KR100630658B1

KR100630658B1 - 돌연변이된 ｓｕｍｏ-1 단백질

Info

Publication number: KR100630658B1
Application number: KR1020050054429A
Authority: KR
Inventors: 이공주; 이지영; 서자원; 정재호
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2006-10-02

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질 및 이를 함유하는 SUMO화된 단백질의 검출용 조성물, 이를 이용하여 SUMO화된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질은 정상 SUMO화 활성을 나타내고, 이를 이용하여 기질 단백질에서의 SUMO화 위치를 확인할 수 있으므로 이를 통해 단백질의 SUMO화와 관련된 치매, 당뇨, 암과 같은 질병에 대한 프로테오믹스 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돌연변이된 ＳＵＭＯ-1 단백질{Mutated SUMO-1 protein}

도 1은 정상 SUMO-1 cDNA가 클로닝된 pGEX5X-1 벡터를 나타낸 도이다.

도 2는 정상 SUMO-1 단백질의 아미노산 서열 및 본 발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.

도 3은 정상 SUMO-1 단백질 또는 본 발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질에 의한 SUMO화 및 SUMO화된 단백질을 트립신 처리를 도식화한 것이다.

도 4는 본 발명의 돌연변이된 SUMO1-T95K 단백질의 SUMO화 활성을 확인한 도이다.

도 5는 본 발명의 돌연변이된 SUMO1-T95K 단백질을 이용하여 기질 단백질의 SUMO화 위치를 확인한 도이다.

본 발명은 돌연변이된 SUMO-1 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

SUMO-1(Small Ubiquitin-related modifier 1)은 101개 아미노산으로 구성된 유비퀴틴 유사 단백질(ubiquitin-like protein)로서, 유비퀴틴과는 아미노산 서열이 18% 동일하고, 48%의 유사성 있는 구조를 가지고 있다[Tetsu Kamitani, et al., J. Biol. Chem. 272:pp14001-14004(1997)].

SUMO-1은 이미 많은 연구가 이루어진 유비퀴틴과 마찬가지로 번역 후 단백질 변형 과정(posttranslational modification)을 일으키는 단백질로 알려져 있다. 번역 후 단백질 변형과정은 단백질의 기능, 활성, 세포내의 위치 등의 변화를 주도하는 중요 수단으로, 표적 단백질의 특정 아미노산 서열에 인산기, 아세틸기, 지질 또는 당류가 결합됨으로써 단백질의 화학적인 변화를 유도하는데, 이러한 변형과 관련된 분자들 중에서 현재 각광받는 작은 분자의 대표적인 것이 유비퀴틴이다.

유비퀴틴에 의한 표적 단백질의 유비퀴틴화(ubiquitination 또는 ubiquitylation)는, 유비퀴틴 자신의 C 말단의 글리신(Glycine)을 표적 단백질의 리신(Lysine)에 결합시켜 유비퀴틴 사슬을 형성하는 방식으로 진행된다. 이와 같은 표적 단백질의 유비퀴틴화는 세포 활성, 단백질의 분해과정의 전반적인 조절, 유전자 발현 및 세포 분열 과정의 중요한 신호가 된다[Stefan Muller Carsten Hoege, et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2(3):pp202-10.(2001)].

위와 같은 생체 내에서 중요한 역할을 하는 분자인 유비퀴틴은 세포내에서 유사한 서열을 가지는 단백질을 가지고 있다. 이들은 유비퀴틴 유사 변형자(ubiquitin like modifiers, 이하 UBLs)라 칭하고, 유비퀴틴의 유사성에 의거하여 두 가지 군으로 나눈다.

1군의 예로는, SUMO-1 (Small Ubiquitin-related modifier 1), Nedd8 (Rub1), Apg8과 Apg12이고, 2군은 유비퀴틴과 서열 유사성은 지니고 있으나 표적 단백질과는 결합하지 않는 parkin, RAD23, DSK2가 있으며 이들을 유비퀴틴 부위 단 백질(ubiquitin domain proteins)이라 명명한다.

위와 같은 UBL 단백질 중에서 진핵 세포에 존재하며, 효모에서부터 사람에까지 진화적으로 보존된 단백질이 SUMO (sentrin, GMP, UBL, PIC)이다.

SUMO 단백질은 효모의 경우 SMT3, 포유 동물에서는 SUMO-1, SUMO-2 [Tetsu Kamitani, et al., J. Biol. Chem. 273:pp11349-11353(1998)], SUMO-3 [Tetsu Kamitani, et al., J. Biol. Chem. 273:pp3177-3120(1998)], SUMO-4 [Bohren KM, et al., J Biol Chem. 279(26):pp27233-8(2004)]의 총 4가지의 동위체(isoform)를 가지고 있다. 이 동위체 중에서 가장 활발한 연구가 진행되고 있는 SUMO-1에 의한 변형은 유비퀴틴화 경로(ubiquitination pathway)와 유사한 방법으로 표적 단백질에 결합하게 된다. 즉, SUMO의 C말단에 96번 글리신, 97번 글리신 잔기를 가지고 있어 98~101번 아미노산 잔기인 Histidine-Serine-Threonine-Valine이 잘려 나가면서 SUMO tag이 붙게 된다.

유비퀴틴 및 SUMO의 번역 후 단백질 변형과정은 매우 흡사하나, 이 과정에서 서로 다른 효소를 이용하고 유비퀴틴은 스스로 48번의 리신에 중합체를 만드는데, SUMO의 경우 이 잔기가 69번의 글리신으로 치환되어 있어 자체적인 중합체를 만들지 않는다.

SUMO에 의해서 번역 후 단백질 변형과정을 거치는 단백질로 연구되어진 단백질은 대표적으로 RanGAP1, PML, IκBα 등이 있으며 계속해서 많은 단백질들이 차례로 밝혀지고 있다.

단백질의 연구 과정 중에서 알려진 SUMO화의 consensus motif는 ψKXE 이다. ψ는 소수성인(hydrophobic) 아미노산을 의미하며, X는 모든 종류의 아미노산, K는 리신, E는 글루탐산을 의미한다. 이중 가장 중요하게 생각되어지는 잔기는 K로서 이 곳에 SUMO의 글리신이 결합을 형성하게 된다[Manuel S. Rodriguez, et al., J Biol Chem. 276,pp12654-12659(2001)].

이러한 기작을 통하여 SUMO화된 단백질의 경우 세포 내 핵 안에서 많은 역할을 하는 것으로 보고 되어져 있다. 특히, 유전자 전사, DNA repair, 단백질과 RNA의 핵 안과 밖으로의 이동, 체세포 분열시 방추사와의 결합으로 2개의 딸 세포로의 분리를 가능하게 하는 역할이 있다[Marx J., Science 307(5711):pp836-839(2005)].

지금까지 밝혀진 SUMO화 되는 단백질의 대표적인 예로 RanGAP1이 있는데, RanGAP1의 526 리신 잔기와 SUMO-1의 97번의 글리신 잔기가 아이소펩타이드(isopeptide) 결합을 형성하고 NPC(nuclear pore complex)/RanBP2로 타겟팅하여 ras-유사 핵 GTPase(ras-like nuclear GTPase)인 Ran을 조절할 수 있다. 특히, RanGAP1의 경우는 SUMO화 되므로써 RanBP2와의 결합 부위가 형성될 수 있다고 최근 보고되었다[Tatham MH, et al., Nat Struct Mol Biol. 12(1):pp67-74(2005)].

다음으로, NF-κB/IκBα에 SUMO화 되는 것으로 알려져 있다. 평상시에는 IκBα가 NF-κB에 결합하고 있어서 DNA 결합 및 transactivation 능력을 제지하고 있다가, 세포 밖으로부터의 사이토카인 분비, H₂O₂, heat shock에 의한 산화적 스트레스에 의해서는 IκBα의 32, 36번의 세린 잔기가 인산화되어 21, 22번의 리신이 유비퀴틴화된다. 유비퀴틴화된 IκBα는 26S 프로테오좀(proteosome)에서 단백질 분해가 진행되고, IκBα를 잃어버린 NF-κB는 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사를 촉진시킨다. 이에 반해, SUMO의 경우에는 IκBα에 SUMO화 시키므로 IκBα의 유비퀴틴화를 억제하는 유비퀴틴의 길항제로서의 역할을 한다[Joana M. P. Desterro, et al., Mol. Cell 2;pp233-239(1998)].

이러한 생물학적인 역할을 하는 SUMO의 경우 치매, 당뇨, 암과 같은 질병과 밀접하게 연관되어 있으리라 예상되며, 최근 질병 관련 결과의 발표가 급격하게 증가하고 있다.

치매와 관련하여서는 SUMO화가 증가함에 따라 치매의 원인이 되는 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid beta peptide)의 생성을 크게 감소시켰다고 보고되었고[Li Y, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:pp259-264 (2003)], 당뇨와 관련하여 Islet cell autoantigen 512 (ICA512)은 calpain에 의해 분해되어 세포질 조각이 핵안으로 이동하여 E3-SUMO ligase인 PIAS와 결합하여 인슐린의 발현을 증가시켜 당뇨를 조절할 수 있음이 밝혀졌다[Trajkovski M, et al., J Cell Biol. 167(6):pp1063-74 (2004)]. SUMO화와 암과의 상관성은 여러 곳에서 발견되고 있으며 SUMO화가 증가하면 암 발병이 증가함을 보여주고 있다. 특히 암억제 단백질로 알려진 TEL은 SUMO화에 의해 그 활성을 조절하고 있음이 밝혀졌다[Wood LD, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 100(6):pp3257-62 (2003)].

즉, 세포내의 여러 가지 기전에 SUMO 변형이 중요한 역할을 하며, 이는 때에 따라 유비퀴틴과 길항 작용을 할 수 있을 것으로 추정되는데, 이처럼 세포의 생명 조절에 중요한 영향을 미치는 SUMO에 대한 표적 단백질의 변형 부위를 알아내는 것 은 질병과의 상관성을 밝히기 위하여는 매우 중요한 일이다.

지금까지의 연구는 표적 단백질의 SUMO화 부위를 밝혀내기 위해 많은 노력을 하고 있으나, 단백질 단편 중 SUMO화된 부분은 질량이 급격히 증가하여 질량 분석기의 기술적인 한계에 의해서 연구에 어려움을 겪어왔다.

이에 본 발명자는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 제조하고, 이 단백질이 정상 SUMO-1과 동일한 SUMO화 활성을 가지며, 이를 이용하여 SUMO화 위치 분석이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 함유하는 SUMO화된 단백질의 검출용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 이용하여 SUMO화된 단백질을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 제공한다.

상기 돌연변이된 SUMO-1 단백질은 정상(wild type) SUMO-1 단백질의 아미노산 서열에서 95번째 아미노산 트레오닌(Threonine, T)이 리신(Lysine, K)으로 치환된 단백질이다(이하, SUMO1-T95K 라고 한다).

본 발명의 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질을 이용하여 기질 단백질을 SUMO화 (sumoylation) 시켰을 때, 정상 SUMO-1 단백질과 비교하여 SUMO화 정도에 차이가 없으므로, 돌연변이된 SUMO-1 단백질이 정상적인 SUMO화 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 함유하는 SUMO화된 단백질의 검출용 조성물을 제공한다.

본원발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질은 기질 단백질을 SUMO화시키고, 기질 단백질의 아미노산 서열에서 SUMO화의 consensus motif는 ψKXE(ψ는 소수성 아미노산, X는 모든 종류의 아미노산, K는 리신, E는 글루탐산)으로, 이 중 기질 단백질의 리신(K) 위치에 SUMO 단백질의 글리신(G)이 결합을 형성한다[Manuel S. Rodriguez, et al., J Biol Chem. 276, pp12654-12659(2001)].

이 기질 단백질을 트립신 처리하면, 본원발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 아미노산 서열 제95번째에서 절단되어 기질 단백질에 SUMO-1 단백질의 글리신-글리신 아미노산 서열만 결합되어 남게 된다.

그 다음 원래 기질 단백질을 트립신 처리한 것과 본원발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질로 SUMO화된 기질단백질을 트립신 처리한 것을 컬럼크로마토그래피 및 질량분석기를 이용한 분석을 통하여 단백질에서 SUMO화되는 아미노산 위치를 확인할 수 있어, SUMO화되는 단백질을 검출하는데 유용하며, 이와 관련된 프로테오믹스 연구에도 유용하게 사용될 수 있다.

상기 기질 단백질은 대장균, 효모, 세포주에서 분리한 단백질 혼합물이 될 수 있고, 또한 대량 발현하여 분리 정제된, 한 종류의 단백질이 될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 돌연변이된 SUMO-1 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 이용하여 SUMO화된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 이용함으로써 기질 단백질의 SUMO화및 SUMO화되는 아미노산 위치를 확인할 수 있어 SUMO화된 단백질 검출 및 이와 관련된 프로테오믹스 연구를 용이하게 한다.

본 발명의 질병 관련 SUMO화된 단백질의 검출방법은, 1) 기질 단백질에 서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 처리하는 단계; 2) 처리한 단백질 혼합물을 전기영동하여 분리하는 단계; 3) 분리한 단백질에 트립신을 처리하는 단계; 4) 트립신 처리한 단백질을 컬럼크로마토그래피를 수행하여 분리하는 단계; 5) 분리한 펩타이드의 질량을 확인하는 단계; 6) 분리한 펩타이드의 아미노산 배열순서를 결정하는 단계; 7) 상기 5, 6단계에서 얻어진 결과를 분석하여 기기질 단백질에서 SUMO화 부위를 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 1 단계는 기질 단백질에 본원발명의 돌연변이된 SUMO1-T95K를 처리하여 SUMO화시키는 단계이다.

기질 단백질의 아미노산 서열에서 SUMO화의 consensus motif인 ψKXE(ψ는 소수성 아미노산, X는 모든 종류의 아미노산, K는 리신, E는 글루탐산) 서열 중 기질 단백질의 리신(K) 위치에 SUMO 단백질의 글리신(G)이 결합을 형성하게 된다.

도 3과 같이 정상 SUMO-1 및 본원발명의 SUMO1-T95K로 기질 단백질을 SUMO화시키면 기질 단백질의 SUMO화 위치인 리신(K)에 SUMO-1의 글리신(G)이 결합한다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 2 단계는 기질 단백질의 SUMO화 반응 혼합물을 전기영동(예, SDS-PAGE)하여 분리하는 단계이다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 3 단계는 전기영동하여 분리한 단백질에 트립신을 처리하는 단계로, 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 단계에서 SUMO화된 기질 단백질은 기질 단백질의 리신에 SUMO 단백질의 글리신이 결합되어 있는 상태이며, 본 단계에서 트립신을 처리하여 단백질의 아미노산 서열 중 아르기닌(arginine)과 리신(lysine)의 뒤에서 아미노산 사슬이 절단되어 펩티드로 단편화되게 한다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 4단계에서는 트립신 처리한 단백질 단편을 컬럼크로마토그래피, 바람직하게는 액상컬럼크로마토그래피를 수행하여 크기별로 분리한다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 5 단계에서는 분리한 펩타이드의 질량을 확인하는 단계로, 정상 SUMO-1 처리한 것과 본 발명의 SUMO1-T95K 처리한 것의 펩타이드의 질량을 확인하고 비교분석한다. 이때 ESI-q-TOF tandem MS(electospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry)를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 6 단계에서는 CID(collision induced dissociation)를 이용하여 단편화(fragmentation)하여 아미노산 배열순서 를 결정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 SUMO화된 단백질의 검출방법의 7 단계에서는 상기 5, 6단계에서 얻어진 질량분석결과 및 아미노산 배열순서 결과를 분석하여 기질 단백질에서 질량이 114.1 Da 증가된 펩티드를 확인함으로써 SUMO화 부위를 확인할 수 있다.

도 3은 본 발명의 기질 단백질 상 SUMO화를 확인하는 방법을 모식도로 나타낸 것이다.

도 3에서 정상 SUMO-1로 기질 단백질을 SUMO화시키면 SUMO화 위치인 리신(K)에 SUMO-1의 글리신(G)이 결합한다. 여기에 리신(K)의 C-말단을 자르는 트립신을 처리하면, 기질 단백질의 리신 위치에 SUMO-1의 15개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 결합되므로, 이를 질량분석기로 확인하기에는 질량이 높아 질량분석이 불가능하다.

상기 본원발명의 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질로 기질 단백질을 SUMO화시키고, 트립신을 처리하면, 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질에서 95번째 아미노산 리신까지 잘려나가고 기질 단백질의 리신 위치에는 결합된 글리신-글리신(G-G)만이 남게된다. 따라서 SUMO화된 위치의 펩티드는 원래 기질 단백질을 트립신 처리한 펩티드 단편에 글리신-글리신 분자량 114.1 Da만이 증가된 것이므로 질량분석이 가능하고, 기질 단백질을 트립신 처리한 시료와 비교분석하여 질량이 114.1 Da 증가된 펩티드를 확인함으로써 SUMO화 위치분석이 가능하다.

본 발명의 조성물 및 연구방법을 이용하여 기질 단백질을 SUMO화 시키고, SUMO화된 단백질의 종류 및 위치를 확인, 분석할 수 있어 프로테오믹스 연구에 유 용하다.

또한, 단백질의 SUMO화와 관련 있는 각종 암, 백혈병, 당뇨병, 치매 등의 질병과의 상관성을 연구하고, 이의 치료제, 치료방법을 연구개발하는 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예] 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 제조, 이의 SUMO화 활성 및 SUMO화 위치분석확인

1) 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 발현 구조물 제조

본 발명의 돌연변이된 SUMO-1 단백질은 SUMO-1 아미노산 서열[NCBI accession no. P63165 (P55856, Q93068)]의 95번째의 아미노산인 티로신(tyrosine)을 리신(lysine)으로 치환하여 제작하였다(이하, '돌연변이 SUMO1-T95K 단백질'이라 한다).

먼저, 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질을 발현시키기 위해서, 돌연변이된 SUMO-1 발현 construct를 제조하였다.

SUMO-1 cDNA(NCBI accession no. U67122)를 주형으로 하고, 프라이머(primer)로는 서열번호 2의 5'-CAGGAACAAAAGGGGGGTC-3' 및 서열번호 3의 5'- GACCCCCCTTTTGTTCCTG-3'사용하여, site-directed mutagenesis를 수행하였다.

정상 SUMO-1 cDNA가 클로닝된 pGEX5X-1 벡터(배재대학교 채순기 박사님 제공, 도 1 참조)를 단일가닥 SUMO-1 형태로 준비하여, 이에 상기 프라이머를 혼성화시키고, 이를 중합효소(polymerase) 및 dNTP를 이용하여 PCR을 수행하여 돌연변이 SUMO1-T95K 발현 구조물을 제조하였다(도 2 참조).

2) 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 발현

상기 제조된 돌연변이 SUMO1-T95K 발현 구조물을 박테리아 BL21 균주에 형질전환(transformation)시킨 후 발현시켜 재조합 단백질을 제조하였다.

돌연변이 SUMO1-T95K 발현 구조물로 형질전환된 BL21균주를 아가 배지(암피실린농도 150 ㎍/㎖ 함유)에 도말하고, 37℃에서 12~16시간동안 배양하였다. 그 중 하나의 콜로니를 취하여, 다시 5 ㎖ 2×YTA 배지(암피실린농도 100 ㎍/㎖ 함유)에서 12-16시간동안 37℃에서 배양하였다. 이렇게 초기배양(starter culture)한 박테리아를 500 ㎖ 2×YTA 배지(암피실린농도 100 ㎍/㎖ 함유)에서 O.D.값이 0.6~0.8이 되도록 37℃에서 배양한 후, IPTG(isopropylthiogalactoside)를 최종농도 0.1 mM이 되도록 배양액에 첨가하여 발현을 유도하였다. 이를 3시간 더 37℃에서 배양하여 충분히 SUMO-1의 돌연변이 단백질이 발현되도록 대량 배양(large culture)하였다.

배양한 박테리아 세포를 6000 rpm에서 15분 원심분리(Hanil Supra 22K)하고, 수집된 박테리아 펠렛을 30 ㎖ 1×PBS 로 세척하고 이를 코니칼 튜브(conical tube)로 옮기고, 다시 상기 조건과 같이 원심분리하는 과정을 3회 반복하였다. 이 펠렛의 무게를 잰 후, 이를 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

3) 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 정제

상기에서 발현시킨 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 Rohit Mahajan 등의 문헌에 기재된 방법(J. Cell Biol., 140, pp259-270, 1998)에 따라 정제하였다.

상기 준비한 펠렛에 0.1 mM PMSF(phenyl methyl sulfonyl floride: Amresco 0754), 800 ㎍/g 라이소자임(Lysozyme, Sigma사:L6876), 2 ㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin, Sigma사: A6279), 0.1% 트라이톤 X-100(Sigma사: X-100)을 함유한 1×PBS를 5 ㎖/g의 양으로 첨가하여 펠렛을 녹인 후 30분간 얼음에 두었다. 이때, 5 분마다 한번씩 볼텍싱(vortexing)하였다. 그 다음 원심분리관(centrifuge tube)에 나눠 담고 4℃, 60,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다(BECKMAN Optima™ TL Ultracentrifuge). 상기 과정으로 수득한 세포 용해물(cell lysate)을 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.

단백질 정제 하루 전에 4℃에서 글루타티온 비드(glutathione beads, Sigma사: G4510) 500 ㎕를 12시간 이상 불려놓고, 이 비드를 컬럼(BIORAD사: 731-1550)에 잘 충진시키고 3차 증류수로 3번 세척한 다음 1×PBS로 평형화(equilibration)하였다. 이 컬럼을 저온실로 옮겨 4℃로 냉각시켜 준비하였다.

상기 원심분리 후 상층액인 세포 용해물만을 새로운 15 ㎖ 코니칼 튜브로 옮기고, 이를 저온실에 설치되어 있는 컬럼에 1 ㎖씩 로딩(loading)하였다. 컬럼내 비드가 마르지 않도록 세포 용해물을 계속 로딩하고, 로딩하였던 세포 용해물을 다 시 모아서 이를 3번 이상 컬럼을 통과시켜서 여러 번 비드에 흘려주도록 하여 글루타티온-GST tagged SUMO mutant의 친화도(affinity)를 높여주었다. 세포 용해물이 컬럼을 통과한 후에는 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하기 위하여 이 비드를 0.5 M NaCl과 0.1% 트라이톤 X-100이 첨가되어 있는 1×PBS 10 ㎖로 2회 세척하였다. 이 용액이 다 빠지고 나면 비드가 마르지 않도록 0.1% 트라이톤 X-100이 첨가 되어 있는 1×PBS 10 ㎖로 세척하였다.

세척 후 Factor Xa cleavage buffer(50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7.5) 5 ㎖을 넣어서 비드를 마지막으로 세척하고, Factor Xa cleavage buffer가 다 내려가면 컬럼 아래 부분을 막고, 1 단위의 Factor Xa(Amersham Biosciences: 27-0849-01)가 첨가된 Factor Xa cleavage buffer 500 ㎕를 비드에 로딩하고 이 컬럼의 뚜껑을 씌우고 상온으로 꺼내와 밤새 두었다.

다음날 이 완충액을 용리(elution)하여 돌연변이된 SUMO1-T95K의 정제된 단백질을 수득하였다.

4) 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 SUMO화 활성 확인

상기에서 발현 정제된 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질의 SUMO화(sumoylation) 활성을 확인하였다.

4-1) SUMO화 기질 단백질의 준비

SUMO-1의 기질 단백질로 인태반 막 분획(human placenta membrane fraction) 을 준비하였다.

동결된 태반을 4℃에서 녹인 후, 저온실에서 1×PBS로 5번 정도 세척하고 흐르는 1×PBS 2 리터로 다시 헹구었다. 이 태만 무게 5배의 용해 완충액(10 mM Tris-acetate, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 ㎍/㎖ aprotinin, pH 7.4)을 넣고 믹서로 균질화(homogenize)시키고 30분 후에 12000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리로 수득한 침전물의 1/3을 5배 부피의 RSB 완충액(10 mM Tris-acetate, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, pH 7.6)으로 씻어준 후, 0.5% Triton X-100가 포함된 RSB 완충액을 5배 첨가 혼합하여 30분간 두었다. 그 다음, 혼합액을 12,500 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하였고, 원심분리 하여 얻은 상등액이 태반 막 분획(placenta membrane fraction)이며, 이를 취하여 SUMO화 기질 단백질로 사용하였다.

4-2) 돌연변이된 SUMO-1 단백질의 SUMO 화 활성 확인

기질단백질과 GST, GST-SUMO1, GST-SUMO1-T95K 재조합 단백질을 반응시켜 SUMO화 활성을 확인하였다.

먼저, 상기 실시예 3)의 방법과 유사하게 pGEX5X-1 GST 발현벡터 및 pGEX5X-1-SUMO1 발현구조물을 BL21에 형질전환시키고, 형질전환된 균주를 배양한 후, IPTG로 GST, GST-SUMO1 단백질 발현을 유도하였다. 배양된 균주를 원심분리하고, 펠렛에 라이소자임 처리 및 원심분리하여, 상층액인 세포 용해물을 분리하였고, 이와 같은 GST 단백질 또는 GST-SUMO1 단백질을 포함하는 세포 용해물을 하기와 같이 SUMO화 활성 확인에 사용하였다.

GST pull down assay를 하기 위해서 하루 전에 글루타티온 비드(Glutathione beads, Sigma사: G4510)를 각 시료 당 30 ㎕가 되도록 3차 증류수로 불려두었다. 다음날, 이 비드를 3차 증류수로 한번 세척하고 다시 1×PBS로 평형화시켰다.

여기에 상기 실시예 3)의 -80℃에 얼려둔 GST 또는 GST-SUMO1 또는 GST-SUMO1-T95K 재조합 단백질을 포함하는 세포 용해물을 각각 20 ㎕씩 넣어주고 여기에 100 ㎕씩 결합 완충액(0.1% Triton X-100이 첨가된 1×PBS)을 넣어준 후, 4℃에서 3시간 흔들어 주면서 반응시켰다. 3시간이 지난 후, 각각 반응시킨 비드를 0.1% Triton X-100이 첨가된 1×PBS로 3번 세척하였다.

그 후 비드에 0.5 ㎖의 RSB 완충액 및 상기 실시예 4-1)의 0.5 ㎖ 태반 막 분획을 섞은 혼합액 1 ㎖를 넣어주고, 4℃에서 3시간 동안 흔들어 주면서 반응시켰다. 반응 3시간 후, 0.25% triton X-100이 첨가된 1×PBS로 3번 세척하였다.

이 반응물을 30 ㎕ 2×젤 시료 완충액(125 mM Tris base, 10% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, 4.6% SDS)을 넣어 90℃에서 15분 동안 담가두어 끓인 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그리고 10% Hoefer gel에 각 시료 당 20 ㎕씩 로딩한 후, 280 V 에서 3시간 전기영동한 후, 젤을 실버 염색하였다.

도 4에 전기영동 결과를 나타내었으며, 정상 SUMO-1으로 SUMO화 시킨 단백질과 돌연변이된 SUMO1-T95K로 SUMO화 시킨 단백질 간에 SUMO화의 차이가 없음을 관찰함으로써, 돌연변이된 SUMO1-T95K가 정상적인 SUMO화 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

5) SUMO화된 단백질의 SUMO화 위치 확인

본 발명의 돌연변이 SUMO1-T95K 단백질을 이용하여 SUMO화된 기질 단백질에서의 SUMO화 위치를 확인하였다.

SUMO화된 기질 단백질을 SDS-PAGE상에서 분리한 후, 이를 트립신 처리하여 단백질 절편을 만들고, 이들 펩타이드 절편을 모세관 액상컬럼 크로마토그라피 (C18 column, 직경 75 ㎛×100 mm)를 이용하여 분리하였다. 이 경우 시료는 5 ㎕를 사용하고, 유속은 분당 4.5 ㎕를 사용하며, 용리(elution)는 5% 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN)에서 80% ACN 로 농도구배 용리(gradient elution)하여 120분간 분리하였다.

그리고 분리된 펩타이드들은 질량분석기인 Q-TOF tandem MS (Quadrupole time-of-flight mass spectrometry)의 ESI (Electrospray ionization) 방식을 사용하여 이온화시켜, 펩타이드의 모질량을 확인하였다. 이 때 ESI 이온화를 위하여 picotip을 사용하고, 3 kV 모세관 전압(capillary voltage)을 걸어주었다. 그리고 collision cell에서 단편화 (Fragmentation)할 때는 30 kV 근방의 전압을 걸어주었다. MCP 검출기(multichannel plate detector)를 이용하여 그 조각 이온의 질량을 측정하였다.

측정된 질량 스펙트럼은 PLGS (ProteinLinx Global Server)을 통하여 background subtract, peak smoothening과 centroiding 그리고 multiply charged isotopic의 deisotoping 등의 데이터 처리(data processing) 과정을 거치고, 데이 터베이스인 SWISSPROT의 검색을 통하여 펩타이드의 아미노산 배열 순서 및 변형부위를 확인하였다.

SUMO화 되어진 기질 단백질의 경우 K의 위치에 GG-tag이 결합되어 있어, 얻어진 질량 스펙트럼의 아미노산 배열 중 K의 위치에 GG의 질량값 114.1 Da이 증가된 피크를 확인할 수 있었다(도 5).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본원발명의 돌연변이된 SUMO1-T95K 단백질은 정상 SUMO화 활성을 나타내고, 이를 이용하여 기질 단백질을 SUMO화시킴으로써 기질 단백질에서의 SUMO화 위치를 확인할 수 있으며, 이를 통해 단백질의 SUMO화와 관련된 치매, 당뇨, 암과 같은 질병에 대한 프로테오믹스 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질.
서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 함유하는 SUMO화된 단백질의 검출용 조성물.
서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 이용하여 SUMO화된 단백질을 검출하는 방법.
제3항에 있어서, 1) 기질 단백질에 서열번호 1의 아미노산서열을 갖는 돌연변이된 SUMO-1 단백질을 처리하는 단계; 2) 처리한 단백질 혼합물을 전기영동하여 분리하는 단계; 3) 분리한 단백질에 트립신을 처리하는 단계; 4) 트립신 처리한 단백질을 컬럼크로마토그래피를 수행하여 분리하는 단계; 5) 분리한 펩타이드의 질량을 확인하는 단계; 6) 분리한 펩타이드의 아미노산 배열순서를 결정하는 단계; 7) 상기 5, 6단계에서 얻어진 결과를 분석하여 기질 단백질에서 SUMO화 부위를 확인하는 단계를 포함하여 이루어지는 질병관련 SUMO화된 단백질을 검출하는 방법.