 구성된 군으로부터 선택되는 질량 값을 비교하여 상기 생물학적 시료 내에 포함된 베타-락탐계 항생제 내성 관련 단백질의 종류를 판정하는 단계.
- 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)에서 분리된 단백질에 대해 이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 방법은 이온교환 크로마토그래피는 음이온교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 생물학적 시료에 계면활성제를 첨가함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 MALDI-TOF(Matrix Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight) 질량분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 질량분석 방법을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 MALDI-TOF(Matrix Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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