CN108084256A - 降钙素原突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

降钙素原突变体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降钙素原突变体，该降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该降钙素原突变体具有将SEQ ID No:1所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有降钙素原突变体的稳定性的氨基酸序列；其中所述降钙素原突变体片段结构为降钙素原氨基多肽‑连接臂1‑降钙素‑连接臂2‑降钙蛋白，所述连接臂1为‑Ala‑Gly‑，所述连接臂2为‑Ala‑Gly‑Ala‑Gly‑。本发明还公开了该降钙素原突变体的制备方法和用途。本发明通过对天然降钙素原蛋白中的2个水解位点58‑59aa和92‑95aa进行替换，得到了一种降钙素原突变体，提高了降钙素原体外稳定性。同时本发明采用柔性连接臂替换上述水解位点，使获得的降钙素原突变体保留天然降钙素原蛋白的抗原性。

Description

降钙素原突变体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种降钙素原突变体及其制备方法和用途。
背景技术
降钙素原(procalcitonin，PCT)是一个小分子蛋白，含有116个氨基酸残基，分子量为大约13kDa。降钙素通常由甲状腺C细胞产生，经过连续的裂解后行成3个分子：N端部分(N端PCT，57个氨基酸残基)、降钙素(32个氨基酸残基)和抗钙素(21个氨基酸残基)。血清中PCT水平可以作为鉴定细菌感染程度和抗生素指导使用的临床指标，在提示细菌感染及其感染程度、判断治疗效果、指导抗菌药物治疗等方面发挥了重要的作用。
目前用于检测PCT的方法有酶免法、免疫化学发光法、放射免疫法等，这些方法中都需要用到不同浓度的重组的PCT抗原作为标准品，制作标准曲线，从而计算样品中PCT的含量，然而目前重组PCT在体外极不稳定，容易降解，极大地影响临床PCT标准品的稳定性及样本检测结果的准确性。现有研究显示PCT在高尔基体中，经系列水解酶作用最终可形成PCT氨基多肽(1-57aa)、降钙素(60-91aa)及降钙蛋白(96-116aa)。由此推断出看出58-59aa和92-95aa为水解位点，这些水解酶位点的存在极可能是导致PCT参考品不稳定的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于对天然降钙素原蛋白进行改造，在保持原有天然降钙素原活性的同时，使改造后的降钙素原蛋白突变体在稳定性方面有显著提高。
本发明提供了一种降钙素原突变体，该降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该降钙素原突变体具有将SEQ ID No:1所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有降钙素原突变体的稳定性的氨基酸序列；其中所述降钙素原突变体片段结构为降钙素原氨基多肽-连接臂1-降钙素-连接臂2-降钙蛋白，所述连接臂1为-Ala-Gly-，所述连接臂2为-Ala-Gly-Ala-Gly-。
在一个优选实施例中，所述降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种编码降钙素原突变体的基因，所述基因具有SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有编码SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一个优选实施例中，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有如权利要求3所述的基因。
本发明还提供了一种降钙素原突变体的制备方法，包括以下步骤：
a.降钙素原突变体氨基酸序列的设计：采用连接臂1-Ala-Gly-和连接臂2-Ala-Gly-Ala-Gly-分别替换天然降钙素原蛋白位于58-59aa序列-Lys-Arg-和位于92-95aa序列-Gly-Lys-Lys-Arg-，获得序列SEQ ID No:1；
b.降钙素原突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对序列SEQ IDNo:1进行人工优化，得到SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的降钙素原突变体基因；
c.降钙素原突变体表达载体的构建：将步骤(b)中获得到大肠杆菌的降钙素原突变体基因序列用NheI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-30a(+)载体进行连接，得到表达载体；
d.降钙素原突变体的表达纯化：将步骤(c)中获得表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到降钙素原突变体表达菌株，进行培养、诱导表达以及纯化，最终获得所述降钙素原突变体蛋白。
本发明另一方面提供了上述降钙素原突变体在制备降钙素原抗原中的用途。
本发明另一方面提供了上述的降钙素原突变体在降钙素原检测试剂中标准曲线绘制中的用途。
本发明通过对天然降钙素原蛋白中的2个水解位点58-59aa和92-95aa进行替换，得到了一种降钙素原突变体，提高了降钙素原体外稳定性。同时本发明采用柔性连接臂替换上述水解位点，使获得的降钙素原突变体保留天然降钙素原蛋白的抗原性。
附图说明
图1为阳性克隆鉴定结果的核酸电泳图；
图2为超声后上清的SDS-PAGE电泳图；
图3为纯化产物的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
以下本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实
施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1降钙素原突变体氨基酸序列的设计
根据NCBI网站公布的PCT蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，采用柔性连接臂1-Ala-Gly-和连接臂2-Ala-Gly-Ala-Gly-分别替换天然降钙素原蛋白位于58-59aa序列-Lys-Arg-和位于92-95aa序列-Gly-Lys-Lys-Arg-，在保留天然降钙素原抗原性的前提下，获得的降钙素原突变体的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。
实施例2降钙素原突变体基因序列的优化和获得
采用大肠杆菌优势密码子对降钙素原突变体核苷酸序列进行人工优化，最终得到SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的降钙素原突变体基因，具体操作步骤可以参考CN201510085322.5。
实施例3降钙素原突变体表达载体的构建
将实施例2中获得到降钙素原突变体基因序列用NheI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-30a(+)(根据Merck Millipore公司，目录号是69909)的Xho I/Nhe I之间的片段，得到pET-30a(+)-PCT(突变型)。
对重组质粒pET-30a(+)-PCT(突变型)、pET-30a(+)和降钙素突变体基因分别进行Xho I和Nhe I双酶切鉴定，结果如图1所示，其中M：DL5000Marker；1:pET-30a(+)-PCT(突变型)重组质粒双酶切；2：pET-30a(+)质粒双酶切；3；降钙素突变体基因双酶切。由图1可以看出，重组质粒经Xho I和Nhe I双酶切后，电泳均可见到两条与预期分子量大小一致条带，与pET-30a(+)和降钙素突变体基因的大小相符。
实施例4降钙素原突变体表达菌株的构建
从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞BL-21(100μL/支)，迅速冰浴化开；分别取1μL上述重组载体pET-30a(+)-PCT(突变型)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激60秒；4.迅速冰浴2分钟；加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃水浴下复苏培养1h；取100μL全部培养物涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落，二次划线后于37℃培养16小时，提取单菌落小样摇起来6h左右至对数期，IPTG诱导过夜后SDS-PAGE电泳，选取表达目的蛋白量高的菌种进行测序，测序结果正确，此即为成功转化的宿主细胞，命名为BL21/pET-30a(+)-PCT(突变型)。
实施例5降钙素原突变体的表达纯化
将所得阳性克隆BL21/pET-30a(+)-PCT(突变型)接种于含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃，220rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；将第一菌液接种于LB培养基中，于37℃，220rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；于第二菌液中添加终浓度为2mmol/L的IPTG，于32℃，220rpm下培养3小时，得到第三菌液；
将所得第三菌液离心洗涤一遍菌体后(洗涤液为25mM PH 8.5Tris-HCl)，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，M：Marker；1:pET-30a(+)-PCT(突变型)上清，可以看出BL21/pET-30a(+)-PCT(突变型)上清中含有约20KD的目标蛋白PCT抗原。
对所得上清液进行过博格隆5mL Ni柱进行纯化，平衡液为20mM PH 8.0Tris-HCl,分别收集穿过峰，30mM咪唑洗脱液(配方20mM PH 8.0Tris-HCl+30mM咪唑)洗脱峰，60mM咪唑洗脱液洗脱峰(配方20mM PH 8.0Tris-HCl+60mM咪唑)，300mM咪唑洗脱液洗脱峰(配方20mM PH 8.0Tris-HCl+300mM咪唑)。300mM咪唑洗脱峰含有目的蛋白，20mM PH8.0Tris-HCl透析后分装保存(收集原则为紫外检测仪数值上升开始收集，数值出现下降趋势停止收集)。
分别取20μL 300mM咪唑洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，M：Marker；1:pET-30a(+)-PCT(突变型)，从图3蛋白分子量大小与理论大小一致。
实施例6降钙素原突变体稳定性测定
ELISA法双抗体夹心法对上述突变型PCT抗原和对照PCT抗原的稳定性进行检测，将两者分别作为样本进行检测。将本发明所述的降钙素原突变体和作为对照的天然降钙素原抗原与降钙素原单克隆抗体以及HRP标记的降钙素原单克隆抗体进行孵育，形成抗原抗体夹心复合物，再添加AB液进行显色进行孵育，最后加终止液后，450nm波长下读数，即为检测结果。为了便于分析，稳定性实验中本发明降钙素原突变体和对照降钙素原各采用3个浓度梯度进行检测。
表1降钙素原突变体稳定性
表2对照降钙素原稳定性
结果分别如表1、2所示：以0d抗原浓度为参照:37℃破坏3d后，降钙素原突变体和对照降钙素原的稳定率分别为92％左右和70％左右；37℃破坏7d后，两者的稳定率分别为82％左右、37％左右；降钙素原突变体的稳定性显著高于对照降钙素原。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京市华信行生物科技有限公司
<120> 降钙素原突变体及其制备方法和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人类(human)
<400> 1
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr
1 5 10 15
Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Ala Gly Cys Gly Asn Leu Ser
50 55 60
Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr
65 70 75 80
Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Ala Gly Ala Gly Asp
85 90 95
Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro
100 105 110
Gln Asn Ala Asn
115
<210> 2
<211> 348
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 2
gcaccgttcc gttctgcact ggaaagctct ccagcagatc cagcaactct gtctgaagac 60
gaagctcgtc tgctgctggc tgcactggtt caagactacg tacagatgaa agcttctgaa 120
ctggagcaag agcaagaacg tgaaggtagc tctctggatt ctccgcgtag cgcgggttgc 180
ggtaacctga gcacttgcat gctgggtacc tacactcaag acttcaacaa gttccacacc 240
tttccgcaga ctgcaatcgg tgtaggtgca ccagcgggtg caggtgacat gtctagcgat 300
ctggaacgtg atcatcgtcc acatgtgtct atgcctcaga acgctaac 348
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人类(human)
<400> 3
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr
1 5 10 15
Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser
50 55 60
Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr
65 70 75 80
Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp
85 90 95
Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro
100 105 110
Gln Asn Ala Asn
115

Claims (8)

1.一种降钙素原突变体，其特征在于，该降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该降钙素原突变体具有将SEQ ID No:1所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有降钙素原突变体的稳定性的氨基酸序列；其中所述降钙素原突变体片段结构为降钙素原氨基多肽-连接臂1-降钙素-连接臂2-降钙蛋白，所述连接臂1为-Ala-Gly-，所述连接臂2为-Ala-Gly-Ala-Gly-。
2.根据权利要求1所述的降钙素原突变体，其特征在于，所述降钙素原突变体具有SEQID No:1所示的氨基酸序列。
3.一种编码降钙素原突变体的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有编码SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如权利要求3所述的基因。
6.一种降钙素原突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.降钙素原突变体氨基酸序列的设计：采用连接臂1-Ala-Gly-和连接臂2-Ala-Gly-Ala-Gly-分别替换天然降钙素原蛋白位于58-59aa序列-Lys-Arg-和位于92-95aa序列-Gly-Lys-Lys-Arg-，获得序列SEQ ID No:1；
b.降钙素原突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对序列SEQ ID No:1进行人工优化，得到SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的降钙素原突变体基因；
c.降钙素原突变体表达载体的构建：将步骤(b)中获得到大肠杆菌的降钙素原突变体基因序列用NheI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-30a(+)载体进行连接，得到表达载体；
d.降钙素原突变体的表达纯化：将步骤(c)中获得表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到降钙素原突变体表达菌株，进行培养、诱导表达以及纯化，最终获得所述降钙素原突变体蛋白。
7.一种如权利要求1所述的降钙素原突变体在制备降钙素原抗原中的用途。
8.一种如权利要求1所述的降钙素原突变体在降钙素原检测试剂中标准曲线绘制中的用途。
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