CN109337853B - 一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法，通过基因工程技术将编码ExoU蛋白活性功能片段的DNA序列克隆至pGEX‑6p‑2载体上，构建大肠杆菌重组工程菌pGEX‑6p‑2‑rExoU/XL‑1 blue，通过诱导表达获得rExoU。本发明通过对表达rExoU的基因工程菌进行高压破菌、GST亲和层析、PP酶酶切、SP HP层析、G 25层析、Q HP层析等技术，获得高纯度的疫苗候选抗原rExoU。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是临床上最为常见的条件致病菌之一，在临床感染的革兰阴性菌中居首位。近年来，PA感染的流行病学呈现出如下趋势，第一：院内感染尤其是肺部感染的发病率不断增加，有数据显示2013医院获得性肺炎(HAP)患者PA分离率高达33.9％。第二：感染死亡率高，PA感染引起的呼吸机相关性肺炎患者的死亡率可达30％-50％，败血症患者死亡率高达33％～61％。第三：耐药性日趋严峻。CHINET资料显示，2013年PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率分别为29.1％和27.1％，而HAP患者检出标本对二者的耐药率分别高达70.7％和48.8％。PA的高感染率、高死亡率和高耐药性给临床治疗造成了极大的挑战，寻找新的“非抗生素疗法”已迫在眉睫，而疫苗是目前最为理想的选择。

筛选到安全有效的抗原是疫苗研究的前提。本室前期通过反向疫苗学技术从PA全基因组中筛选得到了多个免疫保护性抗原，ExoU是其中之一。该蛋白是细菌III型分泌系统向宿主靶细胞输送的效应蛋白，也是细菌主要的毒性蛋白，ExoU阳性菌株在体内外均可引起细胞坏死、死亡，直接关系到感染患者的病情进展及预后，在致病过程中发挥关键作用(Howell HK等，Mbio，2013)。由于ExoU蛋白本身存在毒性，不能直接用作疫苗抗原，我们对其进行了截短和突变处理，得到了保留免疫原性而无毒性的疫苗候选抗原rExoU，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

综上所述，现有技术存在的问题是：

rExoU为经过突变和截短等改造的蛋白，不同于天然的ExoU蛋白。文献调研没有发现ExoU蛋白纯化方面的报导，更没有针对rExoU纯化方法的研究。

解决上述技术问题的难度和意义：

rExoU为人为改造得到的新蛋白，没有成熟的纯化工艺流程进行参考，需要根据经验摸索该蛋白的纯化工艺。

通过本发明的技术，实现了对rExoU的分离纯化，得到了高纯度的目的蛋白。该蛋白在动物试验中表现出了良好的免疫原性和保护效果，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答，并对细菌的攻毒感染具有一定的保护作用，可作为PA疫苗研发的候选抗原。该技术的建立使得深入研究该蛋白的理化性质，评价其免疫保护功能和机制成为了可能，并为蛋白生产工艺的建立奠定了基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法。

本发明是这样实现的，一种重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue，所述重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue表达抗原rExoU的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法包括步骤：收集表达rExoU的基因工程菌；按照高压破菌、离心，GST亲和纯化；SP HP层析纯化，G 25层析纯化，Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。

进一步，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法具体包括步骤：

1)高压破菌

收集表达rExoU的基因工程菌，用pH为7.0-7.5的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)GST亲和纯化

GST亲和层析填料进行初步纯化，采用PBS洗脱杂蛋白后，用PrescissionProtease酶酶切洗脱目标蛋白，酶切和洗脱缓冲液为A液；

3)SP HP层析纯化

经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱后上样，B液线性梯度洗脱；

4)G 25层析纯化

将经步骤3)纯化的目标蛋白，C液平衡层析系统及G25层析柱后上样，置换缓冲液；

5)Q HP层析纯化

将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱后上样，去除痕量非目标蛋白、内毒素杂质，获得目标蛋白；

其中，A液为pH值7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液，B液为pH7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM Histidine，0.9％NaCl缓冲溶液，PBS缓冲液为A液加入150mM NaCl。

进一步，所述步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa压力，破菌后高速离心获取破菌上清。

进一步，所述步骤2)的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose4B或Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP。

进一步，所述步骤2)的Prescission Protease酶带有GST标签。

进一步，所述步骤3)的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP SepharoseFF或Capto SP。

进一步，所述步骤4)的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine。

进一步，所述步骤5)的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：ExoU是本室前期通过反向疫苗学技术从PA全基因组中筛选得到的免疫优势抗原之一，该蛋白是细菌III型分泌系统向宿主靶细胞输送的效应蛋白，也是细菌主要的毒性蛋白，ExoU阳性菌株在体内外均可引起细胞坏死、死亡，直接关系到感染患者的病情进展及预后，在致病过程中发挥关键作用)。通过大肠杆菌基因工程菌表达获得获PA疫苗候选抗原rExoU，采用本发明中的工艺流程纯化得到了高纯度的目的蛋白。所述重组蛋白经动物试验证明，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，有利于铜绿假单胞菌的预防、诊断和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白rExoU纯化方法的报道。

采用本发明所述的纯化方法，从表达铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98％，回收率大于40％的目的蛋白，通过氨基酸序列预测本发明人构建获得的蛋白rExoU分子质量约为27.4kD，等电点在pH 7.92左右。

本发明所述的纯化方法主要包括GST亲和纯化、SP HP层析、G25层析、Q HP层析，通过上述方法纯化的蛋白用12％SDS-PAGE检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为27kD。HPLC C3柱分析目的蛋白纯度98.1％。纯化后的rExoU经Al(OH)3佐剂吸附后注射免疫BalB/C小鼠，发现免疫血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P<0.01)，证明使用本发明人纯化方法获得的rExoU可有效刺激机体产生高效的免疫应答。使用临床株XN-1(CCTCC M2015730)感染，观察期结束后计算得出rExoU抗PA感染的保护率为76.9％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的重组质粒pGex-6p-1-EXOU的双酶切鉴定结果示意图；

图中：泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2～6：重组表达质粒pGEX-6p-1-EXOU经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约783bp。

图3是本发明实施例提供的蛋白EXOU诱导鉴定结果示意图；

图中：泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道3：经PP酶酶切后的上清；泳道4：经PP酶酶切后的GST填料。

图4是本发明实施例提供的GST亲和层析、PP酶酶切及SP HP层析纯化rExoU的SDS-PAGE结果示意图；

图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：破菌上清；泳道2：蛋白与GST亲和填料结合；泳道3：PP酶酶切后洗脱样本；泳道4：PP酶酶切后GST亲和填料；泳道5：SP HP洗脱样品。

图5是本发明实施例提供的SP HP层析图。

图6是本发明实施例提供的G 25层析图。

图7是本发明实施例提供的Q HP层析图。

图8是本发明实施例提供的Q HP层析后SDS-PAGE结果示意图；

图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1和2为Q HP流穿样品。

图9是本发明实施例提供的rExoU蛋白HPLC检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。重组工程菌中的插入片段ExoU在NCBI中GI为1219685773，protein Accession:ASM94169.1，蛋白全长670个氨基酸。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU，该抗原的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

如图1所示，本发明实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法包括以下步骤：

S101：收集表达rExoU的基因工程菌；

S102：按照高压破菌、离心；

S103：GST亲和纯化；

S104：SP HP层析纯化；

S105：G 25层析纯化；

S106：Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。

菌株与各种试剂如下：

1.铜绿假单胞菌菌株

铜绿假单胞菌国际标准株PAO1从美国ATCC购买(

BAA-47^TM)；

2.试剂

质粒pGEX-6p-2、Glutathione Sepharose 4B、SP Sepharose HP、Sephadex G-25Medium、Q Sepharose HP等填料购自GE Healthcare Life Sciences公司，申请人保存；

大肠杆菌菌株XL-1blue购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；

Na₂HPO₄.12H₂O、NaH₂PO₄.2H₂O、NaCl、NaOH、Tween-20、NaHCO₃，Na₂CO₃购自国药集团化学试剂有限公司；

PBS、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；

Tryptone、Yeast extract均购自英国OXOID公司；

Ampicilline、0.9％氯化钠注射液购自太极集团西南药业；

琼脂粉、IPTG、L-组氨酸、购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

蛋白上样缓冲液购于碧云天生物技术；蛋白Marker购于Thermo公司；

TFA、乙腈购自TEDIA公司；

Al(OH)₃购自Brenntage公司；

Tris购自ANGUS公司；

硫酸、盐酸购自成都科龙化工试剂厂；

牛血清白蛋白V购自BIOSHARP公司；

异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

实施例1：重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue的构建

根据rExoU的编码序列设计上下游引物，采用PCR扩增得到目的序列，将目的序列和pGEX-6p-2载体经BamH1和Xho1双酶切后采用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pGEX-6p-2-rExoU(图2为重组质粒双酶切鉴定结果)。将上述重组质粒转化感受态大肠杆菌XL-1blue，得到重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue。

实施例2：rExoU的表达及酶切鉴定

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue菌液200μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，加入终浓度为200μM的IPTG置于16℃摇床中诱导过夜，诱导结束后5000rpm离心10min收集菌体，再加1.5mLPBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解2min(200V)，收集上清与40μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理，结合条件为4℃结合3h；结合结束后采用PBS洗脱未结合的杂蛋白3次，然后将用40μL PBS重悬填料后取40μL用于电泳。向余下约40μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入5μL PreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温酶切2h后，离心吸取上清后，用PBS洗涤填料3次，各取20μL样品变性处理后进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的rExoU蛋白分子量～25kDa，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。

实施例3rExoU的纯化工艺研究

经过对rExoU的纯化条件的多次摸索，确定了该蛋白的纯化工艺流程，如图1所示，通过该工艺得到的蛋白纯度在97％以上，具体操作如下。

1.高压破菌、离心

将上述表达rExoU的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，离心收集菌体备用。

取菌体300g左右，按重量：体积比1：5比例以PBS缓冲液混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片结晶紫染色，油镜每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

2.GST亲和纯化

选择GST亲和层析填料进行初步纯化，GST亲和填料为Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose 4FF、Glutathione Sepharose HP之一，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。

Prescission Protease酶(PP酶)进行酶切洗脱：所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶，获取目的蛋白，酶切缓冲液为A液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH pH7.0-7.5)。电泳结果如图4所示。经过GST初纯，目的蛋白的纯度已达到90％以上，但仍有待提高，除去痕量杂质。

3.SP HP层析纯化

收集GST亲和层析的样品，使用A液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH pH7.0-7.5)平衡层析系统及SP HP层析柱，B液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，1M NaCl,pH7.0-7.5)线性梯度洗脱,设定洗脱流速10ml/min，洗脱梯度为B％从0到100％，洗脱体积为500ml，收集洗脱下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图5所示，电泳结果如图4所示。

其中，A液的配制：取Na₂HPO₄.12H₂04.5g,NaH₂PO₄.2H₂0 0.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。

B液的配制：取Na₂HPO₄.12H₂04.5g,NaH₂PO₄.2H₂0 0.5g，NaCl 58.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。

4.G25层析纯化

将上述SP HP纯化获得的样品，使用Sephadex G-25Medium层析柱纯化，采用C液(10mM L-组氨酸，0.9％NaCl，pH6.0)平衡层析系统及层析柱，置换缓冲液，收集流穿下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图6所示。

其中，C液的配制：取L-组氨酸0.775g溶于500ml 0.9％氯化钠注射液中,调pH值至6.0。

5.Q HP层析纯化

将上述G25纯化获得的样品，采用C液(10mM L-组氨酸，0.9％NaCl，pH6.0)平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，收集流穿下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图7所示，电泳结果如图8所示。

6.HPLC检测

使用C3(购自Agilent公司)对rExoU蛋白进行纯度检测，用0.1％TFA水溶液平衡柱子，上样10ul样品，0.1％TFA乙腈溶液洗脱，设定柱温60℃，流速0.5ml/min。洗脱程序为：10％～100％B，30min，通过曲线测出rExoU蛋白的纯度为98.1％，层析图如图9所示。

其中，0.1％TFA水溶液的配制：1L I级水加1ml TFA混匀，0.22μm滤膜过滤。

0.1％TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加1ml TFA混匀。

纯化后的抗原，做以下实验：

实施例5免疫动物

疫苗的制备：采用PBS稀释rExoU蛋白抗原，加入浓度为Al(OH)₃佐剂对抗原进行吸附，最终的疫苗成品中抗原浓度为0.5mg/ml，铝含量为0.7mg/ml；

免疫方法：将雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组20只，实验组采用上述疫苗通过肌肉注射(股四头肌)的方式对小鼠进行免疫，每只小鼠注射量为100μL，对照组采用100μl的PBS和Al(OH)₃佐剂分别进行免疫，免疫方案为D0，D14，D21三次免疫。

实施例6抗体的检测

第三次免疫后第7和14天，采集BALB/c小鼠的尾静脉血，用ELISA检测免疫后小鼠血清中特异性IgG抗体水平。

1.制备缓冲液

(1)包被液：在电子天平上称取Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃2.9g，NaN₃0.2g，加蒸馏水500ml，调至pH 9.6，蒸馏水定容至1000ml，批次设置为当日配制时间，标识：包被液。

(2)抗体稀释液：在电子天平上称取NaCl 8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5ml，调至pH 7.4，加蒸馏水定容至1000ml，批次设置为当日配制时间，标识：抗体稀释液。

(3)洗涤液：0.05％Tween 20-PBS(pH 7.4)，取规格为1000ml/袋PBS 1袋溶于1000ml纯水中，加入0.5ml Tween 20。

(4)封闭液：现配现用，量取适量体积的抗体稀释液，按1％的比例加入BSA，4℃放置备用。

(5)终止液：2mol/L硫酸，用移液枪吸取(18mol/L)H₂SO₄111ml至889ml ddH₂O中。

2.ELISA检测rExoU重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)包被：用包被液将纯化后的rExoU重组蛋白稀释为2μg/mL。200μL/孔加入酶标板，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

2)封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

3)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000等倍比稀释；取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

4)100μL/孔加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:5000稀释)，，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

5)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；

6)加入终止液(2M H₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

7)结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。

结果：检测rExoU蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:49200；免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的rExoU重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例7rExoU免疫后攻毒保护效果评价

rExoU重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：Gao Chen等ClinImmunol 2017,183,354-363进行。简要地说，rExoU末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备PAXN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。

表1 EXOU重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

表1显示：阴性对照组和空白对照组的存活率为分别为16.7％和13.3％，重组融合蛋白rExoU加Al(OH)₃佐剂组的存活率为70.0％，通过公式：保护率＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率×100％，计算得到rExoU的保护率为76.9％。因此，本发明的rExoU重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PA XN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆艾力彼生物科技有限公司

<120> 铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌标准株PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)

<400> 1

agccgtccgc ctctgaccag cctggttctg agcggtggtg gtgcaaaagg tgcagcatat 60

ccgggtgcaa tgctggcact ggaagaaaaa ggtatgctgg atggtattcg tagcatgagc 120

ggtagcgcag ccggtggtat taccgcagca ctgctggcaa gcggtatgag tccggcagca 180

tttaaaaccc tgagcgataa aatggatctg attagcctgc tggatagcag caacaaaaaa 240

ctgaaactgt tccagcatat cagcagcgaa attggtgcaa gcctgaaaaa aggtctgggt 300

aacaaaattg gtggttttag tgaactgctg ctgaatgttc tgcctcgtat tgatagccgt 360

gcagaaccgc tggaacgtct gctgcgtgat gaaacccgta aagcagttct gggtcagatt 420

gcaacccatc cggaagttgc acgtcagccg accgttgcag caattgcaag ccgtctgcag 480

agcggttcag gtgttacctt tggtgatctg gatcgtctga gcgcatatat tccgcagatt 540

aaaacactga atattaccgg caccgcaatg tttgaaggtc gtccgcagct ggttgttttt 600

aatgcaagcc atacaccgga tctggaagtt gcccaggcag cacatattag cggtagcttt 660

ccgggtgttt ttcagaaagt tagcctgagt gatcagccgt atcaggcagg cgttgaatgg 720

accgaatttc aagcgggtgg tgttatgatt aatgttccgg ttccggaaat gatcgacaaa 780

aac 783

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌标准株PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)

<400> 1

Ser Arg Pro Pro Leu Thr Ser Leu Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ala Tyr Pro Gly Ala Met Leu Ala Leu Glu Glu Lys Gly Met

20 25 30

Leu Asp Gly Ile Arg Ser Met Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Ile Thr

35 40 45

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gly Met Ser Pro Ala Ala Phe Lys Thr Leu

50 55 60

Ser Asp Lys Met Asp Leu Ile Ser Leu Leu Asp Ser Ser Asn Lys Lys

65 70 75 80

Leu Lys Leu Phe Gln His Ile Ser Ser Glu Ile Gly Ala Ser Leu Lys

85 90 95

Lys Gly Leu Gly Asn Lys Ile Gly Gly Phe Ser Glu Leu Leu Leu Asn

100 105 110

Val Leu Pro Arg Ile Asp Ser Arg Ala Glu Pro Leu Glu Arg Leu Leu

115 120 125

Arg Asp Glu Thr Arg Lys Ala Val Leu Gly Gln Ile Ala Thr His Pro

130 135 140

Glu Val Ala Arg Gln Pro Thr Val Ala Ala Ile Ala Ser Arg Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ser Gly Val Thr Phe Gly Asp Leu Asp Arg Leu Ser Ala Tyr

165 170 175

Ile Pro Gln Ile Lys Thr Leu Asn Ile Thr Gly Thr Ala Met Phe Glu

180 185 190

Gly Arg Pro Gln Leu Val Val Phe Asn Ala Ser His Thr Pro Asp Leu

195 200 205

Glu Val Ala Gln Ala Ala His Ile Ser Gly Ser Phe Pro Gly Val Phe

210 215 220

Gln Lys Val Ser Leu Ser Asp Gln Pro Tyr Gln Ala Gly Val Glu Trp

225 230 235 240

Thr Glu Phe Gln Ala Gly Gly Val Met Ile Asn Val Pro Val Pro Glu

245 250 255

Met Ile Asp Lys Asn

260

Claims (2)

1.一种重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue，其特征在于，所示重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue表达抗原rExoU的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2.一种利用权利要求1所述重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法包括步骤：收集表达rExoU的基因工程菌；按照高压破菌、离心，GST亲和纯化；SP HP层析纯化，G 25层析纯化，Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化；

所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法具体包括步骤：

1)高压破菌

收集表达rExoU的基因工程菌，用pH为7.0-7.5的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)GST亲和纯化

GST亲和层析填料进行初步纯化，采用PBS洗脱杂蛋白后，用预分解蛋白酶切洗脱目标蛋白，酶切和洗脱缓冲液为A液；

3)SP HP层析纯化

经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱后上样，B液线性梯度洗脱；

4)G 25层析纯化

将经步骤3)纯化的目标蛋白，C液平衡层析系统及G25层析柱后上样，置换缓冲液；

5)Q HP层析纯化

将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱后上样，去除痕量非目标蛋白、内毒素杂质，获得目标蛋白；

其中，A液为pH值7.0-7.5的20mM Na₂ HPO₄-NaH ₂PO₄缓冲溶液，B液为pH7.0-7.5的20mMNa2HPO 4-NaH₂ PO ₄，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM组氨酸，0.9％NaCl缓冲溶液，PBS缓冲液为A液加入150mM NaCl；

所述步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa压力，破菌后高速离心获取破菌上清；

所述步骤2)的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose 4B或GlutathioneSepharose4FF或Glutathione Sepharose HP；

所述步骤2)的预分解蛋白酶带有GST标签；

所述步骤3)的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP Sepharose FF或CaptoSP；

所述步骤4)的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine；

所述步骤5)的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q。

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