CN101748121A - 蛋白质类泛素化修饰(sumo)缺失型模式生物体斑马鱼模型及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型及其建立方法，该模型利用Morpholino技术在模式生物体斑马鱼早期胚胎发育过程中将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段单一或联合显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中以单独或联合沉默各SUMO亚型基因的表达而建立。

Description

蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型及其建立方法

技术领域

本发明涉及蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型及其建立方法。

背景技术

蛋白质类泛素化修饰(Small Ubiquitin-Related Modifier，SUMO)是一种与泛素化修饰过程极其相似的小分子蛋白质翻译后修饰。越来越多的蛋白质被发现存在SUMO化修饰，它们涉及细胞生命活动的各个方面，如蛋白质稳定性、转录调控、蛋白质定位、信号转导、染色体分离、细胞周期调控和病毒感染应答等(Gill，G.(2005)Somethingabout SUMO inhibits transcription.Current opinion in genetics &development 15：536-541)。在许多人类疾病如癌症和神经退化性疾病中，SUMO化修饰作用对疾病的发生与发展起着极为重要的作用。因此阐明SUMO化修饰的功能，将为疾病的治疗开辟一条崭新的思路。

蛋白质SUMO化修饰是一个多步骤酶促反应，E1，E2，E3三类酶相继参与此反应过程，最终将SUMO分子共价结合于底物。SUMO激活酶(E1)为Aos1/Uba2，SUMO结合酶(E2)为Ubc9，SUMO连接酶(E3)有PIAS，Pc2，RanBP2三类(Melchior，F.(2000)SUMO--nonclassical ubiquitin.Annual review of cell and developmentalbiology 16：591-626)。

SUMO化修饰途径非常保守。哺乳动物体内存在四种亚型的SUMO：SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。SUMO1由101个氨基酸残基组成，与SUMO2、SUMO3和SUMO4的同源性大约为50％，与泛素分子有18％的同源性。SUMO2、SUMO3和SUMO4之间同源性更高(Guo，D.，Li，M.，Zhang，Y.，Yang，P.(2004)A functionalvariant of SUMO4，a new I kappa B alpha modifier，is associated withtype 1 diabetes.Nature genetics 36：837-841)。不同亚型的SUMO蛋白有各自的特异性，表现在亚细胞定位，底物选择性等方面(Saitoh，H.&Hinchey，J.(2000)Functional heterogeneity of small ubiquitin-relatedprotein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.The Journal of biologicalchemistry 275：6252-6258)。

SUMO化修饰途径中惟一的E2酶Ubc9的功能缺失可引起多种模式生物体发育缺陷和致死。但不同亚型的SUMO蛋白在体内各自的生物功能尚不清楚。在较为低等的且仅有一种类型SUMO表达的生物体中，SUMO对胚胎的正常发育是必需的(Jones，D.，Crowe，E.，Stevens，T.A.，& Candido，E.P.(2002)Functional and phylogeneticanalysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans：ubiquitin-conjugating enzymes，ubiquitin-activating enzymes，andubiquitin-like proteins.Genome biology 3：RESEARCH0002)。而最近的基因敲除(knockout)结果显示SUMO1不是小鼠胚胎发育所必需的(Zhang，F.P.，Mikkonen，L.，Toppari，J.，Palvimo，J.J.(2008)Sumo-1function is dispensable in normal mouse development.Molecular andcellular biology 28：5381-5390)。

发明内容

因此，为了研究不同SUMO亚型各自的功能，本发明运用Morpholino技术在模式生物体斑马鱼早期胚胎发育过程中单独/联合沉默(knockdown)各SUMO亚型基因的表达，以提供蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型，以作为蛋白质翻译后修饰相关药物筛选的动物模型。

本发明的一个目的是提供蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型以及建立该模型的方法。

本发明的蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型利用Morpholino技术在模式生物体斑马鱼早期胚胎发育过程中将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段单一或联合显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中以单独或联合沉默各SUMO亚型基因的表达而建立。

本发明的蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型的建立方法包括将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段单一或联合显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中的步骤以及持续培养并在倒置解剖显微镜下观察整体表型的步骤。

在模式生物体斑马鱼中存在SUMO1、SUMO2和SUMO3三种亚型的SUMO蛋白表达。本研究发现Morpholino基因沉默结果显示，与Ubc9缺失的表型相似，三种亚型SUMO联合缺失的胚胎表现出最为严重的发育缺陷；而基因沉默单一亚型SUMO或联合基因沉默SUMO1/SUMO2的胚胎无明显异常表型；SUMO1/SUMO3或SUMO2/SUMO3联合基因沉默的胚胎发育缺陷率较低。斑马鱼胚胎发育缺陷主要包括头部发育异常，出现小头、小眼和颌部畸型，并且胚胎致死。

因此，本发明还提供所述蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型作为蛋白质翻译后修饰相关药物筛选的动物模型的用途。

附图说明

图1A为斑马鱼胚胎发育各时相UBC9表达谱，

其中，Hpf：受精后小时；lateral：侧向；dorsal：背向；

图1B为斑马鱼胚胎发育各时相SUMO各亚型表达谱，

其中，Hpf：受精后小时；lateral：侧向；dorsal：背向；

图2显示Morpholino寡核苷酸测效结果，

其中，Con：对照；Mis：错配对照；actin：肌动蛋白，A为Morpholino寡核苷酸测效实验结果(a，b，c，d，e，f，g，h，i为荧光显微镜下视野，a’至i’为光学显微镜下同一视野)，B和C均为蛋白印迹(Western blot)结果；

图3显示表型分析，

其中，a，b，c表示倒置光学解剖显微镜下分别注射错配Morpholino寡核苷酸(Mis)；SUMO1，SUMO2，SUMO3 Morpholino寡核苷酸联合注射(MO sumo1-sumo2-sumo3)；注射UBC9 Morpholino寡核苷酸(MO ubc9)的胚胎的表型。d，e，f为同一胚胎Alcian blue染色显示软骨组织结构。g，h分别为注射错配Morpholino寡核苷酸(Mis)；SUMO1，SUMO2，SUMO3 Morpholino寡核苷酸联合注射(MOsumo1-sumo2-sumo3)进行HE染色显示胚胎眼部结构；

图4显示TUNEL实验及pH3(antiphosphorylated histone H3)免疫荧光实验结果，

其中，a，b分别表示注射错配Morpholino寡核苷酸(Mis)；SUMO1，SUMO2，SUMO3 Morpholino寡核苷酸联合注射(MOsumo1-sumo2-sumo3)的胚胎头部TUNEL实验显示凋亡细胞。c，d分别表示这两种胚胎PH3实验结果。e，f为c，d的局部放大细节图。g，h显示注射错配Morpholino寡核苷酸(Mis)；SUMO1，SUMO2，SUMO3Morpholino寡核苷酸联合注射(MO sumo1-sumo2-sumo3)的胚胎头部细胞的流式细胞仪检测结果。i和j显示这两种胚胎躯干细胞的流式细胞仪检测结果；

图5为PCS2+表达载体图谱。

具体实施方式

结合附图，本发明将参照以下实施例进行详细说明，但这不应成为对本发明的限制。

实施例1

1、斑马鱼的养殖

斑马鱼的饲养、繁殖与分龄依照经典方法进行(Kimmel，C.B.，Ballard，W.W.，Kimmel，S.R.，Ullmann，B.(1995)Stages of embryonicdevelopment of the zebrafish.Dev Dyn 203：253-310)。

2、Morpholino(MO)寡核苷酸片段的合成与显微注射

Morpholino(MO)寡核苷酸片段由Gene Tools公司合成。斑马鱼各基因Morpholino寡核苷酸片段序列如下：

SUMO1  MO    GTCTCCGTGTCTGACATGATATTCC

                                      (SEQ ID NO.1)

SUMO2  MO    CATGGTTATTGTATTTGCGCTTCTC

                                      (SEQ ID NO.2)

SUMO3  MO    TAGGCTTGTCTTCGGACATTTTTGC

                                      (SEQ ID NO.3)

Ubc9   MO    TCAGAGCAATGCCAGACATGACCAC

                                      (SEQ ID NO.4)

错配MO(Mismatch MO)  GTGTCCCTGTCTCACATCATATACC

                                      (SEQ ID NO.5)

其中，Ubc9MO作为阳性对照MO；错配MO作为错配阴性对照MO。

将各Morpholino(MO)寡核苷酸片段溶于超纯水中，以如下显微注射剂量，注射入单细胞期的斑马鱼卵中：

单一注射剂量：错配MO，SUMO1 MO，SUMO2 MO，SUMO3MO，Ubc9 MO均为12.46ng/卵。

联合注射剂量：SUMO1/SUMO2 MO，SUMO1/SUMO3 MO，SUMO2/SUMO3，SUMO1/SUMO2/SUMO3MO，各4.15ng/卵。

显微注射后即将胚胎培养于egg溶液(egg solution)中(配方：纯水9升，海盐0.54克，100微升0.2％亚甲基蓝)并置于28.5℃恒温培养箱中持续培养，在附图中所示时相于倒置解剖显微镜下观察表型并进行相关实验，具体相关实验见下文。

3、质粒构建与体外转录

斑马鱼Ubc9和各SUMO基因由RT-PCR(按常规方法抽提斑马鱼总RNA，总RNA提取应用Trizol试剂(Gibco公司)。取1μg RNA用M-MLV(Promega公司)300U进行逆转录，引物使用试剂盒中提供的oligo dT引物。PCR扩增反应总体积为100μl，内含1×buffer，3.75mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、正反向引物各0.35μmol/L、1μl逆转录产物、0.05U/μl高保真Taq DNA聚合酶(Takara公司)。反应程序：95℃2min，1个循环；95℃60s、50℃60s、72℃2min，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。)获得，并克隆入PCS2+表达载体中(PCR扩增产物连接到PCS2+表达载体中，转化DH5α感受态细胞，经平板筛选单克隆，扩增后抽提质粒DNA，然后酶切鉴定。用末端荧光标记法进行DNA序列分析。所获测序结果通过Blast软件与GenBank收录序列进行同源性比较得到正确克隆。)，其中表达载体的结构如图5中所示。

斑马鱼Ubc9和各SUMO基因全长基因的各克隆引物序列如下(其中“For”表示正向引物；“Rev”表示反向引物)：

SUMO1   For    CCGGAATTCATGTCAGACACGGAGACCAAGCCCTC

                                      (SEQ ID NO.6)

        Rev    CCGCTCGAGGCGAGGCTCTCGTGAAGGCAGGTATG

                                      (SEQ ID NO.7)

SUMO2   For    CCGGAATTCCTTTGTGTGGCGGCGTAGAGAAGCGC

                                      (SEQ ID NO.8)

        Rev    CCGCTCGAGGTATCTGAAGCAGAACAAACCCTGAAC

                                      (SEQ ID NO.9)

SUMO3   For    CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC

                                    (SEQ ID NO.10)

        Rev    CCGCTCGAGCTACACCCTCCCTCGATGTTTGCTCTC

                                    (SEQ ID NO.11)

Ubc9    For    CCGGAATTCATGTCTGGCATTGCTCTGAGTCGAC

                                    (SEQ ID NO.12)

        Rev    CCGCTCGAGCTGATCGAGAAGGGGAACAGAGCG

                                    (SEQ ID NO.13)

将各全长基因克隆进行体外转录：用限制酶KpnI消化质粒制备线性模板DNA；用酚：氯仿抽提及乙醇沉淀纯化模板DNA；将DNA溶解于水；在一微量离心管中，室温下以下列顺序混合：模板DNA 1ug，2μl 10×转录缓冲液，2μl噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶(约10单位)，补无RNA酶的水加至20μl。37℃下温育反应物2小时。

RNA转录本用于原位杂交实验。

斑马鱼Morpholino测效质粒克隆序列如下：

测效质粒是指在正式实验前将所要沉默的基因启始密码子ATG左右各约50bp序列与EGFP荧光基因融合入同一质粒中，体外转录出mRNA，将此融合转录本单独或与相应的Morpholino寡核苷酸共注射入单细胞期的斑马鱼卵中，在荧光显微镜下观察共注射Morpholino寡核苷酸的胚胎中EGFP的表达是否消失，以此判断各Morpholino寡核苷酸沉默外源性SUMO分子表达的有效性，判断出各Morpholino寡核苷酸片段的有效性之后即开展正式实验。

采用如下引物将各所需沉默基因用PCR方法扩增出(条件同上)，该克隆包含各基因启始密码子ATG左右各约50bp序列(其中“For”表示正向引物；“Rev”表示反向引物)：

SUMO1   For  CCGGAATTCCTGCTGGTAGCACTAGCAAAACCTCTC

                                     (SEQ ID NO.14)

       Rev   CCGCTCGAGGGTCAGGTTGTCTGTGATTCTCTGTCC

                                     (SEQ ID NO.15)

SUMO2  For   CCGGAATTCGTGTGGCGGCGTAGAGAAG

                                     (SEQ ID NO.16)

       Rev   CCGCTCGAGCTTCAGGTTGATGTGGTCG

                                     (SEQ ID NO.17)

SUMO3  For   CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC

                                     (SEQ ID NO.10)

       Rev   CCGCTCGAGCGCCACCTTCAGATTGATGTG

                                     (SEQ ID NO.18)

将上述SUMO1，SUMO2，SUMO3扩增片段分别按阅读框架插入PCS2-EGFP载体(即在附图中PCS2载体多克隆位点中已插入一个EGFP荧光基因)的多克隆位点中，体外转录出含目的基因与EGFP的融合转录本。将此融合转录本单独或与相应的Morpholino寡核苷酸共注射入单细胞期的斑马鱼卵中，在荧光显微镜下观察共注射Morpholino寡核苷酸的胚胎中EGFP的表达是否消失，以此判断各Morpholino寡核苷酸沉默外源性SUMO分子表达的有效性，单独注射融合转录本的胚胎由于EGFP的表达，会在荧光显微镜下发出绿色荧光；而融合转录本与相应的Morpholino寡核苷酸共注射的胚胎，如果Morpholino能够特异性沉默融合转录本的翻译，那绿色荧光的表达也会随之消失，如果该绿色荧光的表达仍然存在，说明Morpholino不能特异性地沉默目的基因的表达。

4、原位杂交

SUMO1，SUMO2，SUMO3和UBC9各反义RNA探针(用体外转录试剂盒将上述已克隆的各全长基因转录成反义RNA探针)体外合成(Roche)，原位杂交与检测按已报道方法进行(Bennett，C.M.，Kanki，J.P.，Rhodes，J.，Liu，T.X.(2001)Myelopoiesis in the zebrafish，Daniorerio.Blood 98：643-651)。

5、蛋白印迹(Western blot)：

显微注射3天后，提取胚胎细胞总蛋白进行SDS PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜(Invitrogen)，封闭，用肌动蛋白(actin)抗体做为上样量参考(Sigma公司)；SUMO1抗体和SUMO2/3抗体(均为Zymed公司)杂交，SuperSignal West Pico化学发光法试剂盒(Pierce公司)检测，观察各Morpholino寡核苷酸沉默内源性SUMO分子表达的有效性。

6、组织和细胞化学染色

HE和Alcian blue染色均按已报道方法进行(Robu，M.E.，Larson，J.D.，Nasevicius，A.，Beiraghi，S.(2007)p53 activation by knockdowntechnologies.PLoS genetics 3：e78)。

7、细胞凋亡原位检测(TUNEL)实验，pH3免疫荧光实验和流式细胞仪(FACS)检测

TUNEL试剂盒购自Roche公司，按推荐方法进行。

pH3免疫荧光实验试剂盒购自Invitrogen公司，按推荐方法进行。

FACS检测按已报道方法进行(Nowak，M.& Hammerschmidt，M.(2006)Ubc9 regulates mitosis and cell survival during zebrafishdevelopment.Mol Biol Cell 17：5324-5336)。

实验结果

1.SUMO和Ubc9在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱

斑马鱼中存在三种SUMO亚型，这三种SUMO分别和人的相应亚型具有高度的同源保守性。本发明利用全胚胎原位杂交的方法检测了三种亚型的SUMO及Ubc9在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达情况(如图1中所示)。在受精后24小时左右，SUMO及Ubc9全身广泛表达，24小时到48小时，表达主要集中在细胞高增殖区，包括神经系统、眼睛、神经嵴细胞(neural crest cell)、胸鳍芽细胞(pectoral finbud)，到72小时左右，表达则主要集中在鳃弓和消化系统。

2.基因沉默SUMO蛋白的表达导致斑马鱼早期胚胎发育异常

为了研究SUMO在斑马鱼胚胎发育早期的生物学功能，本发明采用了morpholino基因沉默技术。预初实验显示SUMO MO及Ubc9MO能够有效地沉默相应的靶基因表达(如图2中所示)，验证了MO引物的有效性。图2中，A为Morpholino寡核苷酸测效实验结果。结果显示单独注射融合转录本的胚胎和共注射错配Morpholino寡核苷酸的胚胎由于EGFP的表达，会在荧光显微镜下发出绿色荧光；而融合转录本与相应的Morpholino寡核苷酸共注射的胚胎，由于Morpholino能够特异性沉默融合转录本的翻译，绿色荧光的表达也随之消失，说明了我们所用的Morpholino寡核苷酸针对目的基因的有效性。A说明免疫荧光实验显示各亚型特异性Morpholino寡核苷酸有效地阻止了相应SUMO 1，2，3(c，f，i)蛋白质的翻译；B和C均为蛋白印迹(Western blot)结果。胚胎显微注射3天后，提取细胞总蛋白进行Western blot检测，结果显示未注射胚胎和注射错配Morpholino寡核苷酸的胚胎中SUMO和UBC9的表达不变，而注射相应的Morpholino寡核苷酸的胚胎中，SUMO和UBC9的蛋白质表达大大减弱，也说明了我们所用的Morpholino寡核苷酸针对目的基因的有效性。B和C说明蛋白印迹实验同样显示Morpholino寡核苷酸有效地阻止了SUMO(B)和ubc9(C)蛋白质的翻译。当联合基因沉默三种亚型的SUMO后，发育72小时后，胚胎出现表型异常，具体表现为头部及眼睛变小，鳃弓出现异常，而耳部及躯干发育正常。Ubc9基因沉默实验也出现类似表型(如图3中所示)。图3中，当联合基因沉默三种亚型的SUMO后(b)，胚胎出现头部及眼睛变小，鳃弓出现异常，而耳部及躯干发育正常。Ubc9基因沉默实验也出现类似表型(c)。Alcian blue染色结果显示：斑马鱼头部第一到第四鳃弓(gillarch)缩短或缺失，而第五鳃弓仍然存在，鳃弓软骨细胞形态变圆，体积增大(e)。组织化学染色眼部切片显示：眼部细胞各层都存在，仅出现细胞数量减少(h)。Alcian blue染色结果显示：斑马鱼头部第一到第四鳃弓(gill arch)缩短或缺失，而第五鳃弓仍然存在，鳃弓软骨细胞形态变圆，体积增大。

3.SUMO各亚型的缺失导致细胞周期阻滞和细胞凋亡

为了进一步阐述上述表型是由细胞增殖减少或是细胞凋亡增多所引起，我们进行了TUNEL实验及pH3(antiphosphorylated histoneH3)免疫荧光实验(如图4中所示)。TUNEL实验结果显示，联合基因沉默SUMO 48小时后，在中后脑边界及眼部出现大量的凋亡细胞(b)，pH3免疫荧光实验结果显示，这些区域同时出现了大量pH3阳性细胞(d，f)。为了进一步检测细胞周期是否受到影响，流式细胞仪分析显示，头部细胞出现了明显的细胞周期G2/M期阻滞(g，h)，而躯干细胞则没有受到影响(i，j)。

通过上述实验结果证实本发明成功建立了蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型，从而为蛋白质翻译后修饰相关药物的筛选提供了很好的动物模型。

讨论

1.三种亚型的SUMO是斑马鱼胚胎早期发育所必需的

SUMO化修饰在许多细胞生命活动中发挥重要功能。虽然已经有报道证实Ubc9在斑马鱼胚胎早期发育有重要作用，但各SUMO亚型相应的生物学功能仍然未知。这里我们证实了类似于基因沉默Ubc9，联合基因沉默各SUMO亚型导致胚胎早期发育异常并致死。值得注意的是，基因沉默Ubc9后异常胚胎的比率更高于基因沉默SUMO(97.5％vs 84.9％)。提示基因沉默Ubc9的效率更高于联合基因沉默SUMO各亚型，可能是Ubc9除了作为SUMO化途径的E2连接酶外，还具有其他功能。

2.三种亚型的SUMO在斑马鱼胚胎早期发育过程中存在冗余性

与Ubc9基因沉默的表型相似，三种亚型的SUMO联合基因沉默的胚胎表现出最为严重的发育缺陷；而基因沉默单一亚型的SUMO或联合基因沉默SUMO1/SUMO2的胚胎无明显异常表型；SUMO1/SUMO3或SUMO2/SUMO3两两联合基因沉默的胚胎发育缺陷率较低。这与在小鼠与拟南芥菜中沉默某种亚型的SUMO得到的结果相类似(Zhang，F.P.，Mikkonen，L.，Toppari，J.，Palvimo，J.J.(2008)Sumo-1 function is dispensable in normal mouse development.Molecularand cellular biology 28：5381-5390和Saracco，S.A.，Miller，M.J.，Kurepa，J.，& Vierstra，R.D.(2007)Genetic analysis of SUMOylation inArabidopsis：conjugation of SUMO1 and SUMO2 to nuclear proteins isessential.Plant physiology 145：119-134)。提示三种亚型的SUMO在斑马鱼胚胎早期发育过程中存在一定的冗余性。

3.SUMO缺失后造成特异性的细胞周期阻滞和细胞凋亡

最近有报道证实SUMO参与了哺乳动物细胞的有丝分裂过程，SUMO缺失后，可能阻止了姐妹染色单体的正常分离，从而导致了细胞周期阻滞，最终引起细胞凋亡(Zhang，X.D.，Goeres，J.，Zhang，H.，Yen，T.J.(2008)SUMO-2/3 modification and binding regulate theassociation of CENP-E with kinetochores  and progression throughmitosis.Molecular cell 29：729-741)。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120>蛋白质类泛素化修饰(SUMO)缺失型模式生物体斑马鱼模型及其建立方法

<130>DI08-2051-XC37

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtctccgtgt ctgacatgat attcc                            25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catggttatt gtatttgcgc ttctc                            25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

taggcttgtc ttcggacatt tttgc                            25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcagagcaat gccagacatg accac                            25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtgtccctgt ctcacatcat atacc                            25

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccggaattca tgtcagacac ggagaccaag ccctc                 35

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ccgctcgagg cgaggctctc gtgaaggcag gtatg                35

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ccggaattcc tttgtgtggc ggcgtagaga agcgc                35

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccgctcgagg tatctgaagc agaacaaacc ctgaac               36

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccggaattcg cgcgtcttgt gttctaatc                       29

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ccgctcgagc tacaccctcc ctcgatgttt gctctc               36

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccggaattca tgtctggcat tgctctgagt cgac                 34

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ccgctcgagc tgatcgagaa ggggaacaga gcg                  33

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ccggaattcc tgctggtagc actagcaaaa cctctc                36

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ccgctcgagg gtcaggttgt  ctgtgattct ctgtcc               36

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ccggaattcg tgtggcggcg tagagaag                         28

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ccgctcgagc ttcaggttga tgtggtcg                         28

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ccgctcgagc gccaccttca gattgatgtg                       30

Claims (3)

1.一种蛋白质类泛素化修饰缺失型模式生物体斑马鱼模型，其中，该模型利用Morpholino技术在模式生物体斑马鱼早期胚胎发育过程中将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段单一或联合显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中以单独或联合沉默各SUMO亚型基因的表达而建立。

2.一种建立蛋白质类泛素化修饰缺失型模式生物体斑马鱼模型的方法，其包括将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段单一或联合显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中的步骤以及持续培养并在倒置解剖显微镜下观察整体表型的步骤。

3.权利要求1所述的蛋白质类泛素化修饰缺失型模式生物体斑马鱼模型作为蛋白质翻译后修饰相关药物筛选的动物模型的用途。

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