CN110845596B

CN110845596B - 突变体xSUMO及其相关产品

Info

Publication number: CN110845596B
Application number: CN201911121345.1A
Authority: CN
Inventors: 赵博; 叶琳; 李新宇; 刘金钊
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110845596A

Abstract

本发明提供了突变体xSUMO及其相关产品，所述突变体xSUMO对于野生型SUMO至少包含以下突变位点：第70位R被E取代、第91位Y被A取代以及93位E被R取代。突变体xSUMO的构建促进了正交SUMO途径中xSUMO‑xE1突变对的构建，为OST途径的完成奠定了很好的基础，并且加深了SUMO与E1相互作用与结构的理解。

Description

突变体xSUMO及其相关产品

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种突变体xSUMO及其相关产品。

背景技术

SUMO(Small ubiquitin-like modifier)是真核生物细胞内存在的一种非常重要的小分子量蛋白质(～12kDa)。人体内有5种不同的SUMO蛋白，分别是SUMO1-5(图1)。SUMO-1是最常见的SUMO蛋白，含有101个氨基酸，分子量为11.6kDa，与SUMO-2/3具有约50％的序列相似性。虽然SUMO-1与泛素(Ubiquitin,Ub)序列相似性仅为18％，二者却有相似的三维空间结构，SUMO-1仅比泛素在N末端上多了一段约20个氨基酸的柔性伸展结构(图1)。作为一种翻译后修饰，SUMO化(Sumoylation)参与了多种重要的细胞功能，包括DNA的损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡与增殖、转录因子调控、细胞信号转导、染色质重构等。此外，SUMO化还与癌症和神经退行性疾病有关，包括帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病(AD)等，使得SUMO化过程及其SUMO化的底物有望成为临床治疗的新靶点。

与Ub类似，SUMO需要经过一系列特定的酶传递到底物，这个过程被称作SUMO化。细胞中表达的SUMO最初都是以前体的形式存在，经特异性蛋白酶剪切后，暴露出C-末端的双甘氨酸残基，变成具有功能的SUMO。在ATP的参与下，SUMO被由Aos1和Uba2异构形成的二聚体，称为SUMO激活酶E1(SUMO activating enzyme,SAE)催化激活，其C-末端的甘氨酸与Uba2的半胱氨酸形成硫酯键。然后，活化的SUMO从E1转移到细胞中唯一的结合酶E2(SUMOconjugating enzyme,Ubc9)上，形成第二个硫酯键。与Ub不同的是，底物SUMO化有两条途径：第一种是在没有SUMO连接酶E3的条件下，Ubc9直接与底物蛋白结合，将SUMO传递到底物并催化SUMO的C末端甘氨酸残基与底物蛋白赖氨酸ε-氨基形成异肽键，这样的底物被称为Ubc9的特异性底物；第二种途径是在SUMO E3的参与下，Ubc9先与SUMO E3结合，E3再将SUMO直接传递到底物上，这样的底物被称为E3的特异性底物。(图2)

近年来，随着蛋白组学及质谱技术的完善，越来越多的SUMO底物蛋白被发现。据文献报道，截止2016年，已经发现有1664个底物蛋白质可以被SUMO化。但到目前为止，大部分底物无法区分是E2的特异性底物还是E3的特异性底物，并且没有任何文献报导E2或E3的特异性底物库。有一些疾病相关蛋白，尽管知道发生了SUMO化，但至今仍未确定其是E2的直接底物还是某个E3的特异性底物，因此，开发针对SUMO化底物的药物非常困难。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种突变体xSUMO及其相关产品，用于构建正交SUMO途径，进而解决现有技术中无法区分E2的特异性底物还是E3的特异性底物的问题。

为了解决上述问题，我们构建正交的SUMO途径(参见图3)，简称OST，即通过噬菌体展示技术和分子生物学技术，分别获得不与任何野生型SUMO及相关酶反应的SUMO、E1、E2突变体，在细胞内产生一条与野生型途径共存但互不干涉的SUMO化传递途经，使xSUMO被特异性地传递到Ubc9的底物上，再通过检测xSUMO上携带的tag，就可以确定Ubc9的特异性底物。即通过构建正交的xSUMO-xE1和xE1-xE2来确定Ubc9的特异性底物。该方法的重要环节是构建不与野生型SUMO E1反应的突变体xSUMO。

本发明已经成功构建出了与野生型SUMO E1没有反应活性的突变体xSUMO，(例如实施例中的xSUMO5)促进了正交SUMO途径中xSUMO-xE1突变对的构建，为OST途径的完成奠定了很好的基础，并且加深了SUMO与E1相互作用与结构的理解。

基于研究发现本申请提出了一种突变体xSUMO，所述突变体xSUMO相对于野生型SUMO至少包含以下突变位点：第70位R被E取代、第91位Y被A取代以及93位E被R取代。

所述野生型SUMO的Genbank NM_001005781.2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示：

MSDQEAKPSTEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGV PMNSLRFLFEGQRIADNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTGGHSTV

突变体xSUMO编码基因的具体序列SEQ ID NO.21所示：

atgtctgaccaggaggcaaaaccttcaactgaggacttgggggataagaaggaaggtgaatatattaaactcaaagtcattggacaggatagcagtgagattcacttcaaagtgaaaatgacaacacatctcaagaaactcaaagaatcatactgtcaaagacagggtgttccaatgaattcactcaggtttctctttgagggtcaggaaattgctgataatcatactccaaaagaactgggaatggaggaagaagatgtgattgaagttgctcagagacaaacggggggttag

上述突变体xSUMO可以采用现有技术中的蛋白质制备方法获得。

本发明的另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述突变体xSUMO。

本发明的另一方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上所述多核苷酸。

本发明的另一方面提供了一种生物工程菌，所述生物工程菌中含有上述重组表达载体或者其基因组内整合有上述多核苷酸。

本发明的另一方面提供了上述突变体xSUMO、多核苷酸、重组表达载体或者生物工程菌用于鉴别Ubc9底物的类型的用途。

本发明的另一方面提供了一种xSUMO-xE1突变对，所述xSUMO-xE1突变对含有与xSUMO一致的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述xSUMO-xE1突变对。

本发明的另一方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述多核苷酸。

具体的，所述重组表达载体由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

本发明中的表达载体通常指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本发明的另一方面提供了一种生物工程菌，所述生物工程菌中含有上述多核苷酸或者其基因组内整合有上述分离的核苷酸。

本发明的另一方面提供了上述xSUMO-xE1突变对、多核苷酸、重组表达载体或者生物工程菌用于鉴别Ubc9底物的类型的用途。

上述xSUMO-xE1突变对可以采用现有技术中的蛋白质制备方法获得。

本发明的另一方面提供了一种鉴别Ubc9底物类型的方法，所述方法为：

(1)通过噬菌体展示技术，首先在分子水平构建全部突变体，包括xSUMO、xSAE、xUbc9，并通过蛋白质水平SUMO化检测这些突变体之间的活力，以及与野生型SUMO、SAE1和Ubc9之间的活力。

(2)通过慢病毒载体包装质粒，将以上所有突变体的基因转染至真核细胞HEK293中，筛选稳转株细胞，该稳转株细胞可以同时过表达xSUMO、xSAE和xUbc9。同时构建阴性对照菌株，即只转染了xSUMO和xSAE但是不转染xUbc9的细胞。

(3)对上述转染了突变体的细胞和阴性对照细胞进行培养72小时(添加蛋白酶体抑制剂)，裂解细胞，用xSUMO上的标签蛋白免疫沉淀，胰酶消化沉淀下来的蛋白，用质谱分析。

(4)根据质谱分析结果，确定Ubc9特异性底物；选择其中几个底物，在胞内和胞外两个层面，验证其SUMO化。

如上所述，本发明的鉴别细胞内SUMO底物类型的方法，具有以下有益效果：

本申请中的技术方案不仅可以首次区分SUMO E2或E3的特异性底物，有利于加深对整个SUMO化信号转导通路的理解，而且为进一步发现特定SUMO E3的新底物，以及开发针对E3的药物奠定了理论基础。

附图说明

图1为人体内SUMO家族及Ub的氨基酸序列比对图

图2为SUMO的传递过程

图3为正交的SUMO传递途径

图4cDNA以及总RNA凝胶电泳图

图5为野生型SUMO、SAE和Ubc9构建测序比对图

图6为野生型SUMO、SAE和Ubc9的原核蛋白表达图

图7为野生型SUMO、SAE和Ubc9的反应活性验证图

图8为突变型SUMO构建测序对比图

图9为突变型SUMO与野生型SAE的反应活性验证图

具体实施方式

本发明的研究内容主要由两大部分组成：第一部分是验证野生型SUMO(wtSUMO)、野生型SAE(wtSAE)和野生型Ubc9(wtUbc9)的反应活性，以作为SUMO突变体反应的阳性对照。提取总RNA获得cDNA，从cDNA中分别通过PCR调取wtSUMO、wtSAE和wtUbc9的目的基因，并构建进入PET28a载体中，转化进入大肠杆菌原核表达后，通过western反应验证wtSUMO与wtSAE和wtUbc9皆有反应活性；第二部分是以点突变的方式构建不与wtSAE反应的SUMO突变体(xSUMO)。根据SUMO与SAE的直接结合位点及SUMO与UB的序列比对信息确定SUMO的突变位点，设计含有突变位点的引物，利用wtSUMO作为模板，通过PCR得到不同的xSUMO片段，构建进入PET28a载体，然后进行原核表达，分别与wtSAE反应，通过western反应验证xSUMO与wtSAE的反应活性，最后得到不与野生型E1反应的SUMO突变体xSUMO5(R70E,Y91A,E93R)。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1总RNA提取及cDNA获取

将293细胞(中国科学院细胞库)计数后，800rpm离心3min，按照10⁶细胞/mlTRIzol加入TRIzol(Thermo Scientific)，用移液枪反复吹吸溶解细胞。12000g，4℃离心十分钟(除脂肪组织等不溶物)，将上清液转移到干净的离心管中。将上述上清室温裂解5min。按0.2ml氯仿/ml TRIzol的比例加入氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡，然后冰上静置10min。4℃，12000r/min，离心十分钟，离心后分为三层，注意吸取上层水相于新的离心管中，注意不要吸到中间界面。加入500ul/ml TRIzol的比例加入异丙醇，充分混匀，冰上静置10min。4℃，12000r/min，离心十分钟，弃去上清液。用DEPC水配置的75％乙醇洗涤沉淀(将底部沉淀小心吹起)，7500g，4℃离心5min，离心后直接倒去乙醇，将离心管倒扣在放在桌面上的吸水纸上，在纸上扣干。再次乙醇洗涤，离心，倒去乙醇，并直接将离心管倒扣在放在桌面上的吸水纸上，在纸上扣干。室温干燥5-10min。用EDPC水溶解干燥后的RNA，测RNA浓度，取2ul跑胶验证(EDPC水配胶及电泳液)，其余部分RNA直接进入cDNA合成部分。

TOYOBO Rever Tra Ace qPCR RT kit逆转录试剂盒进行逆转录PCR(所需仪器：PCR仪),取1ul测cDNA浓度，并跑胶验证。

结果如图4所示，可见已经成功获得了RNA和cDNA。

实施例2 wtSUMO、wtSAE和wtUbc9的质粒构建

(1)以提取的cDNA为模板，进行PCR扩增：

在wtSUMO蛋白前融合HA小肽，作为后期western验证的抗体标签。设计wtHA-SUMO的上下游引物。

表1目的基因及其引物

50ul反应体系为：1ul wtSUMO,1ul上游引物(10uM),1ul下游引物(10uM)，25ulrTaq Mix,22ul ddH20。将PCR反应体系的样品加好并混匀后，放入PCR仪中，程序如下：预变性94℃反应2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，反应35个循环，最后72℃延伸7分钟，4℃暂存。

(2)样品凝胶电泳：

全部样品上样电泳(根据DNA分子量大小，配置1％琼脂糖凝胶)，110V，30分钟。跑胶完成后，将凝胶置于凝胶成像仪中紫外下观察，拍照观察后，切取对应位置(约300bp)的PCR片段，使用Omega Gel Exstraction Kit回收纯化，使用微量分光光度计测定回收浓度。

(3)将wtSUMO PCR产物和载体质粒PET28a用限制性内切酶NheI和XhoI进行酶切、连接并验证：

30ul酶切体系如下：200ng wtSUMO PCR片段/1ug PET28a，1ul NheI，1ul XhoI,3ul 10X buffer,加dd H20补齐至30ul。37℃水浴反应3小时。

对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像仪紫外下从凝胶中切取对应位置的载体片段，使用Omega Gel Extraction Kit回收纯化。

利用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)对Insert和Vector进行连接，10ul连接体系如下：7ul wtSUMO酶切片段，1ul PET28a酶切片段，1ul 10x T4 buffer，1ul T4ligase。混匀后室温反应1小时，取4ul用于转化DH5α感受态细胞(上海淳麦生物科技有限公司)。将4ul连接产物与50ul左右的DH5α感受态细胞小心混匀，冰敷30分钟后，42℃热激90秒，之后置于冰上复苏2分钟，加入1ml SOC培养基，于37℃摇晃培养1小时，取400ul复苏液体涂布卡那抗生素板子，并在37℃细菌培养箱培育过夜。

培养过夜后，挑取3个单克隆接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，220rpm/min振荡培养过夜，使用质粒小提试剂盒小量制备质粒DNA，测序(金唯智)。然后将测序结果与模板序列比对，确定目标序列是否成功构建。

wtSAE、wtUbc9的构建流程同上。

结果如图5所示，表明wtSUMO、wtSAE和wtUbc9皆成功构建。

实施例3 wtSUMO、wtSAE和wtUbc9的原核表达与纯化

取4ul wtSUMO质粒与50ul BL21(DE3)感受态细胞(上海康朗生物科技有限公司)小心混匀，同上述方式进行化学转化，最后取400ul复苏液体涂布于卡那抗生素板子，并在37℃细菌培养箱培育过夜。挑一个单克隆进入10ml LB(Kana)中，经37℃过夜摇晃后，转入1L LB(Kana)中，37℃摇晃培养至细菌密度OD600＝0.6-0.8，加入1ml IPTG(1M)，16℃低温过夜诱导16h。

隔日收集细菌，4℃，7000rpm菌液离心10分钟，倒尽上清液后，加入10ml lysisbuffer重悬离心瓶底的菌体沉淀，依次加入10ul MgCl₂、10ul CaCl₂和5mg溶菌酶，并充分混匀。用高压破碎仪充分裂解菌体，将所得裂解液4℃，12000rpm离心30分钟。小心将上清液转移进入另一个15ml离心管中，加入1ml含有镍的亲和填料液体，旋转充分结合2小时。采用重力柱洗脱的方式，将此混合液体倒入重力柱中，依次加入15ml lysis buffer润洗一次，15ml wash buffer洗涤三次,最后加入4ml elution buffer，静止15min后洗脱，得到HA-SUMO的蛋白液体。取40ul洗脱液，加入10ul 5X蛋白上样缓冲液,于金属浴99℃加热10分钟使蛋白变性。样品取10ul在10％蛋白胶进行上样，以90V，100分钟进行SDS-PAGD电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝染料染色半小时，过夜脱色，隔日观看蛋白的表达情况。

将剩余蛋白洗脱液装入透析袋中，过夜透析后，分装至PCR管中，每管100-200ul，冻存于-80℃超低温冰箱中备用。

wtSAE和wtUbc9的原核表达及纯化同上。

结果如图6所示，表明wtSUMO、wtSAE和wtUbc9皆成功表达。

实施例4 Western blot实验验证野生型蛋白活性

利用BCA工作法测定蛋白质浓度，并根据浓度设置50ul反应体系：5uM SUMO,1uMSAE,1uM Ubc9,1mM ATP,10mM MgCl₂,并用TBS buffer补齐至50ul，室温反应1小时。每个样品加入12.5ul 5X蛋白上样缓冲液，于金属浴99℃加热10分钟使蛋白变性。

进行Western blot实验前，每种样品先取12ul上样，以90V,90分钟的条件进行SDS-PAGE电泳，胶浓度为8％。待电泳结束后，将SDS-PAGE胶小心从玻璃板上切下，准备转膜。将转膜用的夹子在盛有转膜液的水槽中打开，在两侧的海绵垫上分别铺2层滤纸，在水中打湿，按照“黑胶白膜”的方式将SDS-PAGE胶和0.45um的NC膜贴合在滤纸上，使转膜液没过胶和膜，保证NC膜可以完全覆盖胶上的Marker及样品条带，并用楔子赶走胶与膜之间的气泡。将夹子夹紧后随转膜液一起倒入电泳槽中，并将整个电泳槽插入冰中，防止转膜过程中温度过高。调节电压100V转膜75分钟。转膜完成后用丽春红染色初步观察转膜情况，然后将丽春红洗去，并将NC膜放于5％的脱脂奶粉中常温封闭一小时。封闭结束后，洗去NC膜上残留的牛奶，将膜置于含有Rabbit-HA一抗的塑封袋中，去除干净塑封袋中的气泡，4℃过夜孵育。隔日将NC膜置于1xTNET溶液中，洗膜3次，每次15分钟。洗膜充分后，将膜置于含有R800荧光二抗的塑封袋中，避光孵育1小时。用上述同一方法洗去未结合的二抗，最后利用Odyssey双色红外荧光成像系统进行扫膜观察结果。

结果如附图7所示，wtSUMO与wtSAE和wtUbc9皆出现结合条带，说明三个野生型蛋白皆有反应活性。

实施例5 xSUMO的质粒构建、表达纯化及活性验证

基于以上突变位点的信息，先后依次设计了7个不同的SUMO突变体，具体如表2：

表2突变体及其突变位点

SUMO mutant	Mutation residues	Reactive with wtSAE？
			xSUMO 1	E93R	Yes
xSUMO 2	R63E,E93R	Yes
			xSUMO 3	R63E,R70E,E93R	Yes
xSUMO 4	R70E,E93R	Yes
			xSUMO 5	R70E,Y91A,E93R	No
xSUMO 6	Y91A,E93R	Yes
			xSUMO 7	Y91A	Yes

以其中一个为例：首先设计含有相应突变点的上下游引物，根据上述技术方法，以wtSUMO为模板，PCR得到相应xSUMO的目的基因，构建进入PET28a质粒中，然后进行原核表达，在ATP和Mg²⁺的参与下与wtSAE反应，最后通过Western验证其与野生型SAE的反应活性。

以突变体xSUMO1为例(具体未标明的实验条件参考前述实施例请)：首先设计含有相应突变点(E93R)的上下游引物，以wtSUMO为模板，在50ul的反应体系中再加入相应的上下游引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)和rTaq Mix，设置对应的程序，PCR得到xSUMO1的目的基因。利用1％琼脂糖胶电泳分离xSUMO1的PCR片段，在紫外成像仪下切下xSUMO1的片段条带。用限制性内切酶NheI和XhoI分别对PCR产物和PET28a进行酶切及片段回收，并将Insert和Vector进行连接。酶连产物化转进入DH5α，涂布于卡那LB板子中，隔日挑取3个单克隆小摇，提取质粒送测序，直至获得引入所设计突变位点的xSUMO1。

将构建成功的xSUMO1质粒，化学转化进入BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达及纯化。得到相应的蛋白样品后，利用BCA测定法测定其蛋白浓度，根据蛋白浓度设置50ul反应体系，加入一定浓度的xSUMO1、wtSAE、ATP、Mg²⁺和TBS buffer，室温反应1小时，最后通过Western blot验证xSUMO1与野生型SAE的反应活性。

其余6个SUMO突变体的构建(引物如表3)、表达及验证与此类似。

表3目的基因及其引物

结果如图8，为7个SUMO突变体与wtSUMO的核酸序列比对图，说明7个SUMO突变体均成功构建。

Western验证结果如附图9所示，7个SUMO突变体只有xSUMO5(R70E,Y91A,E93R)与wtSAE没有反应活性，表明成功构建了不与野生型SAE反应的SUMO突变体xSUMO5。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 突变体xSUMO及其相关产品

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagcatgcta gctctgacca ggaggcaaaa 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtatctcg agctaacccc ccgtttgttc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgatggta ccatggtgga gaaggaggag 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcgatctcg agtcaatcta atgctatgac atc 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctatgcta gctcggggat cgccctcagc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgcgctcg agttatgagg gcgcaaactt 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagcatgcta gctctgacca ggaggcaaaa 30

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagcatctcg agctaacccc ccgtttgtct ctgataaact tcaatcac 48

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcagcgaat tcactcgaat ttctctttga gggtcag 37

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tagcatctcg agctaacccc ccgtttgtct ctgataaact tcaatcac 48

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcagcgcga attcactcga atttctcttt gagggtcagg aaattgctga taatcatac 59

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagcatctcg agctaacccc ccgtttgtct ctgataaact tcaatcac 48

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtcagcgcga attcactcag gtttctcttt gagggtcagg aaattgctga taatcatac 59

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagcatctcg agctaacccc ccgtttgtct ctgataaact tcaatcac 48

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcagcgcga attcactcag gtttctcttt gagggtcagg aaattgctga taatcatac 59

<210> 16

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagcattact cgagctaacc ccccgtttgt ctctgagcaa cttcaatcac atc 53

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tagcatgcta gctctgacca ggaggcaaaa 30

<210> 18

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tagcattact cgagctaacc ccccgtttgt ctctgagcaa cttcaatcac atc 53

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tagcatgcta gctctgacca ggaggcaaaa 30

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tagcatgact cgagctaacc ccccgtttgt tcctgagcaa cttcaatcac atc 53

<210> 21

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgtctgacc aggaggcaaa accttcaact gaggacttgg gggataagaa ggaaggtgaa 60

tatattaaac tcaaagtcat tggacaggat agcagtgaga ttcacttcaa agtgaaaatg 120

acaacacatc tcaagaaact caaagaatca tactgtcaaa gacagggtgt tccaatgaat 180

tcactcaggt ttctctttga gggtcaggaa attgctgata atcatactcc aaaagaactg 240

ggaatggagg aagaagatgt gattgaagtt gctcagagac aaacgggggg ttag 294

<210> 22

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Ser Asp Gln Glu Ala Lys Pro Ser Thr Glu Asp Leu Gly Asp Lys

1 5 10 15

Lys Glu Gly Glu Tyr Ile Lys Leu Lys Val Ile Gly Gln Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Ile His Phe Lys Val Lys Met Thr Thr His Leu Lys Lys Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Tyr Cys Gln Arg Gln Gly Val Pro Met Asn Ser Leu Arg Phe

50 55 60

Leu Phe Glu Gly Gln Arg Ile Ala Asp Asn His Thr Pro Lys Glu Leu

65 70 75 80

Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu Gln Thr Gly

85 90 95

Gly His Ser Thr Val

100

Claims

1.一种突变体xSUMO，其特征在于，所述突变体xSUMO相对于野生型SUMO具有以下突变位点：第70位R被E取代、第91位Y被A取代以及93位E被R取代，所述突变体xSUMO编码基因的具体序列如SEQ ID No.21所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述突变体xSUMO。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种生物工程菌，其特征在于，所述生物工程菌含有如权利要求3所述的重组表达载体，或者其基因组内整合有如权利要求2所述的多核苷酸。