CN106749673B

CN106749673B - 一种融合蛋白、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN106749673B
Application number: CN201611044569.3A
Authority: CN
Inventors: 张紫寒; 于文涛; 张震宇; 刘崇东
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhang Zihan
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2036-11-22
Also published as: CN106749673A

Abstract

本发明提供一种融合蛋白、制备方法及其应用。一种融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、连接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通过连接肽与Hsp27蛋白连接。本发明所述融合蛋白可以应用于肿瘤防治药物制备中，具有特异性好、抗原高效等优点。

Description

一种融合蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌是三种恶性肿瘤严重威胁女性生命健康，五年存活率不足50％，子宫颈癌发病率居女性生殖系统肿瘤之首，我国新发病例每年高达15万之多，而且有明显的年轻化趋势，国家已经广泛开展“两癌筛查”，但是仍然未能改善肿瘤患者的预后，女性生殖系统恶性肿瘤是我国中长期科技发展纲要计划攻关的恶性肿瘤之一。女性生殖系统恶性肿瘤的传统治疗为手术、放疗、化疗，但是仅仅有一定疗效，对于晚期或复发患者均不能奏效，目前急需寻找新的治疗方法。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种融合蛋白、制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、连接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通过连接肽与Hsp27蛋白连接。

采用上述方案的有益效果是:

发明人通过蛋白质组学，免疫组化，RT-PCR，western blot等研究方法，发现CLIC1(细胞内氯离子通道蛋白1，氯离子通道蛋白是一组调节基本细胞功能的蛋白，包括细胞膜电位稳定、跨膜转运、维持胞内pH，调节细胞容积)在卵巢癌组织中呈现高表达，CLIC1被发现和细胞周期相关，在细胞G2/M期表达于细胞膜上,应用CLIC 1特异性拮抗剂阻断该离子通道后，细胞的有丝分裂受到影响，细胞周期停滞于G2/M期，推测CLIC1在卵巢细胞周期中参与了调节这一过程，发明人进一步通过建立CLIC1基因敲降和过表达的细胞系，在体外试验中证实CLIC 1在SKOV3和A2780卵巢癌细胞系中呈现高表达，抑制CLIC1的表达可以减少卵巢癌细胞系的增殖及浸润，提示CLIC 1可能是参与卵巢癌发生及淋巴道转移的重要基因之一，在此前国内外均尚未见相关报道。

进一步，发明人将CLIC1基因和人HSP27基因(热休克蛋白27，属于低分子量热休克蛋白家族的成员，HSP27是一个涉及到药物抗性、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，HSP27介导的这些功能可能与其对其它蛋白质的影响有关)通过一段柔性连接肽进行人工融合，合成一种CLIC1-HSP27的融合基因，采用基因联合优化技术在原核表达系统中成功实现了该融合基因的高表达，通过质谱鉴定和亲和层析纯化获得了纯度大于90％的CLIC1-HSP27融合蛋白，该融合蛋白标准品成功解决现有肿瘤细胞裂解物成分复杂，无法保证所诱发抗肿瘤免疫的强度和特异性的缺点，并且成分单一，结构明确，降低成本，方便于工业化生产，为以后的生物学研究打下基础，非常具有应用前景。

进一步，所述融合蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

采用上述方案的有益效果是：有现有技术进行改进，摸索出基因联合优化技术，从密码子优化，mRNA结构优化，基因表达优化三方面联合入手，通过对稀有密码子、mRNA结构、表达菌株的筛选、纯化的温度、诱导度、培养基OD值探索，提高外源基因的表达效率、可溶性和稳定性，提升表达产量和准确性，后期质谱测序与原始预测序列在存在误差的情况下符合率接近100％，传统技术一般为60％-80％左右。

进一步，所述连接肽为柔性连接肽。

采用上述方案的有益效果是：

采用柔性的连接肽有利于：增加产物的稳定性，选甘氨酸作为融合蛋白linker是因为甘氨酸是所有氨基酸中最小且没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥，采用的linker不能太大，否则一是对结构有影响，二是增加了融合蛋白的抗原性。

进一步，所述融合蛋白还包括基因联合优化技术。

采用上述方案的有益效果是：一方面确保目标产物序列的准确性；另一方面提高融合基因表达产物的可溶性和稳定性，提高目标蛋白产量。

基因联合优化技术，本例从密码子优化，mRNA结构优化，基因表达优化三方面联合入手，提升外源基因的表达效率和稳定性。以下是该优化过程所涉及的关键步骤：

1.密码子优化是基因表达优化技术的关键步骤之一，主要涉及mRNA二级结构、稀有密码子、核糖体结合位点等关键因素，基因能否顺利表达与稀有密码子含量、mRNA结构是否阻碍翻译有很大关系。许多motif在基因表达过程中承担着重要的角色，通过仔细研究转录翻译过程，不断阅读基础资料和研究进展，将如下功能性motif纳入到基因联合优化技术中：TATA框：是构成真核生物的启动子元件之一，位于转录起始点上游-30bp处，它可以保证转录的正确定位。SD序列:作为原核表达的核糖体绑定位点，是翻译必不可少的信号。Kozak序列：真核生物中符合Kozak规则的基因，其转录及翻译效率较好。Chi序列：在原核生物中能够增加自然重组的几率，可能会影响人工重组蛋白的表达。隐蔽剪切位点：真核生物中存在大量的隐蔽剪切位点，一旦被激活，会造成mRNA的剪接偏离原始预期。

重复序列和GC含量：重复序列过多，会增加基因合成的难度。反向互补序列也对mRNA二级结构有重要影响。相对于AT配对需要2个氢键，GC配对是3个氢键，GC含量直接影响着PCR退火温度。在启动子等保守区域GC含量相对较高。GC含量也影响着mRNA热力学稳定性及mRNA二级结构.本例对融合基因进行了改造,选用大肠杆菌偏爱的密码子,增加了GC含量,去除原序列下影响mRNA稳定的元件。

2.mRNA二级结构优化：mRNA二级结构是影响翻译过程的重要因素，复杂稳定的二级结构会阻碍翻译过程的顺利进行，特别是核糖体绑定位点(RBS)附近的二级结构。mRNA的二级结构预测是一个复杂的过程，需要考虑碱基配对、自由能等多种因素，本例通过识别发卡结构区并进行有效规避。

密码子偏好性：不同物种的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的。在外源基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，外源基因的表达水平会显著提高。

限制性酶切位点:限制性酶切位点需要根据实际情况进行排除，以免与需要用到的酶切位点产生冲突，影响重组基因的操作。

3.表达条件优化:基因表达优化的目的在于通过重组基因技术表达出尽可能接近天然构象的重组蛋白质。重组蛋白表达的关键要素包括基因、载体、表达宿主、表达培养条件。这些要素之间是相互影响的，所以为了更好地达到优化的目的，需要将目标放到其所在上下文中进行优化。表达条件的优化对目标蛋白的表达量及表达质量同样也起到至关重要的作用，包括以下几点：

亲和标签的选择:亲和标签已经成为重组蛋白表达及纯化的一个重要且有效的工具。它们不仅有利于融合蛋白的检测与纯化，而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响，可以提高重组蛋白的表达水平，增强重组蛋白的可溶性，促进重组蛋白的正确折叠。像GST、MBP、Ub、Sumo可以明显提高重组蛋白的表达水平。在融合亲和标签进行原核表达的过程中，某些高度可溶的蛋白标签具有提高融合蛋白可溶性的能力，如GST、MBP、Sumo、NusA等，本例研究和使用最清楚的增强融合蛋白可溶性的标签有Mbp和NusA，促进蛋白正确折叠的标签有MBP、NusA和Trx。亲和标签还可能抑制融合蛋白的水解、保护融合蛋白的抗原性。

大肠杆菌中表达条件的优化：为了提高大肠杆菌的重组蛋白表达水平，抑制包涵体的生成可以选用特定表达菌株、与分子伴侣共表达、降低目标蛋白表达温度、调整诱导温度等手段优化蛋白表达。本发明采用0.5mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，15℃诱导16h达到最佳诱导条件。

本发明提供一种编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

本发明提供一种包括上述核苷酸序列的载体、重组细胞或重组菌。

本发明提供一种融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建包括SEQ ID NO.2核苷酸序列的表达系统，利用该表达系统表达融合蛋白。

所述的表达系统既可以是原核表达系统，也可以是真核表达系统。例如：大肠杆菌体系、昆虫或哺乳动物细胞表达体系等等。

进一步，还包括将表达系统表达的融合蛋白进行亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白。

采用上述方案的有益效果是：进一步提高融合蛋白的纯度。

一种上述的融合蛋白在肿瘤防治药物制备中的应用。尤其可以用于人卵巢癌防治药物的制备。

一种疫苗，包括上述的融合蛋白和药学上可接受的载体。

所述的药学上可接受的载体，例如：可以为聚乳酸-羟基乙酸微球等等。

采用上述方案的有益效果是：使所生产的肿瘤疫苗具有低成本，结构单一准确，特异性好、抗原高效等优点。

附图说明

图1为融合蛋白在BL21(DE3)中的表达结果，箭头指目标蛋白，LaneM为SDS-PAGE蛋白marker；Lane0为对照，对照为未加诱导剂；Lane1为15℃诱导过夜的结果；Lane2为28℃诱导过夜的结果；Lane3为37℃诱导过夜的结果。

图2为通过SDA-PAGE分析融合蛋白上清纯化的结果；LaneM为SDS-PAGE蛋白marker；Lane1为全菌破菌离心后上清；Lane2为上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane 3-4为50nm浓度的咪唑的洗脱组分，Lane 5-7为100nm浓度咪唑的洗脱组分，Lane 8-13为300nm浓度咪唑的洗脱组分。

图3为分别利用SDS-PAGE和Western Blot对融合蛋白质检结果，Lane1为BSA(1.0ug)；Lane2为融合蛋白(1.0ug)；LaneM₁为SDS-PAGE蛋白marker；LaneM₂为Western Blotmarker。

图4为融合蛋白质谱鉴定的结果。

图5为pET30a CLIC1-HSP27的质粒图谱。

图6为实施例3的检测结果。

图7为CLIC1-HSP27激活的T细胞对SKOV3(24、48h)细胞系迁移能力的影响的结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下面通过一些具体的实施例来进行进行介绍。

各实施中采用的实验材料及仪器介绍如下：

质粒抽提试剂盒、DNA回收试剂盒(天根生化公司)，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶(宝生物公司)，酵母提取物、蛋白胨(OXOID)，电泳相关试剂(Tris，Acr，Bis，AP,TEMED等)(Sigma)，0.22um滤器及透析袋(Millipore)，IPTG及抗生素(Amersco)，Ni-IDA树脂，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)，DNA合成仪(MerMade-192),PCR仪(ABI)，电泳仪(Bio-Rad),超声细胞破碎仪(宁波新芝生物)，高速冷冻离心机(湖南湘仪),四维旋转混合仪(海门其林贝尔)ABI 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪。

实施例1构建并表达纯化融合蛋白

1、对CLIC1和HSP27进行密码子优化和基因合成。

设计目标核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该核苷酸序列可以编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.委托南通大学医学院采用全基因合成的方法获得SEQ ID NO.2所示的基因片段，命名为CLIC1-HSP27基因。

3、利用限制性内切酶Nde I和Hind III分别酶切CLIC1-HSP27基因和表达载体pET30a，将CLIC1-HSP27基因插入到表达载体pET30a中，获得重组质粒，命名为pET30aCLIC1-HSP27，pET30a CLIC1-HSP27的质粒图谱如图5所示。质粒构建中，基因和载体的比例及一些相关条件如下(20ul反应体系)：

COMPONENT	20μl REACTION
		10X T4 DNA Ligase Buffer	2ul
Vector DNA	50ng
		Insert DNA	50ng
Nuclease-free water	To 20ul
		T4 DNA Ligase	1ul

具体操作为：步骤a.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。步骤b.16℃孵育连接过夜。

4、将重组质粒pET30a CLIC1-HSP27转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后将转化后的细胞均匀涂布到LB平板上(含有50ug/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50ug/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，之后分别置于15℃、28℃、37℃诱导表达。

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm,取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色,随后转入脱色液中,脱色至背景清晰。结果见图1。

5、CLIC1-HSP27蛋白放大培养,培养3L的表达菌，生长至OD600＝0.8时，加终浓度0.5mM IPTG，15℃诱导16h后收集菌体。

上清中亲和层析纯化CLIC1-HSP27蛋白(整个纯化过程在低温下操作)全菌采用50mM Tris(pH8.0),150mM NaCl含1％Triton X-100,1ug/mL Pepstatin A,1ug/mLLeupeptin超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0),150mM NaCl缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度(Lane 3-4为50nm浓度的咪唑的洗脱组分，Lane 5-7为100nm浓度咪唑的洗脱组分，Lane 8-13为300nm浓度咪唑的洗脱组分)咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图2。

6经Ni-IDA亲和层析纯化，目标蛋白CLIC1-HSP27主要存在于洗脱组分Lane 8-1中，收集上述目标蛋白将其透析到1X PBS,10％Glycerol,pH7.4中,透析结束后用0.22um膜过滤，并分装冻于-80℃。

7、CLIC1-HSP27蛋白质检见图3。

利用SDS-PAGE对融合蛋白质检的方法为：SDS-PAGE纯度评估来源于R250染色的SDS-PAGE胶。

利用Western Blot对融合蛋白质检，方法为：用His单抗和His标签结合，二抗偶联HPR再和His单抗结合最后显影检测目标蛋白。

根据图3的结果可以说明融合基因成功表达，分子量在预测范围之内。

8、融合蛋白质谱鉴定的结果见图4。

质谱鉴定的条件为：

使用仪器：ABI 4800 MALDI-TOF/TOF，采用碰撞诱导裂解(CID)二级质谱(MS/MS)，鉴定覆盖的肽段、对蛋白含量和置信度的综合打分。

根据图4的结果可以看出，目标蛋白原始序列覆盖率95.17％，由于本身存在肽段电离的误差，结果说明表达产物的序列准确可靠。

实施例2

通过白细胞分离标准程序获得周边血单核细胞，体外与该重组蛋白CLIC1-HSP27共培养，获得被该重组蛋白CLIC1-HSP27活化的抗原提呈细胞(APCs)及杀伤淋巴细胞，抗原呈递细胞则将PAP蛋白消化为多肽而呈现于其表面，可被免疫系统T细胞识别，识别该抗原后的T细胞能找到并杀灭体内表达CLIC1抗原的癌细胞。

实施例3

Elisa法检测CLIC1-HSP27负载树突细胞激活的T淋巴细胞上清中的TGF-β含量(TGF-β是T细胞活化时分泌的一种细胞因子)，检测结果如图6所示，血样A、血样B和血样C分别来自不同人的外周血。从图6中可以看出，CLIC1-HSP27和对照组(空白对照组)相比，，CLIC1-HSP27刺激组的TGF-β的含量显著上升(pg/ml)。

实施例4CLIC1-HSP27激活的T细胞对SKOV3细胞的迁移能力的影响

划痕试验检测试验组(空白T细胞)和对照组(50μg/ml CLIC1-HSP27激活T细胞)24和48小时对SKOV3细胞的迁移能力的影响。如图7所示，与对照组相比，试验组24和48小时细胞迁移的数量和距离均下降。

本例使用独创的基因联合优化技术，从密码子优化，mRNA结构优化，基因表达优化三方面联合入手，通过对稀有密码子，mRNA结构，表达菌株的筛选，纯化的温度、诱导度、培养基OD值探索，提高外源基因的表达效率、可溶性和稳定性，提升表达产量和准确性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>张震宇

<120>一种融合蛋白、制备方法及其应用

<160>2

<210>1

<211>414

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221> CLIC1-HSP27蛋白

<400>1

MHHHHHHTER RVPFSLLRGP SWDPFRDWYP HSRLFDQAFG LPRLPEEWSQ

1 11 21 31 41

WLGGSSWPGY VRPLPPAAIE SPAVAAPAYS RALSRQLSSG VSEIRHTADR

51 61 71 81 91

WRVSLDVNHF APDELTVKTK DGVVEITGKH EERQDEHGYI SRCFTRKYTL

101 111 121 131 141

PPGVDPTQVS SSLSPEGTLT VEAPMPKLAT QSNEITIPVT FESRAQLGGP

151 161 171 181 191

EAAKSDETAA KGGGSGGGSD TKRRTETVQK LCPGGQLPFL LYGTEVHTDT

201 211 221 231 241

NKIEEFLEAV LCPPRYPKLA ALNPESNTAG LDIFAKFSAY IKNSNPALND

251 261 271 281 291

NLEKGLLKAL KVLDNYLTSP LPEEVDETSA EDEGVSQRKF LDGNELTLAD

301 311 321 331 341

CNLLPKLHIV QVVCKKYRGF TIPEAFRGVH RYLSNAYARE EFASTCPDDE

351 361 371 381 391

EIELAYEQVA KALK

401 411

<210>2

<211>1031

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223> CLIC1-HSP27基因

<400>2

atgcaccacc atcatcatca caccgagcgg agagtgccct tcagcctgct gaggggccct 60

tcttgggacc ccttcagaga ttggtacccc cacagcaggc tgttcgatca ggcctttggc 120

ctgcctagac tgccagaaga gtggagtcag tggctgggag gaagcagttg gccaggatac 180

gtcagacctc tgcctccagc agccattgaa tctccagccg tggcagctcc agcctatagc 240

agagccctga gcagacagct gtctagcggc gtgtccgaga tcagacacac cgcagatcgc 300

tggagagtgt ctctggacgt gaaccacttc gccccagacg agctgacagt gaagaccaag 360

gacggcgtgg tggagatcac cggaaagcac gaggagaggc aggacgaaca cggatacatc 420

agccgctgct tcacccggaa gtacaccctg cctccaggag tggatcctac ccaggtgtcc 480

tctagcctga gcccagaagg aaccctgacc gtggaagccc ctatgcctaa gctggccacc 540

cagagcaacg agatcaccat cccagtgacc ttcgagagca gagctcagct gggaggacca 600

gaagcagcca aaagcgacga gacagccgct aaaggaggag gaagcggagg aggcagcgat 660

accaagagaa ggaccgagac cgtgcagaaa ctctgtccag gcggtcagct ccctttcctg 720

ctgtacggaa ccgaggtgca caccgacacc aacaagatcg aggagttcct ggaggccgtg 780

ctgtgtcctc ctaggtatcc taagctggcc gccctgaacc cagagtctaa cacagccggc 840

ctggacatct tcgccaagtt cagcgcctac atcaagaaca gcaaccccgc cctgaacgac 900

aacctggaga agggcctgct gaaagccctg aaggtgctgg acaactacct gaccagccct 960

ctgccagagg aagtggacga aaccagcgcc gaagacgaag gagtgtctca gcggaagttc 1020

ctggacggaa a 1031

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包括CLIC1蛋白、连接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通过连接肽与Hsp27蛋白连接，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的核酸。

3.一种包括权利要求2所述核酸的载体、重组细胞或重组菌。

4.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建包括SEQ ID NO.2核苷酸序列的表达系统，利用该表达系统表达融合蛋白。

5.根据权利要求4所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，还包括将表达系统表达的融合蛋白进行亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白。

6.权利要求1所述的融合蛋白在治疗卵巢癌药物制备中的应用。

7.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。