CN108503698B

CN108503698B - 鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性

Info

Publication number: CN108503698B
Application number: CN201810510029.2A
Authority: CN
Inventors: 朱力; 刘志成; 潘超; 王恒樑; 刘先凯; 王东澍; 冯尔玲
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: EP3805255A1; US20210214400A1; WO2019223749A1; CN108503698A; EP3805255A4

Abstract

本发明公开了鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性。本发明提供了一种蛋白质，包括鲍曼不动杆菌Ata蛋白N‑端α‑螺旋部分39个氨基酸和佐剂蛋白；所述鲍曼不动杆菌Ata蛋白N‑端α‑螺旋部分39个氨基酸的氨基酸序列分别为序列2第127‑165位。本发明将鲍曼不动杆菌的表面蛋白Ata(Acinetobacter trimeric autotransporter)，截取N‑端α‑螺旋部分39个氨基酸，与CTB进行融合，在BL21中表达。经镍柱纯化，以40μg/只小鼠进行腹腔免疫，通过动物实验验证其免疫原性和免疫保护性，证明其具有良好的抗鲍曼不动杆菌的侵染。

Description

鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是自然界中广泛存在的一种革兰氏阴性菌，属于一种机会致病菌，极易感染免疫功能低下的人，同时也是医院感染中最典型的临床病原菌之一。因其增殖速度快，粘附力极强，因此在医院环境中广泛分布，并且随着抗生素的大量使用，出现了越来越多的耐药菌株，鲍曼不动杆菌已经对全球医疗卫生系统构成了严重威胁。目前，临床上主要利用抗生素对抗鲍曼不动杆菌的感染，然而多重耐药菌株的出现，使得医生在治疗时不得不联合用药。可是联合用药存在许多弊端，因此相关疫苗的研制，对于预防鲍曼不动杆菌的疫情刻不容缓。可惜的是，目前还没有一种针对鲍曼不动杆菌的疫苗上市。

发明内容

本发明一个目的是提供一种蛋白质(人工设计构建的融合蛋白质)。

本发明提供的蛋白质，包括鲍曼不动杆菌Ata蛋白N-端α-螺旋部分39个氨基酸；

所述鲍曼不动杆菌Ata蛋白N-端α-螺旋部分39个氨基酸的氨基酸序列分别为序列2第127-165位。

上述蛋白质还包括佐剂蛋白或具有佐剂功能的蛋白片段；

或，所述佐剂蛋白具体为CTB蛋白。

上述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：

a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；

b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；

d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；

e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列1；

2)其编码序列为序列表中序列1；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

本发明另一个目的是提供下述1)-3)中的任一种生物材料。

本发明提供的生物材料为如下：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的重组菌或转基因细胞系。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料如下任一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备促进动物或人产生拮抗鲍曼不动杆菌的抗体产品；

2)制备预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病产品。

本发明第3个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其包括上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料。

上述产品具有如下a和/或b功能：a)、促进动物或人产生拮抗鲍曼不动杆菌的抗体；b)预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病。

上述中，所述动物为小鼠；

或，所述产品为药品或保健品或检测试剂盒或疫苗。

本发明将鲍曼不动杆菌的表面蛋白Ata(Acinetobacter trimericautotransporter)，截取N-端α-螺旋部分39个氨基酸，与CTB进行融合，在BL21中表达。经镍柱纯化，以40μg/只小鼠进行腹腔免疫，通过动物实验验证其免疫原性和免疫保护性，证明其具有良好的抗鲍曼不动杆菌的侵染的作用。

附图说明

图1为蛋白AtaN-端α-螺旋部分39个氨基酸的示意图。

图2为纯化的融合蛋白CTB-Ata的SDS-PAGE分析结果。

图3为间接ELISA法测各组小鼠血清中抗鲍曼不动杆菌的抗体滴度结果。

图4为融合蛋白CTB-Ata免疫后小鼠攻毒鲍曼不动杆菌的实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、融合蛋白CTB-Ata的获得

融合蛋白CTB-Ata包括CTB和鲍曼不动杆菌的表面蛋白Ata(Acinetobactertrimeric autotransporter)N-端α-螺旋部分39个氨基酸。

1、融合蛋白CTB-Ata

鲍曼不动杆菌的表面蛋白Ata(Acinetobacter trimeric autotransporter)，截取N-端α-螺旋部分39个氨基酸(图1)。

再通过全基因合成Ata蛋白的α-螺旋部分39个氨基酸、tac启动子以及融合表达的CTB蛋白，构成融合蛋白CTB-Ata，该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

序列2中第20-123位为融合表达的CTB蛋白，第127-165位为Ata蛋白的α-螺旋部分，第201-206位为His标签。

融合蛋白编码基因CTB-Ata的核苷酸序列为序列表中序列1，其中，第103-131位为tac启动子，第235-543位为CTB蛋白的编码基因，第556-672位为Ata蛋白的α-螺旋部分编码基因，第778-795位为His标签基因。

2、表达融合蛋白CTB-Ata的载体

用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将上述序列1所示的融合蛋白编码基因CTB-Ata与载体大片段连接，得到重组表达载体pET28a-CTB-Ata。

重组表达载体pET28a-CTB-Ata为将序列1所示的融合蛋白编码基因CTB-Ata插入pET28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切酶切位点得到的载体，表达融合蛋白CTB-At。

3、融合蛋白CTB-Ata的表达与纯化

将上述2得到的重组表达载体pET28a-CTB-Ata导入到BL21细胞中，得到重组菌pET28a-CTB-Ata/BL21；

将重组菌pET28a-CTB-Ata/BL21接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，以体积比1:100传代于LB液体培养基，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导12h，得到蛋白诱导培养液，离心(10800g离心8min)，收集沉淀得到蛋白诱导菌体。

取蛋白诱导菌体30g，加入100ml A1液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.5M NaCl、10mM咪唑，调pH至7.0)，超声破菌(超声4s暂停5s，累计超声时间2h)，用12 000g的离心力离心，收集上清液，此上清为含融合蛋白CTB-Ata的粗提液。

利用Chelating亲和层析柱(GE Healthcare，产品目录号为17-5203-06)(Φ1.6cm*15cm)纯化上述上清液。首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO₄水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.5M NaCl、500mM咪唑，调pH至7.0)平衡至少一个柱床体积，最后用上述A1液平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将粗提液上样，再用A1液洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nM)接近于0mAU，最后用含0％-100％(体积比)的B1液的溶液进行线性洗脱(A管道进A1液，B管道进B1液，纯化仪自动混合)，收集洗脱液80mL，得到纯化的融合蛋白CTB-Ata。

将纯化的融合蛋白CTB-Ata用15％SDS-PAGE分析，结果如图2所示，纯化后成功得到了比较纯的目的融合蛋白CTB-Ata(分子量为22.5Da)。经BCA法蛋白定量后，能够进行动物实验。

将空载体pET28a转入BL21细胞中，同样的方法诱导表达，没有得到目的蛋白。

实施例2、融合蛋白CTB-Ata的功能验证

1、融合蛋白动物免疫

将实施例1制备的纯化的融合蛋白CTB-Ata用生理盐水稀释，制成含有融合蛋白CTB-Ata的免疫样品；按照每只小鼠40μg融合蛋白CTB-Ata的免疫剂量进行免疫。

取20只5周龄大(体重无显著差异)的雌性Balb/c小鼠(维通利华)，随机分为2组(每组5只)：

腹腔免疫组：每只小鼠注射100μl含有融合蛋白CTB-Ata的免疫样品注射免疫样品，免疫剂量为每只小鼠40μg；

空白对照组(不注射任何样品)：雌性Balb/c小鼠；

各组分别在第1、14、28天进行免疫，每次免疫注射后10天断尾取血，收集各组小鼠血清。

2、抗鲍曼不动杆菌的抗体滴度检测

用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗鲍曼不动杆菌的抗体滴度，具体如下：

12 000r/min收集新鲜培养的鲍曼不动杆菌，用菌预处理液(0.25％福尔马林、0.02mol/L pH7.4的PBS(NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g，用ddH₂O溶解并定容到1L))洗3次后，再用菌预处理液稀释至10⁸cfu/ml，得到菌体悬液，4℃保存备用。用0.1mol/L的NaHCO₃溶液配制2.5％(体积百分比)戊二醛溶液，加入96孔板，150μl/孔，37℃孵育1h，再用蒸馏水洗4次，每次5min，拍干。然后向处理好的96孔板中加入菌体悬液，100μl/孔，37℃过夜直至干燥。用PBST(1L PBS加500μl吐温-20)洗3次，拍干，每孔加入含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST 200μl，37℃孵育2h，再用PBST洗3次，拍干，加入倍比稀释的上述1得到的腹腔免疫组的小鼠血清(用含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST稀释)，100μl/孔，37℃孵育90min。PBST洗3次，拍干，加入驴抗鼠抗体(abcam，产品目录号ab6820)(用含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST按1:10 000稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗3次，拍干，加入100μl/孔的OPD-H₂O₂显色液，避光显色15min，加入50μl终止液，测OD₄₉₀值。

结果如图3所示，可以看出，随着免疫次数的增加，腹腔免疫组小鼠血清中的IgG抗体量在逐步提高，说明融合蛋白CTB-Ata免疫能够成功使小鼠产生拮抗鲍曼不动杆菌的抗体。

3、小鼠攻毒实验

在末次免疫后14天，给各组每只小鼠以1.5倍LD₅₀的鲍曼不动杆菌进行腹腔注射攻毒，每只小鼠注射体积为200μL，连续7天观察和记录每组小鼠死亡数。

结果如图4所示，可以看出，空白对照组只存活了2只，而腹腔免疫组存活5只，可见注射融合蛋白CTB-Ata对小鼠具有良好的保护性，表明，融合蛋白CTB-Ata可以用来预防鲍曼不动杆菌所致疾病。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 鲍曼不动杆菌Ata蛋白的免疫原性

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacggcggat ccggcaacaa aattaccaat ctgggtgatc agttacaaca agtgttctat 600

gacaccaata aacgtattga tgacgttgag aaaaaagcta atgcaggtat tgccgctgcc 660

atggccttag aaggcggttc tggtagcgcc gtgaccgagt actatctgaa ccatggcgag 720

tggccgggta ataacaccag cgccggcgtg gccacaagca gtgagatcaa gctcgagcac 780

caccaccacc accactga 798

<210> 2

<211> 206

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Ser Gly Asn Lys

115 120 125

Ile Thr Asn Leu Gly Asp Gln Leu Gln Gln Val Phe Tyr Asp Thr Asn

130 135 140

Lys Arg Ile Asp Asp Val Glu Lys Lys Ala Asn Ala Gly Ile Ala Ala

145 150 155 160

Ala Met Ala Leu Glu Gly Gly Ser Gly Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr

165 170 175

Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala

180 185 190

Thr Ser Ser Glu Ile Lys Leu Glu His His His His His His

195 200 205

Claims

1.一种蛋白质，由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.下述1)-3)中的任一种生物材料：

1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；

2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体；

3)含有权利要求2所述核酸分子的重组菌或转基因细胞系。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述的生物材料在如下任一种中的应用：

1)制备促进动物或人产生拮抗鲍曼不动杆菌的抗体产品；

2)制备预防和/或治疗鲍曼不动杆菌所致疾病产品。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述动物为小鼠；

或，所述产品为药品或检测试剂盒或疫苗。

6.一种产品，其包括权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述的生物材料。